Règlement grand-ducal du 1er août 2007 modifiant le règlement grand-ducal du 17 décembre 1994 concernant la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre.

22 août 2007

Règlement grand-ducal du 1er août 2007 modifiant le règlement grand-ducal du 17 décembre 1994

concernant la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre.

Nous Henri, Grand-Duc de Luxembourg, Duc de Nassau,

Vu la loi du 14 juillet 1971 concernant la protection des végétaux et produits végétaux contre les organismes

nuisibles;

Vu la directive 93/85/CEE du Conseil concernant la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre,

telle que modifiée en dernier lieu par la directive 2006/56/CE de la Commission du 12 juin 2006;

Vu l’avis de la Chambre d’Agriculture;

Vu l’avis de la Chambre de Commerce;

Vu l’article 2 (1) de la loi du 12 juillet 1996 portant réforme du Conseil d’Etat et considérant qu’il y a urgence;

Sur le rapport de Notre Ministre de l’Agriculture, de la Viticulture et du Développement rural et après délibération

du Gouvernement en Conseil;

Arrêtons

Les annexes I à III du règlement grand-ducal du 17 décembre 1994 concernant la lutte contre le

flétrissement bactérien de la pomme de terre sont remplacées comme indiqué à l’annexe du présent règlement.

L’annexe fait partie intégrante du présent règlement grand-ducal.

Notre Ministre de l’Agriculture, de la Viticulture et du Développement rural est chargé de l’exécution du

présent règlement qui sera publié au Mémorial.

Le Ministre de l’Agriculture,

Cabasson, le 1er août 2007.

de la Viticulture

Henri

et du Développement rural,

Fernand Boden

Dir. 2006/56/CE

ANNEXE I

PROTOCOLE DE TEST EN VUE DU DIAGNOSTIC, DE LA DETECTION ET DE

L’IDENTIFICATION DE L’AGENT RESPONSABLE DU FLETRISSEMENT

BACTERIEN DE LA POMME DE TERRE, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS

(Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

CHAMP D’APPLICATION DU PROTOCOLE DE TEST

Le protocole présenté ci-dessous décrit les différentes étapes à suivre pour

i)

le diagnostic du flétrissement bactérien sur les tubercules et sur les plants de pomme de terre;

ii) la détection de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus sur des échantillons de tubercules et de plants de pomme

de terre;

iii) l’identification de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. ssp. sepedonicus).

TABLE DES MATIERES

Principes généraux

1. Diagramme fonctionnel

1.1

Protocole de détection en vue du diagnostic du flétrissement bactérien sur des tubercules et des plants de

pomme de terre présentant des symptômes de la maladie

1.2

Protocole de détection et d’identification de C. m. ssp. sepedonicus sur des échantillons de tubercules de

pomme de terre asymptomatiques

1.3

Protocole de détection et d’identification de C. m. ssp. sepedonicus sur des échantillons de plants de pomme

de terre asymptomatiques

2. Recherche visuelle des symptômes du flétrissement bactérien

2.1

Plants de pomme de terre

2.2

Tubercules de pomme de terre

3. Préparation de l’échantillon

3.1

Tubercules de pomme de terre

3.2

Plants de pomme de terre

4. Test d’immunofluorescence (test IF)

5. Test d’hybridation fluorescente in situ (test FISH)

6. Test de réaction en chaîne par polymérase (test RCP)

6.1

Méthodes de purification de l’ADN

6.1. a) Méthode de Pastrik (2000)

6.1. b) Autres méthodes

6.2

PCR

7. Test biologique

8. Isolement de C. m. ssp. sepedonicus

8.1

Etalement sur milieu sélectif

8.2

Purification des colonies présumées de C. m. subsp. sepedonicus

9. Identification

9.1

Tests d’identification nutritionnels et enzymatiques

9.2

Test d’immunofluorescence

9.3

Test PCR

9.4

Test FISH

9.5

Test de profil des acides gras (FAP)

9.6

BOX-PCR

10.Test de confirmation

Appendice 1

Laboratoires pratiquant l’optimisation et la validation des protocoles

Appendice 2

Préparation des témoins

Appendice 3

Tampons pour les procédures de test

Appendice 4

Détermination du degré de contamination lors des tests IF et FISH

Appendice 5

Milieux d’isolement et de culture de C. m. ssp. sepedonicus

Appendice 6

Protocole et réactifs PCR validés

Appendice 7

Réactifs validés pour le test FISH

Appendice 8

Cultures d’aubergine

Appendice 9

Coloration de Gram

Références

PRINCIPES GENERAUX

Les protocoles optimisés pour les différentes méthodes, les réactifs validés et les modalités de la préparation du

matériel nécessaire aux tests et aux contrôles figurent dans les appendices. Une liste des laboratoires retenus pour

l’optimisation et la validation des protocoles est fournie à l’appendice 1.

Etant donné que les protocoles impliquent la détection d’un organisme nuisible à mettre en quarantaine et incluent

l’utilisation de cultures viables de C. m. ssp. sepedonicus en tant que matériels de contrôle, il est nécessaire de mettre

en œuvre les procédures dans des conditions de quarantaine appropriées, au moyen des installations adéquates

d’élimination des déchets et dans le respect des exigences liées aux licences appropriées délivrées par les autorités

officielles de quarantaine.

Les paramètres des tests doivent garantir une détection cohérente et reproductible des taux de C. m. ssp. sepedonicus

aux seuils fixés pour les méthodes sélectionnées.

La préparation précise de témoins positifs est impérative.

La réalisation des tests selon les seuils requis implique également l’établissement de paramètres corrects, la

maintenance et le calibrage des équipements, la manipulation et la conservation soigneuse des réactifs et toutes les

mesures visant à empêcher la contamination entre échantillons, comme la séparation des témoins positifs et des

échantillons des tests. Des normes de contrôle de la qualité doivent être appliquées pour éviter toute erreur,

notamment d’ordre administratif, dans l’étiquetage et la documentation.

L’apparition suspectée d’un foyer, au sens de l’article 4, paragraphe 2, de la directive 93/85/CEE, implique une

réaction positive aux tests de diagnostic ou de dépistage réalisés sur un échantillon, comme cela est indiqué dans les

diagrammes.

Si le premier test de dépistage (IF ou PCR/FISH) est positif, il y a suspicion de contamination par le Cms et un second

test de dépistage doit être effectué. Si le second test de dépistage est positif, la suspicion est confirmée (apparition

suspectée) et il y a lieu de poursuivre les tests conformément au protocole. Si le second test de dépistage est négatif,

l’échantillon est considéré comme non contaminé par le Cms.

La réaction positive au test d’immunofluorescence visée à l’article 4, paragraphe 2, est donc définie comme une

réaction positive au test d’immunofluorescence confirmée par un second test de dépistage (PCR/FISH).

La présence confirmée visée à l’article 5, paragraphe 1, de la directive 93/85/CEE implique l’isolement et

l’identification d’une culture pure de C. m. ssp. sepedonicus avec confirmation de la pathogénicité.

1. PRESENTATION DU DIAGRAMME FONCTIONNEL

1.1

PROTOCOLE DE DETECTION EN VUE DU DIAGNOSTIC DU FLETRISSEMENT

BACTERIEN SUR DES TUBERCULES ET DES PLANTS DE POMME DE TERRE

PRESENTANT DES SYMPTOMES DE LA MALADIE

La procédure de test concerne les tubercules de pomme de terre et les plants présentant des symptômes

caractéristiques du flétrissement bactérien ou permettant d’en suspecter la présence. Elle comporte un test

rapide de dépistage, l’isolement de l’organisme pathogène à partir du tissu vasculaire infecté sur des milieux

de diagnostic et, en cas de résultat positif, l’identification de la culture comme étant C. m. ssp. sepedonicus.

La description des symptômes figure à la section 2.

Les tests appropriés sont

le test d’immunofluorescence (section 4),

le test PCR (section 6),

le test FISH (section 5).

Bien que l’isolement par dilution et étalement sur milieu de culture de l’agent pathogène provenant de matériel végétal

présentant des symptômes caractéristiques soit une tâche simple, la mise en culture risque d’échouer à partir des stades

d’infection avancés. Les bactéries saprophytes qui se développent sur un tissu malade risquent en effet de se multiplier

beaucoup plus rapidement que l’agent pathogène ou d’inhiber sa croissance sur le milieu d’isolement. Il est donc recommandé

d’utiliser à la fois des milieux non sélectifs et sélectifs, de préférence du type MTNA (section 8), ou de recourir au test

biologique (section 7).

Le profil morphologique d’une colonie caractéristique est présenté à la section 8.

Tubercule(s) ou plant(s) de pomme de terre avec symptômes

suspects de flétrissement bactérien1

TEST D'ISOLEMENT PRINCIPAL3

TESTS RAPIDES DE DEPISTAGE2

Colonies avec morphologie caractéristique4

NON5

C.m. subsp. sepedonicus non détecté.

Echantillon non infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

OUI

Purification par repiquage

TESTS D’IDENTIFICATION6

NON

OUI

TEST DU POUVOIR PATHOGENE 7

Les deux tests confirment une culture

pure de C.m. subsp. sepedonicus.

Echantillon non infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

Echantillon infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

Lorsque le test d’isolement est négatif en dépit de symptômes caractéristiques de la maladie, l’isolement doit être réitéré.

Il est possible d’identifier de manière fiable une culture pure de C. m. ssp. sepedonicus en utilisant les tests énumérés à la section

9.

Le test du pouvoir pathogène est décrit à la section 10.

1.2

PROTOCOLE DE DETECTION ET D’IDENTIFICATION DE CLAVIBACTER MICHIGANENSIS

SSP. SEPEDONICUS SUR DES ECHANTILLONS DE TUBERCULES DE POMMES DE TERRE

ASYMPTOMATIQUES

Principe

La procédure de test vise à détecter des infections latentes de tubercules de pomme de terre. Tout résultat

positif d’au moins deux tests de dépistage3, fondés sur des principes biologiques différents, doit être complété

par l’isolement de l’organisme pathogène, suivi, en cas d’isolement de colonies caractéristiques, de la confirmation

d’une culture pure comme étant C. m. ssp. sepedonicus. Le résultat positif d’un unique test de dépistage n’est pas

suffisant pour que l’échantillon soit considéré comme suspect.

Les tests de dépistage et les tests d’isolement doivent autoriser des seuils de détection compris entre 103 et 104

cellules/ml d’extrait concentré remis en suspension, inclus à titre de témoins positifs dans chaque série de tests.

VII

échantillon non infecté par

Echantillon de tubercules de pomme de terre 1

TESTS DE DEPISTAGE PRINCIPAUX 3

Test IF 4 / test PCR 5 / test FISH 6

Négatif

positif

Isolement sélectif 7 et test biologique 8

Extraction et concentration de l’organisme pathogène 2

Second test de dépistage3

Négatif

Positif

Purification par repiquage

TESTS D’IDENTIFICATION 11

TEST DU POUVOIR

PATHOGENE 12

Premier test de dépistage 3

Colonies avec morphologie

caractéristique9

NON10

OUI

C.m. subsp. sepedonicus non détecté.

Echantillon non infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

C.m. subsp. sepedonicus pas détecté

échantillon non infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

C.m. subsp. sepedonicus pas détecté.

Echantillon non infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

Les deux tests confirment une culture

pure de C.m. subsp. sepedonicus.

Echantillon infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

OUI

NON

Echantillon non infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

La taille de l’échantillon standard est de 200 tubercules, bien que la procédure puisse être appliquée à des échantillons plus

réduits si l’on ne dispose pas de 200 tubercules.

L’extraction de l’organisme pathogène et les méthodes de concentration sont décrites à la section 3.1.

Si au moins deux tests fondés sur des principes biologiques différents se révèlent positifs, l’isolement et la confirmation doivent

être effectués. Réaliser au moins un test de dépistage. Si ce test est négatif, l’échantillon est considéré comme négatif. S’il est

positif, il y a lieu de procéder à, au moins, un deuxième test de dépistage fondé sur des principes biologiques différents afin

de vérifier le premier résultat positif. Si le deuxième test ou les suivants sont négatifs, l’échantillon est considéré comme

négatif. Il n’est alors pas nécessaire de procéder à d’autres tests.

Test d’immunofluorescence (IF).

Toujours utiliser un anticorps polyclonal pour les tests d’immunofluorescence. On peut obtenir plus de spécificité (voir

section 4) en y associant des anticorps monoclonaux supplémentaires.

Test PCR.

Utiliser des réactifs et des protocoles PCR dûment validés (voir section 6).

Test FISH.

Utiliser des réactifs et des protocoles validés (voir section 5).

Isolement sélectif.

Associé à l’emploi d’un milieu MTNA ou NCP-88 et d’une dilution au 1/100e d’extrait concentré remis en suspension,

l’isolement sélectif constitue dans de nombreux cas une bonne méthode d’isolement direct de C. m. ssp. sepedonicus.

L’obtention de colonies caractéristiques peut intervenir entre trois et dix jours après l’étalement. Il est alors possible de

procéder à la purification et à l’identification de l’agent pathogène. Pour mettre pleinement à profit les possibilités offertes par

ce test, il faut préparer soigneusement les cônes de pommes de terre prélevés au talon afin d’éviter la contamination par les

bactéries secondaires liées au tubercule, qui constituent des organismes concurrents de C. m. ssp. sepedonicus sur le milieu de

culture et sont susceptibles de supplanter cet agent pathogène. En cas d’échec du test d’étalement, l’isolement doit être

effectué à partir des plants utilisés pour le test biologique (voir section 8).

Le test biologique est utilisé pour l’isolement de C. m. ssp. sepedonicus à partir d’extraits de pommes de terre par

enrichissement sélectif dans des aubergines (Solanum melongena). Il exige des conditions optimales d’incubation conformes aux

spécifications de cette procédure. Les bactéries ayant un effet inhibiteur sur C. m. ssp. sepedonicus en présence d’un milieu

MTNA ou NCP-88 ne risquent guère de gêner le déroulement de ce test (voir section).

Le profil morphologique d’une colonie caractéristique est présenté à la section 8.

La mise en culture ou les tests biologiques risquent d’échouer en raison de la concurrence ou de l’effet inhibiteur de bactéries

saprophytes. Si les tests de dépistage produisent des résultats positifs mais que les tests d’isolement sont négatifs, il convient

de réitérer les tests d’isolement sur le même extrait ou à l’aide de nouveaux prélèvements de tissu vasculaire effectués à

proximité du talon sur des tubercules coupés provenant du même échantillon et, au besoin, de tester des échantillons

supplémentaires.

Il est possible d’identifier de manière fiable des cultures pures d’isolats supposés de C. m. ssp. sepedonicus en utilisant les tests

énumérés à la section 9.

Le test du pouvoir pathogène est décrit à la section 10.

1.3

PROTOCOLE DE DETECTION ET D’IDENTIFICATION DE CLAVIBACTER MICHIGANENSIS

SSP. SEPEDONICUS SUR DES ECHANTILLONS DE PLANTS DE POMMES DE TERRE

ASYMPTOMATIQUES

Voir section 3.2. pour la taille d’échantillons recommandée.

L’extraction de l’organisme pathogène et les méthodes de concentration sont décrites à la section 3,2.

Si au moins deux tests fondés sur de principes biologiques différents se révèlent positifs, l’isolement et la confirmation doivent

être effectués.

Réaliser au moins un test de dépistage. Si ce test est négatif, l’échantillon est considéré comme négatif. S’il est positif, il y a

lieu de procéder à, au moins, un deuxième test de dépistage fondé sur des principes biologiques différents afin de vérifier le

premier résultat positif. Si le deuxième test ou les suivants sont négatifs, l’échantillon est considéré comme négatif. Il n’est

alors pas nécessaire de procéder à d’autres tests.

Le test d’isolement sélectif et le profil morphologique d’une colonie caractéristique sont présentés à la section 8.

Le test IF est décrit à la section 4.

Les tests PCR sont décrits à la section 6.

Le test FISH est décrit à la section 5.

Le test biologique est décrit à la section 7.

La mise en culture ou les tests biologiques risquent d’échouer en raison de la concurrence ou de l’effet inhibiteur de bactéries

saprophytes. Si les tests de dépistage produisent des résultats positifs mais que les tests d’isolement sont négatifs, il convient

de réitérer les tests d’isolement et, au besoin, de tester des échantillons supplémentaires.

Il est possible d’identifier de manière fiable des cultures pures d’isolats supposés de C. m. ssp. sepedonicus en utilisant les tests

énumérés à la section 9.

Le test du pouvoir pathogène est décrit à la section 10.

Echantillon de segments de tige1

TESTS DE DEPISTAGE PRINCIPAUX3

Isolement sélectif 4 / Test IF 5 / Test PCR 6 / Test FISH 7

Test facultatif accessoire : test biologique 8

Tous les tests effectués négatifs

Extraction et concentration de l’organisme pathogène 2

Colonies avec morphologie

caractéristique4 après isolement

Purification par repiquage

TESTS

D’IDENTIFICATION10

TEST DU POUVOIR

PATHOGENE 11

NON

OUI

NON9

OUI

C.m. subsp. sepedonicus non détecté.

Echantillon non infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

Les deux tests confirment une culture

pure de C.m. subsp. sepedonicus.

Echantillon infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

Echantillon non infecté par

C.m. subsp. sepedonicus

2. RECHERCHE VISUELLE DES SYMPTOMES DU FLETRISSEMENT BACTERIEN

2.1

PLANTS DE POMME DE TERRE

Dans le contexte climatique européen, il est rare d’observer les symptômes dans les champs, et lorsque

c’est le cas, ce n’est possible qu’en fin de saison. En outre, il arrive fréquemment que les symptômes soient

masqués par ceux d’autres maladies, par des dommages mécaniques ou par la sénescence, ou soient

confondus avec eux. Les symptômes peuvent donc facilement passer inaperçus lors d’inspections sur place.

Les symptômes du flétrissement sont très différents de ceux qui caractérisent le flétrissement bactérien.

D’une manière générale, le premier progresse en effet lentement et se limite initialement au bord des

feuilles. Les jeunes feuilles infectées continuent souvent à se développer, mais de façon moins marquée aux

endroits infectés, ce qui donne aux feuilles des formes irrégulières. Les feuilles touchées par l’obstruction

des tissus vasculaires situés plus bas sur la tige développent fréquemment des tâches chlorotiques

intercostales de couleur jaune ou orange. Il arrive que les folioles, les feuilles et même les tiges infectées

finissent par mourir. Souvent, les feuilles et les tubercules sont simplement rabougris. Il arrive

occasionnellement de constater une atrophie des plants. Des illustrations en couleurs d’une série de

symptômes sont présentées à l’adresse: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2.2

TUBERCULES DE POMME DE TERRE

Les premiers symptômes sont, surtout près du talon, un aspect légèrement vitreux ou translucide du tissu,

sans ramollissement autour du système vasculaire. L’anneau vasculaire peut présenter, au talon, une couleur

légèrement plus foncée que la normale. Les premiers symptômes aisément identifiables sont une coloration

jaunâtre de l’anneau vasculaire et le fait que, lorsqu’on presse doucement le tubercule, des colonnes de

matière ressemblant à du fromage sortent des vaisseaux. Cet exsudat contient des millions de bactéries. Un

brunissement du tissu vasculaire peut apparaître. A ce stade, le bulbe présente des symptômes semblables

à ceux du flétrissement bactérien à Ralstonia solanacearum. Dans un premier temps, ces symptômes peuvent

se limiter à une partie de l’anneau, qui n’est pas nécessairement proche du talon, avant de se propager

graduellement à l’ensemble de l’anneau. Au fur et à mesure de la progression de l’infection, les tissus

vasculaires sont détruits et le cortex extérieur peut se séparer du cortex intérieur. Aux stades avancés de

l’infection, des fissures, aux bords souvent rouge-brun, apparaissent à la surface du tubercule. Dans plusieurs

cas observés récemment en Europe, on constate un pourrissement simultané du cortex central et de

l’anneau vasculaire entraînant une infestation secondaire avec creusement interne et nécrose. Une

infestation fongique ou bactérienne secondaire peut masquer les symptômes et il peut être malaisé, voire

impossible, de distinguer les symptômes avancés du flétrissement bactérien de ceux d’autres pourritures des

tubercules. Des formes asymptomatiques ne sont pas à exclure. Des illustrations en couleurs d’une série de

symptômes sont présentées à l’adresse: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

3. PREPARATION DE L’ECHANTILLON

3.1

TUBERCULES DE POMME DE TERRE

Nota bene

La taille de l’échantillon standard est de 200 tubercules par test. Un échantillonnage plus intensif implique

davantage de tests sur des échantillons de cette taille. Un nombre plus important de tubercules dans

l’échantillon entraînera une inhibition ou une interprétation difficile des résultats. Lorsqu’on ne dispose pas

d’un tel nombre de tubercules, la procédure peut cependant être appliquée sans difficulté à des échantillons

de moins de 200 tubercules.

La validation de toutes les méthodes de détection décrites ci-après est basée sur la réalisation de tests sur

des échantillons de 200 tubercules.

L’extrait de pomme de terre décrit ci-dessous peut également être utilisé pour détecter la présence de la

bactérie responsable du flétrissement bactérien de la pomme de terre, Ralstonia solanacearum.

Prétraitement facultatif préalable à la préparation de l’échantillon

Laver les tubercules en appliquant des désinfectants (composés chlorés lorsque le test PCR doit être utilisé

pour éliminer l’ADN pathogène) et des détergents appropriés entre les échantillons. Sécher les tubercules

à l’air. Cette procédure de lavage est particulièrement utile (sans être obligatoire) pour les échantillons

comportant des éléments de sol en excédent et si un test PCR ou une procédure d’isolement direct doit

être mis en œuvre.

3.1.1

A l’aide d’un scalpel ou d’un couteau à légumes propre et désinfecté, peler chaque tubercule au niveau

du talon de manière à faire apparaître le tissu vasculaire. Découper soigneusement un petit cône de

tissu vasculaire au niveau du talon, en veillant à prélever aussi peu que possible de tissu non vasculaire

(voir le site web accessible à l’adresse: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota bene: le cas échéant, mettre de côté les tubercules qui présentent des symptômes suspects de

flétrissement bactérien et les tester séparément.

Si des symptômes suspects de flétrissement bactérien sont observés lors du prélèvement du cône

de talon, il convient de procéder à une inspection visuelle du tubercule après l’avoir coupé à

proximité du talon. Tout tubercule coupé présentant des symptômes suspects doit être subérifié

pendant deux jours à température ambiante, puis conservé en quarantaine (à une température

comprise entre 4 et 10 °C) jusqu’à ce que tous les tests aient été achevés. Tous les tubercules de

l’échantillon (y compris ceux qui présentent des symptômes suspects) doivent être conservés

comme prescrit à l’annexe II.

3.1.2

Rassembler les cônes de talons dans des récipients jetables neufs qui peuvent être fermés et/ou

scellés (dans le cas de récipients réutilisés, les nettoyer et les désinfecter intégralement à l’aide de

composés chlorés). Il est préférable de traiter immédiatement les cônes de talons. A défaut, il

convient de les entreposer dans le récipient, sans addition de tampon, et, soit de les réfrigérer pour

une période inférieure à 72 heures, soit de les conserver à température ambiante pour une période

inférieure à 24 heures. Le séchage et la subérisation ainsi que le développement de saprophytes lors

de l’entreposage des cônes sont susceptibles de gêner la détection de l’agent responsable du

flétrissement bactérien.

3.1.3

Traiter les cônes de talons en suivant l’une des procédures ci-dessous

a)

recouvrir les talons d’un bain de tampon d’extraction en volume suffisant (environ 40 ml) (voir

l’appendice 3) et les placer dans un agitateur rotatif (entre 50 et 100 tours/minute) pendant 4

heures à une température inférieure à 24 °C ou pendant 16 à 24 heures s’ils sont réfrigérés,

ou

b)

homogénéiser les talons à l’aide d’un volume suffisant (environ 40 ml) de tampon d’extraction

(voir l’appendice 3), soit dans un mixeur (par exemple Waring ou Ultra Thurax), soit en les

broyant avec un maillet en caoutchouc ou un dispositif de broyage approprié (par exemple

Homex) dans un sac de macération jetable scellé (par exemple de type Stomacher ou «Bioreba

strong guage polythène» de 150 mm × 250 mm, stérilisé par radiations ionisantes).

Nota bene: il existe un risque élevé de contaminations croisées d’échantillons lorsque les échantillons sont

homogénéisés au moyen d’un mixeur. Prendre des précautions pour éviter toute vaporisation ou

débordement au cours du processus d’extraction. Veiller à utiliser des lames de mixeur et des vaisseaux

fraîchement stérilisés pour chaque échantillon. En cas d’utilisation du test PCR, éviter tout transport d’ADN

sur les récipients ou le dispositif de broyage. Le broyage dans des sacs jetables et l’utilisation de tubes jetables

est recommandé en cas de recours au test PCR.

3.1.4

Décanter le liquide surnageant. S’il est excessivement trouble, le clarifier par une centrifugation à

vitesse ralentie (à 180 g au maximum pendant 10 minutes, à une température de 4 à 10 °C ou par

une filtration sous vide (40 à 100 μm), en lavant le filtre avec un tampon d’extraction supplémentaire

(~ 10 ml) [voir l’appendice 3].

3.1.5

Concentrer la fraction bactérienne par centrifugation à une vitesse de 7 000 g pendant 15 minutes

(ou de 10 000 g pendant 10 minutes), à une température comprise entre 4 et 10 °C, puis éliminer

le liquide surnageant sans agiter le culot.

3.1.6

Remettre le culot en suspension dans un tampon de 1,5 ml (voir l’appendice 3). Utiliser 500 μl pour

les tests relatifs à C. m. ssp. sepedonicus, 500 μl pour les tests relatifs à Ralstonia solanacearum et

500 μl à des fins de référence. Ajouter du glycérol stérile à la concentration finale de 10 à 25 % (en

volume) aux 500 μl de l’aliquote de référence et à l’aliquote de test restante, passer au vortex et

stocker à une température de -16 à -24 °C (semaines) ou de -68 à -86 °C (mois). Maintenir les

aliquotes de test à une température de 4 à 10 °C pendant les tests.

Congélations et dégels répétés ne sont pas recommandés.

Si l’extrait doit être transporté, veiller à ce qu’il soit livré sous 24 à 48 heures dans une glacière.

3.1.7

Afin d’éviter toute contamination, il est impératif que tous les témoins positifs et échantillons de

C. m. ssp. sepedonicus soient traités séparément, aussi bien pour les tests d’immunofluorescence que

pour tous les autres tests.

3.2

PLANTS DE POMME DE TERRE

Nota bene: pour la recherche de populations latentes de C. m. ssp. sepedonicus, il est conseillé de tester des

échantillons composites. La procédure peut facilement être appliquée à des échantillons composites comportant

jusqu’à 200 parties de tiges. (Lorsque des enquêtes sont réalisées, elles doivent être basées sur un échantillon

statistiquement représentatif de la population végétale considérée.)

3.2.1

A l’aide d’un couteau ou d’un sécateur propre et désinfecté, détacher un segment d’un à deux

centimètres au niveau de la base de chaque tige, juste au-dessus du niveau du sol.

Après les avoir brièvement désinfectés au moyen d’éthanol à 70 %, sécher immédiatement les

segments de tige au papier absorbant.

Rassembler les segments de tiges dans un récipient stérile fermé en observant les procédures

d’échantillonnage exposées ci-après.

3.2.2

Traiter les segments de tiges en suivant l’une des procédures suivantes

a)

recouvrir les segments de tiges d’un bain de tampon d’extraction en volume suffisant (environ

40 ml) (voir l’appendice 3) et les placer dans un agitateur rotatif (entre 50 et 100 tours/minute)

pendant 4 heures à une température inférieure à 24 °C ou pendant 16 à 24 heures s’ils sont

réfrigérés, ou

b)

procéder immédiatement au broyage des segments dans un sac de macération résistant (par

exemple Stomacher ou Bioreba) avec un volume approprié de tampon d’extraction (voir

l’appendice 3), en utilisant un maillet en caoutchouc ou un dispositif de broyage approprié

(Homex, par exemple). A défaut, il convient soit de réfrigérer les segments (pour une période

inférieure à 72 heures), soit de les conserver à température ambiante (pour une période

inférieure à 24 heures).

3.2.3

Décanter le liquide surnageant après sédimentation pendant 15 minutes.

3.2.4

Il n’est habituellement pas nécessaire de procéder à une nouvelle clarification de l’extrait ou de la

concentration de la fraction bactérienne, mais celle-ci peut toutefois être réalisée par filtration et/ou

centrifugation selon la méthode décrite aux sections 3.1.4 à 3.1.6.

3.2.5

Séparer l’extrait d’échantillon initial ou concentré en deux parties égales. En maintenir une tout au

long du test à une température de 4 à 10 ºC et entreposer l’autre à une température de -16 à

-24 °C (semaines) ou de -68 à -86 °C (mois) après y avoir incorporé 10 à 25 % (en volume) de

glycérol stérile, pour le cas où il serait nécessaire de pratiquer un second test.

4. Test d’immunofluorescence

Principe

Compte tenu de sa capacité reconnue à atteindre les seuils requis, il est recommandé d’utiliser le test

d’immunofluorescence comme principal test de dépistage.

Si le test d’immunofluorescence est utilisé comme principal test de dépistage et qu’il produit un résultat positif,

il y a lieu de pratiquer un test PCR ou FISH à titre de test secondaire. Si le test d’immunofluorescence est utilisé

comme test secondaire et qu’il produit un résultat positif, l’analyse doit être complétée par des tests

supplémentaires comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

Nota bene: toujours utiliser un anticorps polyclonal lorsque le test d’immunofluorescence est utilisé comme test principal.

Lorsqu’un test d’immunofluorescence réalisé avec un anticorps polyclonal produit un résultat positif, un test supplémentaire

de l’échantillon avec un anticorps monoclonal peut permettre de gagner en spécificité, mais aussi se révéler moins sensible.

Il convient d’utiliser les anticorps d’une souche de référence de C. m. ssp. sepedonicus. Il est recommandé de déterminer

le titre pour chaque nouveau lot d’anticorps. Le titre est défini comme la plus haute dilution à laquelle on obtient une

réaction optimale lorsqu’on teste une suspension contenant entre 105 et 106 cellules par millilitre d’une souche homologue

de C. m. ssp. sepedonicus en utilisant un conjugué approprié d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), conformément aux

recommandations du fabricant. La solution brute d’anticorps polyclonaux ou monoclonaux doit présenter un titre

d’immunofluorescence d’au moins 1: 2000. Lors du test, la/les dilution(s) de travail des anticorps doivent être

approximativement égales à la moitié du titre. Utiliser des anticorps validés (voir site web à l’adresse

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Le test doit être effectué sur des extraits d’échantillon fraîchement préparés. Le cas échéant, il peut être pratiqué avec

succès sur des extraits conservés en solution de glycérol à une température de -68 °C à -86 °C. Le glycérol peut être

séparé de l’échantillon par l’ajout d’un ml de tampon d’extrait concentré (voir l’appendice 4), centrifugation pendant

15 minutes à 7 000 g et resuspension dans le même volume de tampon d’extrait concentré. Cela est rarement nécessaire,

particulièrement lorsque l’échantillon est fixé à la lame par flambage (voir le point 2.2).

Préparer des lames témoins positives distinctes d’une souche homologue ou de toute autre souche de référence

de C. m. ssp. sepedonicus, dans une suspension d’extrait de pomme de terre, comme indiqué dans l’appendice 2

et, éventuellement, dans une solution tampon.

Du tissu infecté naturellement (conservé par lyophilisation ou congélation entre -16 °C et -24 °C) devrait, dans

la mesure du possible, être utilisé à titre de témoin similaire sur la même lame.

A titre de témoins négatifs, utiliser des aliquotes d’extrait d’échantillon ayant préalablement produit un résultat

négatif lors de tests.

Utiliser des lames multipuits de microscope dotées de préférence de 10 fenêtres d’au moins 6 mm de diamètre.

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

4.1

Préparer les lames en utilisant l’une des méthodes suivantes

i)

Extraits finaux contenant relativement peu d’amidon

Déposer à la pipette sur la première fenêtre un volume standard (15 μl conviennent pour un

diamètre de fenêtre de 6 mm; choisir une quantité plus importante pour les fenêtres de plus grand

diamètre) d’une solution au 1/100e de l’extrait concentré de pomme de terre remis en suspension.

Ensuite, déposer à la pipette un volume similaire d’extrait concentré non dilué (1/1) sur les fenêtres

restantes de la rangée. La rangée suivante peut faire office de double ou servir à un deuxième

échantillon, comme indiqué à la figure 1.

ii)

Autres extraits

Préparer des dilutions décimales (au 1/10e, au 1/100e et au 1/1000e) de l’extrait concentré remis en

suspension dans la solution tampon. Déposer à la pipette sur une rangée de fenêtres un volume

standard (15 μl conviennent pour un diamètre de fenêtre de 6 mm; choisir une quantité plus

importante pour les fenêtres de plus grand diamètre) de la suspension d’extrait pur et de chaque

dilution. La rangée suivante peut faire office de double ou servir à un deuxième échantillon, comme

indiqué à la figure 2.

4.2

Faire sécher les gouttes à température ambiante ou par chauffage à des températures comprises entre

40 °C et 45 °C. Fixer les cellules bactériennes sur la lame par chauffage (15 minutes à 60 °C), par flambage,

à l’aide d’éthanol à 95° ou suivant les instructions spécifiques des fournisseurs des anticorps.

En cas de besoin, des lames fixées peuvent alors être réfrigérées et entreposées dans une boîte à

dessiccation, pour la plus courte durée possible (jusqu’à un maximum de 3 mois) avant un nouveau test.

4.3

Procédure du test d’immunofluorescence

i)

Conformément à la méthode de préparation des lames de test indiquée au point 4.1.i)

préparer une série de dilutions au demi de l’anticorps dans un tampon d’immunofluorescence. Le

premier puits doit recevoir 1/2 du titre (T/2), les autres 1/4 du titre (T/4), 1/2 du titre (T/2), le titre

(T) et deux fois le titre (2T);

ii)

Conformément à la méthode de préparation des lames de test indiquée au point 4.1.ii)

préparer la dilution de travail de l’anticorps dans un tampon d’immunofluorescence. La dilution de

travail a un effet sur la spécificité.

Figure 1. Préparation de la lame de test conformément aux points 4.1 i) et 4.3 i)

Figure 2. Préparation de la lame de test conformément aux points 4.1 ii) et 4.3 ii)

4.3.1

Disposer les lames sur du papier humide. Couvrir complètement chaque fenêtre de test avec une

ou plusieurs dilutions d’anticorps. Le volume d’anticorps appliqué sur chaque fenêtre doit être au

moins équivalent au volume d’extrait appliqué.

En l’absence d’instructions spécifiques des fournisseurs des anticorps, appliquer la procédure

suivante

4.3.2

faire incuber les lames sur du papier humide et sous cloche pendant 30 minutes, à température

ambiante (18 à 25 ºC);

Dilution de travail de l’antisérum/anticorps

1/1

1/10

1/100

vide

vide

Dilution au dixième

d’extrait concentré

remis en

suspension

Echantillon 1 •1 •2 •3 •4 •5

Double de

l’échantillon 1

ou de

l’échantillon 2 •6 •7 •8 •9 •10

Dilution

de

l’extrait

concentré

remis

en

suspension

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1

Dilution

d’extrait

concentré remis en

suspension

(T = titre)

T/2

T/4

T/2

T

2T

Dilution au demi de

l’antisérum/anticor

ps

Echantillon 1 •1 •2 •3 •4 •5

Double de

l’échantillon 1

ou de

l’échantillon 2 •6 •7 •8 •9 •10

4.3.3

éliminer les gouttelettes de chaque lame et rincer soigneusement dans une solution tampon pour

immunofluorescence. Laver par immersion pendant cinq minutes dans une solution tampon IF-

Tween (voir l’appendice 3) puis encore cinq minutes dans une solution tampon IF. Eviter toute

vaporisation ou débordement qui pourrait entraîner une contamination croisée. Eliminer

précautionneusement au buvard l’humidité excédentaire;

4.3.4

disposer les lames sur du papier humide. Couvrir les fenêtres de test avec du conjugué FITC à la

dilution utilisée lors du titrage. Le volume de conjugué appliqué sur les fenêtres doit être identique

au volume d’anticorps utilisé;

4.3.5

faire incuber les lames sur du papier humide et sous cloche pendant 30 minutes, à température

ambiante (18 à 25 ºC);

4.3.6

éliminer de la lame les gouttes de conjugué. Rincer et laver comme indiqué ci-dessus (point 4.3.3).

Eliminer avec soin l’humidité excédentaire.

4.3.7

dans chaque fenêtre, déposer à la pipette 5 à 10 μl d’une solution de glycérol tamponnée au

phosphate à 0,1 M (voir l’appendice 3) ou un support antidécoloration du commerce, puis couvrir

d’une lamelle.

4.4

Lecture du test d’immunofluorescence

4.4.1

Examiner les lames de test à l’aide d’un microscope à épifluorescence et de filtres adaptés à

l’excitation de l’isothiocyanate de fluorescéine, en immersion dans l’huile ou dans l’eau et avec un

grossissement de 500 à 1 000. Examiner les fenêtres selon deux diamètres perpendiculaires et en

en suivant le pourtour. Pour les échantillons ne présentant pas de cellules ou n’en présentant qu’un

faible nombre, observer au moins 40 champs microscopiques.

Commencer par contrôler la lame du témoin positif. Les cellules doivent présenter une fluorescence

vive et être complètement colorées au titre d’anticorps ou de dilution de travail déterminés. En cas

de coloration aberrante, le test IF (section 4) doit être réitéré.

4.4.2

Rechercher dans les fenêtres des lames de test la présence de cellules présentant une fluorescence

vive et une morphologie caractéristique de C. m. ssp. sepedonicus (voir site web à l’adresse

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensité de la fluorescence doit être

équivalente à celle de la souche témoin positive pour une dilution d’anticorps identique. Les cellules

dont la coloration est incomplète ou qui présentent une faible fluorescence ne doivent pas être

prises en considération.

Au moindre soupçon de contamination, le test doit être recommencé. Cela peut être le cas si toutes

les lames d’un lot montrent des cellules positives en raison de la contamination du tampon ou si des

cellules positives sont isolées (hors des fenêtres) sur le milieu de montage de la lame.

4.4.3

II existe un certain nombre de problèmes inhérents à la spécificité du test d’immunofluorescence.

Des populations indésirables de cellules fluorescentes morphologiquement atypiques et de bactéries

saprophytes provoquant des réactions croisées qui présentent une taille et une morphologie

similaires à C. m. sepedonicus risquent fort d’apparaître dans les extraits de cônes de talons et de

segments de tiges de pommes de terre.

4.4.4

Seules les cellules fluorescentes présentant une taille et une morphologie caractéristiques au titre

ou à la dilution de travail des anticorps visés au point 4.3 doivent être prises en considération.

4.4.5

Interprétation du test d’immunofluorescence

i)

Si l’échantillon contient des cellules présentant une fluorescence vive et une morphologie

caractéristique, évaluer le nombre moyen de cellules caractéristiques par champ

microscopique et calculer le nombre de ces cellules par millilitre d’extrait concentré remis en

suspension (voir l’appendice 4).

La lecture du test d’immunofluorescence est considérée comme positive lorsque l’échantillon

contient au moins 5 x 103 cellules caractéristiques par millilitre d’extrait concentré remis en

suspension. L’échantillon est alors considéré comme potentiellement contaminé et il y a lieu

de poursuivre les tests.

ii)

La lecture du test d’immunofluorescence est considérée comme négative si l’échantillon

contient moins de 5 x 103 cellules par millilitre d’extrait concentré remis en suspension et

l’échantillon est considéré comme non contaminé. Il n’est pas utile de poursuivre les tests.

5. TEST FISH

Principe

Si le test FISH est utilisé comme test de dépistage initial et qu’il produit un résultat positif, il y a lieu de pratiquer

un test d’immunofluorescence à titre de deuxième test de dépistage obligatoire. Si le test FISH est utilisé comme

test secondaire et qu’il produit un résultat positif, le diagnostic doit être complété par des tests supplémentaires

comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

Nota bene: utiliser des oligo-sondes validées spécifiques de C. m. ssp. sepedonicus (voir l’appendice 7). Les tests

préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre la détection reproductible d’au moins 103 à 104 cellules/ml

de C. m. ssp. sepedonicus ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné antérieurement des résultats négatifs.

Il est préférable d’appliquer la procédure décrite ci-après à des extraits d’échantillon fraîchement préparés, mais

elle peut également fonctionner avec des extraits d’échantillon conservés en solution de glycérol à des

températures de -16 °C à -24 °C ou de -68 °C à -86 °C.

A titre de témoins négatifs, utiliser des aliquotes d’extrait d’échantillon ayant préalablement produit un résultat

négatif lors de tests de recherche de C. m. ssp. sepedonicus.

A titre de témoins positifs, préparer des suspensions contenant entre 105 et 106 cellules/ml de C. m. ssp.

sepedonicus (souches NCPPB 4053 ou PD 406, par exemple) dans une solution tampon phosphatée à 0,01 M, à

partir d’une culture de trois à cinq jours (voir l’appendice 2 pour la préparation). Préparer des lames témoins

positives distinctes de la souche homologue ou de toute autre souche de référence de C. m. ssp. sepedonicus, dans

une suspension d’extrait de pomme de terre, comme indiqué dans l’appendice 2.

L’utilisation d’une oligo-sonde eubactérienne marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) permet de

contrôler le processus d’hybridation en colorant toutes les eubactéries présentes dans l’échantillon.

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

5.1

Fixation de l’extrait de pomme de terre

Le protocole exposé ci-après est basé sur Wullings et al., (1998).

5.1.1

Préparer la solution de fixation (voir l’appendice 7).

5.1.2

Introduire à la pipette 100 μl de chaque extrait dans un tube Eppendorf et centrifuger pendant 8

minutes à 7000 g.

5.1.3

Eliminer le liquide surnageant et dissoudre l’extrait concentré dans 500 μl de fixatif préparé moins

de 24 heures auparavant. Passer au vortex et laisser incuber toute la nuit à 4 °C.

On peut également utiliser de l’éthanol à 96 % comme fixatif. Dans ce cas, dissoudre l’extrait concentré visé

au point 5.1.2 dans un mélange constitué de 50 μl de tampon phosphaté à 0,01 M et de 50 μl d’éthanol

à 96 %. Mélanger au vortex et laisser incuber à 4 °C pendant 30 à 60 minutes.

5.1.4

Centrifuger pendant 8 minutes à 7000 g, éliminer le liquide surnageant et remettre l’extrait

concentré en suspension dans 75 μl de tampon phosphaté à 0,01 M.

5.1.5

Déposer 16 μl des suspensions fixées sur une lame multitest comme indiqué à la figure 3. Sur chaque

lame, appliquer deux échantillons différents, non dilués, et en diluer 10 μl à 1:100 (dans un tampon

phosphaté à 0,01 M). Le reste de la solution d’échantillon (49 μl) peut être conservé à -20 °C après

addition d’un volume d’éthanol à 96 %. S’il y a lieu de réitérer le test FISH, éliminer l’éthanol par

centrifugation et le remplacer par un volume équivalent de tampon phosphaté à 0,01 M

(homogénéiser au vortex).

Figure 3 – Disposition d’une lame pour test FISH

5.1.6

Sécher les lames à l’air (ou dans un séchoir, à 37 °C), puis les fixer par flambage.

Il est possible d’interrompre la procédure à ce stade et d’entamer l’hybridation le lendemain. Les

lames doivent être entreposées à l’abri de la poussière, dans un lieu sec et à température ambiante.

5.2

Préhybridation et hybridation

5.2.1

Préparer une solution de lysozyme à raison de 10 mg de lysozyme (Sigma L-6876) pour 10 ml de

tampon (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Cette solution peut être conservée, mais ne doit

être congelée et dégelée qu’une fois. Couvrir intégralement chaque échantillon d’environ 50 μl de

solution de lysozyme et laisser incuber 10 minutes à température ambiante, puis plonger une seule

fois les lames dans de l’eau déminéralisée et les sécher au papier filtre.

Autre possibilité: dans chaque puits, en remplacement du lysozyme, ajouter au tampon (2 mM Tris-HCl, 2

mM CaCl2, pH 7,4) 50 μl de protéinase K à 40-400 μg/ml, puis laisser incuber à 37 °C pendant 30

minutes.

Echantillon

{

fenêtre 1

Témoin

fenêtre 2

Témoin

{

fenêtre 3

Témoin

fenêtre 4

Echantillon

{

fenêtre 5

Echantillon

{

fenêtre 6

Témoin

fenêtre 7

Témoin

{

fenêtre 8

Témoin

fenêtre 9

Echantillon

{

fenêtre 10

Lamelle 1

Lamelle 2

{

{

{

{

5.2.2

Déshydrater les cellules par bains successifs d’éthanol à 50 %, 80 % et 96 % d’une minute chacun.

Disposer les lames sur un support et les laisser sécher à l’air libre.

5.2.3

Préparer une chambre d’incubation humide en tapissant le fond d’une boîte hermétique de papier

absorbant ou de papier filtre imprégné d’hybmix 1x (voir l’appendice 7). Faire préincuber la boîte

pendant au moins 10 minutes dans le four à hybridation, à une température de 55 °C.

5.2.4

Préparer la solution d’hybridation (voir l’appendice 7) à raison de 45 μl par lame, puis faire

préincuber pendant cinq minutes à 55 °C.

5.2.5

Disposer les lames sur une plaque chauffante à 45 °C et verser 10 μl de solution d’hybridation dans

chacun des quatre puits de chaque lame.

5.2.6

Couvrir chaque lame de deux lamelles (24 x 24 mm) en ayant soin de ne pas emprisonner d’air, puis

placer les lames dans la chambre d’hybridation humide préchauffée et les y laisser une nuit, dans

l’obscurité et à une température de 55 °C, pour permettre le déroulement de l’hybridation.

5.2.7

Préparer trois béchers contenant 1 l d’eau ultrapure, 1 l d’hybmix 1x (334 ml d’hybmix 3x et 666

ml d’eau ultrapure) et 1 l d’hybmix 1/2x (167 ml d’hybmix 3x et 833 ml d’eau ultrapure).

Faire préincuber chacun de ces béchers au bain-marie, à 55 °C.

5.2.8

Débarrasser les lames des lamelles et les placer sur un support.

5.2.9

Eliminer l’excédent de sonde en procédant par incubation pendant 15 mn à 55 °C dans le bécher

contenant l’hybmix 1x.

5.2.10 Transférer le support à lames dans une solution de lavage à l’hybmix 1/2 et laisser incuber pendant

15 mn supplémentaires.

5.2.11 Plonger brièvement les lames dans un bain d’eau ultrapure et sécher au papier filtre. Eliminer

l’humidité excédentaire en disposant doucement du papier filtre sur la surface à sécher.

Verser à la pipette dans chaque fenêtre entre 5 et 10 μl de solution support anti-décoloration (par

exemple, Vectashield de Vecta Laboratories, CA, USA ou équivalente) et couvrir toute la surface de

la lame d’une grande lamelle (24 x 60 mm).

5.3

Lecture du test FISH

5.3.1

Procéder immédiatement à l’observation des lames au moyen d’un microscope à épifluorescence,

sous un film d’huile et à un grossissement de 630 à 1 000 x. Avec un filtre adapté à l’isothiocyanate

de fluorescéine (FITC), les cellules eubactériennes (y compris la plupart des cellules gram-négatives)

présentes dans l’échantillon prennent une coloration verte fluorescente. Avec un filtre adapté à la

tétramethylrhodamine-5-isothiocyanate, les cellules de C. m. ssp. sepedonicus marquées au Cy3

apparaissent en rouge fluorescent. Comparer la morphologie des cellules avec celle des témoins

positifs. Les cellules doivent être entièrement colorées et présenter une fluorescence vive. En cas

de coloration aberrante, le test FISH (section 9,4) doit être réitéré. Examiner les fenêtres selon

deux diamètres perpendiculaires et en en suivant le pourtour. Pour les échantillons ne présentant

pas ou ne présentant qu’un faible nombre de cellules, observer au moins 40 champs microscopiques.

5.3.2

Rechercher dans les fenêtres des lames de test la présence de cellules présentant une fluorescence

vive et une morphologie caractéristique de C. m. ssp. sepedonicus (voir site web à l’adresse

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensité de la fluorescence doit être

équivalente ou supérieure à celle de la souche témoin positive. Les cellules dont la coloration est

incomplète ou qui présentent une faible fluorescence ne doivent pas être prises en considération.

5.3.3

Au moindre soupçon de contamination, le test doit être recommencé. Cela peut être le cas si toutes

les lames d’un lot montrent des cellules positives en raison de la contamination du tampon ou si des

cellules positives sont isolées (hors des fenêtres) sur le milieu de montage de la lame.

5.3.4

II existe un certain nombre de problèmes inhérents à la spécificité du test FISH. Des populations

indésirables de cellules fluorescentes morphologiquement atypiques et de bactéries saprophytes

provoquant des réactions croisées qui présentent une taille et une morphologie similaires à C. m.

ssp. sepedonicus sont susceptibles d’apparaître dans les extraits de cônes de talons et de segments

de tiges de pommes de terre. Ce phénomène est toutefois beaucoup moins fréquent que dans le

cas du test d’immunofluorescence.

5.3.5

Seules les cellules fluorescentes présentant une taille et une morphologie caractéristiques doivent

être prises en considération

(voir le point 5.3.2).

5.3.6

Interprétation du résultat du test FISH

i)

Les résultats du test FISH sont valides lorsqu’on observe des cellules présentant une

fluorescence vive de couleur verte ainsi qu’une taille et une morphologie caractéristiques de

C. m. ssp. sepedonicus en utilisant le filtre FITC et des cellules présentant une fluorescence vive

de couleur rouge en utilisant le filtre rhodamine dans tous les témoins positifs mais dans aucun

témoin négatif. Si l’échantillon contient des cellules présentant une fluorescence vive et une

morphologie caractéristique, évaluer le nombre moyen de cellules caractéristiques par champ

microscopique et calculer le nombre de ces cellules par millilitre d’extrait concentré remis en

suspension (voir l’appendice 4). Les échantillons contenant au moins 5 x 103 cellules

caractéristiques par millilitre d’extrait concentré remis en suspension sont considérés comme

potentiellement contaminés. Il y a lieu de poursuivre les tests. Les échantillons contenant moins

de 5 x 103 cellules caractéristiques par millilitre d’extrait concentré remis en suspension sont

considérés comme négatifs.

ii)

Le test FISH est négatif si l’on n’observe pas, en utilisant le filtre rhodamine, de cellules de la

taille et de la morphologie caractéristiques de C. m. ssp. sepedonicus qui présentent une

fluorescence vive de couleur rouge, pour autant que des cellules caractéristiques présentant

une fluorescence vive de couleur rouge soient observées avec le filtre rhodamine dans les

préparations de témoins positifs.

6. TEST PCR

Principes

Si le test PCR est utilisé comme principal test de dépistage et qu’il produit un résultat positif, il y a lieu de

pratiquer un test d’immunofluorescence à titre de second test de dépistage obligatoire. Si le test PCR est utilisé

comme test secondaire et qu’il produit un résultat positif, le diagnostic doit être complété par des tests

supplémentaires comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

L’exploitation complète de cette méthode en tant que test de dépistage principal n’est recommandée que

lorsqu’une expertise spécialisée a été acquise en la matière.

Nota bene: les tests préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre la détection reproductible de 103 à

104 cellules/ml de C. m. ssp. sepedonicus ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné antérieurement des résultats

négatifs. Des expériences d’optimisation peuvent se révéler nécessaires pour obtenir des niveaux maxima de sensibilité et

de spécificité dans tous les laboratoires.

Utiliser des réactifs et des protocoles PCR validés. Sélectionner de préférence une méthode avec contrôle interne.

Prendre les précautions nécessaires pour éviter la contamination de l’échantillon par de l’ADN cible. Afin de réduire autant

que possible la possibilité de contamination par de l’ADN cible, il conviendrait que le test PCR soit réalisé par des

techniciens expérimentés, dans des laboratoires de biologie moléculaire spécialisés.

Les témoins négatifs (en ce qui concerne les procédures de PCR et d’extraction d’ADN) doivent toujours être

traités comme échantillons finaux dans la procédure, afin de faire apparaître si un transfert d’ADN est intervenu.

Il convient d’inclure les témoins négatifs suivants dans le test PCR

extrait d’échantillon ayant produit précédemment des résultats négatifs pour C. m. ssp. sepedonicus,

tampons témoins utilisés pour extraire la bactérie et l’ADN de l’échantillon,

mélange réactif destiné au PCR.

De même, il convient d’y inclure les témoins positifs suivants

aliquotes d’extraits finaux remis en suspension après ajout de C. m. ssp. sepedonicus (voir l’appendice 2 pour

la préparation),

suspension en milieu aqueux de 106 cellules par millilitre d’un isolat virulent de C. m. ssp. sepedonicus (par

exemple: NCPPB 2140 ou NCPPB 4053),

utilisation également, si possible, d’ADN extrait d’échantillons témoins positifs lors du test PCR.

Pour éviter les risques de contamination, préparer les témoins positifs dans un environnement

distinct de celui des échantillons à tester.

Autant que possible, les extraits d’échantillons doivent être exempts de terre. Dans certains cas, il pourrait donc

être recommandable de préparer des extractions de pommes de terre lavées s’il est prévu d’utiliser des

protocoles PCR.

6.1

Méthodes de purification de l’ADN

Utiliser des échantillons témoins positifs et négatifs selon la méthode décrite ci-dessus.

Préparer le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

Il existe toute une série de méthodes pour la purification de l’ADN cible dans le cas de substrats

d’échantillons complexes, en vue d’éliminer les inhibiteurs de la PCR et d’autres réactions enzymatiques et

de concentrer l’ADN cible dans l’extrait d’échantillon.

La méthode suivante a été optimisée pour une utilisation avec la méthode PCR validée décrite à l’appendice 6.

6.1. a) Méthode de Pastrik (2000)

1.

Déposer à la pipette 220 μl de tampon lyse (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM

EDTA [pH 8,0]) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.

2.

Ajouter 100 μl d’extrait d’échantillon et le placer dans un bloc chauffant ou un bain-marie à

95 °C pendant dix minutes.

3.

Déposer le tube sur de la glace pendant cinq minutes.

4.

Ajouter 80 μl de solution concentrée de lysozyme (50 mg de lysozyme par millilitre dans 10

mM Tris HCl, pH 8,0) et laisser incuber à 37 °C pendant 30 minutes.

5.

Ajouter 220 μl d’Easy DNA® solution A (Invitrogen), bien homogénéiser au vortex et laisser

incuber à 65 °C pendant 30 minutes.

6.

Ajouter 100 μl d’Easy DNA® solution B (Invitrogen), homogénéiser vigoureusement au vortex

jusqu’à ce que le précipité circule librement dans le tube et que l’échantillon présente une

viscosité uniforme.

7.

Ajouter 500 μl de chloroforme et homogénéiser au vortex jusqu’à ce que la viscosité diminue

et que le mélange soit homogène.

8.

Centrifuger à 15 000 g pendant 20 minutes à 4 °C pour séparer les phases et former

l’interphase.

9.

Verser la phase supérieure dans un nouveau tube Eppendorf.

10.

Ajouter 1 millilitre d’éthanol à 100 % (-20 °C), homogénéiser brièvement au vortex et laisser

incuber sur de la glace pendant 10 minutes.

11.

Centrifuger à 15 000 g pendant 20 minutes à 4 °C et éliminer l’éthanol de l’extrait concentré.

12.

Ajouter 500 μl d’éthanol à 80 % (-20 °C) et mélanger en retournant le tube.

13.

Centrifuger à 15 000 g pendant 10 minutes à 4 °C, conserver l’extrait concentré et éliminer

l’éthanol.

14.

Laisser sécher l’extrait à l’air libre ou dans un DNA Speed Vac.

15.

Remettre en suspension l’extrait concentré dans 100 μl d’eau ultrapure stérile et le laisser à

température ambiante pendant au moins 20 minutes.

16.

Le conserver à -20 °C jusqu’au moment de l’utiliser pour la PCR.

17.

Isoler tout précipité blanc par centrifugation et utiliser 5 μl du liquide surnageant contenant

l’ADN pour la PCR.

6.1. b)Autres méthodes

D’autres méthodes d’extraction de l’ADN (Qiagen DNeasy Plant Kit, par exemple) peuvent être

appliquées, à condition qu’elles soient d’une efficacité reconnue comme équivalente pour la

purification d’ADN issu d’échantillons témoins contenant entre 103 et 104 cellules d’agent pathogène

par millilitre.

6.2

PCR

6.2.1

Préparer les matrices de test et de contrôle pour la PCR suivant les protocoles validés (voir

l’appendice 6). Préparer une dilution décimale de l’extrait d’ADN issu de l’échantillon (1:10 dans de

l’eau ultrapure).

6.2.2

Préparer le mélange réactif destiné à la PCR dans un environnement exempt de toute contamination

suivant les protocoles publiés (voir l’appendice 6). Le protocole PCR validé est une réaction

multiplex qui intègre également un contrôle PCR interne.

6.2.3

Ajouter 5 μl d’extrait d’ADN à 25 μl de réactif PCR dans des tubes PCR stériles.

6.2.4

Constituer un échantillon témoin négatif ne contenant que le mélange réactif destiné à la PCR et

ajouter à la place de l’échantillon une eau ultrapure de même provenance que celle utilisée dans le

mélange PCR.

6.2.5

Placer les tubes dans le même cycleur thermique que celui utilisé lors du test préliminaire et lancer

le programme PCR optimisé comme il convient (voir l’appendice 6).

6.3

Analyse du produit de la réaction PCR

6.3.1

Décoder les amplimères PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Soumettre à une tension de 5

à 8 V/cm une quantité d’au moins 12 μl de mélange réactif d’ADN amplifié provenant de chaque

échantillon, associé à 3 μl de tampon de lest (appendice 6) sur des gels d’agarose à 2,0 % dans un

tampon d’EDTA (TAE) tris-acétate (appendice 6). Utiliser un marqueur d’ADN approprié, comme

le «100 bp ladder».

6.3.2

Pour révéler les bandes d’ADN, utiliser la coloration au bromure d’éthidium (à 0,5 mg/l) pendant

une période 30 à 45 minutes, en prenant les précautions qui s’imposent pour la manipulation

de cet agent mutagène.

6.3.3

Dans le cas des produits PCR présentant la taille attendue (appendice 6), visualiser le gel coloré par

diaphanoscopie sous UV ondes courtes (par exemple, λ = 302 nm) et noter les résultats.

6.3.4

Pour tous les nouveaux cas/résultats, vérifier l’authenticité de l’amplimère en pratiquant une analyse

de restriction enzymatique sur un échantillon de l’ADN amplifié restant. A cet effet, faire incuber à

température optimale sur une durée optimale, en employant un enzyme et un tampon appropriés

(voir l’appendice 6). Décoder les fragments digérés par électrophorèse sur gel d’agarose selon la

méthode indiquée plus haut et visualiser par diaphanoscopie sous UV la disposition caractéristique

des fragments après restriction enzymatique et coloration au bromure d’éthydium. Comparer

ensuite avec les témoins positifs pré et post-digestion.

Interprétation du résultat du test PCR

Le test PCR est négatif si l’on met en évidence l’amplimère PCR spécifique de C. m. ssp. sepedonicus de la

taille attendue pour l’ensemble des échantillons témoins positifs, mais pas pour l’échantillon concerné (dans

le cas d’un PCR multiplex avec amorces de contrôle interne spécifiques à la plante, un second produit PCR

de la taille attendue doit être amplifié avec l’échantillon concerné).

Le test PCR est positif si l’on met en évidence l’amplimère PCR spécifique de C. m. ssp. sepedonicus,

présentant la taille et (au besoin) la disposition post-restriction attendues, à condition qu’il ne soit pas

amplifié par l’un des échantillons témoins négatifs. On peut également confirmer avec fiabilité un résultat

positif en recommençant le test avec une deuxième série d’amorces PCR (voir la section 9.3).

Nota bene: on peut suspecter une inhibition du PCR si l’amplimère attendu est obtenu à partir de l’échantillon

témoin positif contenant C. m. ssp. sepedonicus en solution aqueuse alors que les témoins positifs contenant

C. m. ssp. sepedonicus dans de l’extrait de pomme de terre produisent un résultat négatif. Dans les protocoles PCR

multiplex avec contrôles PCR internes, l’inhibition de la réaction est probable quand on n’obtient aucun des deux

amplimères.

On peut suspecter une contamination si l’amplimère attendu est mis en évidence dans un au moins des

témoins négatifs.

7. TEST BIOLOGIQUE

Nota bene: les tests préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre la détection reproductible de 103 à

104 cellules/ml de C. m. ssp. sepedonicus formant des colonies, ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné

antérieurement des résultats négatifs (pour la préparation, voir l’appendice 2).

Pour obtenir le plus haut degré de sensibilité de détection, il est préférable d’utiliser un extrait d’échantillon

fraîchement préparé, dans des conditions de croissance optimales. Toutefois la méthode peut être appliquée avec

succès à des extraits conservés en solution de glycérol entre -68 °C et -86 °C.

Certaines variétés d’aubergine constituent un excellent milieu d’enrichissement sélectif pour la culture de

C. m. ssp. sepedonicus, même en l’absence de symptômes, et permettent également de réaliser un excellent test

de confirmation sur hôte.

Pour réduire le risque d’obtenir des résultats faussement négatifs, les conditions de croissance doivent être

optimales.

Pour les détails de la culture, voir l’appendice 8.

7.1

Répartir sur des aubergines, selon l’une des méthodes indiquées plus bas (points 7.3 ou 7.4), la totalité du

reste de l’aliquote de test d’extrait concentré remis en suspension obtenu comme indiqué aux sections

3.1.6 ou 3.2.5. Utiliser uniquement des plants au stade de la deuxième ou de la troisième feuille, jusqu’au

développement complet de la troisième vraie feuille. Pour utiliser intégralement l’extrait concentré remis

en suspension et assurer l’efficacité de l’inoculation, l’exécution des procédures décrites ci-après requiert

entre 15 et 25 aubergines par échantillon.

7.2

Avant l’inoculation, ne pas arroser les aubergines pendant une ou deux journées afin de réduire la pression

de turgescence.

7.3

Inoculation par incision

7.3.1

Tenir le plant entre deux doigts et déposer à la pipette sur la tige, entre les cotylédons et la

première feuille, une goutte (environ 5 à 10 μl) d’extrait concentré en suspension.

7.3.2

A l’aide d’un scalpel stérile, pratiquer, en partant de la goutte d’extrait concentré, une incision

diagonale d’une longueur de 1,0 cm et d’une profondeur égale approximativement aux deux tiers de

l’épaisseur de la tige.

7.3.3

Refermer l’incision avec de la vaseline stérile au moyen d’une seringue.

7.4

Inoculation par injection

7.4.1

A l’aide d’une seringue munie d’une aiguille hypodermique (pas moins de 23 G), pratiquer

l’inoculation dans les tiges d’aubergine juste au-dessus des cotylédons. Répartir l’échantillon entre

les aubergines.

7.5

A titre de témoins positifs, inoculer cinq plants par la même méthode (voir les points 7.3 ou 7.4) avec une

suspension aqueuse contenant entre 105 et 106 cellules/ml d’une culture connue de C. m. ssp. sepedonicus,

et, si possible, avec de l’extrait de tubercule naturellement infecté (voir la section 4).

7.6

A titre de témoins négatifs, inoculer cinq plants par la même méthode (voir les points 7.3 ou 7.4) avec une

solution tampon stérile d’extrait concentré.

7.7

Laisser incuber les plants jusqu’à quatre semaines entre 18 °C et 24 °C dans des locaux adaptés aux

conditions de quarantaine. Pendant l’incubation, maintenir une lumière suffisante et un degré élevé

d’humidité (de 70 % à 80 %), en assurant un arrosage approprié pour prévenir tout engorgement hydrique

ou flétrissement de sécheresse. Les cellules de C. m. sepedonicus ne résistent pas à des températures

supérieures à 30 °C; leur température idéale de culture se situe à 21 °C. Pour éviter les risques de

contamination, faire incuber les témoins positifs et négatifs en serre ou phytotron sur des étagères

nettement séparées ou, si la place est limitée, prévoir un compartimentage rigoureux. Si des plants

correspondant à des échantillons différents doivent incuber à proximité les uns des autres, les séparer à

l’aide d’écrans appropriés. Prendre grand soin d’éviter toute contamination croisée lors de la fertilisation,

de l’arrosage, des inspections et de toute autre manipulation. Il est essentiel d’éviter toute présence

d’insectes dans les serres ou les phytotrons, car ils sont susceptibles de disséminer la bactérie d’un

échantillon à l’autre.

7.8

Au bout d’une semaine, examiner régulièrement les plants pour y déceler l’apparition de symptômes.

Dénombrer les plants présentant des symptômes. Le C. m. ssp. sepedonicus provoque chez l’aubergine un

flétrissement des feuilles qui peut se manifester en premier lieu par une flaccidité sur les bords ou entre

les nervures. Au départ, le tissu flétri peut prendre une couleur vert foncé ou un aspect tacheté, mais il

pâlit avant de se nécroser. Les flétrissures entre les nervures présentent souvent l’aspect graisseux de tissus

gorgés d’eau. Le tissu nécrosé présente souvent un bord jaune vif. Les plants ne meurent pas

nécessairement. Plus les symptômes tardent à apparaître, plus les chances de survie sont élevées. Les plants

peuvent surmonter l’infection. Les jeunes aubergines sont considérablement plus sensibles à de faibles

populations de C. m. ssp. sepedonicus que les plants plus âgés, d’où la nécessité d’utiliser des plants au stade

de la troisième feuille ou juste avant.

Des flétrissements peuvent également être provoqués par des populations d’autres bactéries ou de

champignons présentes dans l’extrait concentré de tissu tuberculaire. Il s’agit entre autres de Ralstonia

solanacearum, d’Erwinia carotovora ssp. carotovora et d’E. carotovora ssp. atroseptica, d’Erwinia chrysanthemi, de

Phoma exigua var. foveata, ainsi que de vastes populations de bactéries saprophytes. Erwinia chrysanthemi, en

particulier, peut induire au niveau des feuilles des symptômes et un flétrissement très semblables aux

symptômes de C. m. sepedonicus, à cette seule différence près que les infections à Erwinia chrysanthemi

provoquent un noircissement des tiges. D’autres types de flétrissements se distinguent de ceux causés par

C. m. ssp. sepedonicus par le fait que des feuilles ou des plants entiers fanent rapidement. Il est également

possible de recourir à une coloration de Gram pour distinguer C. m. ssp. sepedonicus d’Erwinia spp.

7.9

Dès l’apparition de symptômes sur les aubergines, il y a lieu de procéder à de nouvelles opérations

d’isolement à partir de segments de tissu provenant des feuilles flétries ou de la tige des plants (pour la

macération des tissus, se reporter au point 3.1.3). Désinfecter la surface des feuilles et des tiges d’aubergine

en les frottant avec de l’éthanol à 70 %. Effectuer un test IF ou PCR sur la sève d’aubergine et procéder à

l’isolement sur un milieu approprié [sélectif] (voir la section 8). Il est aussi possible de préparer une

coloration de Gram (voir l’appendice 9). Identifier les cultures pures d’isolats supposés de C. m. ssp.

sepedonicus et confirmer leur pathogénécité (voir les sections 9 et 10).

7.10 Dans certaines circonstances et en particulier si les conditions de culture ne sont pas optimales, C. m. ssp.

sepedonicus peut être présent dans les aubergines à l’état d’infection latente, même après des périodes

d’incubation allant jusqu’à quatre semaines. Si aucun symptôme n’est observé après quatre semaines,

effectuer un test IF ou PCR sur un échantillon composite de segments de tiges de 1 cm provenant de

chaque plant test, prélevés au-dessus du point d’inoculation. Si le test est positif, pratiquer un nouvel

isolement sur un milieu approprié (sélectif), conformément à la procédure exposée à la section 8. Identifier

les cultures pures d’isolats supposés de C. m. ssp. sepedonicus et confirmer leur pathogénécité (voir les

sections 9 et 10).

Interprétation des résultats du test biologique

Les résultats du test biologique sont valides lorsque les plants constituant le témoin positif présentent des

symptômes caractéristiques, qu’il est possible d’isoler à nouveau les bactéries sur ces plants et qu’aucun

symptôme n’est observé sur les témoins négatifs.

Le test biologique est négatif si les plants tests ne sont pas infectés par C. m. ssp. sepedonicus, sous réserve que

C. m. ssp. sepedonicus soit mis en évidence sur les témoins positifs.

Le test biologique est positif si les plants tests sont infectés par C. m. ssp. sepedonicus.

8. ISOLEMENT DE C. M. SSP. SEPEDONICUS

Nota bene: le diagnostic ne peut être confirmé que par l’isolement et la mise en évidence, de C. m. ssp. sepedonicus (voir

la section 9), suivis d’une validation par un test du pouvoir pathogène (voir la section 10). Bien qu’il s’agisse d’un organisme

difficile à isoler, il est possible de le faire au départ de tissu présentant des symptômes d’infection.

Il peut toutefois se trouver étouffé par des bactéries saprophytes à croissance rapide, ce qui le rend difficile à

isoler directement à partir de l’extrait concentré de tissu de tubercule ou de tige (obtenu aux sections 3.1.6 ou

3.2.5). L’isolement direct de C. m. ssp. sepedonicus reste envisageable sur milieu sélectif et à partir d’une dilution

appropriée d’extrait concentré, remis en suspension, de cônes de pommes de terre prélevés au talon ou de tiges

de pomme de terre.

Les isolements doivent être pratiqués sur tous les tubercules ou segments de tiges de pommes de terre et toutes

les aubergines ne présentant aucun symptôme mais pour lesquels le test IF ou PCR pratiqué sur l’échantillon

composite (voir la section 7.10) a produit un résultat positif. Le cas échéant, les tiges d’aubergines doivent subir

une macération suivant la méthode décrite à la section 3.1.3.

A titre de témoins positifs, préparer des dilutions au dixième d’une suspension de 106 ufc/ml de C. m. ssp.

sepedonicus (par exemple, NCPPB 4053 ou PD 406). Pour éviter toute possibilité de contamination, préparer les

témoins positifs totalement à l’écart des échantillons à tester.

Pour chaque lot nouvellement préparé de milieu sélectif, il importe de vérifier qu’il convient bien pour la culture

de l’agent pathogène avant de l’utiliser pour tester des échantillons de routine.

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

8.1

Etalement sur milieu sélectif

8.1.1

A partir de 100 μl d’une aliquote d’échantillon d’extrait concentré de pomme de terre remis en

suspension ou de sève d’aubergine, effectuer des dilutions au dixième dans un tampon d’extrait

concentré (voir l’appendice 3).

8.1.2

Les tentatives d’isolation à partir d’extrait concentré de pomme de terre non dilué se soldent

généralement par un échec en raison des difficultés que présentent la culture de Cms et de la

concurrence des saprophytes. Etant donné que la bactérie est généralement présente en masse dans

les tissus infectés, il est le plus souvent possible d’évacuer les saprohytes par dilution tout en

conservant l’agent pathogène. Il est donc recommandé de recourir à la technique d’étalement sur

lame et d’étaler, à l’aide d’un applicateur («crosse de hockey»), 100 μl de chaque échantillon, à des

dilutions de 1/100e à 1/10 000e, sur un milieu MTNA ou NCP-88 (voir l’appendice 5).

Nota bene: une autre stratégie peut consister à étaler l’aliquote initiale de 100 μl d’extrait concentré de

pomme de terre sur une première lame gélosée à l’aide d’un applicateur, à étendre en stries sur une

deuxième lame le reliquat resté sur l’applicateur et à procéder de même sur une troisième lame.

L’applicateur permet ainsi d’obtenir sur les lames un effet de dilution.

8.1.3

Faire incuber les lames à l’abri de la lumière et à des températures comprises entre 21 °C et 23 °C.

8.1.4

Un premier examen des lames, avec comptage, par référence aux lames témoins, des éventuelles

colonies d’aspect semblable à C. m. ssp. sepedonicus, doit avoir lieu au bout de trois jours. Les

comptages suivants sont à effectuer au bout de cinq, sept et enfin dix jours.

8.2

Purification des colonies suspectes

Nota bene: il y a lieu de repiquer sur milieu YGM les colonies d’aspect semblable à C. m. ssp. sepedonicus, à des

fins d’inoculation ultérieure d’aubergines et/ou d’identification. Cette opération doit être effectuée avant que les

lames ne connaissent un foisonnement excessif, soit de préférence au bout de trois à cinq jours.

8.2.1

Pratiquer un ensemencement en stries des colonies d’aspect semblable à C. m. ssp. sepedonicus sur

un des milieux suivants (les formules figurent à l’appendice 5)

gélose nutritive avec dextrose (uniquement pour les repiquages),

gélose avec levure, peptone et glucose,

gélose avec extrait de levure et sels minéraux.

Laisser incuber jusqu’à 10 jours à une température comprise entre 21 °C et 24 °C.

C. m. ssp. sepedonicus se multiplie lentement et produit généralement en dix jours des colonies de la taille et de

la forme d’une tête d’épingle, convexes et de couleur crème (des photographies de colonies caractéristiques de

C. m. ssp. sepedonicus sont présentées à l’adresse http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2

Ensemencer à nouveau en stries pour obtenir des cultures pures.

Les taux de croissance sont meilleurs pour les repiquages. Les colonies caractéristiques sont de

couleur crème ou ivoire, parfois jaune, arrondies, lisses, gonflées, convexes et de consistance

mucoïde à fluidale. Elles possèdent des bords bien dessinés et leur diamètre s’étend généralement

de 1 à 3 mm.

Une simple coloration de Gram (voir l’appendice 9) peut aider à sélectionner des colonies en vue

de tests supplémentaires.

8.2.3

Identifier les cultures supposées (voir la section 9) et réaliser un test du pouvoir pathogène (voir la

section 10).

9. IDENTIFICATION

Identifier des cultures pures d’isolats supposés de C. m. ssp. sepedonicus en utilisant au moins deux des tests

suivants, fondés sur des principes biologiques différents.

Le cas échéant, inclure des souches de référence connues pour chaque test effectué.

9.1

Tests d’identification nutritionnels et enzymatiques

Rechercher les caractéristiques phénotypiques ci-après qui sont systématiquement présentes ou absentes

chez C. m. ssp. sepedonicus, suivant les méthodes de Lelliott et Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad

(2001), Anonyme (1987).

Tous les milieux doivent incuber à 21 °C et être examinés au bout de six jours. Si l’on ne constate aucune

multiplication, laisser incuber jusqu’à 20 jours.

Chaque test doit inclure une souche connue de C. m. ssp. sepedonicus à titre de témoin. Les tests

nutritionnels et physiologiques doivent être effectués sur de l’inoculat provenant de repiquages sur gélose

nutritive. Les comparaisons morphologiques doivent se faire à partir de cultures sur gélose nutritive avec

dextrose.

Tests

Résultats attendus

Oxydation/fermentation (O/F)

Inerte ou faiblement oxydant

Oxydase

Croissance à 37 °C

Activité uréasique

Hydrolyse de l’esculine

+

Hydrolyse de l’amidon

– ou faible

Tolérance d’une solution de NaCl à 7 %

Production d’indole

Activité de la catalase

+

Production de H2S

Utilisation du citrate

Liquéfaction de la gélatine

Production d’acide à partir de glycérol

Production d’acide à partir de lactose

– ou faible

Production d’acide à partir de rhamnose

Production d’acide à partir de salicine

Coloration de Gram (voir l’appendice 9)

+

9.2

Test d’immunofluorescence (IF)

a)

Préparer une suspension d’environ 106 cellules par millilitre dans un tampon d’immunofluorescence

(voir l’appendice 3).

b)

Préparer une dilution au demi d’un antisérum approprié.

c)

Suivre la procédure du test d’immunofluorescence (voir section 4).

d)

Pour qu’un test IF soit positif, le titre obtenu avec la culture doit être équivalent à celui obtenu avec

le témoin positif.

9.3

Test PCR

a)

Préparer une suspension d’environ 106 cellules par millilitre dans de l’eau ultrapure.

b)

Dans un bloc chauffant ou dans un bain d’eau bouillante, chauffer 100 μl de la suspension dans des

tubes fermés à 100 °C pendant 4 minutes. Si nécessaire, l’addition de NaOH fraîchement préparé à

une concentration finale de 0,05 M peut faciliter la lyse des cellules. Les échantillons peuvent ensuite

être stockés à des températures de -16 °C à -24 °C jusqu’au moment d’être utilisés.

c)

Appliquer des procédures PCR appropriées pour amplifier les amplimères spécifiques de C. m. ssp.

sepedonicus specific amplicons (par exemple: Pastrik, 2000; voir l’appendice 4; Li et de Boer, 1995;

Mills et al., 1997; Pastrik et Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

d)

L’identification de C. m. ssp. sepedonicus est positive lorsque les amplimères PCR sont de la même

taille et présentent les mêmes polymorphismes de longueur des fragments de restriction que pour

la souche témoin positive.

9.4

Test FISH

a)

Préparer une suspension d’environ 106 cellules par millilitre dans de l’eau ultrapure.

b)

Suivre la procédure du test FISH (voir section 5).

c)

Le test FISH est positif si l’on obtient les mêmes réactions avec la culture et le témoin positif.

9.5

Test de profil des acides gras (FAP)

a)

Développer la culture pendant 72 heures à 21 °C (+/- 1 °C) sur gélose de soja Trypticase (Oxoid).

b)

Appliquer une procédure de test FAP appropriée (Janse, 1991; Stead, 1992).

c)

Pour qu’un test FAP soit positif, le profil de la culture supposée doit être identique à celui du témoin

positif. La présence des acides gras caractéristiques 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso,

16:0 et 17:0 Anteiso est fortement révélatrice de C. m. sepedonicus. Des bactéries d’autres genres,

comme Curtobacterium, Arthrobacter et Micrococcus, possèdent également certains de ces acides, mais

très rarement 15:1 Anteiso A, alors qu’il est présent chez tous les Clavibacter spp. à des taux compris

entre 1 % et 5 %. Dans le cas de C. m. sepedonicus, ce taux gravite habituellement autour de 5 %.

9.6

BOX-PCR

a)

Préparer une suspension d’environ 106 cellules par millilitre dans de l’eau ultrapure.

b)

Effectuer le test conformément à la procédure (Smith et al., 2001).

10.TEST DE CONFIRMATION

Le test du pouvoir pathogène doit être effectué à la fois pour apporter la confirmation finale d’un diagnostic de

C. m. ssp. sepedonicus et pour évaluer la virulence des cultures identifiées comme étant C. m. ssp. sepedonicus.

10.1 Préparer un inoculum d’environ 106 cellules/ml à partir d’une culture de trois jours de l’isolat à tester et

d’une souche témoin positive appropriée de C. m. ssp. sepedonicus.

10.2 Inoculer 5 à 10 tiges de jeunes plants d’aubergine au stade de la troisième feuille (voir les sections

7.3 ou 7.4).

10.3 Faire incuber entre 18 °C et 24 °C à un degré d’humidité relative élevée, en assurant un arrosage approprié

pour prévenir tout engorgement hydrique ou stress de sécheresse (voir la section 7.7). Avec des cultures

pures, un flétrissement typique devrait apparaître dans les deux semaines; toutefois, les plants ne présentant

pas de symptômes (voir la section 7.8) à l’issue de cette période doivent continuer à incuber jusqu’à trois

semaines, à des températures favorables à la croissance des aubergines mais ne dépassant pas 25 °C (voir

l’appendice 8). Si la culture ne présente pas de symptômes au bout de trois semaines, on ne peut pas

confirmer qu’il s’agit d’une forme pathogène de C. m. ssp. sepedonicus.

10.4 Assurer l’isolement par rapport aux plants symptomatiques en prélevant une section de tige à une hauteur

de 2 cm au-dessus du point d’inoculation. Réduire et mettre en suspension dans un petit volume d’eau

distillée stérile ou de tampon phosphaté à 50 mM (voir l’appendice 3). Isoler de la suspension en diluant

par étalement simple ou en stries sur MTNA et YPGA (voir l’appendice 5), laisser incuber pendant trois à

cinq jours entre 21 °C et 23 °C, puis observer la formation de colonies caractéristiques de C. m. ssp.

sepedonicus.

APPENDICE 1

Laboratoires pratiquant l’optimisation et la validation des protocoles

Pour les experts de contact, se référer au site web à l’adresse

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Laboratoire1

Lieu

Pays

Agentur für Gesundheit und

Ernährungssicherheit

Departement Gewasbescherming

Plantedirektoratet

Central Science Laboratory

Scottish Agricultural Science Agency

Laboratoire national de la protection des

végétaux, Unité de Bactériologie

Laboratoire national de la protection des

végétaux, Station de quarantaine de la

pomme de terre

Biologische Bundesanstalt

Pflanzenschutzamt Hannover

State Laboratory

Plantenziektenkundige Dienst

Norwegian Crop Research Institute, Plant

Protection Centre

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Nacionalni institut za biologijo

Centro Diagnostico de Aldearrubia

Vienne et Linz

Merelbeke

Lyngby

York

Edinburgh

Angers

Le Rheu

Kleinmachnow

Hannover

Dublin

Wageningen

Aas

Lisbon

Ljubljana

Salamanca

Autriche

Belgique

Danemark

Angleterre

Ecosse

France

France

Allemagne

Allemagne

Irlande

Pays-Bas

Norvège

Portugal

Slovénie

Espagne

APPENDICE 2

Préparation des témoins positifs et négatifs pour l’application aux cônes des tests de dépistage

PCR/IF et FISH

Mettre en culture pendant 72 heures une souche virulente de C. m. ssp. sepedonicus [NCPPB 4053 ou PD 406]

sur un milieu de base MTNA et mettre en suspension dans un tampon phosphaté à 10 mM de manière à obtenir

une densité cellulaire d’environ 1 à 2 x 108 ufc par millilitre. Celle-ci correspond généralement à une suspension

légèrement turbide présentant une densité optique de 0,20 à 600 nm.

Prélever un cône au talon sur 200 tubercules d’une récolte de variété à peau blanche connue pour être exempte

de R. solanacearum.

Traiter les talons selon la méthode habituelle et remettre l’extrait concentré en suspension dans 10 millilitres.

Verser 900 μl d’extrait concentré remis en suspension dans dix microtubes stériles de 1,5 ml.

Ensemencer le premier microtube au moyen de 100 μl de la suspension de C. m. ssp. sepedonicus. Homogénéiser

au vortex.

Etablir des niveaux de contamination au dixième en poursuivant la dilution dans les cinq microtubes suivants.

Les six microtubes contaminés seront utilisés comme témoins positifs. Les quatre microtubes non contaminés

seront utilisés comme témoins négatifs. Etiqueter les microtubes en conséquence.

Préparer des aliquotes de 100 μl dans des microtubes stériles de 1,5 ml de manière à obtenir neuf répliques de

chaque échantillon témoin. Entreposer entre -16 et -24 °C jusqu’à utilisation.

La présence et la quantification de C. m. ssp. sepedonicus dans les échantillons témoins doivent être confirmées

en premier lieu par un test d’immunofluorescence.

Pour le test PCR, effectuer une extraction d’ADN à partir des échantillons témoins positifs et négatifs de chaque

série d’échantillons.

Pour les test IF et FISH, effectuer des essais sur les échantillons témoins positifs et négatifs de chaque série

d’échantillons.

Dans le cas des tests IF, FISH et PCR, C. m. ssp. sepedonicus doit être détecté au minimum dans les témoins

positifs à 106 et 104 cellules/ml et être totalement absent des témoins négatifs.

APPENDICE 3

Tampons pour les procédures de test

GENERALITE: les tampons stérilisés non ouverts peuvent être stockés jusqu’à un an.

1. Tampons pour la procédure d’extraction

1.1

Tampon d’extraction (tampon phosphaté à 50 mM, pH 7,0)

Ce tampon est utilisé pour l’extraction, par homogénéisation ou agitation, de la bactérie présente dans les

tissus de la plante.

Na2HPO4 (anhydre)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Eau distillée

1,00 l

Dissoudre les ingrédients, vérifier le pH et stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C.

Les additifs suivants peuvent être utiles

Usage

Quantité (par L)

Flocons de Lubrol

Défloculant*

0,5 g

Antimousse au DC silicone

Agent antimoussant*

1,0 ml

Pyrophosphate tétrasodique

Antioxydant

1,0 g

Polyvinyl pyrrolidone-40000 (PVP-40)

Liaison d’inhibiteurs de PCR

50 g

* A utiliser avec la méthode d’extraction par homogénéisation

1.2

Tampon d’extrait concentré (tampon phosphaté à 10 mM, pH 7,2)

Ce tampon est utilisé pour la remise en suspension et la dilution des extraits de talons de tubercules de

pommes de terre concentrés par centrifugation.

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Eau distillée

1,00 l

Dissoudre les ingrédients, vérifier le pH et stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C.

2. Tampons pour le test d’immunofluorescence

2.1

Tampon IF (tampon au phosphate à 10 mM, pH 7,2)

Ce tampon est utilisé pour la dilution des anticorps

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCl

8,0 g

Eau distillée

1,0 l

Dissoudre les ingrédients, vérifier le pH et stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.

2.2

Tampon IF-Tween

Ce tampon est utilisé pour laver les lames.

Ajouter 0,1 % de Tween 20 au tampon IF.

2.3

Glycérol tamponné au phosphate, pH 7,6

Ce tampon est utilisé comme fluide de support sur les fenêtres des lames IF pour renforcer la fluorescence.

Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Glycérol

50 ml

Eau distillée

100 ml

Des solutions supports anti-décoloration sont disponibles dans le commerce: par exemple, Vectashield®

(Vector Laboratories) ou Citifluor® (Leica).

APPENDICE 4

Détermination du degré de contamination lors des tests IF et FISH

1. Compter le nombre moyen de cellules fluorescentes caractéristiques par champ (c).

2. Compter le nombre de cellules fluorescentes caractéristiques par fenêtre de lame de microscope (C).

C = c x S/s

où S = la superficie (S) de la fenêtre d’une lame multipuits

et s = la superficie du champ de l’objectif

s = πi2/4G2K2

où

i = le coefficient du champ (dépend du type d’oculaire et varie de 8 à 24)

K = le coefficient du tube (1 ou 1,25)

G = le grossissement de l’objectif (100 fois, 40 fois, etc.)

3. Compter le nombre de cellules fluorescentes caractéristiques par millilitre d’extrait concentré remis en

suspension (N)

N = C x 1 000/y x F

où

y = le volume d’extrait concentré remis en suspension sur chaque fenêtre

et

F = le facteur de dilution de l’extrait concentré remis en suspension.

APPENDICE 5

Milieux d’isolement et de culture de C. m. ssp. sepedonicus

a) Milieux de culture de type général

Gélose nutritive

Gélose nutritive (Difco)

23,0 g

Eau distillée

1,0 l

Dissoudre les ingrédients et stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C.

Gélose nutritive avec dextrose

Gélose nutritive de Difco Bacto contenant 1 % de D-glucose (monohydrate). Stériliser à l’autoclave à 115 °C

pendant 20 minutes.

Gélose avec levure, peptone et glucose (YPGA)

Extrait de levure (Difco)

5,0 g

Bacto-Peptone (Difco)

5,0 g

D-glucose (monohydrate)

10,0 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Eau distillée

1,0 l

Dissoudre les ingrédients et stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.

Milieu de culture avec extrait de levure et sels minéraux (YGM)

Extrait de levure bacto (Difco)

2,0 g

D-glucose (monohydrate)

2,5 g

K2HPO4

0,25 g

KH2PO4

0,25 g

MgSO4.7H2O

0,1 g

MnSO4.H2O

0,015 g

NaCl

0,05 g

FeSO4.7H2O

0,005 g

Bacto-Agar (Difco)

18 g

Eau distillée

1,0 l

Dissoudre les ingrédients et stériliser par demi-litre à l’autoclave pendant 20 minutes à 115 °C.

b) Milieux de croissance sélectifs validés

Milieu MTNA

Sauf mention contraire, tous les ingrédients proviennent de BDH.

Extrait de levure (Difco)

2,0 g

Mannitol

2,5 g

K2HPO4

0,25 g

KH2PO4

0,25 g

NaCl

0,05 g

MgSO4.7H2O

0,1 g

MnSO4.H2O

0,015 g

FeSO4.7H2O

0,005 g

Gélose (Oxoid n° 1)

16,0 g

Eau distillée

1,0 l

Dissoudre les ingrédients et porter le pH à 7,2. Après un passage à l’autoclave (15 minutes à 121 °C) et un

refroidissement à 50 °C, ajouter les antibiotiques: triméthoprime 0,06 g, acide nalidixique 0,002 g, amphotéricine

B 0,01 g.

Entreposer les solutions d’antibiotiques comme suit: triméthoprime (Sigma) et acide nalidixique (Sigma) [tous

deux à 5 mg/ml] dans du méthanol à 96 %; amphotéricine B (Sigma) [1 mg/ml] dans du diméthylsulfoxyde. Les

solutions entreposées sont stérilisées par filtration.

Nota bene: le milieu généraliste se conserve trois mois. Après l’ajout des antibiotiques, il se conserve un mois en

atmosphère réfrigérée.

Milieu NCP-88

Gélose nutritive (Difco)

23 g

Extrait de levure (Difco)

2 g

D-Mannitol

5 g

K2HPO4

2 g

KH2PO4

0,5 g

MgSO4.7 H2O

0,25 g

Eau distillée

1,0 l

Dissoudre les ingrédients et porter le pH à 7,2. Après passage à l’autoclave et refroidissement à 50 °C, ajouter

les antibiotiques suivants: sulphate de polymixine B (Sigma) 0,003 g, acide nalidixique (Sigma) 0,008 g,

cycloheximide (Sigma) 0,2 g.

Dissoudre les antibiotiques en solutions mères: l’acide nalidixique dans du NaOH à 0,01 M; le cycloheximide dans

de l’éthanol à 50 %, le sulphate de polymixine B dans de l’eau distillée. Les solutions entreposées sont stérilisées

par filtration.

Nota bene: le milieu généraliste se conserve trois mois. Après l’ajout des antibiotiques, il se conserve un mois en

atmosphère réfrigérée.

APPENDICE 6

Protocole et réactifs PCR validés

Nota bene: les tests préliminaires doivent permettre la détection reproductible d’au moins 103 à 104 cellules de C. m.

sepedonicus par millilitre d’extrait d’échantillon.

Les tests préliminaires doivent également ne montrer aucun faux résultat positif avec une gamme de souches bactériennes

sélectionnées.

1. Protocole PCR multiplex avec contrôle PCR interne (Pastrik et al., 2000)

1.1

Oligonucléotide amorces

Amorce sens PSA-1

5’- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3’

Amorce antisens PSA-R

5’- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3’

Amorce sens NS-7-F

5’- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3’

Amorce antisens NS-8-R

5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’

Taille de l’amplimère prévue de la matrice d’ADN de C. m. ssp. sepedonicus = 502 bp (en présence de

l’amorce PSA)

Taille de l’amplimère prévue du contrôle PCR interne 18S rRNA = 377 bp (en présence de l’amorce NS)

1.2

Mélange réactif destiné au PCR

Réactif

Quantité par réaction

Concentration finale

Eau ultrapure stérile

15,725 μl

Tampon 10X pour PCR1 (15 mM MgCI2)

2,5 μl

1x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraction V) (10 %)

0,25 μl

0,1%

Mélange d-nTP (20 mM)

0,25 μl

0,1 mM

Amorce PSA-1 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Amorce PSA-R (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Amorce NS-7-F (10 μM)2

0,1 μl

0,04 μM

Amorce NS-8-R (10 μM)2

0,1 μl

0,04 μM

Polymérase Taq (5 U/μl)1

0,2 μl

1,0 U

Volume de l’échantillon

5,0 μl

Volume total

25,0 μl

Les méthodes ont été validées en utilisant la polymérase Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq ou Gold) et Gibco BRL.

Les concentrations des amorces NS-7-F et NS-8-R ont été optimisées pour l’extraction de noyaux de talons de

pommes de terre utilisant la méthode de l’homogénéisation et de la purification de l’ADN suivant Pastrik (2000)

[voir sections 6.1.a.) et 6.2]. Une nouvelle optimisation des concentrations de réactifs sera requise si l’extraction

par agitation ou d’autres méthodes d’isolement de l’ADN sont utilisées.

1.3

Conditions de la réaction PCR

Exécuter le programme suivant

1 cycle de…

i)

3 minutes à 95 °C: dénaturation de la matrice ADN;

10 cycles de… ii)

1 minute à 95 °C: dénaturation de la matrice ADN;

iii) 1 minute à 64 °C: hybridation avec les amorces;

iv) 1 minute à 72 °C: extension de l’ADN complémentaire;

25 cycles de… v)

30 secondes à 95 °C: dénaturation de la matrice ADN;

vi) 30 secondes à 62 °C: hybridation avec les amorces;

vii) 1 minute à 72 °C: extension de l’ADN complémentaire;

1 cycle de…

viii) 5 minutes à 72 °C: extension finale;

ix) maintenir à 4 °C.

Nota bene: ce programme a été optimisé pour une utilisation avec un cycleur thermique MJ Research PTC 200. Une

modification de la durée des étapes des cycles ii), iii), iv), v), vi) et vii) peut être nécessaire pour une utilisation avec

d’autres modèles.

1.4

Analyse de restriction enzymatique de l’amplimère

Les produits PCR amplifiés de l’ADN de C. m. ssp. sepedonicus produisent un polymorphisme de longueur

de fragments de restriction distinct avec l’enzyme Bgl II après incubation à 37 °C pendant 30 minutes. Les

fragments de restriction obtenus à partir du fragment spécifique de C. m. ssp. sepedonicus ont une longueur

de 282 bp et 220 bp.

2. Préparation du tampon de lest

2.1

Bleu de bromophénol (solution concentrée à 10 %)

Bleu de bromophénol

5 g

Eau distillée (bidest)

50 ml

2.2

Tampon de lest

Glycérol (86 %)

3,5 ml

Bleu de bromophénol (5.1)

300 μl

Eau distillée (bidest)

6,2 ml

3. 10X tampon d’EDTA (TAE) tris-acétate, pH 8,0

Tampon tris

48,4 g

Acide acétique glacial

11,42 ml

EDTA (sel disodique)

3,72 g

Eau distillée

1,00 l

Diluer jusqu’à 1 x avant utilisation.

Egalement disponible dans le commerce (ex.: Invitrogen ou équivalent)

APPENDICE 7

Réactifs validés pour le test FISH

Oligosondes

Sonde CMS-CY3-01 spécifique de Cms: 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg-3’

Sonde eubactérienne EUB-338-FITC non spécifique: 5’- gct gcc tcc cgt agg agt-3’

Solution de fixation

[ATTENTION! LE FIXATIF CONTIENT DU PARAFORMALDEHYDE, QUI EST TOXIQUE. PORTER DES

GANTS ET NE PAS INHALER. IL EST CONSEILLE DE TRAVAILLER SOUS UNE HOTTE DE CHIMISTE.]

i)

Chauffer 9 ml d’eau pure moléculaire (ex: eau ultrapure à environ 60 °C et ajouter 0,4 g de

paraformaldéhyde. Le paraformaldéhyde est dissous après avoir ajouté 5 gouttes de 1N NaOH et remué

avec un agitateur magnétique.

ii)

Ajuster le pH à 7,0 par l’ajout de 1ml de tampon phosphaté à 0,1,1M (PB; pH 7,0) et 5 gouttes de 1N HCl.

Vérifier le pH avec les bandes indicatrices et ajuster en cas de besoin avec du HCl ou NaOH.

[ATTENTION! NE PAS UTILISER DE PH-METRE DANS LES SOLUTIONS CONTENANT DU

PARAFORMALDEDHYDE.]

iii)

Filtrer la solution à travers un filtre à membrane de 0,22 μm et protéger de la poussière à 4 °C jusqu’à

l’utilisation.

iv)

Nota bene: solution de fixation de remplacement: éthanol à 96 %.

Hybmix 3X

NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (filtre stérilisé et passé à l’autoclave)

15 mM

Diluer jusqu’à 1 x comme requis.

Solution d’hybridation

Hybmix 1X

Dodécylsulfate de sodium (SDS)

0,01%

Sonde EUB 338

5 ng/μl

Sonde CMSCY301

5 ng/μl

Préparer des quantités de solution d’hybridation suivant les calculats du tableau 1. Pour chaque lame (contenant

2 échantillons différents en double), 90 μl de solution d’hybridation solution sont nécessaires.

Tableau 1: Quantités suggérées pour préparer le mélange d’hybridation.

Nombre de lames

Eau ultrapure stérile

50,1

200,4

hybmix 3x

30,0

120,0

1 % de Dodécylsulfate de sodium

0,9

3,6

Sonde EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

Sonde CMSCY301 (100 ng/μl)

4,5

18,0

Volume total (μl)

90,0

360,0

N.B. Stocker dans l’obscurité et à -20 °C toutes les solutions contenant des oligosondes sensibles à la lumière. Protéger de

la lumière directe du soleil ou de la lumière électrique directe au cours de l’utilisation.

5. Tampon M phosphaté 0,1, pH 7,0

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Eau distillée

1,00 l

Dissoudre les ingrédients, vérifier le pH et stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C.

APPENDICE 8

Cultures d’aubergine

Semer des graines d’aubergines (Solanum melongena) dans une terre de semis pasteurisée. Repiquer les plantules

dans de la terre de rempotage pasteurisée lorsque les cotylédons sont entièrement développés (10 à 14 jours).

Les aubergines doivent être cultivées en serre dans les conditions suivantes

Durée du jour

14 heures ou durée naturelle de la journée si elle est supérieure,

Température

jour

21 à 24 °C,

nuit

15 °C.

Variétés sensibles d’aubergine

«Black Beauty»,

«Long Tom»,

«Rima»,

«Balsas».

Fournisseur: voir site web à l’adresse http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

APPENDICE 9

Procédure pour la réaction de Gram [modification de Hucker] (Doetsch, 1981)*

Solution de violet cristallisé

Dissoudre 2 g de violet cristallisé dans 20 ml d’éthanol à 95 %.

Dissoudre 0,8 g d’oxalate d’ammonium dans 80 ml d’eau distillée.

Mélanger les deux solutions.

Soluté iodo-ioduré de Lugol

Iode

1 g

Iodure de potassium

2 g

Eau distillée

300 ml

Broyer les solides ensemble à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Ajouter à l’eau et mélanger dans un récipient

fermé pour dissolution.

*

Il est également possible d’utiliser des kits de coloration et des solutés disponibles dans le commerce.

Solution colorante de safranine

Solution mère

Safranine O

2,5 g

Ethanol à 95 %

100 ml

Mélanger et stocker.

Diluer à 1:10 pour obtenir une solution de travail.

Procédure de coloration

1. Préparer les frottis, les sécher à l’air et les fixer à la chaleur.

2. Plonger la lame dans la solution de cristal violet pendant une minute.

3. Laver rapidement à l’eau courante.

4. Plonger dans le soluté iodo-ioduré de Lugol pendant une minute.

5. Laver à l’eau courante et sécher au buvard.

6. Décolorer en ajoutant goutte à goutte de l’éthanol à 95 % jusqu’à ce qu’il ne modifie plus la couleur ou en

plongeant dans l’éthanol pendant 30 secondes tout en agitant légèrement.

7. Laver à l’eau courante et sécher au buvard.

8. Plonger dans la solution de safranine pendant 10 secondes.

9. Laver à l’eau courante et sécher au buvard.

Les bactéries Gram positives ont une couleur violet-bleu; les bactéries Gram négatives ont une couleur rose-

rouge.

REFERENCES

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batches of potato tubers. Commission des Communautés européennes, Luxembourg. Publ EUR 11288 EN, 21

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4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general

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Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101-106.

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solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted

probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546-4554.

ANNEXE II

1. Dans tous les cas d’apparition suspectée pour laquelle on a constaté, lors du ou des tests de dépistage pratiqués

selon les méthodes décrites à l’annexe I, une réaction positive devant être confirmée ou infirmée par l’application

de ces procédures, il convient de garder et de conserver dans des conditions appropriées

tous les tubercules faisant partie de l’échantillon et, dans la mesure du possible, tous les plants faisant partie

de l’échantillon,

tout extrait résiduel et matériel supplémentaire préparé pour le ou les tests de dépistage, tels que les lames

préparées en vue de tests d’immunofluorescence,

et

toute documentation pertinente,

jusqu’au terme desdites procédures.

La conservation des tubercules permettra de tester les variétés, le cas échéant.

2. En cas de confirmation de la présence de l’organisme, il convient de garder et de conserver dans des conditions

appropriées

le matériel visé au point 1,

un échantillon d’aubergine infecté par l’inoculation d’extrait de tubercule ou de plante,

la culture isolée de l’organisme,

et ce pendant au moins un mois après la procédure de notification prévue à l’article 5, paragraphe 2.

ANNEXE III

1. Pour déterminer l’étendue de la contamination probable visée à l’article 5, paragraphe 1, point b), il convient de

prendre en considération les éléments suivants

les tubercules ou les plants cultivés en un lieu de production déclaré contaminé en vertu de l’article 5,

paragraphe 1, point a),

le(s) lieu(x) de production ayant, dans le système de production, un lien avec les tubercules ou les plants qui

ont été déclarés contaminés en vertu de l’article 5, paragraphe 1, point a), y compris ceux partageant

l’équipement et les installations de production directement ou par le biais d’un entrepreneur commun,

les tubercules ou les plants produits dans le(s) lieu(x) de production visé(s) au tiret précédent, ou présents

dans ledit (lesdits) lieu(x) pendant la période où les tubercules ou plants déclarés contaminés en vertu de

l’article 5, paragraphe 1, point a), étaient présents dans les lieux de production visés au premier tiret,

les installations où sont manipulées des pommes de terre provenant des lieux de production susvisés,

tout matériel, véhicule, récipient, entrepôt ou partie de ceux-ci, ainsi que tout autre objet, y compris

l’emballage, qui peut avoir été en contact avec les tubercules ou les plants déclarés contaminés conformément

à l’article 5, paragraphe 1, point a) ii),

tout tubercule ou plante entreposé dans ou en contact avec un des éléments ou objets visés au tiret

précédent, avant le nettoyage et la désinfection de ceux-ci,

à la suite des tests visés à l’article 6, les tubercules ou plants ayant un lien clonal ou parental, avec les

tubercules ou les plants déclarés contaminés conformément à l’article 5, paragraphe 1, point a) ii), et pour

lesquels, bien que les résultats des tests concernant la présence de l’organisme aient été négatifs, il apparaît

que la contamination est probable par le biais d’un lien clonal. Un test sur les variétés peut être opéré afin

de vérifier l’identité des tubercules ou plants contaminés possédant un tel lien clonal, et

le(s) lieu(x) de production des tubercules ou plants visés au tiret précédent.

2. Pour déterminer la propagation possible visée à l’article 5, paragraphe 1, point c), il convient de prendre en

considération les éléments suivants

la proximité des autres lieux de production où sont cultivées des pommes de terre ou d’autres plantes hôtes,

la production et l’utilisation communes des stocks de pommes de terre de semence.

3. La notification visée à l’article 5, paragraphe 2, premier alinéa, comprend

immédiatement après la confirmation de la présence de l’organisme par tests de laboratoire, suivant les

méthodes prévues à l’annexe I, au minimum

la dénomination variétale du lot de pommes de terre,

le type (conservation, semences, etc.) et, le cas échéant, la catégorie de semences de pomme de terre;

lorsqu’il existe un risque de contamination de pommes de terre en provenance ou à destination d’un ou

plusieurs des autres Etats membres, l’Etat membre dans lequel le foyer a été confirmé communique

immédiatement à l’Etat membre ou aux Etats membres concernés les informations permettant de se

conformer à l’article 5, paragraphe 3, à savoir

la dénomination variétale du lot de pommes de terre,

les nom et adresse de l’expéditeur et du destinataire,

la date de livraison du lot de pommes de terre,

le volume du lot de pommes de terre livré,

le cas échéant, une copie du passeport phytosanitaire ou au moins le numéro du passeport phytosanitaire,

ainsi que, le cas échéant, le numéro d’enregistrement du producteur ou du négociant et une copie du bon

de livraison.

La Commission est informée immédiatement de la communication de ces informations

après l’achèvement de toutes les investigations, pour chaque cas

la date à laquelle la contamination a été confirmée,

une brève description des investigations menées afin d’identifier la source et la propagation possible de la

contamination, en précisant le niveau d’échantillonnage appliqué,

des informations sur la ou les sources identifiées ou présumées de la contamination,

des précisions sur l’étendue de la contamination déclarée, y compris le nombre de lieux de production et

le nombre de lots, avec indication de la variété et, s’il s’agit de pommes de terre de semence, de la

catégorie,

des précisions sur la délimitation de la zone, y compris le nombre de lieux de production non déclarés

comme contaminés mais inclus dans la zone,

toutes les autres informations que la Commission pourrait souhaiter en ce qui concerne le ou les foyers

déclarés.

ANNEXE IV

1. Les mesures sous contrôle officiel visées à l’article 7, paragraphe 1, sont les suivantes

l’utilisation comme aliment destiné aux animaux après un traitement thermique de nature à éliminer tout

risque de survie de l’organisme pathogène, ou

la décharge dans un centre d’élimination des déchets officiellement agréé ne présentant aucun risque

identifiable de propagation du pathogène dans l’environnement au travers, par exemple, d’infiltrations dans

des terres agricoles, ou

l’incinération, ou

la transformation industrielle par livraison directe et immédiate à une entreprise de transformation disposant

d’installations officiellement agréées d’élimination des déchets dont il a été établi qu’elles ne présentaient

aucun risque identifiable de propagation de l’organisme, ainsi que d’un système permettant de nettoyer et de

désinfecter au moins les véhicules quittant l’entreprise, ou

d’autres mesures, pour autant qu’il soit établi qu’elles ne présentent aucun risque identifiable de propagation

de l’organisme, ces mesures et leur justification devant par ailleurs être notifiées à la Commission et aux

autres Etats membres.

Tout déchet qui subsisterait au terme des opérations visées ci-dessus ou qui en résulterait est éliminé selon des

méthodes officiellement agréées conformément à l’annexe V de la présente directive.

2. L’utilisation ou l’élimination appropriée des tubercules ou plants déclarés probablement contaminés en vertu de

l’article 5, paragraphe 1, point b), et visés à l’article 7, paragraphe 2, sous le contrôle des organismes officiels

compétents des Etats membres concernés et moyennant une communication adéquate entre les organismes

officiels compétents de manière à garantir ce contrôle à tout moment ainsi que l’agrément des organismes

officiels compétents de l’Etat membre où les pommes de terre doivent être conditionnées ou transformées quant

aux installations d’élimination des déchets visées aux premier et deuxième tirets, impliquent

leur utilisation en tant que pommes de terre de conservation destinées à la consommation, en emballages

prévus pour une livraison et une utilisation directes ne nécessitant aucun réemballage, dans un site disposant

d’installations appropriées d’élimination des déchets. Les pommes de terre destinées à la plantation ne

peuvent être manipulées sur le même site que si cela se fait d’une manière séparée ou après nettoyage et

désinfection, ou

leur utilisation en tant que pommes de terre de conservation destinées à la transformation industrielle après

livraison directe et immédiate à une entreprise de transformation disposant d’installations appropriées

d’élimination des déchets ainsi que d’un système permettant de nettoyer et de désinfecter au moins les

véhicules quittant l’entreprise, ou

une autre utilisation ou élimination, pour autant qu’il soit établi qu’il n’y a aucun risque identifiable de

propagation de l’organisme et sous réserve de l’agrément desdits organismes officiels compétents.

3. Les méthodes appropriées de nettoyage et de désinfection des objets visés à l’article 7, paragraphe 3, sont celles

dont il a été établi qu’elles ne présentaient aucun risque identifiable de propagation de l’organisme; elles sont

appliquées sous la surveillance du service.

4. Les mesures à mettre en œuvre par le service dans la zone délimitée établie en vertu de l’article 5, paragraphe 1,

point c), et visées à l’article 7, paragraphe 4, comprennent les mesures suivantes

4.1.

sur les lieux de production déclarés contaminés en vertu de l’article 5, paragraphe 1, point a)

a) dans un champ déclaré contaminé en vertu de l’article 5, paragraphe 1, point a)

i) – pendant au moins les trois campagnes suivant la campagne de la contamination déclarée

des mesures sont prises en vue d’éliminer les repousses de pommes de terre et les autres

plantes hôtes de l’organisme;

aucun tubercule, plant ou graine de pommes de terre, aucune autre plante hôte de l’organisme

et aucune culture pour laquelle il existe un risque identifié de propagation de l’organisme n’est

planté ni semé;

– durant la première campagne de récolte des pommes de terre suivant la période indiquée au tiret

précédent et à la condition que le champ ait été déclaré exempt de repousses de pommes de

terre et d’autres plantes hôtes de l’organisme pendant au moins les deux campagnes consécutives

précédant la plantation, seule la production de pommes de terre de conservation sera autorisée

et les tubercules récoltés seront testés suivant la procédure détaillée à l’annexe I;

– durant la saison de récolte des pommes de terre suivant celle visée au tiret précédent et après

un cycle approprié de rotation, qui est de deux ans dans le cas des cultures de plants de pommes

de terre, il est autorisé de planter des pommes de terre pour la production de semences ou de

pommes de terre de conservation et des recherches officielles sont effectuées conformément à

l’article 2, paragraphe 1, ou

ii) – pendant les quatre campagnes suivant celle de la contamination déclarée

des mesures sont prises en vue d’éliminer les repousses de pommes de terre et les autres

plantes hôtes de l’organisme spontanément présentes,

le champ est mis et maintenu soit en jachère nue, soit en pâturage permanent, auquel cas il

est fréquemment fauché ras ou mis en pâturage intensif,

– durant la première campagne de récolte des pommes de terre suivant la période indiquée au tiret

précédent et à la condition que le champ ait été déclaré exempt de repousses de pommes de

terre et d’autres plantes hôtes de l’organisme pendant au moins les deux campagnes consécutives

précédant la plantation, la production de semences ou de pommes de terre de conservation sera

autorisée et les tubercules récoltés seront testés suivant la procédure détaillée à l’annexe I;

b) dans tous les autres champs du lieu de production contaminé, et à la condition que les organismes

officiels compétents acquièrent la certitude que le risque constitué par les repousses de pommes de

terre et les autres plantes hôtes de l’organisme naturellement présentes a été éliminé

– au cours de la campagne suivant celle de la contamination déclarée, soit il n’est planté ni semé aucun

tubercule, plant ou semence véritable de pomme de terre ni aucune autre plante hôte de l’organisme

naturellement présente,

– soit il peut être planté des plants de pommes de terre officiellement certifiés, exclusivement en

vue de la production de pommes de terre de conservation,

– au cours de la deuxième campagne suivant celle de la contamination déclarée, seules des semences

certifiées ou des plants de pommes de terre ayant fait l’objet d’un dépistage officiel du flétrissement

bactérien et cultivés sous contrôle officiel dans des lieux de production autres que ceux visés au

point 4.1 sont plantés en vue de la production de semences ou de pommes de terre de conservation,

– pendant au moins la troisième campagne suivant la contamination déclarée, seuls des plants de

pommes de terre certifiés ou des plants de pommes de terre cultivés sous contrôle officiel à partir

de plants de pommes de terre certifiés sont plantés en vue de la production de pommes de terre de

semence ou de conservation,

– au cours de chacune des campagnes visées aux points précédents, des mesures sont prises pour

éliminer les repousses de pommes de terre ainsi, le cas échéant, que les plantes hôtes de l’organisme

spontanément présentes et, dans chaque champ de pommes de terre, des tests officiels des pommes

de terre récoltées sont effectués conformément à la procédure détaillée à l’annexe I;

c) immédiatement après la déclaration de contamination conformément à l’article 5, paragraphe 1, point

a), et après la première campagne suivante, tout le matériel et les installations de stockage présents sur

le lieu de production et impliqués dans la production de pommes de terre sont nettoyés et désinfectés

en tant que de besoin par des méthodes appropriées, conformément au point 3;

d) dans une unité de production en culture protégée permettant le remplacement total du milieu de

culture,

– aucun tubercule, plant ou graine n’est planté ni semé, sauf si l’unité de production a été soumise à

des mesures sous contrôle officiel visant à l’élimination de l’organisme et de toute plante hôte, y

compris au moins le remplacement complet du milieu de culture ainsi que le nettoyage et la

désinfection de l’unité de production et de tout l’équipement, et si elle a par la suite été agréée pour

la production de pommes de terre par les organismes officiels responsables,

– la production de pommes de terre est issue de plants de pomme de terre certifiés, de minitubercules

ou de microplants provenant de sources testées.

4.2.

A l’intérieur de la zone délimitée, sans préjudice des mesures énumérées au point 4.1, le service

a) immédiatement après la déclaration de la contamination, exige que toutes les machines et installations

de stockage situées sur le lieu de production soient nettoyées et, si nécessaire, désinfectées selon les

méthodes appropriées précisées au point 3;

b) immédiatement après la déclaration de la contamination et pendant au moins trois périodes de

végétation

– fait surveiller par leurs organismes officiels responsables les installations pratiquant la culture, le

stockage et la manutention de tubercules de pommes de terre, ainsi que les locaux des entreprises

exploitant sous contrat du matériel utilisé dans le secteur de la pomme de terre,

– exige que seules des semences certifiées ou des semences cultivées sous contrôle officiel soient

plantées pour toutes les cultures de pommes de terre dans ladite zone, et que soient soumises à des

tests les pommes de terre de semence récoltées sur des lieux de production déclarés probablement

contaminés en vertu de l’article 5, paragraphe 1, point b),

– exige, dans toutes les installations de la zone, la manutention séparée des stocks de plants de pomme

de terre récoltés et des stocks de pommes de terre de conservation, ou la mise en œuvre d’un

système de nettoyage et de désinfection entre la manutention des plants de pommes de terre et des

pommes de terre de conservation,

– procède à des recherches officielles conformément à l’article 2, paragraphe 1;

c) établit, en tant que de besoin, un programme de remplacement de tous les stocks de plants de pommes

de terre sur une période appropriée.

ANNEXE V

Afin de prévenir tout risque identifiable de propagation de l’organisme, les installations d’élimination des déchets

officiellement agréées et visées à l’annexe IV, point 1, respectent les dispositions ci-après.

i)

Les déchets de pommes de terre (y compris les pommes de terre déclassées et les pelures) et tout autre déchet

solide lié aux pommes de terre (y compris la terre, les pierres et d’autres débris) sont éliminés

dans un centre d’élimination des déchets officiellement agréé ne présentant aucun risque identifiable de

propagation de l’organisme pathogène dans l’environnement au travers, par exemple, d’infiltrations dans des

terres agricoles, les déchets étant acheminés directement vers le site dans des conditions d’isolement

prévenant tout risque de perte, ou

par incinération, ou

au travers d’autres mesures, pour autant qu’il soit établi qu’elles ne présentent aucun risque identifiable de

propagation de l’organisme. Ces mesures doivent être notifiées à la Commission et aux autres Etats

membres.

ii) Effluents liquides: avant leur élimination, les effluents liquides contenant des solides en suspension sont soumis à

un procédé de filtration ou de décantation afin d’en extraire ces solides. Ces derniers sont éliminés ainsi qu’il est

précisé au point i).

Les effluents liquides sont ensuite

soit chauffés à cœur à une température de 60 °C pendant au moins 30 minutes avant d’être éliminés,

soit éliminés d’une autre manière, sous réserve d’agrément officiel et sous contrôle officiel, de telle sorte qu’il

n’y ait aucun risque identifiable de contact des déchets avec des terres agricoles. Les modalités en sont

notifiées aux autres Etats membres ainsi qu’à la Commission.

Les différentes procédures décrites dans la présente annexe s’appliquent également aux déchets liés à la

manipulation, à l’élimination et au traitement des lots contaminés.

Editeur

Service Central de Législation, 43, boulevard F.-D. Roosevelt, L-2450 Luxembourg

Imprimeur: Association momentanée Imprimerie Centrale / Victor Buck