LU
APPLICATION DE LA PROCÉDURE DE TEST
Texte législatif (2 Articles)
SECTION I
APPLICATION DE LA PROCÉDURE DE TEST
1. Diagnostic du flétrissement bactérien sur les tubercules de pomme de terre et sur les plantes de
pomme de terre et de tomate
La procédure de test concerne les tubercules de pomme de terre et les plantes de pomme de terre et de tomate
présentant des symptômes typiques du flétrissement bactérien ou permettant de soupçonner sa présence. Elle
comporte un test rapide de dépistage, l’isolement de l’organisme pathogène à partir du tissu vasculaire infecté sur des
milieux de diagnostic et, en cas de résultat positif, l’identification de la culture comme étant Ralstonia solanacearum.
Présentation du diagramme fonctionnel
Renvois du diagramme fonctionnel
(1) La description des symptômes figure à la section II.1.
(2) Des tests rapides de tri facilitent le diagnostic présomptif.
Les tests appropriés sont
- test de purulence des tissus vasculaires caulinaires (section II.2),
- test de mise en évidence des granules de poly-ß-hydroxybutyrate (section II.2),
- test d’immunofluorescence (section III.2),
- test ELISA (section III.3),
- test PCR (section III.4).
(3) Bien que l’isolement de l’agent pathogène par dilution et étalement sur milieu de culture soit une tâche simple,
la mise en culture risque d’échouer à partir des stades d’infection avancés. Les bactéries saprophytes qui se
développent sur un tissu malade risquent de se développer beaucoup plus rapidement que l’agent pathogène ou
d’inhiber sa croissance sur le milieu d’isolement. Lorsque le test d’isolement est négatif en dépit de symptômes
caractéristiques de la présence de la maladie, l’isolement doit être réitéré, de préférence par un test de dilution
et étalement sur un milieu sélectif.
(4) L’identification fiable d’une culture pure de Ralstonia solanacearum nécessite au minimum l’un des tests dont la
liste figure à la section II.4.1, réalisé conjointement avec un test de pouvoir pathogène (section II.4.3). La
caractérisation de la souche est facultative mais recommandée pour chaque cas nouveau.
Plantes de pomme de terre ou de tomate ou
tubercules de pomme de terre présentant des symptomes (1)
Tests rapides de dépistage (2)
ISOLEMENT
Colonies ayant une morphologie caractéristique
OUI
NON (3)
TESTS DE CONFIRMATION
Identification (4) d’une culture
pure comme étant Ralstonia
solanacearum et test de
pathogénécité (4)
OUI
NON
Plantes et/ou tubercules
non infectés par Ralstonia
solanacearum
Plantes et/ou
tubercules infectés par
Ralstonia solanacearum
2. Détection et identification de Ralstonia solanacearum sur des échantillons de tubercules de
pomme de terre
La procédure de test vise à détecter des infections latentes de tubercules de pomme de terre au moyen d’un test
de tri ou, mieux encore, de plusieurs tests de ce type, dont les résultats, s’ils sont positifs, sont confirmés par
l’isolement de l’agent pathogène. En cas d’isolement de colonies caractéristiques, on procède à l’identification d’une
culture pure comme étant Ralstonia solanacearum.
Diagramme fonctionnel
Renvois du diagramme fonctionnel
(1) Taille de l’échantillon
La taille de l’échantillon standard est de 200 tubercules. Cependant, la procédure peut être appliquée à des
échantillons de moins de 200 tubercules.
(2) Test(s) de tri
La sensibilité ou la fiabilité d’un seul test n’est pas toujours suffisante pour détecter la présence de Ralstonia
solanacearum dans un échantillon. Il est donc recommandé de procéder à plusieurs tests. Dans la mesure du
possible, ces tests doivent être basés sur des principes biologiques différents.
(3) Test d’immunofluorescence
Le test d’immunofluorescence est un test de tri bien connu. C’est un avantage par rapport à d’autres types de
tests qui ne sont pas encore parfaitement mis au point, ou validés. Ce test est utilisé pour d’autres bactéries de
Echantillons de tubercules de pommes de terre (1)
TEST(S) DE DEPISTAGE (2)
Test d’immunoinfluorescence (3) et/ou d’ensemencement sur milieu
sélectif (4) avec tests complémentaires facultatifs
Test ELISA (5)
Test(s) PCR (6)
Test (7)
Au moins un
test positif
Tous les tests
réalisés négatifs
Echantillon non infecté
par Ralstonia
solanacearum
TEST(S) D’ISOLEMENT
Ensemencement
test sur milieu
sélectif
test
biologique (8)
Colonies de morphologie
caractéristique
OUI
NON
Echantillon non infecté
par Ralstonia
solanacearum
TEST(S) DE CONFIRMATION
Identification de la culture en tant que
culture de Ralstonia solanacearum et
test de pouvoir pathogène (9)
OUI
NON
Echantillon non infecté
par Ralstonia
solanacearum
Echantillon non infecté par Ralstonia
solanacearum
quarantaine, comme Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Compte tenu des paramètres de lecture
spécifiés dans cette méthode, il s’agit d’un test sensible (seuil de sensibilité 10 3 -10 4 cellules/ml de l’extrait final
de pomme de terre).
Le facteur décisif pour la fiabilité des résultats du test est la qualité de l’antisérum. Seul un antisérum ayant un
titre élevé (au minimum 2 000 pour l’antisérum brut) est acceptable et tous les tests doivent être réalisés au
titre de l’antisérum ou à une dilution en dessous. La méthode indirecte est utilisée de préférence. La méthode
directe est applicable lorsque la sensibilité et la spécificité du test sont équivalentes à celles de la méthode
indirecte.
Le test d’immunofluorescence présente l’avantage d’offrir une interprétation subjective quant à la morphologie
et à l’intensité de la fluorescence des cellules qui fournissent des indications sur la spécificité de la réaction. Il
est fréquent de constater des réactions croisées avec des bactéries sérologiquement proches, du sol ou
associées à des tissus de pomme de terre, présentant une morphologie cellulaire de Ralstonia solanacearum. Le
test d’immunofluorescence peut faire office de test de tri unique, mais lorsque la présence de réactions croisées
est suspectée, il convient de réaliser un autre test de tri basé sur un principe biologique différent. Dans de tels
cas, l’isolement sur milieu sélectif est le test le plus approprié.
(4) Etalement sur milieu sélectif
Lorsqu’on utilise le milieu sélectif modifié SMSA et la méthodologie spécifiée, on dispose d’un test sensible et
sélectif permettant de détecter Ralstonia solanacearum. Le résultat est disponible dans un délai de trois à six
jours après la préparation de l’échantillon. L’agent pathogène est obtenu directement sous forme de culture et
peut être facilement identifié. Pour mettre pleinement à profit les possibilités offertes par ce test, il faut préparer
soigneusement les talons de pommes de terre afin de réduire les contaminations par les bactéries secondaires
liées au tubercule; ces bactéries sont des organismes concurrents de Ralstonia solanacearum sur le milieu de
culture, qui sont susceptibles d’affecter le développement de l’agent pathogène. Certaines souches risquent en
outre de se développer insuffisamment dans la mesure où les composants du milieu peuvent également affecter
l’organisme cible. Il faut veiller également à différencier Ralstonia solanacearum des autres bactéries susceptibles
de se développer sur le milieu de culture. L’étalement sur milieu sélectif peut également servir de test de
dépistage unique; toutefois, lorsqu’on obtient un résultat négatif et qu’un effet inhibiteur d’autres bactéries sur
la croissance de Ralstonia solanacearum est suspecté, il convient d’effectuer un deuxième test de dépistage. En
pareille circonstance, le test d’immunofluorescence est le plus indiqué.
(5) Test ELISA
Le test ELISA est généralement moins sensible que le test d’immunofluorescence (seuil de détection de 10 4 -
10 5 cellules/ml d’extrait final de pomme de terre). Ce test est bon marché et rapide, mais généralement plus
sensible au risque de résultats erronés positifs (réactions croisées) ou négatifs (inhibition sous l’effet des
molécules phénoliques des extraits de pomme de terre). Les exigences de spécificité d’antisérum sont
extrêmement rigoureuses. Le test ELISA ne peut servir de test de dépistage unique.
(6) Test PCR
Le test PCR est potentiellement très sensible, bien que le test soit facilement inhibé par des composants de
plants ou d’extrait de tubercules aboutissant à un résultat négatif erroné. Certains cultivars de pomme de terre
contiennent davantage d’inhibiteurs que d’autres. Il est donc nécessaire de les éliminer. La dilution réduit les
inhibitions, mais les populations de Ralstonia solanacearum sont alors également diluées. Il faut procéder avec
le plus grand soin à toutes les étapes de la préparation de l’échantillon et du test pour éviter toute
contamination susceptible de produire des résultats positifs erronés. Des résultats faussement positifs peuvent
survenir à cause d’homologies de séquences avec d’autres organismes. Pour ces raisons, l’utilisation directe du
test PCR comme seul test de dépistage n’est pas possible.
(7) Test d’enrichissement en bouillon nutritif
L’incubation d’extrait final de pomme de terre dans un milieu nutritif liquide semi-sélectif, tel que le bouillon
nutritif modifié SMSA, permet la multiplication de Ralstonia solanacearum et, ce qui est peut-être plus important
encore, la dilution des inhibiteurs potentiels des tests ELISA et PCR. Le test d’immunofluorescence, le test
ELISA et le test PCR permettent donc de détecter la présence de Ralstonia solanacearum dans un milieu nutritif
liquide d’enrichissement.
Nous ne conseillons pas de procéder à un étalement direct à partir de milieux nutritifs enrichis. Ces méthodes
d’enrichissement n’ont pas été complètement expérimentées et testées; elles sont mentionnées ici en raison
des possibilités intéressantes qu’elles offrent. Mais faute d’une expérience suffisante, il n’est pas possible de les
utiliser comme seules méthodes de dépistage.
(8) Test biologique
Le test biologique est utilisé pour l’isolement de Ralstonia solanacearum à partir des extraits de pommes de
terre par enrichissement sélectif dans une plante hôte et peut être effectué sur des plants de tomates ou
d’aubergines. Il exige des conditions optimales d’incubation conformes aux spécifications de cette procédure.
Les bactéries ayant un effet inhibiteur sur Ralstonia solanacearum en présence d’un milieu nutritif SMSA ne
risquent guère de gêner le déroulement de ce test.
(9) Test(s) de confirmation
Il est possible d’identifier de manière fiable une culture pure de Ralstonia solanacearum en utilisant au moins
l’un des tests énumérés à la section II.4.1, associé à un test de pouvoir pathogène (section II.4.3). La
caractérisation de la souche est facultative, mais conseillée en présence d’un cas nouveau.
SECTION II
DIAGNOSTIC DU FLÉTRISSEMENT BACTÉRIEN SUR LES TUBERCULES DE POMME DE TERRE ET SUR LES
PLANTES DE POMME DE TERRE ET DE TOMATE
1.
Symptômes
1.1.
Symptômes sur les pommes de terre
Plante de pomme de terre. Le premier stade de l’infection se traduit par un flétrissement des feuilles du haut
de la plante à température élevée pendant la journée et un retour à l’aspect normal pendant la nuit. Le
flétrissement devient rapidement irréversible et se traduit par la mort de la plante. On peut observer un
brunissement du tissu vasculaire des tiges de plantes flétries coupées transversalement, et un exsudat laiteux
apparaît à la surface de la coupe ou peut en être extrait facilement en pinçant la tige. Lorsqu’une tige coupée
est placée dans l’eau verticalement, des filets de productions bactériennes s’écoulent des faisceaux
vasculaires.
Tubercule de pomme de terre. Les tubercules de pomme de terre doivent être coupés transversalement, près
du talon. Le premier stade d’infection se traduit par une coloration jaune vitreux à brun clair de l’anneau
vasculaire, d’où émerge un suintement crémeux pâle, soit spontanément après quelques minutes, soit
lorsqu’on applique une légère pression des doigts à proximité de la coupe, sur l’épiderme du tubercule. Par
la suite, la décoloration vasculaire devient plus nettement brune et la nécrose s’étend parfois au tissu
parenchymateux. Aux stades avancés, l’infection se propage à partir du talon et des yeux, et l’épiderme des
tubercules présente alors des lésions brun rougeâtre légèrement concaves; de ces lésions peut suinter un
liquide bactérien provoquant l’adhérence des particules de sol.
1.2.
Symptômes sur les tomates
Plante de tomate. Le premier symptôme visible est la flaccidité des plus jeunes feuilles. Dans des conditions
favorables à l’agent pathogène (température du sol d’environ 25 °C, humidité saturée), l’épinastie et le
flétrissement d’un côté de la plante ou de l’ensemble de la plante surviennent en quelques jours et
provoquent l’effondrement complet de la plante. Dans des conditions moins favorables (température du sol
inférieure à 21 °C), un grand nombre de racines adventices peuvent se développer sur la tige. On peut
observer le long de la tige un cordon graisseux qui témoigne de la nécrose du système vasculaire. Lorsque
la tige est coupée transversalement, des gouttes d’exsudat bactérien blanc ou jaunâtre s’écoulent du tissu
vasculaire brun décoloré de la tige.
2.
Tests rapides de dépistage
Des tests rapides de dépistage facilitent le diagnostic présomptif. Utilisez un ou plusieurs des tests suivants
Test d’exsudation des tiges
La présence de Ralstonia solanacearum dans des tiges de pommes de terre ou de tomates flétries peut être
mise en évidence en procédant au test de présomption suivant
Sectionner la tige juste au-dessus du sol. Placer l’extrémité de la tige sectionnée dans un bécher rempli d’eau.
Peu de temps après, des filets de productions bactériennes s’écouleront spontanément des faisceaux
vasculaires. Aucune autre bactérie responsable de l’infection vasculaire des plants de pommes de terre ou
de tomates ne fera apparaître ce phénomène.
Mise en évidence des granules de poly-ß-hydroxybutyrate (PHB)
La coloration au bleu du Nil A ou au noir du Soudan B permet de visualiser les granules de PHB présents
dans les cellules de Ralstonia solanacearum.
Préparer sur une lame de microscope un frottis à partir de l’exsudat ou du tissu placé en suspension ou
préparer un frottis d’une culture de 48 heures sur gélose avec levure, peptone et glucose (YPGA) ou sur
gélose avec peptone (SPA) (appendice 1). Préparer un témoin positif obtenu avec une souche du biovar 2
de la race 3. Laisser sécher. Passer rapidement à plusieurs reprises le côté inférieur de la lame dans une
flamme jusqu’à ce que le frottis soit fixé.
Test au bleu du Nil
1) Recouvrir le frottis fixé dans une solution aqueuse à 1 % de bleu du Nil A. Incuber 10 minutes à 55 °C.
2) Eliminer la solution colorante. Laver rapidement sous un filet d’eau courante. Enlever l’eau excédentaire
avec du papier absorbant.
3) Recouvrir le frottis dans une solution aqueuse d’acide acétique à 8 %. Incuber 1 minute à la température
du laboratoire.
4) Laver sous un filet d’eau courante et sécher sur du papier absorbant.
5) Réhumecter en déposant une goutte d’eau. Recouvrir d’une lamelle.
Examiner le frottis coloré au microscope à épifluorescence sous un film d’huile de 450 nm, à un
grossissement de 1 000.
Observer la fluorescence orange vif des granules de PHB. Faire également des observations en lumière
normale afin de vérifier le caractère intracellulaire des granules; vérifier que la morphologie des cellules est
caractéristique de Ralstonia solanacearum.
Test au noir du Soudan
1) Recouvrir le frottis fixé dans une solution de noir du Soudan B à 0,3 % dans de l’éthanol à 70 %. Incuber
10 minutes à la température du laboratoire.
2) Egoutter la solution colorante. Laver rapidement sous un filet d’eau courante. Enlever la quantité d’eau
excédentaire au papier absorbant.
3) Plonger rapidement le frottis dans du xylol. Sécher au papier absorbant.
Attention, le xylol est un produit dangereux. Travailler sous une hotte de chimiste.
4) Recouvrir le frottis dans une solution aqueuse de safranine à 0,5 % et incuber 10 secondes à la
température du laboratoire.
Attention, la safranine est un produit dangereux. Opérer sous une hotte de chimiste.
5) Laver sous un filet d’eau courante. Sécher au papier absorbant et recouvrir d’une lamelle.
6) Examiner le frottis coloré au microscope à immersion sous un film d’huile, à un rossissement de 1 000,
sous lumière transmise normale.
Les granules de PHB présents dans les cellules de Ralstonia solanacearum présentent une coloration bleu
noir. Les parois des cellules sont colorées en rose.
Autres tests
Les autres tests de tri appropriés sont l’immunofluorescence (section III.2), l’ELISA (section III.3) et la PCR
(section III.4).
3.
Procédure d’isolement
3.1.
Prélever de l’exsudat ou des morceaux de tissu décoloré, soit à partir de l’anneau vasculaire du tubercule,
soit à partir des vaisseaux de la tige. Mettre en suspension dans un petit volume d’eau distillée stérile ou
dans un tampon au phosphate 50 mM. Laisser reposer 5 à 10 minutes sur la paillasse.
3.2.
Préparer une série de dilutions, par exemple au 1/10 et au 1/100 de la suspension, ou plus si cela est jugé
nécessaire.
3.3.
Transférer un volume standard de la suspension et des dilutions sur un milieu de culture général (NA, YPGA
et SPA, appendice 1) et/ou sur le milieu tétrazolium de Kelman (appendice 1), et/ou sur le milieu semi-
sélectif SMSA (appendice 7). Etaler à l’aide d’une technique d’étalement en nappe ou à l’anse stérile. Si cela
est jugé utile, préparer des boîtes de Petri avec chaque milieu, ensemencé avec une suspension bactérienne
virulente appartenant au biovar 2, race 3 de Ralstonia solanacearum, pour témoin positif.
3.4.
Incuber les boîtes pendant 3 jours à 28 °C. L’incubation peut être prolongée jusqu’à 6 jours si la croissance
est lente, mais les colonies sur milieu SMSA deviennent atypiques et meurent.
Sur milieu nutritif général, les isolats virulents de Ralstonia solanacearum forment des colonies fluides, à bord
irrégulier, plates, blanchâtres et présentant fréquemment des verticilles caractéristiques.
Sur milieu “tétrazolium de Kelman”, les colonies virulentes typiques de Ralstonia solanacearum sont de
couleur crème plates, à bord irrégulier, fluides, avec un centre de couleur rouge sang. Les formes avirulentes
de Ralstonia solanacearum donnent des colonies butyreuses, de couleur rouge sombre.
Sur milieu nutritif SMSA, les isolats virulents de Ralstonia solanacearum forment des colonies blanc laiteux,
plates, fluides, à bord irrégulier et avec un centre rouge à violacé.
Les isolats non virulents de Ralstonia solanacearum form
3.5.
Purifier les colonies de morphologie caractéristique par repiquage sur un milieu nutritif de type général.
Eviter les repiquages successifs susceptibles de provoquer une perte de virulence.
4.
Test(s) de confirmation
4.1.
Identification de Ralstonia solanacearum
Identifier des cultures pures de Ralstonia solanacearum en utilisant au moins l’une des procédures suivantes
Tests nutritionnels et enzymatiques
Note: inclure les témoins appropriés dans chacun des tests utilisés.
Les caractéristiques phénotypiques de Ralstonia solanacearum listées ci-après sont systématiquement
présentes ou absentes.
Pigment fluorescent
Inclusions de granules de PHB
+
Test du métabolisme oxydatif-fermentatif (O/F)
O+/F -
Catalase
+
Oxydase de Kovacs
+
Réduction des nitrates
+
Utilisation de citrate
+
Croissance à 40 °C
Croissance dans une solution à 1 % de NaCl
+
Croissance dans une solution à 2 % de NaCl
Arginine dihydrolase
Liquéfaction de gélatine
Hydrolyse de l’amidon
Hydrolyse de l’esculine
Production de levane
Les milieux et les techniques sont donnés dans Lelliott et Stead (1987).
Test d’immunofluorescence
Préparer une suspension de 10 6 cellules/ml au moyen de la culture réalisée et d’une souche témoin positive.
Préparer une série de dilutions au demi de l’antisérum. Suivre la procédure du test d’immunofluorescence
(section III.2). Le titre obtenu avec la culture en immunofluorescence doit être identique à celui obtenu avec
la souche témoin.
Test ELISA
Préparer une suspension contenant plus de 10 6 cellules/ml de la culture bactérienne et d’une souche témoin
positive. Appliquer la procédure du test ELISA (section III.3). Les valeurs obtenues en ELISA avec la culture
doivent être équivalentes à celles obtenues avec la souche témoin.
Test de PCR
Préparer une suspension contenant 10 6 cellules/ml au moyen de la culture bactérienne et d’une souche
témoin positive.
Appliquer la procédure du test de PCR (section III.4). Le produit PCR de la culture doit avoir la même taille
et le même profil de restriction (REA) que ceux obtenus avec la souche témoin positive.
Hybridation fluorescente in situ (FISH-Fluorescent in situ hybridisation)
Préparer une suspension de 10 6 cellules/ml au moyen de la culture bactérienne et d’une souche témoin
positive. Appliquer la procédure du test FISH (van Beuningen et al., 1995), avec l’amorce PCR OLI-1 (Seal
et al., 1993). La culture doit présenter une réaction identique à celle de la souche témoin positive.
Profil protéique
Les protéines totales de la bactérie sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) en
conditions dénaturantes (Stead, 1992a).
Test de profil des acides gras (FAP, fatty acid profiling)
Cultiver la culture bactérienne et celle d’une souche témoin positive pendant 48 heures à 28 °C sur des
boîtes gélosées de trypticase soja, puis appliquer la procédure du test FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead,
1992b). Le profil de la culture doit être identique à celui du témoin positif. Dans les conditions spécifiées,
les acides gras caractéristiques sont les suivants: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH et 18:1 2OH.
4.2.
Caractérisation de la souche
La caractérisation de la souche est facultative mais conseillée en présence d’un cas nouveau. Utilisez au
moins l’un des tests suivants
Détermination du biovar
On distingue différents biovars de Ralstonia solanacearum en fonction de leur aptitude à utiliser et/ou à oxyder trois
hexoses alcools et trois sucres (Hayward, 1964 & 1994)
Biovar
Utilisation de
- maltose
+
+
+
- lactose
+
+
+
- cellobiose
+
+
+
- mannitol
+
+
+
- sorbitol
+
+
- dulcitol
+
+
Des tests supplémentaires différencient le biovar 2 en trois phénotypes secondaires (Hayward, 1994)
Biovar 2
Biovar 2-A
Biovar 2-T
Utilisation du tréhalose
+
+
Utilisation de l’inositol
+
+
Utilisation du D-ribose
+
Activité pectolytique
faible
faible
forte
Détermination de la race
La race (Buddenhagen et al., 1962) est déterminée sur la base du résultat d’un test de pouvoir pathogène effectué
sur des plants de tomates ou d’aubergines et sur des plants de tabac grâce à un test de réaction d’hypersensibilité (HR)
sur des feuilles de tabac (Lozano et Sequeira, 1970)
Race (*)
Réaction sur
- plantes de tomates/aubergines
Flétrissement
Pas de réaction
Flétrissement
- plantes de tabac
Flétrissement
Pas de réaction
Pas de réaction
- feuilles de tabac
Nécrose
Hypersensibilité
Chlorose
(48 h) et
flétrissement (7-8 j)
(*) La race 4 (pathogène du gingembre et de quelques autres hôtes) et la race 5 (pathogène du mûrier seulement)
ne sont pas incluses.
La caractérisation de la race par le test du pouvoir pathogène ou par le test d’hypersensibilité sur tabac peut
n’être pas très répétable, aussi la race peut-elle être déduite du biovar et de l’hôte naturel d’origine.
La caractérisation de la culture peut être complétée comme suit
Emprunte génomique
Les procédés suivants permettent de réaliser une différenciation moléculaire des souches à l’intérieur du
complexe Ralstonia solanacearum
Analyse du polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP) (Cook et al., 1989)
PCR sur des séquences répétitives (rep-PCR) [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995; Smith et al.,
1995)]
4.3.
Test du pouvoir pathogène
Ce test est pour la confirmation des diagnostics de Ralstonia solanacearum et pour confirmer la virulence
des cultures identifiées en tant que Ralstonia solanacearum.
Préparer un inoculum de 10 6 cellules/ml à partir de la culture et d’une souche témoin positive. Inoculer 5
à 10 plantes de tomates ou d’aubergines au stade, de préférence, de la troisième vraie feuille ou plus (section
III.6). Incuber pendant une période pouvant atteindre 2 semaines à une température de 22 à 28 °C à raison
d’un arrosage quotidien, en maintenant une humidité relative élevée. Observer l’apparition de symptômes
de flétrissement et/ou d’épinastie, de chlorose et de rabougrissement.
Isolement à partir des plantes symptomatiques, comme suit
prélever un morceau de tige à 2 cm du point d’inoculation,
réduire et dilacérer dans un petit volume d’eau stérile ou de tampon phosphates 50 mM. Puis étaler sur
des boîtes, incuber, et rechercher l’apparition des colonies typiques de Ralstonia solanacearum.
SECTION III
DÉTECTION ET IDENTIFICATION DE RALSTONIA SOLANACEARUM SUR DES ÉCHANTILLONS DE
TUBERCULES DE POMME DE TERRE
Note: La taille de l’échantillon standard est de 200 tubercules. Cependant, la procédure peut être appliquée à des
échantillons de moins de 200 tubercules.
1. Préparation de l’échantillon pour le test
NB: L’extrait concentré de pomme de terre obtenu suivant cette procédure peut servir également à la détection
de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Opérations préalables éventuellement utiles
i)
incuber l’échantillon à une température de 25 à 30 °C pendant une période pouvant atteindre 2 semaines afin
de faciliter la multiplication des faibles populations de Ralstonia solanacearum;
ii) laver les tubercules à l’eau courante en utilisant des désinfectants et des détergents appropriés. Sécher les
tubercules à l’air.
1.1
Enlever la peau du tubercule au niveau du talon au moyen d’un scalpel ou d’un couteau à légumes propre et
désinfecté, de façon à faire apparaître les tissus vasculaires. Découper soigneusement un petit cône de tissu
vasculaire (de 3 à 5 mm de diamètre) au niveau du talon de chaque tubercule. Prélever aussi peu que possible
de tissu non vasculaire. Procéder ainsi pour chacun des tubercules de l’échantillon.
NB: Il est possible à ce stade de procéder à un examen visuel des tubercules (section II.1). Mettre de côté
les tubercules présentant des symptômes et les tester à part (section II).
1.2.
Rassembler les talons dans un récipient fermé. Il est préférable de traiter immédiatement les talons. Sinon,
il est possible de les entreposer pour une période de moins de 24 heures ou de moins de 72 heures, à 4°C.
1.3.
Traiter les talons en suivant l’une des procédures ci-dessous
i)
Placer les talons dans un récipient approprié
Ajouter un volume suffisant de tampon de macération (appendice 2) de façon à recouvrir les talons.
Réduire les talons dans un mixeur de type Waring Blender ou dans un mixeur de type Ultra Thurrax
jusqu’à homogénéisation complète. Eviter une homogénéisation excessive.
Laisser le macérat reposer pendant 15 à 30 minutes.
ii) Placer les talons dans un récipient approprié.
Ajouter un volume suffisant de tampon de macération pour couvrir les talons.
Placer les cônes sur un agitateur rotatif.
Incuber à une vitesse de 50 à 100 tours par minute pendant 4 heures à une température de 20 à 22 °C
ou pendant 16 à 24 heures à une température de 4 °C.
iii) Placer les talons dans un sac de macération jetable résistant (par exemple sac Stomacher de 105 mm x
150 mm, stérilisé par radiations ionisantes)
Broyer les talons soigneusement au moyen d’un outil approprié, par exemple un marteau, jusqu’à
homogénéisation juste complète.
Ajouter une quantité suffisante de tampon de macération de façon à recouvrir les talons broyés.
Laisser le macérat décanter de 15 à 30 minutes.
1.4.
Extraire les bactéries des cônes provenant des talons par l’une des méthodes suivantes
i)
Transférer doucement le macérat dans un tube de centrifugation en laissant les débris dans le récipient
ou dans le sac. Si le macérat décanté reste trouble, le centrifuger à 180 g au maximum pendant 10
minutes, à une température inférieure à 10 °C.
Centrifuger le macérat décanté, ou le liquide surnageant issu de la première phase de centrifugation, à
une vitesse de 7 000 g pendant 15 minutes ou à 10 000 g pendant 10 minutes à une température
inférieure à 10 °C.
Jeter le liquide surnageant sans déranger le culot.
ii) Filtrer le macérat dans un dispositif filtrant (pores de diamètre 40-100 µm). Accélérer la filtration à l’aide
d’une pompe à vide.
Recueillir le filtrat dans un tube de centrifugation.
Laver le filtre au moyen du tampon de macération.
Centrifuger le filtrat à une vitesse de 7 000 g pendant 15 minutes ou à une vitesse de 10 000 g pendant
10 minutes à une température inférieure à 10 °C.
Jeter le liquide surnageant sans déranger le culot.
1.5.
Remettre en suspension le culot dans un tampon de 1 ml (appendice 2).
Le diviser en deux parties égales et placer chacune dans un microtube.
Utiliser l’un des microtubes pour effectuer le test. Pendant ce temps, conserver la partie restante de cet
extrait à une température de 4°C.
Ajouter de 10 à 25% (en volume) de glycérol stérile à l’autre microtube. Vortexer et conserver à une
température de -18°C (plusieurs semaines) ou de - 70°C (plusieurs mois).
2. Test d’immunofluorescence
Utiliser un antisérum anti-Ralstonia solanacearum de préférence dirigé contre la race 3/biovar 2. Déterminer le titre
requis sur une suspension contenant 10 6 cellules/ml de la souche homologue de Ralstonia solanacearum, au moyen
d’une dilution appropriée de l’antisérum conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), conformément aux
recommandations du fabricant. L’antisérum brut devrait avoir un titre d’immunofluorescence d’au moins 1 : 2 000.
Utiliser des lames à plusieurs puits pour microscope comportant de préférence 10 fenêtres d’au moins 6 mm de
diamètre.
Placer sur chaque lame un témoin conjugué FITC. Il convient de répéter le test avec une préparation témoin PBS
en cas d’occurrence de cellules positives sur la préparation témoin conjugué FITC.
Préparer des lames témoins positives distinctes avec une suspension contenant 10 6 cellules/ml d’une souche de
race/biovar appropriée de Ralstonia solanacearum. Prévoir une lame de ce type pour chaque série de tests.
2.1.
Préparer les lames en utilisant l’une des méthodes suivantes
i)
Extraits finals contenant relativement peu d’amidon
Déposer à la pipette sur une rangée de fenêtres un volume standard (15 µl est une quantité suffisante
pour un diamètre de fenêtre de 6 mm — choisir une quantité plus importante pour les puits de plus
grand diamètre) de la suspension d’extrait final. La rangée suivante peut servir de double ou servir à un
deuxième échantillon, comme indiqué à la figure 1.
ii) Dans le cas des autres extraits
Préparer des dilutions décimales (1/10, 1/100 et 1/1 000) de l’extrait final dans la solution tampon.
Déposer à la pipette sur une rangée de fenêtres un volume standard (15 µl est une quantité suffisante
pour un diamètre de fenêtre de 6 mm — choisir une quantité plus importante pour les puits de plus
grand diamètre) de la suspension d’extrait pur et de chaque dilution. La rangée suivante peut servir de
double ou servir à un deuxième échantillon, comme indiqué à la figure 2.
2.2.
Laisser sécher les gouttes. Fixer les cellules bactériennes sur la lame en chauffant, en passant à la flamme, ou
avec de l’éthanol à 95 °.
2.3.
Procédure du test d’immunofluorescence
i)
Conformément à la méthode de préparation des lames de test indiquée en 2.1.i)
Préparer une série de dilutions au demi de l’antisérum dans un tampon d’immunofluorescence
(appendice 3)
1/4 du titre (T/4), 1/2 du titre (T/2), titre (T) et deux fois le titre (2T).
ii) Conformément à la méthode de préparation des lames de test indiquée en 2.1.ii)
Préparer la dilution de travail de l’antisérum dans un tampon d’immunofluorescence. La dilution de travail
est la dilution de l’antisérum offrant la spécificité optimale et égale habituellement à la moitié du titre.
Figure 1
Préparation de la lame de test conformément aux indications fournies en 2.1.i) et 2.3.i)
Dilution standard de l’extrait concentré en suspension
(T =Titre)
FITC
T/4
T/2
T
2T
–>
Dilutions doubles de
l’antisérum
Figure 2
Préparation de la lame de test conformément aux indications fournies en 2.1.ii) et 2.3.ii)
FITC
Dilution standard de l’antiserum
Pur
Pur
1/10
1/100
1/1000
–>
Dilution décimale de
l’extrait en suspension
2.3.1.
Disposer les lames sur du papier absorbant.
Couvrir les puits de lame de test avec des dilutions d’antisérum. Appliquer le tampon PBS sur les puits FITC.
La quantité d’antisérum appliquée doit être équivalente à la quantité d’extrait concentré.
2.3.2. Incuber sous un couvercle pendant 30 minutes à la température ambiante.
2.3.3.
Eliminer les gouttelettes d’antisérum et rincer soigneusement les lames dans une solution tampon pour
immunofluorescence. Laver 5 minutes dans une solution tampon IF-Tween et après laver 5 minutes dans
une solution tampon IF (appendice 3).
Eliminer avec soin le tampon excédentaire.
Echantillon 1
Double de l’échantillon 1 ou
échantillon 2
Echantillon 1
Double de l’échantillon 1 ou
échantillon 2
2.3.4.
Poser les lames sur du papier absorbant humide.
Couvrir les puits correspondant à l’échantillon et ceux du puits témoin FITC avec du conjugué FITC à la
dilution utilisée lors du titrage. La quantité de conjugué appliquée aux puits doit être identique à la quantité
d’antisérum utilisée.
2.3.5.
Laisser incuber 30 minutes sous un couvercle à la température ambiante.
2.3.6.
Eliminer les gouttes de conjugué. Rincer et laver comme indiqué ci-dessus (2.3.3).
Enlever soigneusement l’humidité excédentaire.
2.3.7.
Déposer à la pipette 5 à 10 µl d’un tampon phosphate 0,1 M avec glycérol (appendice 3) ou un support
similaire, sur chaque puits; recouvrir d’une lamelle.
2.4.
Lecture du test d’immunofluorescence
Examiner les lames de test avec un microscope équipé d’une source lumineuse épifluorescente et de filtres
adaptés pour travailler avec l’isothiocyanate de fluorescéine, sous huile à un grossissement de 500 à 1 000.
Examiner les puits selon deux diamètres perpendiculaires et en suivant le pourtour.
Commencer par contrôler la lame témoin positif. Les cellules doivent présenter une fluorescence vive,
surtout leur pourtour.
Note: Le test doit être recommencé si la coloration n’est pas bonne.
Contrôler tout d’abord l’absence de cellules fluorescentes dans les puits témoins FITC. La présence de
cellules fluorescentes dans le témoin FITC indique une liaison non spécifique du conjugué ou la présence de
cellules autofluorescentes ou de cellules contaminantes.
Note: Dans ce cas, le test doit être recommencé.
Rechercher la présence de cellules présentant une fluorescence vive, ayant une morphologie caractéristique
de Ralstonia solanacearum dans les puits échantillons. L’intensité de fluorescence doit être équivalente à
celle de la souche témoin positive pour une dilution d’antisérum identique. Les cellules dont la coloration
est incomplète ou dont la fluorescence est faible ne doivent pas être prises en considération à moins qu’elles
ne soient particulièrement nombreuses (voir l’interprétation du test IF).
Interprétation du test d’immunofluorescence
i)
Le test d’immunofluorescence est négatif pour tout échantillon ne contenant aucune cellule présentant
une fluorescence vive et une morphologie caractéristique.
ii) Si l’échantillon contient des cellules avec une fluorescence vive et une morphologie caractéristique,
déterminer le nombre moyen de cellules par champ microscopique et calculer le nombre de cellules
(N)/ml d’extrait concentré remis en suspension (appendice 4).
Une population d’approximativement 10 3 cellules/ml d’extrait concentré remis en suspension est
considérée comme étant la limite de détection pour le test IF
pour des échantillons contenant N > 10 3 cellules/ml, le test d’immunofluorescence est considéré positif,
pour des échantillons contenant N < 10 3 cellules/ml, le test d’immunofluorescence peut être considéré
comme positif.
iii) Si un grand nombre (N > 10 5 cellules par ml) de cellules incomplètement ou faiblement fluorescentes
est observé au titre de l’antisérum, un second test doit être réalisé
- soit un test basé sur un autre principe biologique,
- soit un test IF préparé avec un autre antisérum ou avec une dilution au dixième du culot.
3. Test ELISA
(d’après Robinson-Smith et al., 1995)
Utiliser un antisérum anti-Ralstonia solanacearum dirigé de préférence contre la race 3/biovar 2. Déterminer le titre
avec une suspension contenant 10 6 cellules/ml préparée avec la souche homologue de Ralstonia solanacearum.
Il est conseillé d’utiliser les plaques de microtitration NUNC-Polysorp.
Utiliser comme témoin négatif un extrait de pomme de terre saine et un témoin PBS.
Utiliser une suspension contenant plus de 10 6 cellules/ml d’une souche appropriée (race/biovar) de Ralstonia
solanacearum à titre de témoin positif. Tester de la même façon que les échantillons, mais en les séparant
soigneusement sur la plaque de microtitration.
3.1.
Pipetter 100 à 200 µl de l’extrait final et le déposer dans un microtube. Chauffer 4 minutes à 100°C. Plonger
le microtube dans la glace.
3.2.
Ajouter un volume identique de tampon carbonate concentré 2 fois (appendice 5). Homogénéiser au vortex.
3.3.
Déposer des aliquots de 100 µl sur au moins deux puits de la plaque de microtitration. Incuber une heure
à 37 °C ou une nuit à 4 °C.
3.4.
Eliminer les extraits concentrés des puits. Laver ces derniers à trois reprises. Utiliser PBS-Tween (appendice
5), en laissant la dernière solution de lavage dans les puits pendant au moins 5 minutes.
3.5.
Préparer la dilution appropriée d’antisérum anti-Ralstonia solanacearum dans la solution tampon de
saturation (appendice 5). Déposer 100 µl de dilution antisérum dans les puits. Incuber 1 heure à 37 °C.
3.6.
Eliminer l’antisérum contenu dans les puits. Laver les puits comme indiqué ci-dessus (3.4).
3.7.
Préparer la dilution appropriée de l’antisérum conjugué à la phosphatase alcaline dans le tampon de
saturation. Déposer 100 µl de la dilution conjuguée dans les puits. Incuber une heure à 37 °C.
3.8.
Eliminer le conjugué versé dans les puits. Laver ces derniers comme indiqué ci-dessus (3.4 et 3.6).
3.9.
Préparer la solution du substrat de la phosphatase alcaline (appendice 5). Déposer 100 µl dans les puits.
Incuber 30 minutes à une heure à l’obscurité, à la température du laboratoire.
3.10.
Mesurer l’absorbance à 409 nm.
Interprétation du test ELISA
Le test ELISA est négatif si la densité optique de l’échantillon est inférieure au double de celle du témoin négatif.
Le test ELISA est positif si la densité optique de l’échantillon est supérieure au double de celle du témoin négatif.
4. Test PCR
(d’après Seal et al., 1993)
Note: Il faut utiliser des cônes de pipettes à filtre pour toutes les étapes de la préparation des échantillons et pour
les autres manipulations concernant la PCR.
Préparer une suspension de 10 6 cellules/ml de la race 3/biovar 2 de Ralstonia solanacearum à titre de témoin positif.
Tester de la même façon que l’échantillon.
4.1.
Déposer à la pipette 100 µl de l’extrait concentré en suspension dans un microtube.
Il est également possible de déposer 90 µl de l’extrait concentré remis en suspension dans un microtube
contenant 10 µl d’une solution à 0,5 M de NaOH. Mélanger en retournant le microtube à plusieurs reprises.
4.2.
Chauffer pendant 4 minutes à 100°C. Transférer immédiatement le microtube sur la glace.
4.3.
Préparer au moins deux dilutions au dixième (par exemple au 1/10 et au 1/100 ou plus si nécessaire), dans
de l’eau distillée stérile ou dans de l’eau ultrapure.
4.4.
Préparer le mélange destiné à la PCR (appendice 6) dans un microtube stérile, en ajoutant les composants
suivants dans l’ordre indiqué ci-dessous
Pour un volume de réaction de 50 µl
Composant
Quantité
Concentration
Finale
Eau distillée stérile ou ultra épurée
30,8 µl-33,8 µl
10xTampon PCR
5,0 µl
1x
d-ATP
1,0 µl
0,2 mM
d-CTP
1,0 µl
0,2 mM
d-GTP
1,0 µl
0,2 mM
d-TTP
1,0 µl
0,2 mM
Amorce OLI 1 (20 µM)
2,5 µl
1 µM
Amorce Y-2 (20 µM)
2,5 µl
1 µM
Polymérase taq (5U/ µl)
0,2 µl
1,0 U
Volume total
45 µl -48 µl
Pour un nombre plus important de réactions
Calculer la quantité de chaque composant nécessaire au nombre requis de réactions.
Mélanger les composants et verser de 45 à 48 µl du mélange dans des microtubes stériles de test de PCR.
Conserver sur glace les microtubes contenant le mélange réactionnel destiné à la PCR.
Pour des volumes de réaction du 25 µl
Réduire proportionnellement les quantités de chaque composant.
4.5.
Amplification par PCR
4.5.1.
Facultatif! Centrifuger pendant quelques instants les microtubes contenant les échantillons bouillis et le
témoin positif.
Ajouter dans l’ordre prescrit de 2 à 5 µl des échantillons, du témoin eau et du témoin positif aux différents
microtubes contenant le mélange de PCR. Placer les microtubes dans le bloc chauffant du cycleur.
4.5.2.
Exécuter le programme suivant
1 cycle de
i)
2 minutes à 96 °C: dénaturation de la matrice
50 cycles de
ii) 20 secondes à 94 °C: dénaturation
iii) 20 secondes à 68°C: hybridation avec les amorces
iv) 30 secondes à 72°C: extension de l’ADN complémentaire
1 cycle de
v) 10 minutes à 72°C: extension finale
1 cycle de
vi) maintien à 4 °C
NB: Ces paramètres correspondent à un appareil Perkin Elmer 9600. D’autres types de cycleur thermique
peuvent exiger la présence d’une goutte d’huile minérale dans les microtubes ou une modification de la
durée des étapes ii), iii) et iv) du profil d’amplification.
4.5.3.
Retirer les microtubes du cycleur thermique. Analyser le produit de la PCR. Si l’analyse n’est pas faite
immédiatement, les microtubes doivent être conservés à 4 °C en vue d’une utilisation le jour même ou à
– 18°C en vue d’une utilisation ultérieure.
4.6.
Analyse du produit de réaction PCR
Les produits d’amplification par PCR sont détectés par électrophorèse en gel d’agarose et par coloration au
bromure d’éthidium.
4.6.1.
Préparer un gel d’agorose approprié en amenant doucement à ébullition l’agorose dans une solution tampon
d’électrophorèse tris-acétate.
4.6.2.
Refroidir l’agarose fondu à une température de 50 à 60 °C. Verser dans le moule du bloc d’électrophorèse
et introduire le peigne. Laisser la solution se solidifier.
4.6.3. Retirer le peigne. Recouvrir le gel de tampon tris-acétate jusqu’à ce qu’il soit à peine recouvert (2-3 mm)
par la solution tampon.
4.6.4.
Déposer des gouttes de 3 µl du tampon de lest sur du parafilm. Ajouter 12 µl du produit de PCR provenant
des échantillons, du témoin positif ou du témoin eau et mélanger en aspirant doucement avec l’extrémité
de la pipette avant de déposer dans le gel. Les volumes indiqués peuvent être modifiés afin de les ajuster à
la capacité des puits du gel d’agarose.
4.6.5.
Remplir soigneusement les puits du gel. Introduire pour référence dans l’un des puits au moins un marqueur
de poids moléculaire approprié.
4.6.6.
Reccorder le générateur et la cuve d’électrophorèse. Mettre le gel sous une tension de 5 à 8 V/cm jusqu’à
ce que le front de l’indicateur de suivi se trouve à moins de 1 cm de l’extrémité du gel.
4.6.7.
Couper l’alimentation. Débrancher les fils de la cuve d’électrophorèse. Retirer soigneusement le gel. Le
tremper pendant 30 à 45 minutes dans une solution de bromure d’éthidium.
NB: Il faut toujours porter des gants jetables pour manipuler le bromure d’éthidium qui est un agent
mutagène puissant.
4.6.8.
Décolorer dans l’eau distillée pendant 10 à 15 minutes.
4.6.9.
Visualiser les fragments d’ADN amplifiés sous lumière ultraviolette. Le produit de PCR de Ralstonia
solanacearum en présence des amorces OLI-1 et Y-2 à une longueur de 288 bp. Vérifier à nouveau par
rapport au marqueur d’ADN et par rapport au témoin positif.
NB: Le témoin eau doit être négatif dans tous les cas. Sinon le test est à recommencer.
4.6.10. Photographier le gel si l’obtention d’un enregistrement permanent est nécessaire.
4.6.11. Confirmer l’authenticité du fragment amplifié par analyse de restriction enzymatique (REA — Restriction
enzyme analysis).
4.7.
Analyse de restriction enzymatique
4.7.1.
Transférer 8,5 µl du produit de PCR (4.5.3) dans un autre microtube. Ajouter 1µl d’une solution tampon
enzymatique concentré (10 x et 0,5 µl d’enzyme de restriction AvaII.
4.7.2.
Mélanger en aspirant doucement avec l’extrémité de la pipette. Si des gouttelettes subsistent sur les parois
du microtube, le passer à la centrifugeuse à impulsions. Incuber pendant une heure à 37 °C.
4.7.3.
Analyser le fragment de PCR digéré par électrophorèse en gel d’agarose comme indiqué au point 4.6.
Interprétation du résultat du test PCR
Le test PCR est négatif si le fragment caractéristique de 288 bp n’est pas détecté et si le fragment est détecté pour
la souche témoin positive de Ralstonia solanacearum.
Le test PCR est positif si le fragment caractéristique de 288 bp est détecté et si l’analyse d’enzyme de restriction du
fragment amplifié est identique à celle de la souche témoin positive de Ralstonia solanacearum.
5. Test d’étalement sur milieu sélectif
(d’après Elphinstone et al., 1996)
5.1.
Effectuer le test en utilisant une technique appropriée d’ensemencement par dilution, par exemple en
procédant comme suit
i)
Préparer au moins deux dilutions au dixième, par exemple au 1/10 et au 1/100, de l’extrait concentré
mis en suspension dans la solution tampon. Déposer à la pipette un volume standard (par exemple, de
50 à 100 µl) de l’extrait concentré mis en suspension et de chacune des dilutions sur un milieu nutritif
sélectif SMSA (appendice 7) et étaler sur une boîte, sur toute la surface du support. Si cela est jugé
nécessaire, réaliser également un étalement en strie avec une anse platinée de 10 µl. Flamber l’anse entre
chaque série de stries.
ii) Verser un volume standard (50-100 µl) de l’extrait concentré sur un milieu sélectif nutritif modifié SMSA,
puis l’étaler au moyen d’une tige de verre sur toute la surface du milieu nutritif. Ensemencer au moins
deux boîtes de milieu SMSA modifié sans flamber la tige entre 2 étalements du même échantillonnage.
5.2.
Au moyen de la même technique d’ensemencement par dilution, appliquer une suspension de 10 6
cellules/ml d’une souche de race 3/biovar 2 de Ralstonia solanacearum à titre de témoin positif sur une autre
série de boîtes de milieu nutritif SMSA modifié.
5.3.
Incuber les boîtes à 28 °C. Commencer le relevé des observations après 3 jours. En cas de résultats négatifs,
prolonger l’incubation jusqu’à 6 jours. Les souches virulentes de Ralstonia solanacearum forment des
colonies de couleur blanc laiteux, planes, irrégulières et fluides avec des centres rouges à violacés nettement
apparents, présentant des stries internes ou des verticilles.
5.4.
Purifier les colonies présentant une morphologie caractéristiques en les repiquant sur un milieu nutritif de
type général (appendice 1).
5.5.
Identifier les cultures pures (section II.4.1) et confirmer la présence de cultures positives au moyen d’un
test de pouvoir pathogène (section II.4.3).
Interprétation du résultat du test de dilution-étalement
Le test de dilution-étalement est négatif si aucune colonie bactérienne n’est apparue au bout de 6 jours, ou si aucune
colonie caractéristique de Ralstonia solanacearum n’est isolée, sous réserve qu’aucune colonie d’autres bactéries n’ait
été susceptible d’inhiber leur développement et que Ralstonia solanacearum est isolé à partir des témoins positifs.
Le test de dilution-étalement est positif si l’on peut isoler des colonies caractéristiques de Ralstonia solanacearum.
6. Test biologique
(d’après Janse, 1988)
6.1.
Utiliser 10 plantes tests des plantules sensibles de tomates ou d’aubergines, au stade de la troisième vraie
feuille. S’abstenir d’arroser les plantes tests durante les 24 heures précédant l’inoculation.
6.2.
Répartir 100 µl d’extrait concentré entre les différentes plantes tests. Inoculer dans la tige entre les
cotylédons et en plusieurs autres endroits.
6.3.
Inoculer par la même technique 10 plantules avec une suspension de 10 6 cellules/ml d’une souche de race
3/biovar 2 de Ralstonia solanacearum à titre de témoin positif et 10 autres avec le tampon de reprise des
culots, à titre de témoin négatif. Séparer les plantes du témoin positif des autres plantes pour éviter des
contaminations croisées.
6.4.
Poursuivre la culture des plantules jusqu’à 4 semaines à une température de 22 à 28 °C et avec un arrosage
quotidien et une humidité relative élevée. Séparer les plantes témoins positives des autres plantes, en évitant
toute contamination. Observer l’apparition des symptômes du flétrissement: épinastie, chlorose et/ou
atrophie.
6.5.
Isoler la bactérie à partir des plantules des plantes infectées (section II). Identifier les cultures pures d’après
leur morphologie caractéristique (section II.4.1) et confirmer la présence de cultures de Ralstonia
solanacearum au moyen d’un test de pouvoir pathogène (section II.4.3).
6.6.
Si cela est jugé nécessaire, vérifier l’absence d’infection sur des lots de plantes tests ne présentant aucun
symptôme d’infection. Prélever sur chaque plante échantillon, 2 cm au-dessus au point d’inoculation, une
section de tige de 1 cm. Homogénéiser les tissus en les plaçant dans une solution tampon de macération.
Procéder à un test d’ensemencement par dilution (section III.5.1). Si le test est positif, identifier les cultures
d’après leur morphologie caractéristique (section II.4.1) et confirmer la présence de cultures de Ralstonia
solanacearum au moyen d’un test de pouvoir pathogène (section II.4.3).
Interprétation des résultats du test biologique
Le test biologique est négatif si les plantes tests ne sont pas infectées par Ralstonia solanacearum sous réserve que
les plantes témoins inoculées soient infectées par Ralstonia solanacearum.
Le test biologique est positif si les plantes échantillons sont infectées par Ralstonia solanacearum.
7. Test d’enrichissement
(d’après J. G. Elphinstone et al., 1996)
7.1.
Verser 100 l d’extrait dans 3 ml de milieu nutritif modifié SMSA (appendice 7).
7.2.
Incuber pendant au moins 48 heures sans toutefois dépasser 72 heures à une température de 28°C, sans
refermer hermétiquement le bouchon du tube, pour permettre son aération.
7.3.
Fermer hermétiquement le bouchon et vortexer. Préparer des aliquots pour les test d’immunofluorescence
(cette section 2), le test ELISA (cette section 3) et/ou le test PCR (cette section 4).
8. Test du pouvoir pathogène
Voir section II.4.3.
Appendice 1
Milieux nutritifs d’isolement et de culture de Ralstonia Solanacearum
Gélose nutritive (NA)
Gélose nutritive (Difco)
23 g
Eau distillée
1 litre
Préparer le milieu par volumes d’un demi-litre dans des flacons d’un litre.
Dissoudre les ingrédients.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Refroidir à 50 °C. Verser dans les boîtes.
Gélose à base de levure-peptoe-glucose (YPGA)
Extrait de levure (Difco)
5 g
Bacto peptone (Difco)
5 g
D(+)-glucose (monohydraté)
10 g
Bacto agar (Difco)
15 g
Eau distillée
1 litre
Préparer des milieux d’un demi-litre dans des flacons d’un litre.
Dissoudre les ingrédients.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Refroidir à 50 °C. Verser dans les boîtes.
Gélose à base de saccharose-peptone (SPA)
Saccharose
20 g
Peptone
5 g
K2HPO4
0,5 g
MgSO4·7H2O
0,25 g
Bacto agar (Difco)
15 g
Eau distillée
1 litre
Préparer des milieux d’un demi-litre dans des flacons d’un litre.
Dissoudre les ingrédients. Ajuster le pH à 7,2-7,4, si nécessaire.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Refroidir à 50 °C. Verser dans les boîtes.
Milieu tétrazolium de Kelman
Acides casaminiques (Difco)
1 g
Bacto peptone (Difco)
10 g
Dextrose
5 g
Bacto agar (Difco)
15 g
Eau distillée
1 litre
Préparer des milieux d’un demi-litre dans des flacons d’un litre.
Dissoudre les ingrédients.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Refroidir à 50 °C.
Ajouter une solution aqueuse de chlorure de triphényltétrazolium (Sigma), stérilisée par filtration, pour obtenir une
concentration finale de 50 mg par litre.
Verser dans les boîtes.
Appendice 2
Matériel nécessaire à la préparation de l’échantillon
Tampon de macération: tampon au phosphate 50 mM à pH 7,0
Ce tampon est utilisé pour la macération des tissus.
Na2HPO4
4,26 g
KH2PO4
2,72 g
Eau distillée
1 litre
Dissoudre les ingrédients et contrôler le pH. Diviser en parties aliquotes, selon les besoins.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
L’ajout de 5% de polyvinyl pyrrolidone-40 000 MWT (PVP-40) est recommandé en cas d’application du test de PCR
direct pour réduire l’incidence de l’inhibition de l’amplification par les molécules aromatiques de l’extrait.
L’ajout d’un défloculant, d’un agent antimousse ou d’un antioxydant est recommandé dans les cas où les procédures
d’homologénéisation Waring Blender ou Ultra Turrax sont utilisées pour la macération des cônes de tissu de pommes
de terre.
Flocons de Lubrol
0,5 g par l
DC silicone antimousse
1,0 ml par l
Pyrophosphate tétrasodique
1,0 g par l
Passer à l’autoclave séparément. Ajouter jusqu’à obtention de la concentration souhaitée.
Tampon de reprise du culot: tampon au phosphate 10 mM à pH 7,2
Ce tampon est utilisé pour la resuspension et la dilution des culots de talons de pommes de terre.
Na2HPO4·12H2O
2,7 g
Na1H2PO4·2H2O
0,4 g
Eau distillée
1 litre
Dissoudre les ingrédients et contrôler le pH. Diviser en parties aliquotes, selon les besoins.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Appendice 3
Matériel nécessaire au test d’immunofluorescence
Tampon IF: PBS 10 mM à pH 7,2
Ce tampon est utilisé pour la dilution des antisérums.
Na2HPO4·12H2O
2,7 g
NaH2PO4·2H2O
0,4 g
NaCl
8,0 g
Eau distillée
1 litre
Dissoudre les ingrédients et contrôler le pH. Diviser en parties aliquotes, selon les besoins.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Tampon IF-Tween
Ce tampon est utilisé pour le lavage des lames. Ajouter 0,1 % de Tween 20 au tampon IF.
Glycérine tamponné au phosphate 0,1 M à pH 7,6
Ce tampon est utilisé comme fluide de support sur les puits de la lame IF pour renforcer la fluorescence.
Na2HPO4·12H2O
3,2 g
NaH2PO4·2H2O
0,15 g
Glycérol
50 ml
Eau distillée
100 ml
Appendice 4
Détermination du degré de contamination lors du test d’immunofluorescence
Superficie (S) d’un puits d’une lame multipuits
= πD2
où D = diamètre du puits.
(1)
Superficie(s) du champ de l’objectif
= πd2
où D = diamètre du champ.
(2)
Calculer le diamètre du champ (d) par mesure directe ou en appliquant les formules suivantes
s = πi2
(3)
G2K2x4
où i = coefficient du champ (dépend du type d’oculaire et varie de 8 à 24),
K = coefficient du tube (1 ou 1,25),
G = grossissement (100 x, 40 x, etc.) de l’objectif.
De (2), on tire
De (3), on tire
Compter le nombre de cellules fluorescentes typiques par champ (c ).
Compter le nombre de cellules fluorescentes typiques par puits (C)
C = c S
s
Compter le nombre de cellules fluorescentes typiques par millilitre d’extrait concentré (N)
N =C x 1000 x F
y
où y = volume d’extrait concentré sur le puits,
F = facteur de dilution de l’extrait concentré.
Appendice 5
Matériel nécessaire au test ELISA
Tampon carbonate double concentration à pH 9,6
Na2CO3
6,36 g
NaHCO3
11,72 g
Eau distillée
1 litre
Dissoudre les ingrédients et contrôler le pH. Diviser en parties aliquotes, selon les besoins.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Du sulfite de sodium à une concentration finale de 0,2 % peut être ajouté comme antioxydant si l’extrait contient
une fraction élevée de molécules aromatiques.
10 x PBS à pH 7,4
NaCl
80 g
KH2PO4
2 g
Na2HPO4·12H2O
29 g
KCl
2 g
Eau distillée
1 litre
Dissoudre les ingrédients et contrôler le pH. Diviser en parties aliquotes, selon les besoins.
Stériliser à l’autoclave a 121 °C pendant 15 minutes.
PBS-Tween (PBS-T)
10 x PBS
100 ml
10% de Tween 20
5 ml
d =
4s
(4)
π
πi2
4 X –––––––––
d =
G2K2x4
–––––––––––––– = i
π
GK
Eau distillée
895 ml
Tampon de blocage (anticorps) (doit être fraîchement préparé)
10 x PBS
10 ml
Polyvinyl pyrrolidone-44 000 MWT (PVP-44)
2 g
10% de Tween 20
0,5 g
Poudre de lait
0,5 g
Eau distillée
jusqu’à 100 ml
Solution substrat de phosphatase alcaline à pH 9,8
Diéthanolamine
97 ml
Eau distillée
800 ml
Mélanger et ajuster le pH à 9,8 avec de l’acide chlorhydrique (HCl).
Porter à 1 litre avec de l’eau distillée.
Ajouter 0,2 g de Mgcl2.
Dissoudre 2 comprimés de substrat de phosphatase de 5 mg (Sigma) par 15 ml de solution.
Appendice 6
Matériel nécessaire au test PCR
Oligonucléotide amorce
Amorce OLI-1 5’-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3’
Amorce Y-2 5’-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’
Pour matériel: voir Seal et al. (1993).
Appendice 7
Matériel nécessaire aux tests d’ensemencement sélectif et d’enrichissement
Milieu sélectif SMSA (Engelbrecht 1994, modifié par Elphinstone et al., 1996)
Milieu de culture
Acides casaminiques (Difco)
1 g
Bacto peptone (Difco)
10 g
Glycérol
5 ml
Gélose (Difco)
15 g
Eau distillée
1 litre
Préparer le milieu par volumes d’un demi-litre dans des flacons d’un litre.
Dissoudre les ingrédients et contrôler le pH. Si nécessaire, ajuster le pH à 6,5 avant l’autoclavage. Ralstonia
solanacearum ne se développera pas bien sur le milieu à pH > 7,0.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Refroidir à 50 °C.
Ajouter les ingrédients suivants (tous de Sigma) pour obtenir les concentrations finales spécifiées
Violet cristallisé
5 mg par l
Sulfate de polymixine B
100 mg par l
(approximativement 600 000 unités)
Sigma P-1004
Bacitracine (*)
25 mg par l
(approximativement 1 250 unités)
Sigma B-0125
Chloramphénicol
5 mg par l
Sigma C-3175
Péniciline-G
0,5 mg par l
(approximativement 825 unités)
Sigma P-3032
Sels de tétrazolium
50 mg par l
Dissoudre les ingrédients dans de l’éthanol à 70 % aux concentrations données pour le volume de milieu préparé.
Certains ingrédients (polymixine B et chloramphénicol) doivent être légèrement chauffés et agités.
Bouillon SMSA (Elphinstone et al., 1996)
Effectuer la même préparation que pour le milieu sélectif, mais supprimer la gélose ou les sels de tétrazolium.
Répartir dans des tubes Universal de 30 ml à usage unique, à raison de 3 ml par tube.
(*) Si jugée nécessaire, une augmentation de la concentration de bacitracine à 300 ppm peut réduire la contamination
par bactéries saprophytes sans réduire la récupération de Ralstonia solanacearum.
Références
Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962, Description of races in Pseudomonas
solanacearum.Phytopathology 52, 726
Cook, D.; Elizabeth, B. and Sequeira, L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of
restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons.
Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121.
Dinesen, I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus fromcomposite
samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142.
Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of
Pseudomonas solanacearum (Smith)Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.
Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of
Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5.
Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-
277.Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In
Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward an G.L. Hartman)
CAB International Oxford, 127-135.
Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data
on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351.
Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty
acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345.
Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a
tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293-695.
Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.)
Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 p.
Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-
PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536.
Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration
technique. Phytopathology 60, 838.
Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted
oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39,
1029-1034.
Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to
Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.
Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P.
syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide
primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594.
Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum
(synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental
Microbiology 61, 4262-4268.
Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid
detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111.
Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles.
International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295.
Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse, J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp.
sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide
probe. Züchtungsforschung 2, 266-269.
ANNEXE III
1. Dans tous les cas d’apparition suspectée pour lesquels on a constaté, lors du ou des test(s) de dépistage
pratiqué(s) selon la méthode décrite à l’annexe II pour le matériel végétal énuméré ou, dans tous les autres cas,
selon toute autre méthode officiellement agréée, une réaction positive à confirmer ou infirmer par cette
méthode, il convient de garder et de conserver dans des conditions appropriées
dans la mesure du possible, le lot, ou une partie de celui-ci (d’où l’échantillon a été prélevé) dans son
emballage d’origine avec étiquette,
dans la mesure du possible, la partie restante des échantillons,
tout extrait résiduel et matériel supplémentaire préparé pour le ou les test(s) de dépistage, tels que
les lames préparées en vue de tests d’immunofluorescence
et
toute documentation pertinente,
et ce, jusqu’à l’achèvement de ladite méthode.
2. En cas de confirmation de la présence de l’organisme, il convient de garder et de conserver dans des conditions
appropriées
le matériel visé au point 1,
un échantillon de la tomate contaminée ou un échantillon d’aubergine infecté par l’inoculation d’extrait de
tubercule ou de plante, le cas échéant
et
la culture isolée de l’organisme,
et ce, pendant au moins un mois après la procédure de notification prévue à l’article 5, paragraphe 2.
ANNEXE IV
Les éléments sur lesquels porte l’enquête visée à l’article 5, paragraphe 1, point a) i), sont les suivants, lorsqu’ils sont
pertinents
i)
lieux de production
culture, actuelle ou passée, de pommes de terre qui sont liées par clonage à des pommes de terre déclarées
contaminées par l’organisme,
culture, actuelle ou passée, de tomates provenant de la même source que les tomates déclarées contaminées
par l’organisme,
culture, actuelle ou passée, de pommes de terre ou de tomates placées sous contrôle officiel en raison de la
présence suspectée de l’organisme,
culture, actuelle ou passée, de pommes de terre qui sont liées par clonage à des pommes de terre qui ont
été cultivées dans des lieux de production déclarés contaminés par l’organisme,
culture de pommes de terre ou de tomates situées à proximité de lieux de production contaminés, et
notamment des lieux de production partageant du matériel et des installations de production soit
directement soit par l’intermédiaire d’un entrepreneur commun,
utilisation, pour l’irrigation ou le traitement par pulvérisation, d’eaux superficielles provenant d’une source
dont la contamination par l’organisme est confirmée ou suspectée,
utilisation, pour l’irrigation ou le traitement par pulvérisation, d’eaux superficielles provenant d’une source
utilisée en commun avec des lieux de production dont la contamination par l’organisme est confirmée ou
suspectée,
submersion actuelle ou passée par des eaux superficielles dont la contamination par l’organisme est
confirmée ou suspectée
et
ii) eaux superficielles utilisées pour l’irrigation ou le traitement par pulvérisation d’un ou plusieurs champs ou lieux
de production dont la contamination par l’organisme est confirmée ou qui ont submergé ceux-ci.
ANNEXE V
1. La détermination de l’étendue de la contamination probable visée à l’article 5, paragraphe 1, point a) iii) et point
c) iii), comprend les éléments suivants, lorsqu’ils sont pertinents
le matériel végétal énuméré cultivé en un lieu de production déclaré contaminé conformément à l’article 5,
paragraphe 1, point a) ii),
le(s) lieu(x) de production ayant, dans le système de production, un lien avec le matériel végétal énuméré qui
a été déclaré contaminé conformément à l’article 5, paragraphe 1, point a) ii), y compris ceux partageant
l’équipement et les installations de production soit directement soit par l’intermédiaire d’un entrepreneur
commun,
le matériel végétal énuméré produit dans le(s) lieu(x) de production visé(s) au tiret précédent, ou présent
dans ledit (lesdits) lieu(x) pendant la période où le matériel végétal énuméré qui a été déclaré contaminé
conformément à l’article 5, paragraphe 1, point a) ii), était présent dans les lieux de production visés au
premier tiret,
les entrepôts où le matériel végétal énuméré provenant des lieux de production visés ci-dessus est manipulé,
tout matériel, véhicule, récipient, entrepôt ou partie de ceux-ci, ainsi que tout autre objet, y compris
l’emballage, qui peut avoir été en contact avec le matériel végétal énuméré qui a été déclaré contaminé
conformément à l’article 5, paragraphe 1, point a) ii),
tout matériel végétal énuméré entreposé dans des structures ou objets visés au tiret précédent ou en
contact avec eux, avant leur nettoyage ou leur désinfection,
à la suite de l’enquête et des essais visés à l’article 5, paragraphe 1, point a) i), dans le cas de la pomme de
terre, les tubercules ou les plants ayant un lien de parenté ascendant ou collatéral, par clonage, et, dans le
cas de la tomate, une source commune avec le matériel végétal énuméré qui a été déclaré contaminé
conformément à l’article 5, paragraphe 1, point a) ii), et pour lequel, bien que les résultats des tests
concernant la présence de l’organisme aient été négatifs, il apparaît que la contamination est probable par le
biais d’un lien clonal,
le(s) lieu(x) de production du matériel végétal énuméré visé au tiret précédent,
le(s) lieu(x) de production du matériel végétal énuméré utilisant, pour l’irrigation ou le traitement par
pulvérisation, de l’eau déclarée contaminée conformément à l’article 5, paragraphe 1, point c) ii),
le matériel végétal énuméré produit dans des champs submergés par des eaux superficielles dont la
contamination par l’organisme est confirmée.
2. La détermination de la propagation possible visée à l’article 5, paragraphe 1, point a) iv) et point c) iii), comprend
i) dans les cas visés à l’article 5, paragraphe 1, point a) iv), la prise en considération des éléments suivants
la proximité d’autres lieux de production où le matériel végétal énuméré est cultivé,
la production et l’utilisation communes des stocks de pommes de terre de semence,
les lieux de production utilisant, pour l’irrigation ou le traitement par pulvérisation de matériel végétal
énuméré, des eaux superficielles dans les cas où il existe ou existait un risque d’écoulement d’eaux
superficielles à partir des lieux de production déclarés contaminés conformément à l’article 5,
paragraphe 1, point a) ii), ou un risque de submersion de ceux-ci;
ii) dans les cas où des eaux superficielles ont été déclarées contaminées conformément à l’article 5, paragraphe
1, point c) ii)
le(s) lieu(x) de production produisant du matériel végétal énuméré adjacents aux eaux superficielles
déclarées contaminées ou risquant d’être submergés par ces eaux,
tout bassin d’irrigation discrète associé aux eaux superficielles déclarées contaminées.
3. Le détail de la notification visée à l’article 5, paragraphe 2, premier alinéa, comprend
la date du signalement de l’apparition suspectée, conformément à l’article 4, et les dates du prélèvement
d’échantillons et de la confirmation de la présence de l’organisme conformément à l’article 5, selon le cas,
une description des éléments de la contamination déclarée et de la zone délimitée.
4. Le détail de la notification supplémentaire visée à l’article 5, paragraphe 2, deuxième alinéa, comprend
pour tout envoi ou lot de pommes de terre déclaré contaminé, les certificats prescrits à l’article 8 du
règlement du 28 mai 1993, le numéro de passeport ou d’enregistrement des producteurs de pommes de
terre, entrepôts collectifs et centres d’expédition, selon le cas,
pour tout envoi ou lot de plants de tomates déclaré contaminé, les certificats prescrits à l’article 8 du
règlement du 28 mai 1993 et le numéro de passeport, conformément à la liste de l’annexe V, partie A,
chapitre I, point 2.2 du règlement du 28 mai 1993.
la dénomination variétale et la catégorie pour les stocks de pommes de terre de semence et, si possible, dans
tous les autres cas,
toutes les autres informations que la Commission pourrait souhaiter en ce qui concerne le foyer déclaré.
ANNEXE VI
1. Les dispositions visées à l’article 6, paragraphe 1, sont les suivantes
incinération
ou
utilisation comme aliment destiné aux animaux après un traitement thermique de telle sorte qu’il n’y ait
aucun risque de survie de l’organisme
ou
enfouissement profond dans un site d’élimination ne présentant aucun risque d’écoulement sur des terres
agricoles ou de contact avec des sources d’eau susceptibles d’être utlisées pour l’irrigation de terres agricoles
ou
transformation industrielle par livraison directe et immédiate à une entreprise de transformation disposant
d’installations d’élimination des déchets officiellement agréées qui sont en conformité avec les dispositions
de l’annexe VII
ou
- d’autres mesures, pour qu’il soit établi qu’elles ne présentent pas de risque identifiable de propagation de
l’organisme; ces mesures sont immédiatement notifiées à la Commission et aux autres Etats membres.
2. L’utilisation ou l’élimination appropriées du matériel végétal énuméré visé à l’article 6, paragraphe 2, sous le
contrôle du service ou des Etats membres concernés et moyennant une communication adéquate entre les
organismes officiels compétents de manière à garantir ce contrôle à tout moment ainsi que l’agrément de
l’organisme officiel compétent de l’Etat membre où les pommes de terre doivent être conditionnées ou
transformées quant aux installations d’élimination des déchets visées aux premier et deuxième tirets,
comportent
i) pour les tubercules de pommes de terre
leur utilisation en tant que pommes de terre de conservation destinées à la consommation et leur
conditionnement, dans des sites disposant d’installations appropriées d’élimination des déchets, en
emballages prévus pour une livraison et une utilisation directes sans réemballage et destinés à une telle
livraison et utilisation directes
ou
leur utilisation en tant que pommes de terre de conservation destinées à la transformation industrielle
après livraison directe et immédiate à une entreprise de transformation disposant d’installations
appropriées d’élimination des déchets
ou
une autre utilisation ou élimination, pour autant qu’il soit établi qu’il n’y a pas de risque identifiable de
propagation de l’organisme et sous réserve de l’agrément du service. Ces mesures sont immédiatement
notifiées à la Commission et aux autres Etats membres;
ii) pour d’autres parties de plantes comprenant la tige et les débris de feuillage
leur destruction
ou
une autre utilisation ou élimination, pour autant qu’il soit établi qu’il n’y a pas de risque identifiable de
propagation de l’organisme; ces mesures sont notifiées à la Commission et aux autres Etats membres.
3. Les méthodes appropriées de décontamination des objets visés à l’article 6, paragraphe 3, sont le nettoyage et,
le cas échéant, la désinfection, de telle sorte qu’il n’y ait aucun risque identifiable de propagation de l’organisme;
elles sont appliquées sous la surveillance du service.
4. Les diverses mesures à mettre en œuvre par le service dans la zone délimitée établie conformément à l’article
5, paragraphe 1, point a) iv), et point c) iii), auxquelles il est fait référence à l’article 6, paragraphe 4, sont les
suivantes
4.1.
Dans les cas où des lieux de production ont été déclarés contaminés conformément à l’article 5,
paragraphe 1, point a) ii)
a) dans un champ ou une unité de production en culture protégée déclaré(e) contaminé(e) conformément
à l’article 5, paragraphe 1, point a) ii), soit
i) pendant au moins les quatre campagnes suivant la contamination déclarée
des mesures sont prises en vue d’éliminer les plants spontanés de pommes de terre et de
tomates et les autres plantes hôtes de l’organisme, y compris les plantes adventices de la famille
des solanacées
et
ne peuvent être plantés
ni tubercule ni plant de pommes de terre,
ni plant ni semence de tomates,
- en prenant en considération les caractéristiques biologiques de l’organisme
- ni d’autres plantes hôtes,
- ni des plantes de l’espèce Brassica pour lesquelles il existe un risque identifié de survie de
l’organisme,
- ni culture pour laquelle il existe un risque identifié de propagation de l’organisme,
- durant la première campagne de récolte des pommes de terre ou des tomates suivant la période
indiquée au tiret précédent et à la condition que le champ ait été déclaré exempt de plants
spontanés de pommes de terre et de tomates et d’autres plantes hôtes, y compris des plantes
adventices de la famille des solanacées, pendant deux campagnes consécutives au moins avant la
plantation
- dans le cas des pommes de terre, des pommes de terre de semence officiellement certifiées
sont plantées exclusivement en vue de la production de pommes de terre de conservation
et
- des recherches officielles comportant des essais sont effectuées conformément à l’article 2,
paragraphe 1,
- durant la campagne de récolte des pommes de terre ou des tomates suivant celle visée au tiret
précédent et après un cycle approprié de rotation, dans le cas des pommes de terre, des
pommes de terre de semence officiellement certifiées sont plantées pour la production de
semence ou de pommes de terre de conservation et, dans le cas des pommes de terre et des
tomates, des recherches officielles sont effectuées conformément à l’article 2, paragraphe 1
soit
ii) pendant les cinq campagnes suivant celle de la contamination déclarée
des mesures sont prises en vue d’éliminer les plants spontanés de pommes de terre et de
tomates et les autres plantes hôtes de l’organisme, y compris les plantes adventices de la famille
des solanacées
et
le champ est mis et maintenu, durant les trois premières années, soit en jachère nue, soit en
céréales selon le risque identifié soit en pâturage permanent, auquel cas il est fréquemment
fauché ras ou mis en pâturage intensif, soit enherbé pour la production de semence, puis
pendant les deux années suivantes, planté de plantes non-hôtes de l’organisme pour lesquelles
il n’y a pas de risque identifié de survie ou de propagation de l’organisme,
durant la première campagne de récolte de pommes de terre ou de tomates suivant la période
visée au tiret précédent
dans le cas des pommes de terre, des pommes de terre de semence officiellement certifiées
sont plantées pour la production de semence ou de pommes de terre de conservation et des
recherches officielles comportant des tests sont effectuées conformément à l’article 2,
paragraphe 1;
b) dans les autres champs
au cours de la campagne suivant la contamination déclarée
aucun tubercule ou plant de pomme de terre ni aucune autre plante hôte de l’organisme n’est
planté(e), et des mesures sont prises en vue d’éliminer les plants spontanés de pommes de terre
et de tomates ainsi que les autres plantes hôtes, y compris les plantes adventices de la famille
des solanacées, selon le cas
ou
dans le cas des tubercules de pommes de terre, des pommes de terre de semence officiellement
certifiées peuvent être plantées exclusivement en vue de la production de pommes de terre de
conservation à condition que les organismes officiels compétents acquièrent la certitude que le
risque constitué par les plants spontanés de pommes de terre et de tomates et autres plantes
hôtes de l’organisme, y compris les plantes adventices de la famille des solanacées, a été éliminé.
La récolte sur pied est inspectée à des moments opportuns, et des plants spontanés de pommes
de terre sont soumis à des essais visant à détecter la présence de l’organisme; en outre, dans le
cas des pommes de terre, les tubercules récoltés sont inspectés,
pendant la première campagne suivant celle visée au premier tiret
dans le cas des pommes de terre, seules des pommes de terre de semence officiellement
certifiées sont plantées, en vue de la production de pommes de terre de semence ou de
conservation,
pendant au moins la deuxième campagne suivant celle visée au premier tiret
dans le cas des pommes de terre, seules des pommes de terre de semence officiellement
certifiées ou des pommes de terre de semence cultivées sous contrôle officiel à partir de
pommes de terre de semence officiellement certifiées sont plantées en vue de la production de
pommes de terre de semence ou de conservation,
pendant chacune des campagnes visées aux tirets précédents, des mesures sont prises pour
éliminer les plants spontanés de pommes de terre et de tomates et les autres plantes hôtes de
l’organisme, y compris les plantes adventices de la famille des solanacées, et des recherches
officielles telles que prévues à l’article 2, paragraphe 1, sont effectuées; dans les cas où les
pommes de terre de semence sont plantées en vue de la production de semence, des tests sont
effectués sur les tubercules;
c) immédiatement après la déclaration de contamination conformément à l’article 5, paragraphe 1, point
a) ii), et pendant chacune des campagnes suivantes jusqu’à, et y compris, la première campagne pour
laquelle la récolte de pommes de terre ou de tomates dans le(s) champ(s) déclaré(s) contaminé(s) est
autorisée, comme indiqué au point a)
toutes les machines et installations de stockage sur le lieu de production servant à la production
des pommes de terre ou des tomates sont nettoyées et, si nécessaire, désinfectées selon des
méthodes appropriées au point 3,
des contrôles officiels des programmes d’irrigation ou de traitement par pulvérisation, y compris
l’interdiction de ces programmes sont mis en place en tant que de besoin pour prévenir la
propagation de l’organisme;
d) dans une unité de production en culture protégée déclarée contaminée conformément à l’article 5,
paragraphe 1, point a) ii), permettant le remplacement total du milieu de culture
aucun tubercule ou plant de pomme de terre ni aucune autre plante hôte de l’organisme, y compris
les plants et semences de tomate, n’est planté(e), sauf si ladite unité a été soumise à des mesures
sous contrôle officiel visant à l’élimination de l’organisme et de tout matériel végétal hôte, y
compris, au moins, le remplacement complet du milieu de culture et du matériel associé ainsi que
le nettoyage et, le cas échéant, la désinfection de ladite unité et de tout l’équipement, et si, par la
suite, elle a été agréée pour la production de pommes de terre ou de tomates par les organismes
officiels compétents
et
la production de pommes de terre est issue de pommes de terre de semence officiellement
certifiées ou de minitubercules ou de microplantes provenant de sources testées,
des contrôles officiels des programmes d’irrigation et de traitement par pulvérisation, y compris
l’interdiction de tels programmes, sont mis en place en tant que de besoin pour prévenir la
propagation de l’organisme.
4.2. À l’intérieur de la zone délimitée, sans préjudice des mesures énumérées au point 4.1, le service
a) immédiatement après la contamination déclarée et pendant au moins trois campagnes
aa)
dans les cas où la zone délimitée a été déterminée conformément à l’article 5, paragraphe 1, point
a) iv)
font surveiller par leurs organismes officiels compétents les installations pratiquant la culture,
le stockage et la manutention de tubercules de pommes de terre ou de tomates, ainsi que les
locaux des entreprises exploitant sous contrat du matériel utilisé pour la production de
pommes de terre ou de tomates,
exigent le nettoyage et, en tant que de besoin, la désinfection du matériel et des entrepôts de
ces installations, par les méthodes appropriées visées au point 3,
exigent que seules des semences certifiées ou des semences cultivées sous contrôle officiel
soient plantées pour toutes les cultures de pommes de terre dans ladite zone, et que soient
soumises à des tests les pommes de terre de semence récoltées sur des lieux de production
dont il a été établi qu’ils sont probablement contaminés en vertu de l’article 5, paragraphe 1,
point a) iii),
exigent, dans toutes les entreprises de la zone, la manutention séparée des pommes de terre
de semence et des pommes de terre de conservation,
procèdent à des recherches officielles conformément à l’article 2, paragraphe 1;
ab) dans les cas où des eaux superficielles ont été déclarées contaminées conformément à l’article 5,
paragraphe 1, point c) ii), ou incluses parmi les éléments de propagation possible de l’organisme
conformément à l’annexe V, point 2
- procèdent à une enquête annuelle à des moments opportuns, y compris au prélèvement
d’échantillons d’eaux superficielles et de plantes hôtes appropriées de la famille des solanacées
dans les sources appropriées ainsi qu’à des tests effectués
pour le matériel végétal énuméré, selon la méthode pertinente décrite à l’annexe II
ou
dans les autres cas, selon toute autre méthode officiellement agréée,
mettent en place des contrôles officiels des programmes d’irrigation et de traitement par
pulvérisation, y compris l’interdiction de l’utilisation de l’eau déclarée contaminée pour
l’irrigation et le traitement par pulvérisation du matériel végétal énuméré et, le cas échéant,
d’autres plantes hôtes, pour prévenir la propagation de l’organisme; cette interdiction peut
être réexaminée sur la base des résultats obtenus au cours de ladite enquête annuelle,
dans les cas où des effluents liquides sont contaminés, mettent en place des contrôles officiels
de l’élimination des déchets d’entreprises de transformation industrielle ou de
conditionnement traitant du matériel végétal énuméré;
b) établissent, en tant que de besoin, un programme de remplacement de tous les stocks de pommes de
terre de semence sur une période appropriée.
ANNEXE VII
Les installations d’élimination des déchets officiellement agréées et visées à l’annexe VI, point 1, quatrième tiret,
respectent les dispositions suivantes, de manière à prévenir le risque de propagation de l’organisme
i) les déchets de transformation de pommes de terre et de tomates (y compris les épluchures de pommes de terre
ainsi que les pommes de terre et tomates éliminées) et tous autres déchets solides de pommes de terre et de
tomates sont éliminés
par enfouissement profond dans un site d’élimination ne présentant aucun risque d’écoulement sur des terres
agricoles ou de contact avec des sources d’eau susceptibles d’être utilisées pour l’irrigation de terres
agricoles. Les déchets sont acheminés directement vers le site dans des conditions d’isolement prévenant
tout risque de perte des déchets
ou
par incinération;
ii) effluents liquides de transformation: avant leur élimination, les effluents liquides contenant des solides en
suspension sont soumis à un procédé de filtration ou de décantation afin d’éliminer ces solides. Ces derniers
sont éliminés ainsi qu’il est précisé au point i).
Les effluents liquides sont ensuite
chauffés à une température minimale de 70 °C pendant au moins 30 minutes, avant leur élimination
ou
éliminés d’une autre manière sous réserve d’agrément officiel et sous contrôle officiel, de telle sorte qu’il n’y
ait aucun risque de contact des déchets avec des terres agricoles ou des sources d’eau qui pourraient être
utilisées pour l’irrigation des terres agricoles; les modalités en sont notifiées aux autres Etats membres ainsi
qu’à la Commission.
Convention sur le recouvrement des aliments à l’étranger, conclue à New York, le 20 juin 1956. –
Communication de l’Australie.
Il résulte d’une notification du Secrétaire Général de l’Organisation des Nations Unies que par une communication,
reçue le 20 juin 2000, le Gouvernement australien a notfié au Secrétaire Général, conformément à l’article 2,
paragraphe 3 de la Convention, que l’autorité suivante a été désignée pour exercer les fonctions d’Autorité expéditrice
aussi bien que celles d’Institution intermédiaire, avec effet au 1er juillet 2000
«Child Support Agency
GPO Box 9815
Hobart Tasmania 7001
Australia
Téléphone
+61 3 6221 0187
Télécopieur
+61 3 6221 0180.»
Convention européenne d’extradition, signée à Paris, le 13 décembre 1957. – Déclaration de la
Slovaquie.
Il résulte d’une notification du Secrétaire Général du Conseil de l’Europe que la Slovaquie a fait la déclaration
suivante, consignée dans une lettre de son Représentant Permanent du 3 mai 2000, enregistrée au Secrétariat Général
le 4 mai 2000
La République slovaque invite les autres Parties contractantes à présenter leurs demandes et pièces
annexes lorsqu’elles ne sont rédigées, ni en langue slovaque, ni dans l’une des langues officielles du Conseil de l’Europe,
accompagnées d’une traduction dans l’une de ces langues.
Convention européenne d’entraide judiciaire en matière pénale, signée à Strasbourg, le 20 avril 1959.
– Ratification de l’Albanie.
Il résulte d’une notification du Secrétaire Général du Conseil de l’Europe qu’en date du 4 avril 2000 l’Albanie a ratifié
la Convention désignée ci-dessus, qui est entrée en vigueur à l’égard de cet Etat le 3 juillet 2000.
Les réserves et déclarations suivantes sont consignées dans l’instrument de ratification
L’exécution des commissions rogatoires aux fins de perquisition ou saisie d’objets est soumise aux conditions
stipulées à l’article 5, paragraphe 1, lettres «a» et «c».
Conformément à l’article 15, paragraphe 6, l’Albanie déclare qu’une copie de toutes les demandes d’entraide
judiciaire qui sont communiquées directement entre les autorités judiciaires, ainsi que les actes les accompagnant,
doivent être transmis en même temps au Ministère de la Justice.
Conformément à l’article 16, paragraphe 2, l’Albanie déclare que les demandes et pièces annexes doivent être
accompagnés d’une traduction dans l’une des langues officielles du Conseil de l’Europe, sauf dans le cas d’accords
conclus sur la base de la réciprocité.
Le Ministère de la Justice est considéré comme l’autorité judiciaire eu égard à l’article 24 de la Convention.
Protocole No 4 à la Convention de sauvegarde des Droits de l’Homme et des Libertés
fondamentales, reconnaissant certains droits et libertés autres que ceux figurant déjà dans la
Convention et dans le premier Protocole additionnel à la Convention, ouvert à la signature, à
Strasbourg, le 16 septembre 1963, tel qu’amendé par le Protocole No 11.
Protocole No 6 à la Convention de sauvegarde des Droits de l’Homme et des Libertés
fondamentales concernant l’abolition de la peine de mort, ouvert à la signature, à Strasbourg, le 28
avril 1983, tel qu’amendé par le Protocole No 11.
Protocole No 7 à la Convention de sauvegarde des Droits de l’Homme et des Libertés
fondamentales, ouvert à la signature, à Strasbourg, le 22 novembre 1984, tel qu’amendé par le
Protocole No 11.
Ratification de la Géorgie.
Il résulte d’une notification du Secrétaire Général du Conseil de l’Europe qu’en date du 13 avril 2000 la Géorgie a
ratifié les Actes désignés ci-dessus. Le Protocole No 4 est entré en vigueur à l’égard de cet Etat à la même date, soit
le 13 avril 2000. Le Protocole No 6 a pris effet le 1er mai 2000 et le Protocole No 7 est entré en vigueur le 1er juillet
2000 à l’égard de cet Etat.
Protocole facultatif se rapportant au Pacte international relatif aux droits civils et politiques, adopté
par l’Assemblée Générale des Nations Unies, le 16 décembre 1966. – Adhésion du Lesotho.
Il résulte d’une notification du Secrétaire Général de l’Organisation des Nations Unies qu’en date du 6 septembre
2000 le Lesotho a adhéré au Protocole désigné ci-dessus, qui entrera en vigueur à l’égard de cet Etat le 6 décembre
2000.
Convention européenne dans le domaine de l’information sur le droit étranger, signée à Londres, le 7
juin 1968. Adhésion de l’Azerbaïdjan.
Il résulte d’une notification du Secrétaire Général du Conseil de l’Europe qu’en date du 26 juin 2000 l’Azerbaïdjan a
adhéré à la Convention désignée ci-dessus, qui est entrée en vigueur à l’égard de cet Etat le 27 septembre 2000.
La déclaration suivante était consignée dans l’instrument d’adhésion
La République d’Azerbaïdjan désigne le Ministère de la Justice (1, Inshaatchilar Avenue, 370073 BAKU) comme
organe de réception et de transmission conformément à l’article 2 de la Convention.
Convention sur les substances psychotropes, conclue à Vienne, le 21 février 1971. – Adhésion des
Maldives.
Il résulte d’une notification du Secrétaire Général de l’Organisation des Nations Unies qu’en date du 7 septembre
2000 les Maldives ont adhéré à la Convention désignée ci-dessus, qui entrera en vigueur à l’égard de cet Etat le 6
décembre 2000.
Convention pour la protection du patrimoine mondial, culturel et naturel, faite à Paris, le 23
novembre 1972. – Acceptation de la Namibie.
Il résulte d’une notification du Directeur Général de l’Organisation des Nations Unies pour l’éducation, la science
et la culture qu’en date du 6 avril 2000 la Namibie a accepté la Convention désignée ci-dessus.
Conformément à son article 33, la Convention est entrée en vigueur pour la Namibie le 6 juillet 2000.
Accord sur le transfert des corps des personnes décédées, ouvert à la signature, à Strasbourg, le 26
octobre 1973. – Ratification de la France.
Il résulte d’une notification du Secértaire Général du Conseil de l’Europe qu’en date du 9 mai 2000 la France a ratifié
l’Accord désigné ci-dessus, qui est entré en vigueur à l’égard de cet Etat le 10 juin 2000.
La France a fait la déclaration suivante, consignée dans l’instrument de ratification
Déclaration portant communication en application de l’article 8 de l’Accord sur le transfert des corps des personnes
décédées
L’autorité française compétente pour la délivrance des laissez-passer mortuaires mentionnée aux articles 3,
paragraphe 1, et 5 de l’Accord est le préfet en sa qualité de représentant de l’Etat dans chaque département. L’autorité
française compétente pour déterminer les caractéristiques des cercueils conformément à l’article 6, paragraphes 1 et
3, de l’Accord est le Ministère chargé de la santé, après avis du Conseil supérieur d’hygiène publique.
Editeur: Service Central de Législation, 43, boulevard F.-D. Roosevelt, L-2450 Luxembourg
Imprimeur: Imprimerie de la Cour Victor Buck, s. à. r. l. Luxembourg