Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 21 listopada 2005 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie metod przeprowadzania badań właściwości fizykochemicznych, toksyczności i ekotoksyczności substancji i preparatów chemicznych

§ 1. W rozporzàdzeniu Ministra Zdrowia z dnia

28 lipca 2003 r. w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci

i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych (Dz. U. Nr 232, poz. 2343) wprowadza si´ nast´pujàce zmiany w za∏àczniku do rozporzàdzenia

1) „Spis metod” otrzymuje brzmienie okreÊlone

w za∏àczniku nr 1 do niniejszego rozporzàdzenia;

2) w cz´Êci A po pozycji „A.20 Rozpuszczanie/ekstrakcja polimerów w wodzie” dodaje si´ pozycj´

———————

1) Minister Zdrowia kieruje dzia∏em administracji rzàdowej

— zdrowie, na podstawie § 1 ust. 2 rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 31 paêdziernika 2005 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Zdrowia

(Dz. U. Nr 220, poz. 1901).

2) Niniejsze rozporzàdzenie dokonuje w zakresie swojej regulacji wdro˝enia dyrektywy 2004/73/WE z dnia 29 kwietnia 2004 r. dostosowujàcej po raz 29 do post´pu technicznego dyrektyw´ 67/548/EWG w sprawie zbli˝enia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszàcych si´ do klasyfikacji, pakowania i etykietowania

substancji niebezpiecznych (Dz. Urz. WE L 152

z 30.04.2004 r.).

3) Zmiany wymienionej ustawy zosta∏y og∏oszone w Dz. U.

z 2001 r. Nr 100, poz. 1085, Nr 123, poz. 1350 i Nr 125,

poz. 1367, z 2002 r. Nr 135, poz. 1145 i Nr 142, poz. 1187,

z 2003 r. Nr 189, poz. 1852, z 2004 r. Nr 96, poz. 959

i Nr 121, poz. 1263 oraz z 2005 r. Nr 179, poz. 1485.

„A.21. W∏aÊciwoÊci utleniajàce (ciecze)” w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 2 do niniejszego

rozporzàdzenia;

3) w cz´Êci B

a) pozycja B.1.BIS. otrzymuje brzmienie okreÊlone

w za∏àczniku nr 3 do niniejszego rozporzàdzenia,

b) pozycja B.1.TRIS. otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 4 do niniejszego rozporzàdzenia,

c) pozycja B.4. otrzymuje brzmienie okreÊlone

w za∏àczniku nr 5 do niniejszego rozporzàdzenia,

d) pozycja B.5. otrzymuje brzmienie okreÊlone

w za∏àczniku nr 6 do niniejszego rozporzàdzenia,

e) pozycja B.31. otrzymuje brzmienie okreÊlone

w za∏àczniku nr 7 do niniejszego rozporzàdzenia,

f) pozycja B.35. otrzymuje brzmienie okreÊlone

w za∏àczniku nr 8 do niniejszego rozporzàdzenia,

g) po pozycji „B.41. FototoksycznoÊç in vitro —

test wychwytu czerwieni oboj´tnej 3T3” dodaje

si´ pozycje

— „B.42. Uczulanie skóry: próba na miejscowym w´êle ch∏onnym” w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 9 do niniejszego rozporzàdzenia,

— „B.43 Badanie neurotoksycznoÊci na gryzoniach” w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku

nr 10 do niniejszego rozporzàdzenia;

c) „C.23. Przemiany tlenowe i beztlenowe w glebie” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku

nr 13 do niniejszego rozporzàdzenia,

4) w cz´Êci C po pozycji „C.20. Rozmna˝anie rozwielitki (Daphnia magna sp.)” dodaje si´ pozycje

d) „C.24. Przemiany tlenowe i beztlenowe w osadach wodnych” — w brzmieniu okreÊlonym

w za∏àczniku nr 14 do niniejszego rozporzàdzenia.

a) „C.21. Mikroorganizmy glebowe: Badanie przemian azotu” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 11 do niniejszego rozporzàdzenia,

b) „C.22. Mikroorganizmy glebowe: Badanie przemian w´gla” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 12 do niniejszego rozporzàdzenia,

§ 2. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie po up∏ywie

14 dni od dnia og∏oszenia.

Minister Zdrowia: Z. Religa

Za∏àczniki do rozporzàdzenia Ministra Zdrowia

z dnia 21 listopada 2005 r. (poz. 2119)

Za∏àcznik nr 1

SPIS METOD

Cz´Êç A. Metody przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych

A.1.

A.2.

A.3.

A.4.

A.5.

A.6.

A.8.

A.9.

A.10.

A.11.

A.12.

A.13.

A.14.

A.15.

A.16.

A.17.

A.18.

A.19.

A.20.

A.21.

Temperatura topnienia/krzepni´cia

Temperatura wrzenia

G´stoÊç wzgl´dna

Pr´˝noÊç par

Napi´cie powierzchniowe

RozpuszczalnoÊç w wodzie

Wspó∏czynnik podzia∏u

Temperatura zap∏onu

PalnoÊç (substancje i preparaty chemiczne sta∏e)

PalnoÊç (gazy)

PalnoÊç (w kontakcie z wodà)

W∏aÊciwoÊci piroforyczne cia∏ sta∏ych i cieczy

W∏aÊciwoÊci wybuchowe

Temperatura samozap∏onu (ciecze i gazy)

Wzgl´dna temperatura samozapalenia substancji/preparatów chemicznych sta∏ych

W∏aÊciwoÊci utleniajàce (substancje/preparaty chemiczne sta∏e)

Liczbowo Êrednia masa czàsteczkowa i rozk∏ad masy czàsteczkowej polimerów

ZawartoÊç polimerów o ma∏ej masie czàsteczkowej

Rozpuszczanie/ekstrakcja polimerów w wodzie

W∏aÊciwoÊci utleniajàce (ciecze)

Cz´Êç B. Metody oznaczania toksycznoÊci i innych skutków zdrowotnych

B.1.BIS. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà) — Metoda Ustalonej Dawki

B.1.TRIS. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà) — Metoda Klas ToksycznoÊci Ostrej

B.2.

ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna)

B.3.

ToksycznoÊç ostra (nara˝enie przez skór´)

B.4.

ToksycznoÊç ostra: dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na skór´

B.5.

ToksycznoÊç ostra: dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na oko

B.6.

ToksycznoÊç ostra (uczulenie skóry)

B.7.

ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga pokarmowa)

B.8.

ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga inhalacyjna)

B.9.

ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, po podaniu na skór´)

B.10.

MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych in vitro na komórkach ssaków)

B.11.

MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych na komórkach szpiku kostnego ssaków)

B.12.

MutagennoÊç (test mikrojàdrowy na erytrocytach ssaków in vivo)

B.13/14. MutagennoÊç (test rewersji mutacji na bakteriach)

B.15.

MutagennoÊç (test mutacji genowych na komórkach Saccharomyces cerevisiae)

B.16.

MutagennoÊç (test rekombinacji mitotycznych na komórkach Saccharomyces cerevisiae)

B.17.

MutagennoÊç (test mutacji genowych na komórkach ssaków)

B.18.

B.19.

B.20.

B.21.

B.22.

B.23.

B.24.

B.25.

B.26.

B.27.

B.28.

B.29.

B.30.

B.31.

B.32.

B.33.

B.34.

B.35.

B.36.

B.37.

B.38.

B.39.

B.40.

B.41.

B.42.

B.43.

— 16359 —

Poz. 2119

Uszkodzenie i naprawa DNA — Nieplanowa synteza DNA — Badanie na komórkach ssaków in vitro

Test wymiany chromatyd siostrzanych in vitro

Recesywne mutacje letalne zwiàzane z p∏cià u Drosophila melanogaster

Transformacja komórek ssaków in vitro

Dominujàce mutacje letalne u gryzoni

Aberracje chromosomowe spermatogoniów ssaków

Test plamkowy u myszy

Test dziedzicznych translokacji u myszy

ToksycznoÊç podchroniczna (90-dniowe powtarzane nara˝enie gryzoni drogà pokarmowà)

ToksycznoÊç podchroniczna (90-dniowe powtarzane nara˝enie drogà pokarmowà zwierzàt z gatunków

innych ni˝ gryzonie)

ToksycznoÊç podprzewlek∏a — nara˝enie przez skór´ (90-dniowe powtarzane nara˝enie na skór´

u gryzoni)

ToksycznoÊç podprzewlek∏a — nara˝enie inhalacyjne (90-dniowe powtarzane nara˝enie inhalacyjne

u gryzoni)

ToksycznoÊç przewlek∏a

Badanie toksycznoÊci w rozwoju przedporodowym

Dzia∏anie rakotwórcze

ToksycznoÊç przewlek∏a/dzia∏anie rakotwórcze

Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu jednopokoleniowego

Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu dwupokoleniowego

Toksykokinetyka

Opóêniona neurotoksycznoÊç zwiàzków fosforoorganicznych po nara˝eniu ostrym

Opóêniona neurotoksycznoÊç zwiàzków fosforoorganicznych po dawce powtarzanej — 28-dniowej

Nieplanowana synteza DNA na komórkach wàtroby ssaków

Dzia∏anie ˝ràce na skór´

FototoksycznoÊç in vitro — test wychwytu czerwieni oboj´tnej 3T3

Uczulanie skóry: próba na miejscowym w´êle ch∏onnym

Badanie neurotoksycznoÊci na gryzoniach

Cz´Êç C. Metody przeprowadzenia badaƒ ekotoksycznoÊci

C.1.

C.2.

C.3.

C.4.

C.4.I.

C.4.II.

C.4.III.

C.4.IV.

C.4.V.

C.4.VI.

C.4.VII.

C.5.

C.6.

C.7.

C.8.

C.9.

C.10.

C.11.

C.12.

C.13.

C.14.

C.15.

C.16.

C.17.

C.18.

C.19.

C.20.

C.21.

C.22.

C.23.

C.24.

ToksycznoÊç ostra (dla ryb)

ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.)

Hamowanie wzrostu glonów

PodatnoÊç na biodegradacj´

Uwagi ogólne

Zanikanie RWO (Metoda C.4—A)

Zmodyfikowane badanie przesiewowe wg OECD (Metoda C.4—B)

Wydzielanie CO2 (Metoda C.4—C)

Metoda respirometrii manometrycznej (Metoda C.4—D)

Metoda naczynia zamkni´tego (Metoda C.4—E)

Metoda M.I.T.I. (Metoda C.4—F)

Degradacja — biochemiczne zapotrzebowanie na tlen

Degradacja — chemiczne zapotrzebowanie na tlen

Degradacja — abiotyczny rozk∏ad przez hydroliz´ w zale˝noÊci od pH

ToksycznoÊç dla d˝d˝ownic. Badanie w sztucznej glebie

Biodegradacja. Test Zahn-Wellensa

Biodegradacja. Badania symulacyjne osadu czynnego

Biodegradacja. Badania stopnia hamowania oddychania osadu czynnego

Biodegradacja. Zmodyfikowany test SCAS

Biokoncentracja. Badanie przep∏ywowe na rybach

Badanie wzrostu narybku

Krótkoterminowa toksycznoÊç na zarodkach ryb i stadiach narybku

Badanie toksycznoÊci ostrej drogà pokarmowà na pszczo∏ach miodnych

Badanie toksycznoÊci ostrej kontaktowej na pszczo∏ach miodnych

Adsorpcja/desorpcja metodà wyznaczania stanu równowagi

Wyznaczanie wspó∏czynnika adsorpcji (KOC) na glebie i osadzie Êciekowym za pomocà chromatografii cieczowej (HPLC)

Rozmna˝anie rozwielitki (Daphnia magna sp.)

Mikroorganizmy glebowe: badanie przemian azotu

Mikroorganizmy glebowe: badanie przemian w´gla

Przemiany tlenowe i beztlenowe w glebie

Przemiany tlenowe i beztlenowe w osadach wodnych

Za∏àcznik nr 2

A.21. W¸AÂCIWOÂCI UTLENIAJÑCE (CIECZE)

1. METODA

1.4. Zasada metody badawczej

1.1. Wst´p

Badanà ciecz miesza si´ w stosunku 1:1 (masowo),

z w∏óknami celulozy i umieszcza si´ w naczyniu ciÊnieniowym. Je˝eli podczas mieszania lub nape∏niania naczynia nastàpi samozapalenie, to dalsze prowadzenie

badania nie jest konieczne.

Niniejsza metoda badania jest przewidziana do pomiaru zdolnoÊci cieczy do zwi´kszenia szybkoÊci spalania lub intensywnoÊci spalania materia∏ów palnych

lub do tworzenia mieszanin z materia∏ami palnymi,

które ulegajà samozapaleniu, je˝eli takie dwa sk∏adniki zostanà dok∏adnie zmieszane. Opiera si´ ona na metodzie ONZ przewidzianej dla cieczy utleniajàcych (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa) i jest z nià równowa˝na. Jednak˝e, metoda ta jako A.21 przewidziana jest

przede wszystkim do spe∏nienia wymagaƒ dyrektywy

67/548; wymagane jest porównanie tylko z jednà substancjà kontrolnà. Badanie i porównanie z dodatkowà

substancjà kontrolnà mo˝e byç konieczne, je˝eli przewiduje si´ zastosowanie wyników badaƒ do innych

celów1.

Badania nie trzeba wykonywaç, je˝eli z budowy

strukturalnej substancji mo˝na wnioskowaç o tym, ˝e

substancja nie reaguje egzotermicznie z materia∏em

palnym.

Przed wykonaniem badania wskazane jest poznanie informacji o w∏aÊciwoÊciach wybuchowych substancji/preparatów chemicznych.

Metody nie nale˝y stosowaç do badaƒ substancji/preparatów chemicznych sta∏ych, gazowych, wybuchowych, wysoce ∏atwopalnych oraz nadtlenków organicznych.

Niniejsze badanie nie musi byç przeprowadzane,

je˝eli dost´pne sà wyniki badania cieczy wed∏ug metody ONZ dla cieczy utleniajàcych (zobacz pozycja 1

piÊmiennictwa).

1.2. Definicje i jednostki

Âredni czas narastania ciÊnienia jest Êrednià ze

zmierzonych czasów narastania ciÊnienia dla mieszanin podatnych w warunkach oznaczenia do powodowania wzrostu ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa powy˝ej ciÊnienia atmosferycznego.

1.3. Substancje kontrolne

Alternatywnie, je˝eli badajàcy przewiduje, ˝e wyniki takiego badania mogà byç wykorzystane do innych celów1, to mo˝e uznaç za zasadne przeprowadzenie badania z dodatkowà substancjà kontrolnà3.

———————

1 Np. w ramach przepisów transportowych ONZ.

2 Przed badaniem kwas powinien byç zmiareczkowany w ce-

lu potwierdzenia st´˝enia.

nadchlorowy i 40

% (w/w) chloran sodu.

1.5. Kryteria wiarygodnoÊci badaƒ

W serii pi´ciu prób dla jednej substancji nie powinno byç wyników ró˝niàcych si´ o wi´cej ni˝ 30 %

od Êredniej arytmetycznej. Wyniki ró˝niàce si´ o wi´cej ni˝ 30 % od Êredniej arytmetycznej powinny byç

odrzucone, a procedury mieszania i nape∏niania powinny zostaç skorygowane, a badanie powtórzone.

1.6. Opis metody badawczej

1.6.1. CzynnoÊci przygotowawcze

1.6.1.1. Materia∏ palny

Jako materia∏ palny stosuje si´ wysuszone w∏ókna

celulozy o d∏ugoÊci w∏ókna pomi´dzy 50 i 250 µm oraz

przeci´tnej Êrednicy 25 µm4. Powinny byç one wysuszone do sta∏ej wagi w warstwie nie grubszej ni˝

25 mm w 105 °C przez 4 godz. i przechowywane

w eksykatorze, ze Êrodkiem suszàcym, a˝ do och∏odzenia i osiàgni´cia stanu wymaganego do stosowania.

ZawartoÊç wody w wysuszonej celulozie powinna byç

ni˝sza ni˝ 0,5 % (masowo) w przeliczeniu na suchà

mas´5. Je˝eli to konieczne, czas suszenia powinien

byç przed∏u˝ony a˝ do osiàgni´cia tej wartoÊci6. Ta sama partia celulozy powinna byç stosowana podczas

ca∏ego badania.

1.6.1.2. Aparatura

Jako substancj´2 kontrolnà stosuje si´ 65 % (masowo) roztwór wodny kwasu azotowego (czystoÊç

analityczna).

3 Wed∏ug odsy∏acza1 stosowane sà np.: 50

Je˝eli samozapalenie nie nastàpi∏o, to powinno

byç przeprowadzone pe∏ne badanie. Mieszanin´

ogrzewa si´ w naczyniu ciÊnieniowym i oznacza si´

Êredni czas narastania ciÊnienia od 690 kPa do

2070 kPa powy˝ej ciÊnienia atmosferycznego. Uzyskany czas porównuje si´ ze Êrednim czasem narastania

ciÊnienia dla mieszaniny 1:1 (masowo) substancji kontrolnej(ych) i celulozy.

% (w/w) kwas

1.6.1.2.1. Naczynie ciÊnieniowe

Wymagane jest naczynie ciÊnieniowe. Aparat sk∏ada si´ z cylindrycznego stalowego naczynia ciÊnieniowego o d∏ugoÊci 89 mm i Êrednicy zewn´trznej 60 mm

———————

4 Np. Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder

CF 11, katalog nr 4021 050.

np. za pomocà miareczkowania metodà

Karl-Fisher’a.

6 Alternatywnie, wskazana zawartoÊç wody mo˝e byç równie˝ osiàgana np. przez ogrzewanie w 105 °C pod obni˝onym ciÊnieniem przez 24 h.

5 Potwierdzone

(patrz rysunek A.21.1). Na przeciwnych stronach znajdujà si´ dwie p∏aszczyzny (zmniejszajàce przekrój naczynia do 50 mm) w celu u∏atwienia trzymania podczas zak∏adania g∏owiczki zapalajàcej i odpowietrznika. Naczynie, które ma wywiercony otwór o Êrednicy

20 mm, z jednego koƒca nagwintowany do g∏´bokoÊci

19 mm gwintem 1„zgodnie z normà British Standard

Pipe (BSP) lub jego odpowiednikiem metrycznym. Odprowadzenie ciÊnienia, w postaci bocznego ramienia,

jest wkr´cane w zakrzywionà powierzchni´ naczynia

ciÊnieniowego 35 mm od jednego koƒca i pod kàtem

90° do powierzchni uchwytowych. Na koƒcu ramienia

bocznego jest wywiercone gniazdo na g∏´bokoÊç

12 mm i nagwintowane gwintem 1/2”, zgodnie z BSP

lub jego odpowiednikiem metrycznym. Je˝eli jest to

konieczne, uszczelnienie wewn´trzne zawiera uszczelk´ gazoszczelnà. Rami´ boczne wchodzi 55 mm

w g∏àb korpusu naczynia ciÊnieniowego i ma otwór

o Êrednicy 6 mm. Koniec ramienia bocznego jest nagwintowany w celu unieruchomienia czujnika ciÊnienia. Do pomiaru ciÊnienia mo˝e byç u˝yte dowolne

urzàdzenie, pod warunkiem ˝e nie jest wra˝liwe na goràce gazy lub produkty rozk∏adu i jest odpowiednie do

odczytu szybkoÊci narastania ciÊnienia w przedziale

690—2070 kPa, w okresie nie d∏u˝szym ni˝ 5 ms. Najdalszy od ramienia bocznego koniec naczynia ciÊnieniowego jest zamykany g∏owiczkà zapalajàcà, wyposa˝onà w dwie elektrody, jedna odizolowana od korpusu, a druga uziemiajàca jest z nim po∏àczona. Drugi

koniec naczynia ciÊnieniowego jest zamykany aluminiowà membranà rozrywajàcà o gruboÊci 0,2 mm (ciÊnienie rozrywajàce wynosi ok. 2200 kPa) zamocowanà w gnieêdzie za pomocà korka z otworem 20 mm.

Je˝eli to konieczne, pod g∏owiczkà zapalajàcà stosuje

si´ oboj´tne uszczelnienie w celu zapewnienia hermetycznoÊci. Urzàdzenie podtrzymujàce (rysunek A.21.2)

umo˝liwia w∏aÊciwà pozycj´ zestawu podczas badania. Zwykle sk∏ada si´ ono z p∏ytki z mi´kkiej stali

o wymiarach 235 mm x 184 mm x 6 mm z przymocowanym do niej wspornikiem o d∏ugoÊci 185 mm i wyprofilowanym kwadratowo zag∏´bieniem na naczynie

ciÊnieniowe o wymiarach 70 mm x 70 mm x 4 mm.

Âciany boczne wyprofilowanego kwadratowo wspornika sà naci´te na dwóch przeciwleg∏ych stronach na

jednym koƒcu jego d∏ugoÊci tak, ˝e konstrukcja ma

dwie p∏askie boczne nogi wznoszàce si´ na wysokoÊç

86 mm ponad nienaruszony przekrój wspornika. Drugie koƒce tych p∏askich Êcian sà obci´te pod kàtem 60°

do poziomu i przyspawane do p∏ytki podstawy. Po jednej stronie górnej cz´Êci podstawy przekroju wspornika wykonana jest szczelina o wymiarach 22 mm szerokoÊci i 46 mm g∏´bokoÊci tak, ˝e gdy zestaw naczynia

ciÊnieniowego jest opuszczany w g∏àb wspornika, najpierw podparty jest we wsporniku zacisk zapalajàcy,

a boczne rami´ umieszczone jest w tej szczelinie. Podk∏adka stalowa o d∏ugoÊci 30 mm i gruboÊci 6 mm jest

dospawana do dolnej wewn´trznej cz´Êci przedniej

wspornika, która dzia∏a jako przek∏adka dystansowa.

Dwie Êruby 7 mm z p∏askim ∏bem (lub motylkowe)

wkr´cone w Êcian´ przeciwleg∏à s∏u˝à do mocowania

naczynia ciÊnieniowego w miejscu. Dwie 12 mm szerokoÊci taÊmy stalowe o gruboÊci 6 mm, przyspawane

do cz´Êci bocznych, stykajà si´ z podstawà wspornika,

podpierajàc naczynie ciÊnieniowe od do∏u.

Poz. 2119

1.6.1.2.2. Uk∏ad zapalajàcy

Uk∏ad zapalajàcy zawiera drut Ni/Cr o d∏ugoÊci

25 cm, Êrednicy 0,6 mm i opornoÊci 3,85 ohm/m. Drut

zwija si´, za pomocà pr´ta o Êrednicy 5 mm w spiral´

i przymocowuje si´ do elektrod g∏owiczki zapalajàcej.

Spirala powinna mieç jednà z form pokazanych na rysunku A.21.3. Odleg∏oÊç pomi´dzy dnem naczynia

a dolnà cz´Êcià spirali powinna wynosiç 20 mm. Je˝eli elektrody nie sà nastawialne, to koƒce drutu zapalajàcego pomi´dzy spiralà a dnem naczynia powinny

byç odizolowane za pomocà ceramicznej gilzy. Drut

rozgrzewa si´ wskutek przep∏ywu pràdu sta∏ego o nat´˝eniu co najmniej 10 A.

1.6.2. Wykonanie badania7

Urzàdzenie, zestawione razem z czujnikiem ciÊnienia i uk∏adem grzewczym, ale bez membrany rozrywajàcej umieszczonej na miejscu, jest podtrzymywane

od do∏u przez g∏owiczk´ zapalajàcà. Badanà ciecz

w iloÊci 2,5 g miesza si´ z 2,5 g wysuszonej celulozy

w szklanej zlewce za pomocà szklanej bagietki8. Ze

wzgl´dów bezpieczeƒstwa, mieszanie powinno byç

przeprowadzone spoza os∏ony pomi´dzy wykonawcà

a mieszaninà. Je˝eli mieszanina zapali si´ podczas

mieszania lub nape∏niania, dalsze wykonywanie badania nie jest konieczne. Mieszanin´ dodaje si´, ma∏ymi

porcjami przez zawór, do naczynia ciÊnieniowego

w sposób gwarantujàcy, ˝e mieszanina zosta∏a u∏o˝ona wokó∏ spirali zapalajàcej i jest z nià w dobrym kontakcie. Wa˝ne jest, aby spirala nie zosta∏a zniekszta∏cona podczas operacji nape∏niania, co mo˝e mieç wp∏yw

na uzyskanie b∏´dnych wyników9.

Membran´ rozrywajàcà umieszcza si´ na miejscu

i zabezpiecza si´ jà, wkr´cajàc korek w celu uszczelnienia. Za∏adowane naczynie z membranà rozrywajàcà

umieszczonà do góry przenosi si´ na miejsce (podstaw´), w którym b´dzie wykonywany zap∏on, umieszczone w odpowiednim opancerzonym wyciàgu lub komorze do spalania. Koƒcówki zasilania powinny zostaç pod∏àczone do zewn´trznych koƒcówek g∏owiczki

zapalajàcej i powinien zostaç w∏àczony pràd o nat´˝eniu 10 A. Czas pomi´dzy poczàtkiem mieszania i w∏àczeniem zasilania nie powinien przekraczaç 10 minut.

Sygna∏ wytwarzany przez czujnik ciÊnienia rejestruje si´ przez odpowiedni uk∏ad, który umo˝liwia

ocen´ i rejestrowanie sta∏ego zapisu czasu narastania

ciÊnienia (np. przekaênik po∏àczony jest z rejestratorem). Mieszanin´ ogrzewa si´ a˝ do p´kni´cia membrany rozrywajàcej lub przez co najmniej 60 s. Je˝eli

membrana rozrywajàca nie p´k∏a, to mieszanin´ nale———————

7 Mieszaniny utleniacza z celulozà powinny byç traktowane

jako potencjalnie wybuchowe i wszelkie czynnoÊci powinny byç wykonywane ostro˝nie.

8 W praktyce, mo˝e to byç uzyskiwane poprzez przygotowanie mieszaniny 1:1 (masowo) mieszaniny cieczy badanej

i celulozy w iloÊci wi´kszej ni˝ potrzebna do próby i do

przeniesienia 5 ± 0,1g do naczynia ciÊnieniowego. Do ka˝dej próby mieszanina powinna byç Êwie˝o przygotowana.

9 W szczególnoÊci nie nale˝y dopuÊciç do kontaktu pomi´dzy sàsiadujàcymi zwojami spirali.

˝y pozostawiç do och∏odzenia przed ostro˝nym rozebraniem urzàdzenia, stosujàc zabezpieczenia przed

dzia∏aniem nadciÊnienia, które mo˝e w nim wyst´powaç. Wykonuje si´ pi´ç prób z cieczà badanà i substancjà(ami) kontrolnà(ymi). Zapisuje si´ czas narastania ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa powy˝ej ciÊnienia atmosferycznego. Potem oblicza si´ Êredni czas

narastania ciÊnienia.

W pewnych przypadkach ciecze mogà powodowaç wzrost ciÊnienia (zbyt wysoki lub zbyt niski), spowodowany przez reakcje chemiczne nieb´dàce charakterystycznymi dla w∏aÊciwoÊci utleniajàcych. W takich przypadkach mo˝e byç konieczne powtórzenie

badania z materia∏em oboj´tnym, np. diatomitem (ziemià okrzemkowà), zast´pujàcym celuloz´ w celu wyjaÊnienia rodzaju reakcji.

Poz. 2119

2. WYNIKI

Czas narastania ciÊnienia zarówno dla substancji

badanej i substancji kontrolnej(ych). Czas narastania

ciÊnienia z badaƒ z materia∏em oboj´tnym, o ile zosta∏y przeprowadzone.

2.1. Opracowanie wyników

Oblicza si´ Êredni czas narastania ciÊnienia dla cieczy badanej i substancji kontrolnej(ych).

Oblicza si´ Êredni czas narastania ciÊnienia z badaƒ z materia∏em oboj´tnym (o ile zosta∏y przeprowadzone).

Niektóre przyk∏ady wyników podano w tabeli

A.21.1.

Tabela A.21.1.

Przyk∏ady wynikówd)

a) Ârednia wartoÊç z porównawczych prób mi´dzylaboratoryjnych.

b) Maksymalnego ciÊnienia 2070 kPa nie uzyskano.

c) Roztwory nasycone powinny byç przygotowywane w 20 °C.

d) Zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa dotyczàca klasyfikacji wed∏ug algorytmu ONZ dla transportu.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie z badaƒ

Sprawozdanie z badaƒ musi zawieraç nast´pujàce

informacje

— identyfikacj´, sk∏ad, czystoÊç badanej substancji

itp.,

— st´˝enie substancji badanej,

— zastosowanà procedur´ suszenia celulozy,

— obliczone Êrednie czasy narastania ciÊnienia,

— odst´pstwa od niniejszej metody i ich przyczyny,

— wszystkie informacje dodatkowe lub uwagi dotyczàce interpretacji wyników.

3.2. Interpretacja wyników10

Wyniki badaƒ ocenia si´ na podstawie

— obserwacji, czy mieszanina cieczy badanej i celulozy zapala si´ samorzutnie, oraz

— zawartoÊç wody w wysuszonej celulozie,

— wyniki badaƒ,

— wyniki badaƒ z materia∏em oboj´tnym, je˝eli by∏y

wykonywane,

———————

10 Zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa; w celu interpretacji wy-

ników na podstawie zaleceƒ ONZ dla transportu stosowanych dla ró˝nych substancji kontrolnych.

— porównania Êredniego czasu przyj´tego dla narastania ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa z substancjà(ami) kontrolnà(ymi).

Ciecz uwa˝a si´ za utleniajàcà, je˝eli

Poz. 2119

W celu unikni´cia fa∏szywie pozytywnych wyników, je˝eli to konieczne, powinny byç równie˝

uwzgl´dnione przy ich interpretacji wyniki uzyskane

podczas badania cieczy z materia∏em oboj´tnym.

— mieszanina 1:1 (masowo), cieczy i celulozy zapala

si´ samorzutnie lub

4. PIÂMIENNICTWO

— mieszanina 1:1 (masowo) cieczy i celulozy wykazuje Êredni czas narastania ciÊnienia mniejszy lub

równy Êredniemu czasowi narastania ciÊnienia dla

mieszaniny 1:1 masowo, 65 % (masowo) wodnego roztworu kwasu azotowego i celulozy.

1) Recommendations on the Transport of Dangerous

Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised

edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev.

3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

Rysunek A.21.1.

Naczynie ciÊnieniowe

A Korpus naczynia ciÊnieniowego

B Korek blokujàcy membran´ rozrywajàcà

C G∏owiczka zapalajàca

D Mi´kka podk∏adka o∏owiana

E Membrana rozrywajàca

F Rami´ boczne

G G∏owica czujnika ciÊnienia

H Podk∏adka

J Elektroda zaizolowana

K Elektroda uziemiona

L Izolacja

M Króciec stalowy

N Wy˝∏obienie na odkszta∏cenie podk∏adki

Rysunek A.21.2.

Urzàdzenie podtrzymujàce

Rysunek A.21.3.

Uk∏ad zapalajàcy

A Spirala zapalajàca

B Izolacja

C Elektrody

D G∏owiczka zapalajàca

Uwaga: mogà byç stosowane oba te ustawienia.

Za∏àcznik nr 3

B.1.BIS. TOKSYCZNOÂå OSTRA (PODANIE DROGÑ POKARMOWÑ) — METODA USTALONEJ DAWKI

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD Nr 420 (2001).

1.1. Wst´p

W tradycyjnych metodach szacowania ostrej toksycznoÊci poszukiwanym wskaênikiem si∏y dzia∏ania

toksycznego jest padni´cie zwierzàt. W 1984 r. Brytyjskie Towarzystwo Toksykologiczne zaproponowa∏o

nowe podejÊcie do badaƒ toksycznoÊci ostrej opierajàce si´ na kolejnym podawaniu dawek o ustalonej

wielkoÊci (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). PodejÊcie

to umo˝liwia unikni´cie traktowania padni´cia zwierzàt jako kryterium oceny, gdy˝ polega na obserwacji

wyraênych cech dzia∏ania toksycznego ujawniajàcych

si´ po kolejnym podaniu dawki o ustalonej wielkoÊci.

Po brytyjskich (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa) i mi´dzynarodowych (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa) badaniach walidacyjnych przeprowadzonych in vivo procedura zosta∏a przyj´ta w 1992 r. jako metoda badawcza. Nast´pnie w kolejnych badaniach (zobacz pozycje

4, 5 i 6 piÊmiennictwa) oszacowano wiarygodnoÊç

Metody Ustalonej Dawki przy zastosowaniu statystycznych modeli matematycznych. Badania in vivo

oraz matematyczne modelowania wykaza∏y, ˝e procedura jest powtarzalna, w porównaniu z metodami tradycyjnymi umo˝liwia zmniejszenie liczby stosowanych zwierzàt oraz pozwala uszeregowaç substancje

w sposób zbli˝ony do innych nietradycyjnych metod

badania toksycznoÊci ostrej.

Wytyczne co do wyboru najbardziej w∏aÊciwej metody badawczej do oceny toksycznoÊci ostrej podane

sà w Wytycznych do Badaƒ ToksycznoÊci Ostrej po Podaniu Drogà Pokarmowà (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Dokument ten zawiera tak˝e dodatkowe informacje, dotyczàce przeprowadzenia badaƒ Metodà

B.1.bis i ich interpretacji.

Zasadà metody jest, aby w badaniu g∏ównym stosowane by∏y tylko Êrednio toksyczne dawki; unikaç nale˝y podawania dawek, które prawdopodobnie b´dà

powodowaç padni´cie zwierzàt. Nie nale˝y podawaç

równie˝ substancji w dawkach, co do których jest

pewnoÊç, ˝e powodujà znaczny ból i cierpienie z powodu ich ostrego dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego.

Zwierz´ta w agonii lub w widoczny sposób cierpiàce,

bàdê te˝ wykazujàce oznaki silnego i trwa∏ego bólu,

powinny byç w sposób humanitarny uÊmiercone,

a w interpretacji wyników powinny zostaç traktowane

tak samo, jak zwierz´ta, które pad∏y podczas badania.

Kryteria podj´cia decyzji o uÊmierceniu zwierzàt

w agonii lub cierpiàcych oraz wytyczne co do rozpoznawania przewidywanej lub nieuchronnej Êmierci sà

przedmiotem osobnych Wytycznych (zobacz pozycja 8

piÊmiennictwa).

Stosujàc t´ metod´, mo˝na uzyskaç informacje na

temat niebezpiecznych w∏aÊciwoÊciach substancji

oraz uszeregowaç je i sklasyfikowaç zgodnie z zasada-

mi Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS)

dotyczàcymi klasyfikacji substancji chemicznych ze

wzgl´du na toksycznoÊç ostrà (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa).

Przed przystàpieniem do badania wykonujàcy je

powinien wziàç pod uwag´ wszystkie dost´pne informacje na temat badanej substancji. Do takich informacji zalicza si´ to˝samoÊç i budow´ chemicznà substancji, jej w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne, wyniki innych badaƒ toksykologicznych in vitro lub in vivo, dane toksykologiczne dla substancji o podobnej budowie chemicznej oraz przewidywane zastosowanie(a) tej substancji. Takie informacje sà konieczne w celu przekonania wszystkich zainteresowanych, ˝e badanie jest

odpowiednie dla ochrony zdrowia ludzkiego i odpowiednie do w∏aÊciwego wyboru dawki poczàtkowej.

1.2. Definicje

ToksycznoÊç ostra po podaniu drogà pokarmowà

oznacza wszystkie szkodliwe skutki, które wyst´pujà

po podaniu substancji drogà pokarmowà w pojedynczej dawce lub w wielu dawkach, podanych w czasie

24 godzin.

Padni´cie opóênione: oznacza, ˝e zwierz´ nie pada

lub nie znajduje si´ w stanie agonii w czasie 48 godzin

od podania badanej substancji, ale pada póêniej,

w czasie 14-dniowego okresu obserwacji.

Dawka: jest iloÊcià badanej substancji podanej

zwierz´ciu. Dawk´ wyra˝a si´ jako mas´ badanej substancji przypadajàcà na jednostk´ masy cia∏a zwierz´cia (np.: mg/kg).

ToksycznoÊç widoczna: jest ogólnym poj´ciem

opisujàcym wyraêne oznaki zatrucia wyst´pujàce po

podaniu badanej substancji (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa) takie, ˝e w nast´pnej najwy˝szej ustalonej dawce mogà wystàpiç trwa∏e objawy ostrego bólu

i cierpienia, stan agonii (kryteria podano w Humane

Endpoints Guidance Document (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) lub prawdopodobne jest padni´cie

wi´kszoÊci zwierzàt.

GHS: Âwiatowy System Zharmonizowany. Wspólne przedsi´wzi´cie OECD (zdrowie i Êrodowisko), Komitetu Ekspertów ONZ ds. Transportu Towarów Niebezpiecznych (w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne), ILO (informacja o zagro˝eniach) i koordynowane przez Mi´dzyorganizacyjny Program Zarzàdzania Chemikaliami

(IOMC).

Nieuchronne padni´cie: oznacza spodziewany

stan agonii lub padni´cie po przed∏u˝eniu czasu obserwacji. Do objawów mogàcych wskazywaç na taki

stan u gryzoni zalicza si´ konwulsje, po∏o˝enie boczne,

pozycj´ le˝àcà i drgawki (bardziej szczegó∏owy opis

mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa).

LD50 (medialna dawka Êmiertelna): jest statystycznie obliczonà pojedynczà dawkà substancji, która spowoduje Êmierç 50 % zwierzàt po podaniu drogà pokarmowà. WartoÊç LD50 jest wyra˝ana w postaci masy

badanej substancji przypadajàcej na jednostk´ masy

badanego zwierz´cia (mg/kg).

Dawka graniczna: odnosi si´ do górnego ograniczenia dawki w badaniu (2000 lub 5000 mg/kg).

Prognozowane padni´cie: wyst´powanie objawów klinicznych Êwiadczàcych o padni´ciu w przewidywalnym okresie w przysz∏oÊci przed up∏ywem zakoƒczenia doÊwiadczenia, np. niezdolnoÊç do picia

wody lub spo˝ywania paszy (bardziej szczegó∏owy

opis mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance

Document, zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa).

1.3. Zasada metody badawczej

Grupy zwierzàt jednej p∏ci nara˝ane sà wed∏ug

procedury etapowej przy zastosowaniu ustalonych

dawek 5, 50, 300 i 2000 mg/kg (wyjàtkowo mo˝e byç

brana pod uwag´ dodatkowa dawka 5000 mg/kg, zobacz pkt 1.6.2). Poziom dawki poczàtkowej jest wybierany na podstawie badania wst´pnego i jest to dawka,

która powinna powodowaç wystàpienie pewnych objawów toksycznoÊci, jednak bez wystàpienia jej

ostrych skutków lub ÊmiertelnoÊci. Objawy kliniczne

i warunki powiàzane z wystàpieniem bólu, cierpienia

i nieuchronnego padni´cia sà szczegó∏owo opisane

w oddzielnych Wytycznych OECD (zobacz pozycja 8

piÊmiennictwa). Nast´pne grupy zwierzàt mogà byç

nara˝ane na badanà substancj´ podawanà w wy˝szych lub ni˝szych ustalonych dawkach, w zale˝noÊci

od wyst´powania lub niewyst´powania objawów toksycznoÊci lub ÊmiertelnoÊci. Procedura ta jest kontynuowana a˝ do podania substancji w dawce powodujàcej widoczne objawy toksycznoÊci lub do momentu,

gdy stwierdzi si´ nie wi´cej ni˝ jeden przypadek padni´cia lub gdy w najwy˝szej dawce nie notuje si´ ˝adnych skutków, bàdê te˝ padni´cie wyst´puje w dawce

najni˝szej.

1.4. Opis metody badawczej

1.4.1. Wybór gatunku zwierzàt

Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝

mogà byç równie˝ stosowane inne gatunki gryzoni.

W badaniach zazwyczaj u˝ywa si´ samic (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Jest to uzasadnione opisanymi

w literaturze wynikami konwencjonalnych badaƒ s∏u˝àcych do okreÊlenia wartoÊci LD50, które wykazujà, ˝e

zazwyczaj istnieje niewielka ró˝nica we wra˝liwoÊci

pomi´dzy samcami a samicami gryzoni; a w tych przypadkach, w których obserwowane sà ró˝nice, samice

sà na ogó∏ nieco bardziej wra˝liwe (zobacz pozycja 10

piÊmiennictwa). Je˝eli wiedza o toksykologicznych lub

toksykokinetycznych w∏aÊciwoÊciach strukturalnie podobnych substancji wskazuje na wi´ksze prawdopodobieƒstwo, ˝e samce mogà byç bardziej wra˝liwe,

wówczas do badaƒ powinny byç u˝yte szczury tej p∏ci.

Gdy badanie prowadzi si´ na samcach, nale˝y podaç

wyraêne uzasadnienie.

Poz. 2119

Stosowane powinny byç m∏ode, dojrza∏e, zdrowe

osobniki powszechnie u˝ywanych ras laboratoryjnych. Samice powinny byç dziewicze i nieci´˝arne.

Ka˝de zwierz´ na poczàtku doÊwiadczenia powinno

byç w wieku 8 do 12 tygodni, a jego masa powinna zawieraç si´ w przedziale ±20 % Êredniej masy uprzednio nara˝anych zwierzàt.

1.4.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt

Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych

powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç

stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. Zwierz´ta mogà

byç pogrupowane w klatkach wg otrzymywanej dawki, ale liczba zwierzàt przypadajàcych na klatk´ nie mo˝e zak∏ócaç dok∏adnych obserwacji ka˝dego zwierz´cia.

1.4.3. Przygotowanie zwierzàt

Zwierz´ta sà wybierane losowo, znakowane dla

umo˝liwienia identyfikacji ka˝dego osobnika i w celu

aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych przetrzymywane w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpocz´ciem podawania substancji.

1.4.4. Przygotowanie okreÊlonych dawek substancji

i ich podawanie

Zasadniczo substancje badane, niezale˝nie od

dawki, powinny byç podawane w sta∏ej obj´toÊci poprzez zró˝nicowanie st´˝enia podawanego preparatu.

Gdy bada si´ produkt koƒcowy w postaci ciek∏ej lub

mieszanin´, wówczas zastosowanie nierozcieƒczonej

badanej substancji, tj. w sta∏ym st´˝eniu, mo˝e byç

bardziej odpowiednie i wymagane przez niektóre

urz´dy dla nast´pujàcej w dalszej kolejnoÊci oceny ryzyka tej substancji. W ka˝dym z tych przypadków nie

nale˝y przekraczaç maksymalnej obj´toÊci podawanej dawki. Maksymalna obj´toÊç cieczy, która mo˝e

byç podana jednorazowo, zale˝y od rozmiarów zwierz´cia. U gryzoni obj´toÊç ta nie powinna przekraczaç

1 ml/100 g masy cia∏a, jednak˝e w przypadku roztworów wodnych mo˝na wziàç pod uwag´ obj´toÊç

2 ml/100 g masy cia∏a. O ile jest to tylko mo˝liwe, to

w przypadku ró˝nych postaci (formulacji) podawanego preparatu zaleca si´ w pierwszej kolejnoÊci u˝ycie

wodnych roztworów/zawiesin/emulsji, a w nast´pnej

kolejnoÊci wskazane sà roztwory/zawiesiny/emulsje

w oleju (np.: oleju kukurydzianym), a w ostatecznoÊci

roztwory w innych rozpuszczalnikach. Powinny byç

znane w∏asnoÊci toksykologiczne noÊników innych ni˝

woda.

Podawane roztwory muszà byç przygotowane

na krótko przed ich podaniem, chyba ˝e stabilnoÊç preparatu w okresie d∏u˝szym od okresu, w jakim przeprowadzono badanie, jest znana i akceptowalna.

1.5. Sposób post´powania

1.5.1. Podawanie substancji

Badana substancja jest podawana jednorazowo

w pojedynczej dawce za pomocà sondy do˝o∏àdkowej

lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W przypadku

gdy jednorazowe podanie ca∏ej dawki jest niemo˝liwe,

mo˝e byç ona podana w porcjach, przy czym czas podania ca∏ej dawki nie mo˝e przekroczyç 24 godzin.

Zwierz´ta przed podaniem badanej substancji powinny byç g∏odzone (np. w przypadku szczurów pozostawia si´ wod´, ale paszy nie podaje si´ w nocy;

w przypadku myszy pozostawia si´ wod´, a paszy nie

podaje si´ w okresie 3—4 godzin przed doÊwiadczeniem). Po okresie g∏odzenia nale˝y zwierz´ta zwa˝yç

i podaç im badanà substancj´. Po podaniu substancji,

w przypadku szczurów, pasz´ podaje si´ po up∏ywie

3—4 godzin, a w przypadku myszy po up∏ywie

1—2 godzin. Je˝eli substancje podaje si´ w porcjach

w ciàgu pewnego okresu, wówczas w zale˝noÊci od

d∏ugoÊci trwania tego okresu mo˝e okazaç si´ konieczne dostarczenie zwierz´tom wody i paszy.

1.5.2. Badanie wst´pne

Celem badania wst´pnego jest ustalenie w∏aÊciwej dawki poczàtkowej stosowanej w badaniu w∏aÊciwym. Badana substancja jest podawana pojedynczym

zwierz´tom w sposób sekwencyjny wed∏ug schematów zamieszczonych w Schemacie 1. Badanie wst´pne koƒczy si´, gdy mo˝na podjàç decyzj´ co do wyboru dawki poczàtkowej stosowanej w badaniu w∏aÊciwym lub gdy w najni˝szej ustalonej dawce obserwuje

si´ padni´cie badanych zwierzàt.

Dawka poczàtkowa do badania wst´pnego jest

wybierana z ustalonych poziomów 5, 50, 300

i 2000 mg/kg jako dawka majàca spowodowaç widocznà toksycznoÊç, jeÊli mo˝na to przewidzieç na podstawie wyników badaƒ in vivo i in vitro tej samej substancji lub substancji podobnej strukturalnie. W przypadku braku takich informacji dawkà poczàtkowà b´dzie 300 mg/kg.

Pomi´dzy nara˝aniem kolejnych zwierzàt powinien byç zachowany odst´p wynoszàcy przynajmniej

24 godziny. Wszystkie zwierz´ta powinny byç obserwowane przez przynajmniej 14 dni.

W wyjàtkowych sytuacjach, usprawiedliwionych

tylko szczególnymi wymaganiami prawnymi, mo˝na

rozwa˝aç zastosowanie dodatkowej, wy˝szej dawki

5000 mg/kg (Kryteria Klasyfikacji). W celu zapobie˝enia nadmiernym cierpieniom zwierzàt nie jest zalecane badanie w zakresach Kategorii 5 wg GHS (dawki

2000 do 5000 mg/kg). Powinno byç ono brane pod

uwag´ tylko wtedy, gdy istnieje du˝e prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki takiego badania b´dà mia∏y istotne znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt.

W przypadkach gdy badane zwierz´ nara˝one

w badaniu wst´pnym na substancj´ w najni˝szej ustalonej dawce (5 mg/kg) padnie, wskazanà procedurà

Poz. 2119

jest zakoƒczenie badaƒ i przypisanie substancji do Kategorii 1 wg GHS (jak przedstawiono w Schemacie 1).

Je˝eli wymagane jest dalsze potwierdzenie tej klasyfikacji, mo˝na przeprowadziç dodatkowà procedur´, nara˝ajàc drugie zwierz´ w dawce 5 mg/kg. Je˝eli i to

zwierz´ padnie, wówczas potwierdza si´ zaklasyfikowanie substancji do Kategorii 1 wg GHS i natychmiast

koƒczy badanie. Je˝eli drugie zwierz´ prze˝yje, wówczas nara˝ane sà maksymalnie trzy dodatkowe zwierz´ta w dawce 5 mg/kg. Ze wzgl´du na wysokie ryzyko ÊmiertelnoÊci, w celu zapobie˝enia zb´dnym cierpieniom, zwierz´ta powinny byç nara˝ane jedno po

drugim. Odst´p czasowy pomi´dzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach powinien byç wystarczajàcy do ustalenia, czy poprzednie zwierz´ mo˝e prze˝yç. Je˝eli padnie drugie zwierz´, natychmiast wstrzymuje si´ podawanie substancji w kolejnych dawkach,

a badanie si´ koƒczy. Wystàpienie przypadku drugiego padni´cia (bez wzgl´du na liczb´ zwierzàt pozosta∏ych przy ˝yciu w momencie zakoƒczenia badania) powoduje zaklasyfikowanie substancji do wyniku A

(2 lub wi´cej padni´ç), przestrzegana jest zasada klasyfikacji wg Schematu 2 w ustalonej dawce 5 mg/kg

(Kategoria 1 — je˝eli wystàpi∏y 2 lub wi´cej przypadki

padni´ç lub Kategoria 2 — je˝eli nie wystàpi∏ wi´cej

ni˝ 1 przypadek padni´cia). Ponadto Schemat 3 przedstawia wytyczne co do klasyfikacji wed∏ug systemu

UE obowiàzujàcego do czasu wdro˝enia systemu

GHS.

1.5.3. Badanie w∏aÊciwe

1.5.3.1. Liczba zwierzàt i poziomy dawek

Dzia∏ania, które nale˝y podjàç po badaniu wst´pnym, podane sà w Schemacie 2. Konieczne b´dzie dokonanie wyboru jednej z trzech mo˝liwoÊci: zaprzestanie badaƒ i przypisanie substancji do odpowiedniej

klasy zagro˝enia, badanie w wy˝szej ustalonej dawce

lub badanie w ni˝szej ustalonej dawce. Jednak˝e w celu oszcz´dzenia cierpieƒ zwierz´tom dawka powodujàca padni´cia w badaniu wst´pnym nie mo˝e byç powtarzana w badaniu w∏aÊciwym (zobacz Schemat 2).

DoÊwiadczenie wykazuje, ˝e najbardziej prawdopodobnym wynikiem badania substancji w dawce poczàtkowej b´dzie mo˝liwoÊç sklasyfikowania jej i dalsze doÊwiadczenia nie b´dà konieczne.

Dla ka˝dej badanej dawki nale˝y u˝yç pi´ciu zwierzàt jednej p∏ci. WÊród tych pi´ciu zwierzàt powinno

znajdowaç si´ jedno zwierz´, któremu podawana by∏a

substancja w odpowiednio ustalonej dawce w trakcie

badania wst´pnego, oraz cztery dodatkowe zwierz´ta

(z wyjàtkiem sytuacji, gdy dawka stosowana w badaniu g∏ównym nie by∏a stosowana w badaniu wst´pnym).

Odst´p czasowy pomi´dzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach jest okreÊlony przez pojawienie si´, czas trwania i nasilenie objawów toksycznoÊci.

Badanie zwierzàt poprzez nara˝anie na substancj´

w kolejnej dawce powinno byç wstrzymane do czasu

uzyskania pewnoÊci co do prze˝ycia uprzednio nara˝onych zwierzàt. Zalecany jest okres przerwy trwajàcy

3 do 4 dni pomi´dzy podawaniem substancji w kolej-

nych dawkach, aby umo˝liwiç zaobserwowanie objawów opóênionej toksycznoÊci. Odst´p czasowy powinien byç w∏aÊciwie dostosowany np. w przypadku niedajàcych si´ wyjaÊniç reakcji.

Gdy pod uwag´ bierze si´ zastosowanie najwy˝szej ustalonej dawki 5000 mg/kg, to powinna byç stosowana procedura podana w Kryteriach Klasyfikacji

(zobacz tak˝e pkt 1.6.2.).

1.5.3.2. Badanie dawki granicznej

Badanie dawek granicznych wykonywane jest

w sytuacjach, gdy osoba przeprowadzajàca doÊwiadczenie posiada informacje, ˝e badany materia∏ jest

prawdopodobnie nietoksyczny, tj. gdy przejawia on

objawy toksycznoÊci w dawkach powy˝ej górnych,

wymaganych przez prawo poziomów. Informacje

o toksycznoÊci badanego materia∏u mogà pochodziç

z badaƒ podobnych zwiàzków lub podobnych zarówno pod wzgl´dem to˝samoÊci sk∏adników, jak i sk∏adu

procentowego produktów. W przypadku braku informacji o toksycznoÊci bàdê te˝ przypuszczeƒ, ˝e badany materia∏ jest toksyczny, nale˝y przeprowadziç badanie w∏aÊciwe.

Stosujàc typowà procedur´ do badania wst´pnego z zastosowaniem dawki poczàtkowej 2000 mg/kg

(lub wyjàtkowo 5000 mg/kg) i nast´pnie badanie z wykorzystaniem czterech zwierzàt nara˝anych na substancj´ w dawce na tym samym poziomie, spe∏nia si´

wymagania badania dawki granicznej zgodne z opisanà procedurà.

1.6. Obserwacje

Obserwacje nale˝y prowadziç dla ka˝dego pojedynczego zwierz´cia, przynajmniej raz podczas pierwszych 30 minut po podaniu badanej substancji i okresowo podczas pierwszych 24 godzin, ze zwróceniem

szczególnej uwagi podczas pierwszych 4 godzin. Obserwacj´ zwierzàt nale˝y przeprowadziç codziennie

przez 14 dni, z wyjàtkiem przypadków, gdy muszà byç

one usuwane z badania i w sposób humanitarny

uÊmiercane lub gdy sà martwe. Okres obserwacji nie

powinien byç jednak ustalony sztywno. Powinien byç

okreÊlony przez objawy toksyczne, czas ich rozpocz´cia i d∏ugoÊç okresu powrotu do stanu normalnego

i dlatego, gdy uzna si´ to za konieczne, mo˝e byç odpowiednio wyd∏u˝ony. Okresy pojawiania si´ i znikania objawów toksycznoÊci sà wa˝ne, szczególnie

w przypadku istnienia tendencji do wystàpienia opóênienia objawów toksycznoÊci (zobacz pozycja 11 piÊmiennictwa). Wszystkie obserwacje nale˝y systematycznie zapisywaç, prowadzàc dla ka˝dego zwierz´cia

osobne zapisy.

Dodatkowe obserwacje b´dà konieczne, gdy zwierz´ta nadal przejawiajà objawy toksycznoÊci. Nale˝y

obserwowaç zmiany na skórze i sierÊci, oczach i b∏onach Êluzowych, a tak˝e w uk∏adzie oddechowym,

uk∏adzie krà˝enia, oÊrodkowym i autonomicznym

uk∏adzie nerwowym oraz w aktywnoÊci somatomotorycznej i zachowaniu. Uwag´ nale˝y zwróciç na pojawienie si´ drgawek, konwulsji, Êlinotoku, biegunki, le-

Poz. 2119

targu, snu i Êpiàczki. Pod uwag´ nale˝y braç zasady

i kryteria podane w Humane Endpoints Guidance Document (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Zwierz´ta

w agonii i wykazujàce objawy silnego cierpienia lub

bólu powinny byç w sposób humanitarny uÊmiercone. Dla zwierzàt uÊmiercanych lub martwych nale˝y

mo˝liwie dok∏adnie zanotowaç czas padni´cia.

1.6.1. Masa cia∏a

Masy cia∏a poszczególnych osobników powinny

byç okreÊlone na krótko przed rozpocz´ciem podawania badanej substancji i nast´pnie powinny byç okreÊlone przynajmniej raz w tygodniu. Zmiany masy cia∏a powinny byç obliczone i zapisywane. Pod koniec

badania zwierz´ta, które prze˝y∏y, nale˝y ponownie

zwa˝yç i nast´pnie w sposób humanitarny je uÊmierciç.

1.6.2. Badania patologiczne

Wszystkie zwierz´ta powinny byç poddane badaniom makroskopowym podczas sekcji (tak˝e te, które

padnà podczas badania lub sà uÊmiercane z powodów humanitarnych). Nale˝y zanotowaç wszystkie

zmiany patologiczne, które wystàpi∏y u ka˝dego zwierz´cia. Nale˝y wziàç pod uwag´ badania mikroskopowe narzàdów wykazujàcych zmiany patologiczne

u zwierzàt prze˝ywajàcych 24 lub wi´cej godzin od poczàtku podawania badanej substancji, poniewa˝ mogà

one dostarczyç u˝ytecznych informacji.

2. WYNIKI

Nale˝y dostarczyç dane pochodzàce od ka˝dego

zwierz´cia indywidualnie. Dodatkowo wszystkie dane

powinny byç zebrane w formie tabeli przedstawiajàcej

dla ka˝dej badanej grupy: liczb´ u˝ytych zwierzàt, liczb´ zwierzàt przejawiajàcych objawy toksycznoÊci, liczb´ zwierzàt martwych i uÊmierconych podczas badania, czas padniecia poszczególnych zwierzàt, opis

i czas wystàpienia objawów toksycznoÊci i odwracalnoÊci reakcji oraz wyniki sekcji.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje

Badana substancja

— stan skupienia, czystoÊç, gdy ma to znaczenie, tak˝e w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (w tym izomeryzacja),

— dane identyfikacyjne, w tym numer CAS.

NoÊnik (jeÊli jego u˝ycie by∏o konieczne)

— uzasadnienie wyboru noÊnika, jeÊli nie by∏a nim

woda.

Badane zwierz´ta

— gatunek/szczep,

— stan mikrobiologiczny zwierzàt, jeÊli jest znany,

— liczba, wiek i p∏eç zwierzàt (w tym tak˝e uzasadnienie zastosowania samców zamiast samic),

— êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania,

pasza itp.

Warunki doÊwiadczenia

— szczegó∏owe dane dotyczàce postaci (formulacji)

badanej substancji, w tym stan skupienia podanego materia∏u,

— szczegó∏owe dane dotyczàce sposobu podawania

badanej substancji, w tym podawane obj´toÊci

i czas podawania,

— szczegó∏owe dane dotyczàce paszy i jakoÊci wody,

w tym typ i êród∏o paszy, êród∏o wody,

— podstawy wyboru dawki poczàtkowej.

Wyniki

— uj´te w tabeli dane dla ka˝dego zwierz´cia i poziomu dawki (tj. zwierz´ta wykazujàce objawy toksycznoÊci ∏àcznie ze ÊmiertelnoÊcià, nasilenie

i czas trwania objawów),

— uj´te w tabeli dane dotyczàce masy cia∏a i jej

zmian,

— masa cia∏a poszczególnych zwierzàt w dniu podawania badanej substancji i nast´pnie w odst´pach

tygodniowych oraz w dniu padni´cia bàdê uÊmiercenia,

— data i czas padni´cia,

— czas pojawienia si´ objawów toksycznoÊci i informacje, czy by∏y one odwracalne dla ka˝dego zwierz´cia,

— jeÊli sà dost´pne, wyniki sekcji i wyniki badaƒ histopatologicznych ka˝dego zwierz´cia.

Dyskusja i interpretacja wyników.

Wnioski.

4. PIÂMIENNICTWO

1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the

classification of substances and preparations on

the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3,

85—92.

Poz. 2119

2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker,

R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the

testing of substances and preparations for their

acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279—291.

3) Van den Heuvel M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international

validation of the fixed — dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol., 28, 469—482.

4) Whithead and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed — dose procedure. Fd. Chem.

Toxicol., 30, 313—324.

5) Stallard and Whitehead, A.(1995). Reducing the

numbers in the fixed — dose procedure. Human

Exptl. Toxicol., 14, 315—323.

6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P.

(2000). Statistical evaluation of modifications to

the fixed — dose procedure (manuscript in preparation).

7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24.

Paris.

8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used

in Safety Evaluation. Environmental Health and

Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the

28th Joint Meeting of the Chemicals Committee

and the Working Party on Chemicals in November

1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/

pages/home/displaygeneral/0,3380,ENdocuments-521-14-no-24-no-0,FF.html].

10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D.,

Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L.,Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up—and—Down, Conventional

LD50, and Fixed—Dose Acute Toxicity Procedures.

Fd. Chem. Toxicol. 33, 223—231.

11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute

Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

SCHEMAT 1: SCHEMAT BADANIA WST¢PNEGO

SCHEMAT 1: SCHEMAT BADANIA WST¢PNEGO

SCHEMAT 2: SCHEMAT BADANIA W¸AÂCIWEGO

SCHEMAT 2: SCHEMAT BADANIA W¸AÂCIWEGO

KRYTERIA KLASYFIKACJI

KRYTERIA KLASYFIKACJI BADANYCH SUBSTANCJI

ZE SPODZIEWANYMI WARTOÂCIAMI LD50 PRZEKRACZAJÑCYMI 2000 mg/kg BEZ POTRZEBY BADANIA

Kryteria zagro˝enia Kategorii 5 sà przeznaczone dla

identyfikacji substancji o stosunkowo niskiej toksycznoÊci ostrej, które w pewnych okolicznoÊciach mogà

stanowiç zagro˝enie dla wra˝liwej populacji. Przewiduje si´, ˝e substancje te wykazujà wartoÊç LD50 po podaniu do˝o∏àdkowym lub naskórnym w zakresie 2000 do

5000 mg/kg lub równowa˝ne dawki poprzez inne drogi

nara˝enia. Substancje badane mogà byç zaklasyfikowane do klasy zagro˝enia wed∏ug klasyfikacji zdefiniowanej przez: 2000 mg/kg<LD50<5000 mg/kg (Kategoria

5 w GHS) w nast´pujàcych przypadkach

a) je˝eli skierowane do tej kategorii przez schemat

badawczy (Schemat 2) w oparciu o wyst´powanie

ÊmiertelnoÊci,

b) je˝eli istniejà wiarygodne dowody, które wykazujà

˝e wartoÊç LD50 b´dzie mieÊci∏a si´ w zakresie Kategorii 5; lub inne badania na zwierz´tach lub skutki toksyczne u ludzi wskazujà ostre dzia∏anie na

zdrowie ludzkie,

c) przez ekstrapolacj´, oszacowanie lub pomiar danych, je˝eli przypisanie do bardziej niebezpiecznej

klasy nie jest gwarantowane i

— dost´pne sà wiarygodne informacje wskazujàce na znaczàce skutki toksyczne u ludzi lub

— nie obserwuje si´ ÊmiertelnoÊci podczas badania a˝ do wartoÊci Kategorii 4 po podaniu drogà pokarmowà, lub

— gdy opinia ekspertów potwierdza znaczàce objawy kliniczne toksycznoÊci, podczas badania a˝

do wartoÊci Kategorii 4, z wyjàtkiem biegunki,

nastroszenia sierÊci lub nietypowego wyglàdu

zewn´trznego, lub

— gdy opinia ekspertów potwierdza wiarygodne

informacje wskazujàce potencja∏ znaczàcych

ostrych objawów w innych badaniach na zwierz´tach.

BADANIE W DAWKACH POWY˚EJ 2000 mg/kg

W wyjàtkowych sytuacjach, uzasadnionych tylko

przez szczególne wymagania prawne, pod uwag´ brane mo˝e byç zastosowanie najwy˝szej ustalonej dawki 5000 mg/kg. Dla dobra zwierzàt badanie dawki

5000 mg/kg nie jest zalecane i powinno byç stosowane tylko wtedy, gdy istnieje du˝e prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki takich badaƒ b´dà mia∏y bezpoÊrednie

znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt (zobacz

pozycja 9 piÊmiennictwa).

Badanie wst´pne

Zasady rzàdzàce procedurà etapowà podane

w Schemacie 1 sà rozszerzone do poziomu dawki

5000 mg/kg. Stàd, jeÊli w badaniu wst´pnym stosuje

si´ dawk´ poczàtkowà 5000 mg/l, to wynik A (padni´cie) b´dzie wymaga∏ drugiego zwierz´cia do badaƒ

w dawce 2000 mg/kg, wyniki B i C (widoczne objawy

toksycznoÊci lub brak objawów toksycznoÊci) pozwoli

na wybór dawki 5000 mg/kg do badania w∏aÊciwego.

Podobnie, jeÊli stosuje si´ innà dawk´ poczàtkowà ni˝

5000 mg/kg, to wtedy badanie podà˝y do 5000 mg/kg

w przypadku wyników B lub C w 2000 mg/kg; wynik A b´dzie dyktowa∏ dawk´ 2000 mg/kg do badania

w∏aÊciwego, a wyniki B i C dawk´ 5000 mg/kg jako poczàtkowà do badania w∏aÊciwego.

Badania w∏aÊciwe

Zasady rzàdzàce procedurà etapowà podane

w Schemacie 2 sà rozszerzone do poziomu dawki

5000 mg/kg. Stàd, jeÊli w badaniu wst´pnym stosuje

si´ dawk´ poczàtkowà 5000 mg/kg, to wynik A (≥ 2

padni´cia) b´dzie wymaga∏ drugiej grupy do badaƒ

w dawce 2000 mg/kg; wynik B (toksycznoÊç widoczna

i/lub ≤ 1 padni´cie) lub C (brak objawów dzia∏ania toksycznego) spowoduje brak klasyfikacji substancji wed∏ug GHS. Podobnie, jeÊli stosuje si´ dawk´ poczàtkowà innà ni˝ 5000 mg/kg, to badanie podà˝y do

5000 mg/kg w przypadku wyniku C w 2000 mg/kg; nast´pnie wynik A 5000 mg/kg spowoduje przypisanie

substancji do Kategorii 5 GHS, a wyniki B lub C spowodujà brak klasyfikacji substancji.

METODA BADAWCZA B.1.bis — Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug schematu UE na okres przejÊciowy do pe∏nego wdro˝enia

Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

SCHEMAT 3

METODA BADAWCZA B.1.bis — Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug schematu UE na okres przejÊciowy do pe∏nego wdro˝enia Âwiatowego

Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

SCHEMAT 3

Za∏àcznik nr 4

B.1.TRIS. TOKSYCZNOÂå OSTRA (PODANIE DROGÑ POKARMOWÑ) — METODA KLAS TOKSYCZNOÂCI

OSTREJ

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 423 (2001).

1.1. Wst´p

Metoda klas toksycznoÊci ostrej (zobacz pozycja 1

piÊmiennictwa) jest etapowà procedurà, w której wykorzystuje si´ na ka˝dym etapie 3 zwierz´ta jednej

p∏ci. W zale˝noÊci od ÊmiertelnoÊci i/lub stanu agonii

zwierzàt konieczne mogà byç Êrednio 2—4 etapy dla

ustalenia ostrej toksycznoÊci badanej substancji. Procedura ta jest odtwarzalna, wykorzystuje si´ ma∏à

iloÊç zwierzàt. Umo˝liwia ona uszeregowanie substancji w sposób podobny, jak inne metody badania toksycznoÊci ostrej. Metoda klasy toksycznoÊci ostrej

opiera si´ na szacunkach biometrycznych (zobacz pozycje 2, 3, 4 i 5 piÊmiennictwa) w ustalonych, odpowiednio rozdzielonych dawkach tak, aby umo˝liwiç zaszeregowanie substancji do odpowiedniej klasy i oceniç zagro˝enia. Metoda przyj´ta w 1996 r. poddana zosta∏a procesom walidacji in vivo w stosunku do danych wartoÊci LD50 uzyskanych z piÊmiennictwa krajowego (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa) i mi´dzynarodowego (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa).

Wytyczne, co do wyboru najbardziej w∏aÊciwej

metody badawczej s∏u˝àcej temu celowi, podane sà

w Wytycznych ToksycznoÊci Ostrej po Podaniu Drogà

Pokarmowà (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Dokument ten zawiera tak˝e dodatkowe informacje, dotyczàce przeprowadzenia badaƒ i ich interpretacji Metodà B.1.tris.

Zasadà metody jest, aby nie podawaç substancji

w dawkach, w stosunku do których jest pewnoÊç, ˝e

powodujà znaczny ból i cierpienie z powodu ich ostrego dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego. Zwierz´ta

w agonii lub w widoczny sposób cierpiàce bàdê te˝

wykazujàce oznaki silnego i trwa∏ego bólu powinny

byç w humanitarny sposób uÊmiercone, a w interpretacji wyników powinny zostaç traktowane tak samo

jak zwierz´ta, które pad∏y podczas badania. Kryteria

podj´cia decyzji o uÊmierceniu zwierzàt w agonii lub

cierpiàcych oraz wytyczne co do rozpoznawania przewidywanej lub nieuchronnej Êmierci sà przedmiotem

osobnych Wytycznych (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa).

Metoda opiera si´ na zastosowaniu wczeÊniej

ustalonych dawek oraz pozwala na uszeregowanie

i sklasyfikowanie substancji zgodnie z zasadami Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) w zakresie klasyfikacji substancji chemicznych powodujàcych

zatrucie ostre (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).

W zasadzie metoda ta nie ma na celu wyznaczania

dok∏adnych wartoÊci LD50, ale pozwala na okreÊlenie

zdefiniowanych zakresów dawek, w których spodziewany jest Êmiertelny skutek z uwagi na fakt, ˝e padni´-

cie cz´Êci zwierzàt wcià˝ jest podstawowym kryterium

oceny tego badania. Metoda pozwala na wyznaczenie

wartoÊci LD50 tylko wtedy, gdy przynajmniej dwie

dawki powodujà ÊmiertelnoÊç wy˝szà ni˝ 0 % i ni˝szà ni˝ 100 %. Zastosowanie wczeÊniej ustalonych dawek, bez wzgl´du na badanà substancj´, z klasyfikacjà

zwiàzanà wy∏àcznie z liczbà zwierzàt znajdujàcych si´

w ró˝nych stanach polepsza zgodnoÊç wyników uzyskanych w ró˝nych laboratoriach oraz ich powtarzalnoÊç.

Przed przystàpieniem do badania wykonujàcy je

powinien wziàç pod uwag´ wszystkie dost´pne informacje na temat badanej substancji. Do takich informacji zalicza si´ to˝samoÊç i budow´ chemicznà substancji, jej w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne, wyniki innych badaƒ toksykologicznych in vitro lub in vivo, dane toksykologiczne dla substancji o podobnej budowie chemicznej oraz przewidywane zastosowanie(a) tej substancji. Takie informacje sà konieczne w celu przekonania wszystkich zainteresowanych, ˝e badanie jest

odpowiednie dla ochrony zdrowia ludzkiego i odpowiednie do w∏aÊciwego wyboru dawki poczàtkowej.

1.2. Definicje

ToksycznoÊç ostra po podaniu drogà pokarmowà

oznacza wszystkie szkodliwe skutki, które wyst´pujà

po podaniu substancji drogà pokarmowà w pojedynczej dawce lub w wielu dawkach, podanych w czasie

24 godzin.

Zgon opóêniony: oznacza, ˝e zwierz´ nie pada lub

nie znajduje si´ w stanie agonii w czasie 48 godzin od

podania badanej substancji, ale pada póêniej w czasie

14-dniowego okresu obserwacji.

Dawka: jest iloÊcià badanej substancji podanej

zwierz´ciu. Dawk´ wyra˝a si´ jako mas´ badanej substancji przypadajàcà na jednostk´ masy cia∏a zwierz´cia (np. mg/kg).

GHS: Âwiatowy System Zharmonizowany. Wspólne przedsi´wzi´cie OECD (zdrowie i Êrodowisko), Komitetu Ekspertów ONZ ds. Transportu Towarów Niebezpiecznych (w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne), ILO (informacja o zagro˝eniach) i koordynowane przez Mi´dzyorganizacyjny Program Zarzàdzania Chemikaliami

(IOMC).

Nieuchronny zgon: oznacza spodziewany stan

agonii lub zgon po przed∏u˝eniu czasu obserwacji. Do

objawów mogàcych wskazywaç na taki stan u gryzoni

zalicza si´ konwulsje, po∏o˝enie boczne, pozycj´ le˝àcà i drgawki (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç

w Human Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa).

LD50 (medialna dawka Êmiertelna): jest statystycznie obliczonà pojedynczà dawkà substancji, która spo-

woduje zgon 50 % zwierzàt po podaniu drogà pokarmowà. WartoÊç LD50 jest wyra˝ana w postaci masy

badanej substancji przypadajàcej na jednostk´ masy

badanego zwierz´cia (mg/kg).

Dawka graniczna: odnosi si´ do górnego ograniczenia dawki w badaniu (2000 lub 5000 mg/kg).

Stan agonii: stan umierania lub niezdolnoÊci do

prze˝ycia pomimo prowadzenia post´powania leczniczego (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç

w Humane Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 9 pismiennictwa).

Prognozowany zgon: wyst´powanie objawów klinicznych Êwiadczàcych o zgonie w przewidywalnym

okresie w przysz∏oÊci przed up∏ywem zakoƒczenia doÊwiadczenia, np. niezdolnoÊç do picia wody lub spo˝ywania paszy (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa).

1.3. Zasada metody badawczej

Zasadà badania zaplanowanego jako etapowe

i w którym stosuje si´ minimalnà liczb´ zwierzat w poszczególnym etapach jest otrzymanie wystarczajàcej

informacji o toksycznoÊci ostrej badanej substancji,

która umo˝liwia klasyfikacj´ tej substancji. Substancj´, w iloÊci równej jednej z wybranych dawek, podaje si´ drogà pokarmowà grupie zwierzàt doÊwiadczalnych. Substancj´ bada si´ stopniowo, przy czym na

ka˝dym poziomie doÊwiadczenia stosuje si´ 3 zwierz´ta tej samej p∏ci (zazwyczaj samice). Wystàpienie

na którymkolwiek etapie zwiàzanym z nara˝eniem na

danà substancj´ skutku Êmiertelnego lub jego brak

warunkuje podj´cie dalszych badaƒ, np.

— nie ma potrzeby wykonywania dalszych badaƒ,

— nale˝y podaç t´ samà dawk´ substancji trzem dodatkowym zwierz´tom,

— nale˝y podaç nast´pnà wy˝szà lub poprzedzajàcà

ni˝szà dawk´ substancji trzem dodatkowym zwierz´tom.

Szczegó∏y procedury opisane sà w Schemacie 1.

Metoda pozwala na zaklasyfikowanie badanej substancji do jednej z klas toksycznoÊci okreÊlonych przez

ustalone wartoÊci graniczne LD50.

1.4. Opis metody badawczej

1.4.1. Wybór gatunku zwierzàt

Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝

mogà byç równie˝ stosowane inne gatunki gryzoni.

W badaniach zazwyczaj u˝ywa si´ samic (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Jest to uzasadnione opisanymi

w literaturze wynikami konwencjonalnych badaƒ s∏u˝àcych do okreÊlenia wartoÊci LD50, które wykazujà, ˝e

zazwyczaj istnieje niewielka ró˝nica we wra˝liwoÊci

pomi´dzy samcami a samicami gryzoni; a w tych przypadkach, w których obserwowane sà ró˝nice, samice

Poz. 2119

sà na ogó∏ nieco bardziej wra˝liwe (zobacz pozycja 10

piÊmiennictwa). Je˝eli wiedza o toksykologicznych lub

toksykokinetycznych w∏aÊciwoÊciach strukturalnie podobnych substancji wskazuje na wi´ksze prawdopodobieƒstwo, ˝e samce mogà byç bardziej wra˝liwe,

wówczas do badaƒ powinny byç u˝yte szczury tej p∏ci.

Gdy badanie prowadzi si´ na samcach, nale˝y podaç

wyraêne uzasadnienie.

Stosowane powinny byç m∏ode, dojrza∏e, zdrowe

osobniki powszechnie u˝ywanych ras laboratoryjnych. Samice powinny byç dziewicze i nieci´˝arne.

Ka˝de zwierz´ na poczàtku doÊwiadczenia powinno

byç w wieku 8 do 12 tygodni, a jego masa powinna zawieraç si´ w przedziale ±20 % Êredniej masy uprzednio nara˝anych zwierzàt.

1.4.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt

Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych

powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powina byç

stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. Zwierz´ta mogà

byç pogrupowane w klatkach wg otrzymywanej dawki, ale liczba zwierzàt przypadajàcych na klatk´ nie mo˝e zak∏ócaç dok∏adnych obserwacji ka˝dego zwierz´cia.

1.4.3. Przygotowanie zwierzàt

Zwierz´ta sà wybierane losowo, znakowane dla

umo˝liwienia identyfikacji ka˝dego osobnika i w celu

aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych przetrzymywane w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpocz´ciem podawania substancji.

1.4.4. Przygotowanie okreÊlonych dawek substancji

i ich podawanie

Zasadniczo substancje badane, niezale˝nie od

dawki, powinny byç podawane w sta∏ej obj´toÊci poprzez zró˝nicowanie st´˝enia podawanego preparatu.

Gdy bada si´ produkt koƒcowy w postaci ciek∏ej lub

mieszanin´, wówczas zastosowanie nierozcieƒczonej

badanej substancji, tj. w sta∏ym st´˝eniu, mo˝e byç

bardziej odpowiednie i wymagane przez niektóre

urz´dy dla nast´pujàcej w dalszej kolejnoÊci oceny ryzyka tej substancji. W ka˝dym z tych przypadków nie

nale˝y przekraczaç maksymalnej obj´toÊci podawanej

dawki. Maksymalna obj´toÊç cieczy, która mo˝e byç

podana jednorazowo, zale˝y od rozmiarów zwierz´cia.

U gryzoni obj´toÊç ta nie powinna przekraczaç

1 ml/100 g masy cia∏a, jednak˝e w przypadku roztworów wodnych mo˝na wziàç pod uwag´ obj´toÊç

2 ml/100 g masy cia∏a. O ile jest to tylko mo˝liwe, to

w przypadku ró˝nych postaci (formulacji) podawanego preparatu zaleca si´ w pierwszej kolejnoÊci u˝ycie

wodnych roztworów/zawiesin/emulsji, a w nast´pnej

kolejnoÊci wskazane sà roztwory/zawiesiny/emulsje

w oleju (np. oleju kukurydzianym), a w ostatecznoÊci

roztwory w innych rozpuszczalnikach. Powinny byç

znane w∏asnoÊci toksykologiczne noÊników innych ni˝

woda. Podawane roztwory muszà byç przygotowane

na krótko przed ich podaniem, chyba ˝e stabilnoÊç

preparatu w okresie d∏u˝szym od okresu, w jakim

przeprowadzono badanie, jest znana i akceptowalna.

Klasyfikacji). Dla dobra zwierzàt odradza si´ badanie

w zakresie Kategorii 5 wg GHS (2000 do 5000 mg/kg).

Powinno byç ono brane pod uwag´ tylko wówczas,

gdy istnieje wysokie prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki

takiego badania b´dà mia∏y bezpoÊrednie znaczenie

dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt.

1.5. Sposób post´powania

1.5.3. Badanie dawki granicznej

1.5.1. Podawanie substancji

Badanie dawek granicznych wykonywane jest

w sytuacjach, gdy osoba przeprowadzajàca doÊwiadczenie posiada informacje, ˝e badany materia∏ jest

prawdopodobnie nietoksyczny, tj. gdy przejawia on

objawy toksycznoÊci w dawkach powy˝ej górnych,

wymaganych przez prawo poziomów. Informacje

o toksycznoÊci badanego materia∏u mogà pochodziç

z badaƒ podobnych zwiàzków lub podobnych zarówno pod wzgl´dem sk∏adu jakoÊciowego i iloÊciowego

produktów. W przypadku braku informacji o toksycznoÊci bàdê te˝ przypuszczeƒ, ˝e badany materia∏ jest

toksyczny, nale˝y przeprowadziç badanie w∏aÊciwe.

Badana substancja jest podawana jednorazowo

w pojedynczej dawce za pomocà sondy do˝o∏àdkowej

lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W przypadku

gdy jednorazowe podanie ca∏ej dawki jest niemo˝liwe

mo˝e byç ona podana w porcjach, przy czym czas podania ca∏ej dawki nie mo˝e przekroczyç 24 godzin.

Zwierz´ta przed podaniem badanej substancji powinny byç g∏odzone (np.: w przypadku szczurów nale˝y g∏odziç je na noc przed badaniem, a w przypadku

myszy nale˝y g∏odziç je na 3—4 godziny przed badaniem). Nie nale˝y wstrzymywaç podawania wody. Po

okresie g∏odzenia zwierz´ta powinny byç zwa˝one,

a nast´pnie nale˝y podaç im badanà substancj´. Po jej

podaniu paszy nie powinno si´ podawaç zwierz´tom

przez 3—4 godziny w przypadku szczurów, a 1—2 godziny w przypadku myszy. Gdy badana substancja jest

podawana w kilku porcjach, mo˝e ze wzgl´du na d∏ugoÊç okresu nara˝ania okazaç si´ konieczne dostarczenie zwierz´tom paszy i wody w trakcie nara˝ania.

Badanie dawek granicznych mo˝e byç wykonane

na szeÊciu zwierz´tach (trzy zwierz´ta w ka˝dym etapie)

przy zastosowaniu jednej dawki 2000 mg/kg masy cia∏a. W sytuacjach wyjàtkowych badanie graniczne mo˝e

byç wykonane na trzech zwierz´tach przy u˝yciu substancji w dawce 5000 mg/kg (Kryteria Klasyfikacji). Je˝eli nara˝enie na badanà substancj´ spowoduje wystàpienie ÊmiertelnoÊci, to mo˝e okazaç si´ konieczne wykonanie dalszego badania dla kolejnej, ni˝szej dawki.

1.5.2. Liczba zwierzàt i poziomy dawek

1.6. Obserwacje

W ka˝dym etapie badania stosuje si´ trzy zwierz´ta. Dawka, która ma byç podana jako poczàtkowa, jest

wybierana z czterech ustalonych poziomów: 5, 50, 300

i 2000 mg/kg masy cia∏a. Dawkà poczàtkowà powinna

byç ta, która w sposób najbardziej prawdopodobny

spowoduje ÊmiertelnoÊç u niektórych nara˝anych

zwierzàt. Schemat 1 przedstawia sposób post´powania dla ka˝dej dawki poczàtkowej. Ponadto Schemat 4

przedstawia wytyczne co do klasyfikacji wed∏ug systemu UE obowiàzujàcego do czasu wdro˝enia systemu

GHS.

Obserwacje nale˝y prowadziç dla ka˝dego pojedynczego zwierz´cia, przynajmniej raz podczas pierwszych 30 minut po podaniu badanej substancji i okresowo podczas pierwszych 24 godzin, ze zwróceniem

szczególnej uwagi podczas pierwszych 4 godzin. Obserwacj´ zwierzàt nale˝y przeprowadziç codziennie

przez 14 dni, z wyjàtkiem przypadków, gdy muszà byç

one usuwane z badania i w sposób humanitarny

uÊmiercane lub gdy sà martwe. Okres obserwacji nie

powinien byç jednak ustalony sztywno. Powinien byç

okreÊlony przez reakcje toksyczne, czas ich rozpocz´cia i d∏ugoÊç okresu powrotu do stanu normalnego

i dlatego, gdy uzna si´ to za konieczne, mo˝e byç odpowiednio wyd∏u˝ony. Okresy pojawiania si´ i znikania objawów toksycznoÊci sà wa˝ne, szczególnie

w przypadku istnienia tendencji do wystàpienia opóênionych objawów toksycznoÊci (zobacz pozycja 12 piÊmiennictwa). Wszystkie obserwacje nale˝y systematycznie zapisywaç, prowadzàc dla ka˝dego zwierz´cia

osobne zapisy.

Gdy dost´pne dane sugerujà, ˝e ÊmiertelnoÊç

prawdopodobnie nie wystàpi w najwy˝szej z dawek

poczàtkowych (2000 mg/kg masy cia∏a), wówczas powinno byç wykonane badanie dla dawek granicznych.

Gdy dla badanej substancji brak jest jakichkolwiek informacji, to dla dobra zwierzàt zaleca si´ stosowanie

dawki 300 mg/kg masy cia∏a jako dawki poczàtkowej.

Odst´py czasowe pomi´dzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach sà okreÊlone przez pojawienie si´, czas trwania i nasilenie objawów toksycznoÊci. Badanie zwierzàt przez nara˝anie na substancj´

w kolejnej dawce powinno byç wstrzymane do czasu

uzyskania pewnoÊci co do prze˝ycia uprzednio nara˝onych zwierzàt.

Wyjàtkowo i tylko w przypadkach uzasadnionych

wymaganiami prawnymi mo˝e byç brane pod uwag´

zastosowanie dawki 5000 mg/kg masy cia∏a (Kryteria

Dodatkowe obserwacje b´dà konieczne, gdy zwierz´ta nadal przejawiajà objawy toksycznoÊci. Nale˝y

obserwowaç zmiany na skórze i sierÊci, oczach i b∏onach Êluzowych, a tak˝e w uk∏adzie oddechowym,

uk∏adzie krà˝enia, oÊrodkowym i autonomicznym

uk∏adzie nerwowym oraz w aktywnoÊci somatomotorycznej i zachowaniu. Uwag´ nale˝y zwróciç na pojawienie si´ drgawek, konwulsji, Êlinotoku, biegunki, letargu, snu i Êpiàczki. Pod uwag´ nale˝y braç zasady

i kryteria podane w Humane Endpoints Guidance Do-

cument (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). Zwierz´ta

w agonii i wykazujàce objawy silnego cierpienia lub

bólu powinny byç w sposób humanitarny uÊmiercone. Dla zwierzàt uÊmiercanych lub martwych nale˝y

mo˝liwie dok∏adnie zanotowaç czas padni´cia.

1.6.1. Masa cia∏a

Masy cia∏a poszczególnych osobników powinny

byç okreÊlone na krótko przed rozpocz´ciem podawania badanej substancji i nast´pnie powinny byç okreÊlone przynajmniej raz w tygodniu. Zmiany masy cia∏a powinny byç obliczone i zapisywane. Pod koniec

badania zwierz´ta, które prze˝y∏y, nale˝y ponownie

zwa˝yç i nast´pnie w sposób humanitarny uÊmierciç.

1.6.2. Badania patologiczne

Wszystkie zwierz´ta powinny byç poddane badaniom makroskopowym podczas sekcji (tak˝e te, które

padnà podczas badania lub sà uÊmiercane z powodów humanitarnych). Nale˝y zanotowaç wszystkie

zmiany patologiczne, które wystàpi∏y u ka˝dego zwierz´cia. Nale˝y wziàç pod uwag´ badania mikroskopowe narzàdów wykazujàcych zmiany patologiczne

u zwierzàt prze˝ywajàcych 24 lub wi´cej godzin od poczàtku podawania badanej substancji, poniewa˝ mogà

one dostarczyç u˝ytecznych informacji.

2. WYNIKI

Nale˝y dostarczyç dane pochodzàce od ka˝dego

zwierz´cia indywidualnie. Dodatkowo wszystkie dane

powinny byç zebrane w formie tabeli przedstawiajàcej

dla ka˝dej badanej grupy: liczb´ u˝ytych zwierzàt, liczb´ zwierzàt przejawiajàcych objawy toksycznoÊci, liczb´ zwierzàt martwych i uÊmierconych podczas badania, czas zgonu poszczególnych zwierzàt, opis i czas

wystàpienia objawów toksycznoÊci i odwracalnoÊci

reakcji oraz wyniki sekcji.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje

Badana substancja

— stan skupienia, czystoÊç, gdy ma to znaczenie, tak˝e w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (w tym izomeryzacja),

— dane identyfikacyjne, w tym numer CAS.

NoÊnik (jeÊli jego u˝ycie by∏o konieczne)

— uzasadnienie wyboru noÊnika, jeÊli nie by∏a nim

woda.

Badane zwierz´ta

— gatunek/szczep,

— stan mikrobiologiczny zwierzàt, jeÊli jest znany,

— liczba, wiek i p∏eç zwierzàt (w tym tak˝e uzasadnienie zastosowania samców zamiast samic),

— êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania,

pasza itp.

Poz. 2119

Warunki doÊwiadczenia

— szczegó∏owe dane dotyczàce postaci (formulacji)

badanej substancji, w tym stan skupienia podanego materia∏u,

— szczegó∏owe dane dotyczàce sposobu podawania

badanej substancji, w tym podawane obj´toÊci

i czas podawania,

— szczegó∏owe dane dotyczàce paszy i jakoÊci wody

(w tym typ i êród∏o paszy, êród∏o wody),

— podstawy wyboru dawki poczàtkowej.

Wyniki

— uj´te w tabeli dane dla ka˝dego zwierz´cia i poziomu dawki (tj. zwierz´ta wykazujàce objawy toksycznoÊci ∏àcznie z ÊmiertelnoÊcià, nasilenie i czas

trwania skutków),

— uj´te w tabeli dane dotyczàce masy cia∏a i jej

zmian,

— masa cia∏a poszczególnych zwierzàt w dniu podawania badanej substancji i nast´pnie w odst´pach

tygodniowych oraz w dniu padni´cia bàdê uÊmiercenia,

— data i czas padni´cia,

— czas pojawienia si´ objawów toksycznoÊci i informacje, czy by∏y one odwracalne dla ka˝dego zwierz´cia,

— jeÊli sà dost´pne, wyniki sekcji i wyniki badaƒ histopatologicznych ka˝dego zwierz´cia.

Dyskusja i interpretacja wyników.

Wnioski.

4. PIÂMIENNICTWO

1) Roll et al. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett. Suppl., 31, 86.

2) Roll et al. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der

akuten Toxicitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt, 32, 336—341.

3) Diener et al. (1994). The biometric Evaluation of

the Acute Toxic Class Method (Orla). Arch. Toxicol., 68, 559—610.

4) Diener et al. (1995). The biometric evaluation of

the OECD modified version of the acute toxic class

method (oral). Arch. Toxicol. 69, 729—734.

5) Diener et al. (1999). Acute toxicity class methods

alterations to LD/LC50 tests. ALTEX 16, 129—134.

6) Schlede et al. (1992). A national validation study of

the acute toxicity class method — an alternative to

the LD50 test. Arch. Toxicol. 66, 455—470.

7) Schlede et al. (1994). The international validation

study of the acute toxicity class method (oral).

Arch. Toxicol. 69, 659—670.

8) OECD(2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series in Testing and Assessment No 24.

Paris.

SCHEMAT 1

9) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as human endpoints for experimental animals used in

safety evaluations. Environmental Health and Safety Monograph Series in Testing and Assessment

No 19.

UWAGI OGÓLNE

10) OECD (1998). Harmonized integrated hazard classification for human health and environmental effects of chemical substances.

11) Lipnick et al. (1995). Comparison of the up — and

— down, conventional LD50 and fixed — dose

acute toxicity procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33,

223—231.

12) Chan et al. (1994). Chapter 16, Acute Toxicity and

Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology, 3rd ed. A.Hayes editor, Raven Press, Ltd.

New York, USA.

Poz. 2119

PROCEDURA POST¢POWANIA W PRZYPADKU KA˚DEJ Z DAWEK POCZÑTKOWYCH

Dla ka˝dej dawki poczàtkowej podj´te powinny

byç nast´pujàce post´powania, wed∏ug niniejszego

Schematu, odpowiednio

— Schemat 1a: dawkà poczàtkowà jest 5 mg/kg masy cia∏a,

— Schemat 1b: dawkà poczàtkowà jest 50 mg/kg masy cia∏a,

— Schemat 1c: dawkà poczàtkowà jest 300 mg/kg

masy cia∏a,

— Schemat 1d: dawkà poczàtkowà jest 2000 mg/kg

masy cia∏a.

W zale˝noÊci od liczby zwierzàt uÊmierconych

w sposób humanitarny lub zwierzàt martwych, kolejny etap post´powania wskazujà strza∏ki.

SCHEMAT 1A

SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 5 MG/KG MASY CIA¸A

SCHEMAT 1B

SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 50 MG/KG MASY CIA¸A

SCHEMAT 1C

SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 300 MG/KG MASY CIA¸A

SCHEMAT 1D

SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 2000 MG/KG MASY CIA¸A

KRYTERIA KLASYFIKACJI

KRYTERIA KLASYFIKACJI BADANYCH SUBSTANCJI

ZE SPODZIEWANYMI WARTOÂCIAMI LD50 PRZEKRACZAJÑCYMI 2000 mg/kg BEZ POTRZEBY BADANIA

Kryteria zagro˝enia Kategorii 5 sà przeznaczone dla identyfikacji substancji o stosunkowo niskiej

toksycznoÊci ostrej, ale w pewnych okolicznoÊciach

mogà one stanowiç zagro˝enie dla wra˝liwej populacji. Przewiduje si´, ˝e substancje te majà doustne lub

skórne LD50 w zakresie 2000 do 5000 mg/kg lub równowa˝ne dawki poprzez inne drogi nara˝enia. Substancje badane mogà byç zaklasyfikowane do klasy

zagro˝enia wed∏ug klasyfikacji zdefiniowanej przez

2000 mg/kg<LD50<5000 mg/kg (Kategoria 5 w GHS)

w nast´pujàcych przypadkach

a) je˝eli skierowane do tej kategorii przez schemat

badawczy (Schematy 1a—1d) w oparciu o wyst´powanie ÊmiertelnoÊci,

b) je˝eli istniejà wiarygodne dowody, które wykazujà,

˝e LD50 b´dzie w zakresie Kategorii 5; lub inne badania na zwierz´tach lub skutki toksyczne u ludzi

wskazujà ostre dzia∏anie na zdrowie ludzkie,

c) przez ekstrapolacj´, oszacowanie lub pomiar danych, je˝eli przypisanie do bardziej niebezpiecznej

klasy nie jest gwarantowane i

— dost´pne sà wiarygodne informacje wskazujàce na znaczàce objawy toksycznoÊci u ludzi lub

— nie obserwuje si´ ÊmiertelnoÊci podczas badania a˝ do wartoÊci Kategorii 4 po podaniu drogà pokarmowà, lub

— gdy opinia ekspertów potwierdza znaczàce objawy kliniczne toksycznoÊci, podczas badania

a˝ do wartoÊci Kategorii 4, z wyjàtkiem biegunki, nastroszenia sierÊci lub niedobrego wyglàdu

zewn´trznego, lub

— gdy opinia ekspertów potwierdza wiarygodne

informacje wskazujàce potencja∏ znaczàcych

ostrych objawów w innych badaniach na zwierz´tach.

BADANIE W DAWKACH POWY˚EJ 2000 mg/kg

W wyjàtkowych sytuacjach, uzasadnionych tylko

przez szczególne wymagania prawne, pod uwag´ mo˝e byç brane zastosowanie najwy˝szej ustalonej dawki 5000 mg/kg. Dla dobra zwierzàt badanie dawki

5000 mg/kg nie jest zalecane i powinno byç stosowane tylko gdy istnieje silne prawdopodobieƒstwo, ˝e

wyniki takich badaƒ b´dà mia∏y bezpoÊrednie znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).

Gdy wymagane jest badanie dawki 5000 mg/kg,

prowadzi si´ tylko jeden etap (tj. trzy zwierz´ta b´dà

stosowane). Je˝eli pierwsze zadawkowane zwierz´

padnie, dalsze dawkowanie nast´puje w 2000 mg/kg

zgodnie z procedurà wed∏ug Schematu 1. Je˝eli

pierwsze zwierz´ prze˝yje, to dawkowane sà dwa dalsze zwierz´ta. Je˝eli tylko jedno z trzech zwierzàt padnie, to LD50 prawdopodobnie przekracza 5000 mg/kg.

Je˝eli zginà dwa osobniki, to dawkowanie przechodzi

do poziomu 2000 mg/kg.

SCHEMAT 2

METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed

pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

SCHEMAT 2 (kontynuowany)

METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed

pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

SCHEMAT 2 (kontynuowany)

METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed

pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

SCHEMAT 2 (kontynuowany)

METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed

pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa)

Za∏àcznik nr 5

B.4. TOKSYCZNOÂå OSTRA: DZIA¸ANIE DRA˚NIÑCE/˚RÑCE NA SKÓR¢

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 404 (2002).

1.1. Wst´p

Podczas opracowywania niniejszej metody szczególnà uwag´ zwrócono na mo˝liwoÊç jej ulepszenia,

bioràc pod uwag´ dobro zwierzàt i oszacowanie

wszystkich istniejàcych informacji dotyczàcych badanej substancji w celu unikni´cia zb´dnych badaƒ na

zwierz´tach laboratoryjnych. W metodzie tej przed

podj´ciem badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego badanej substancji na skór´ in vivo zaleca si´ wykonanie

oceny wagi dowodów istniejàcych danych. Je˝eli sà

dost´pne niepe∏ne dane, to mogà byç one uzupe∏nione przez zastosowanie badania sekwencyjnego (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Strategia badawcza

zawiera wykonanie zwalidowanych i akceptowanych

badaƒ in vitro, a przedstawiona jest ona w Schemacie

za∏àczonym do niniejszej metody. Ponadto zaleca si´,

je˝eli to w∏aÊciwe, sekwencyjne a nie jednoczesne stosowanie trzech pól do przeprowadzenia testów p∏atkowych na zwierz´ciu we wst´pnym badaniu in vivo.

Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe jak

i dobro zwierzàt, nie nale˝y wykonywaç badaƒ in vivo,

przed przeprowadzeniem analizy wagi dowodów

wszystkich dost´pnych danych istotnych dla identyfikacji potencjalnego dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego

substancji na skór´. Dane takie powinny zawieraç dowody otrzymane w badaniach wykonanych u ludzi

i na zwierz´tach laboratoryjnych, dowody o dzia∏aniu

˝ràcym/dra˝niàcym jednej lub wi´cej podobnych

strukturalnie substancji lub mieszanin takich substancji, dane wskazujàce na silnà kwasowoÊç lub zasadowoÊc substancji (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa),

a tak˝e wyniki zwalidowanych i akceptowanych badaƒ

wykonanych w warunkach in vitro lub ex vivo (zobacz

pozycje 4, 5 i 6 piÊmiennictwa). Taka analiza powinna

ograniczyç potrzeby wykonywania w warunkach in vivo oceny dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´

w przypadku substancji, dla których ju˝ zebrano wystarczajàce dowody z innych badaƒ tych dwóch kierunków dzia∏ania toksycznego.

Zalecana strategia badania etapowego, obejmujàca przeprowadzenie badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego za pomocà zwalidowanych i akceptowanych metod in vitro lub ex vivo, jest do∏àczona w formie Schematu stanowiàcego dodatek do niniejszej metody.

Strategia ta zosta∏a opracowana i jednomyÊlnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa) oraz przyj´ta jako zalecana

strategia badawcza w Âwiatowym Systemie Zharmonizowanym (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa).

Zaleca si´, by ww. strategia badawcza by∏a podj´ta

przed wykonaniem badania in vivo. W celu uzyskania

danych o przes∏ankach naukowych dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego dla nowych substancji zale-

ca si´ sposób badania etapowego. Dla substancji istniejàcych o niewystarczajàcych danych dotyczàcych

dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ strategi´ t´

nale˝y stosowaç dla uzupe∏nienia brakujàcych danych. Zastosowanie innej strategii badawczej lub sposobu post´powania bàdê te˝ podj´cie decyzji o niestosowaniu etapowego sposobu badania musi byç uzasadnione.

Je˝eli za pomocà analizy wagi dowodów nie mo˝na ustaliç, czy dana substancja posiada w∏aÊciwoÊci

dra˝niàce lub ˝ràce, to wówczas, zgodnie ze strategià

etapowego badania, nale˝y podjàç decyzj´ o przeprowadzeniu badania in vivo (zobacz Schemat).

1.2. Definicje

Dzia∏anie dra˝niàce na skór´: jest to wywo∏anie

odwracalnego uszkodzenia skóry w czasie do 4 godzin

po na∏o˝eniu badanej substancji.

Dzia∏anie ˝ràce na skór´: jest to wywo∏anie nieodwracalnych uszkodzeƒ skóry; w postaci widocznej

martwicy naskórka i skóry w czasie do 4 godzin po na∏o˝eniu badanej substancji. Dzia∏anie ˝ràce charakteryzuje si´ wrzodami, krwawieniem, krwawymi strupami i na koƒcu 14-dniowego okresu obserwacji odbarwieniem powodowanym ∏uszczeniem si´ skóry, ca∏kowitym miejscowym wy∏ysieniem oraz bliznami. Dla

oceny wàtpliwych uszkodzeƒ nale˝y uwzgl´dniç badania histopatologiczne.

1.3. Zasada metody badawczej

Badanà substancj´ nanosi si´ w pojedynczej dawce na skór´ zwierz´cia doÊwiadczalnego; nienara˝ane

pola skóry zwierz´cia doÊwiadczalnego s∏u˝à jako

kontrola. W celu uzyskania ca∏kowitej oceny skutków

stopieƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego jest odczytywany i punktowany w ustalonych odst´pach czasu, a nast´pnie opisywany. Czas trwania badania powinien

byç wystarczajàcy dla oceny odwracalnoÊci lub nieodwracalnoÊci obserwowanych skutków.

Zwierz´ta wykazujàce ciàg∏e oznaki ci´˝kiego

wstrzàsu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badaƒ muszà byç w sposób humanitarny uÊmiercone, a dzia∏anie substancji odpowiednio oszacowane. Kryteria

podj´cia decyzji o humanitarnym uÊmierceniu zwierzàt w stanie agonii lub silnie cierpiàcych mo˝na znaleêç w piÊmiennictwie (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa).

1.4. Opis metody badawczej

1.4.1. Przygotowanie do badania in vivo

1.4.1.1. Wybór gatunku badanego

Zalecanym gatunkiem jest królik albinotyczny; stosowaç nale˝y zdrowe, m∏ode dojrza∏e króliki. W przypadku stosowania innych gatunków nale˝y podaç uzasadnienie.

1.4.1.2. Przygotowanie zwierzàt

Oko∏o 24 godziny przed na∏o˝eniem substancji nale˝y usunàç sierÊç przez krótkie strzy˝enie cz´Êci

grzbietowej tu∏owia zwierzàt. Nale˝y zwróciç uwag´,

by nie uszkodziç skóry; w badaniu mogà byç stosowane jedynie zwierz´ta ze zdrowà, nienaruszonà skórà.

Niektóre odmiany królików posiadajà pola g´stej

sierÊci, które uwidaczniajà si´ bardziej w niektórych

porach roku. Takich pól z g´stà sierÊcià nie nale˝y wybieraç jako miejsca do przeprowadzenia badania.

1.4.1.3. Warunki przebywania i karmienia zwierzàt

Zwierz´ta powinny byç przetrzymywane pojedynczo. Temperatura w pomieszczeniu doÊwiadczalnym

dla królików powinna wynosiç 20±3 °C. WilgotnoÊç

wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza

wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ).

Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin

Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt

powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna,

nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody.

1.4.2. Sposób post´powania

1.4.2.1. Nanoszenie badanej substancji

Badana substancja powinna byç nanoszona na

ma∏à powierzchni´ (oko∏o 6 cm2) skóry i przykryta

p∏atkiem gazy, umocowanym niedra˝niàcà taÊmà.

W przypadku gdy nie mo˝na nanosiç substancji bezpoÊrednio (np. ciecz lub niektóre pasty), nale˝y nanieÊç badanà substancj´ najpierw na p∏atek gazy i nast´pnie na∏o˝yç go na skór´. P∏atek w czasie nara˝ania

powinien byç w swobodnym kontakcie ze skórà za pomocà odpowiedniego pó∏przepuszczalnego banda˝a.

Gdy badanà substancj´ nanosi si´ na p∏atek, nale˝y go

przenieÊç na skór´ w taki sposób, by zapewniç dobry

kontakt ze skórà i równomierne rozprowadzenie substancji na skórze. Nale˝y zapobiec, by zwierz´ nie mia∏o dost´pu do p∏atka i nie spo˝y∏o go lub nie wdycha∏o badanej substancji.

Poz. 2119

1.4.2.3. Badanie wst´pne (badanie in vivo dzia∏ania

dra˝niàcego/˝ràcego na skór´, na jednym

zwierz´ciu)

Stanowczo zaleca si´, by badanie in vivo przeprowadziç wst´pnie na jednym zwierz´ciu, szczególnie,

gdy przewiduje si´, ˝e substancja posiada w∏aÊciwoÊci ˝ràce. Jest to zgodne ze strategià badania etapowego (zobacz Schemat).

Je˝eli na podstawie analizy wagi dowodów oceniono, ˝e substancja dzia∏a ˝ràco, nie ma potrzeby

przeprowadzenia dalszych badaƒ na zwierz´tach. Dla

wi´kszoÊci substancji podejrzanych o dzia∏anie ˝ràce

dalsze badania in vivo na ogó∏ nie sà potrzebne.

W przypadkach gdy dodatkowe dane by∏yby konieczne, ze wzgl´du na brak dostatecznych dowodów, mo˝na wykonaç ograniczone badania na zwierz´tach, stosujàc nast´pujàcy sposób post´powania: nanosi si´

kolejno do trzech p∏atków na zwierz´. Pierwszy p∏atek

usuwa si´ po trzech minutach. Gdy nie obserwuje si´

powa˝nych reakcji na skórze, nanosi si´ drugi p∏atek

i usuwa po godzinie. Je˝eli obserwacje na tym etapie

wskazujà, ˝e nara˝enie mo˝e byç w sposób humanitarny przed∏u˝one do czterech godzin, nak∏ada si´

trzeci p∏atek i usuwa go po czterech godzinach, a nast´pnie ocenia si´ wynik badania.

Je˝eli obserwuje si´ dzia∏anie ˝ràce po którymÊ

z tych trzech etapów nara˝enia, doÊwiadczenie nale˝y

natychmiast zakoƒczyç. Je˝eli nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego po usuni´ciu ostatniego p∏atka, zwierz´

obserwuje si´ przez 14 dni, chyba ˝e dzia∏anie ˝ràce

wystàpi wczeÊniej.

W przypadkach gdy nie przewiduje si´ dzia∏ania

˝ràcego badanej substancji, lecz dzia∏anie dra˝niàce,

nak∏ada si´ jeden p∏atek na jedno zwierz´ na cztery

godziny.

1.4.2.4. Badanie potwierdzajàce (badanie dzia∏ania

dra˝niàcego skór´ in vivo na dodatkowych

zwierz´tach)

Po up∏ywie okresu nara˝enia, w warunkach typowych po 4 godzinach nale˝y usunàç pozosta∏oÊci badanej substancji, najlepiej u˝ywajàc wody lub odpowiedniego rozpuszczalnika niezmieniajàcego istniejàcej reakcji lub integralnoÊci naskórka.

Gdy w badaniu wst´pnym nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝niàce lub brak takiego

dzia∏ania nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc do dwóch dodatkowych zwierzàt, nak∏adajàc im po jednym p∏atku

na cztery godziny. Gdy w badaniu wst´pnym obserwowano dzia∏anie dra˝niàce, badanie potwierdzajàce

powinno si´ przeprowadziç w sposób etapowy lub nara˝aç dwa dodatkowe zwierz´ta równoczeÊnie. W wyjàtkowym przypadku, gdy nie prowadzi si´ badania

wst´pnego, na dwa lub trzy zwierz´ta nak∏ada si´ po

jednym p∏atku, które usuwa si´ po czterech godzinach. Gdy u˝ywa si´ dwóch zwierzàt i oba wykazujà

takà samà reakcj´, nie potrzeba dalszych badaƒ. W innym przypadku nale˝y badaç równie˝ trzecie zwierz´.

Dla oceny dwuznacznych reakcji potrzebne b´dzie

u˝ycie dodatkowych zwierzàt.

1.4.2.2. Poziom dawkowania

1.4.2.5. Okres obserwacji

Na badane miejsce nak∏ada si´ 0,5 ml cieczy

wzgl´dnie 0,5 g substancji sta∏ej lub pasty.

Czas trwania obserwacji musi byç wystarczajàcy

do pe∏nej oceny odwracalnoÊci obserwowanych skut-

Ciek∏e substancje stosuje si´ z zasady jako nierozcieƒczone. Gdy bada si´ substancje sta∏e (które mogà

byç w razie potrzeby sproszkowane), nale˝y je zwil˝yç

najmniejszà iloÊcià wody (lub w razie potrzeby innym

odpowiednim noÊnikiem) wystarczajàcà do zapewnienia dobrego kontaktu ze skórà. O ile stosuje si´ noÊnik

inny ni˝ woda, to jego mo˝liwy wp∏yw na dra˝nienie

skóry przez badanà substancj´ powinien byç minimalny, a najlepiej gdyby to dzia∏anie nie wystàpi∏o.

ków. DoÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w momencie,

gdy zwierz´ta wykazujà ciàg∏e oznaki silnego bólu lub

ci´˝ki stan. Dla ustalenia odwracalnoÊci skutków zwierz´ta nale˝y obserwowaç do 14 dni po usuni´ciu p∏atków. Gdy odwracalnoÊç widoczna jest przed 14 dniami doÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w tym czasie.

akcje jak ∏ysienie (na ograniczonej powierzchni), nadmierne rogowacenie, przerosty i z∏uszczenie utrzymujà si´ do koƒca 14-dniowego okresu obserwacji, to badanà substancj´ nale˝y uznaç za dra˝niàcà.

1.4.2.6. Obserwacje kliniczne i stopniowanie oddzia∏ywania na skór´

3.1. Sprawozdanie z badaƒ

Wszystkie zwierz´ta nale˝y badaç, zwracajàc uwag´ na oznaki rumienia oraz obrz´ku, a nast´pnie nale˝y oceniç reakcj´ wg skali punktowej po 60 minutach,

a póêniej po 24, 48 i 72 godzinach po usuni´ciu p∏atka.

W badaniu wst´pnym na jednym zwierz´ciu nale˝y

sprawdziç miejsce na∏o˝enia bezpoÊrednio po usuni´ciu p∏atka. Reakcje skórne nale˝y oceniç wg skali

punktowej i odnotowaç zgodnie z tabelà B.4.1. Je˝eli

po 72 godzinach uszkodzenie skóry nie mo˝e byç okreÊlone jako dzia∏anie dra˝niàce lub ˝ràce, to dla ustalenia odwracalnoÊci skutków obserwacje nale˝y prowadziç do 14 dnia. W uzupe∏nieniu obserwacji dzia∏ania

dra˝niàcego nale˝y odnotowaç i dok∏adnie opisaç

wszystkie miejscowe skutki toksyczne, takie jak odt∏uszczenie skóry oraz jakiekolwiek szkodliwe skutki

dzia∏ania ogólnego (np. kliniczne objawy toksyczne

i wp∏yw na mas´ cia∏a). W celu wyjaÊnienia dwuznacznych reakcji nale˝y rozwa˝yç przeprowadzenie badaƒ

histopatologicznych.

Ocena reakcji skóry wg skali punktowej jest z koniecznoÊci subiektywna. W celu ujednolicenia oceny

reakcji skóry wg skali punktowej i wsparcia laboratoriów przeprowadzajàcych doÊwiadczenia w przeprowadzeniu i interpretacji obserwacji, personel przeprowadzajàcy je nale˝y odpowiednio przeszkoliç w zakresie stosownego systemu punktowania (zobacz tabela

poni˝ej). Dla stopniowania dzia∏ania dra˝niàcego na

skór´ lub innych uszkodzeƒ pomocne mogà byç

wszelkie ilustrowane przewodniki (zobacz pozycja 10

piÊmiennictwa).

2. WYNIKI

2.1. Przedstawienie wyników

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie z badaƒ musi zawieraç nast´pujàce

informacje

Racjonalne uzasadnienie do przeprowadzenia badania in vivo; analiz´ istniejàcych wyników badaƒ,

∏àcznie z wynikami strategii dzia∏ania etapowego

— opis istotnych wyników dost´pnych z wczeÊniejszych badaƒ,

— wyniki uzyskane na ka˝dym etapie wynikajàce ze

strategii badania,

— opis przeprowadzonych doÊwiadczeƒ in vitro,

∏àcznie ze szczegó∏ami post´powania, wyniki uzyskane dla badanej substancji kontrolnej,

— analiz´ przeprowadzenia badania in vivo.

Badana substancja

— dane identyfikacyjne (np. numer CAS; êród∏o

otrzymania; znane zanieczyszczenia; numer serii),

— stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (np.

wartoÊç pH, lotnoÊç, rozpuszczalnoÊç, trwa∏oÊç),

— w przypadku mieszanin, sk∏ad i udzia∏ procentowy

sk∏adników.

NoÊnik

— identyfikacja, st´˝enie (je˝eli dotyczy), stosowana

obj´toÊç,

— uzasadnienie wyboru noÊnika.

DoÊwiadczalne zwierz´ta

— stosowany gatunek/szczep, uzasadnienie w przypadku stosowania innych zwierzàt ni˝ króliki albinotyczne,

— liczba zwierzàt ka˝dej p∏ci,

W sprawozdaniu koƒcowym z badania wyniki nale˝y zestawiç w formie tabel i powinny one zawieraç

wszystkie pozycje wymienione w pkt 3.1.

— masa ka˝dego zwierz´cia na poczàtku doÊwiadczenia, po zakoƒczeniu doÊwiadczenia,

2.2. Ocena wyników

— êród∏o pozyskania, warunki przebywania, pasza

itp.

Ocen´ dzia∏ania dra˝niàcego na skór´ nale˝y oceniaç w powiàzaniu z charakterem i nasileniem uszkodzeƒ, ich odwracalnoÊcià lub brakiem odwracalnoÊci.

Indywidualna punktacja nie prezentuje bezwzgl´dnego standardu w∏aÊciwoÊci dra˝niàcych substancji, poniewa˝ inne skutki wywo∏ane przez badany materia∏

sà równie˝ brane pod uwag´. Natomiast indywidualna punktacja powinna byç rozpatrywana jako wartoÊç

odniesienia, którà nale˝y oceniaç w po∏àczeniu

z wszystkimi innymi obserwacjami z tego badania.

W ocenie dzia∏ania dra˝niàcego nale˝y braç pod

uwag´ odwracalnoÊç uszkodzeƒ skóry. Je˝eli takie re-

— wiek na poczàtku doÊwiadczenia,

Warunki prowadzenia doÊwiadczenia

— technika przygotowania miejsca nak∏adania,

— szczegó∏y dotyczàce materia∏u stosowanego na

p∏atki i technika nak∏adania,

— szczegó∏y przygotowania substancji do badaƒ, nak∏adanie i usuwanie.

Wyniki

— zestawienie w tabelach wyników dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego, indywidualnie dla ka˝dego zwierz´cia, dla wszystkich okresów obserwacji,

— opis wszystkich obserwowanych uszkodzeƒ,

— s∏owny opis rodzaju i stopnia obserwowanego

dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego, jak i wyniki badaƒ histopatologicznych,

— opis jakichkolwiek innych skutków miejscowych

(np. odt∏uszczenie skóry) i skutków ogólnoustrojowych towarzyszàcych dzia∏aniu dra˝niàcemu lub

˝ràcemu.

Dyskusja wyników.

4. PIÂMIENNICTWO

1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I.,

Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.j., Provan,

W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden,

P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410—429.

2) Young J.R., How M.J., Walker A.P. and Worth

W.M.H. (1988). Classification as corrosive or irritant to skin of preparations containing acidic or alkaline substances without testing on animals. Toxicology In Vitro, 2, 19—26.

3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A.,

Curren, R.D., Earl, L.K., Esdail, D.J., Liebsch, M.

(1998). Evaluation of the proposed OECD Testing

Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709—720.

4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, European Chemical Industry, Ecology and

Toxicology Centre, Brussels.

Poz. 2119

5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham,

P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for

skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the

Management Team. Toxicology in Vitro 12,

pp. 483—524.

6) Testing Method B. 40 Skin Corrosion.

7) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme

Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for

Alternative Toxicological Test Methods. Held

in Solna, Sweden, 22—24 January 1996

(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

8) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substancecs, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals

Committee and the Working Party on Chemicals,

November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs /Class

/HCL6.htm).

9) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used

in Safety Evaluation. OECD Environmental Health

and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/

monos.htm).

10) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004).

United States Environmental Protection Agency,

Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.

TABELA B.4.1: STOPNIOWANIE REAKCJI SKÓRY

Rumieƒ i tworzenie si´ strupów

Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4

Tworzenie si´ obrz´ku

Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4

W celu wyjaÊnienia wàtpliwych reakcji mo˝na przeprowadziç badania histopatologiczne.

SCHEMAT

Strategia etapowego badania dzia∏ania dra˝niàcego

i ˝ràcego na skór´

ROZWA˚ANIA OGÓLNE

Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe, jak

i dobro zwierzàt, wa˝ne jest, aby unikaç niepotrzebnego stosowania zwierzàt i zmniejszaç liczb´ badaƒ, które mog∏yby wywo∏aç silne reakcje u zwierzàt. Przed

badaniem in vivo nale˝y oceniç wszystkie istotne informacje o substancji dotyczàce jej w∏aÊciwoÊci ˝ràcych i dra˝niàcych na skór´. Byç mo˝e istniejà ju˝ wystarczajàce dowody do klasyfikacji badanej substancji

pod kàtem jej mo˝liwego dzia∏ania ˝ràcego i dra˝niàcego na skór´, bez potrzeby prowadzenia doÊwiadczeƒ na zwierz´tach laboratoryjnych. Dlatego stosowanie analizy wagi dowodów i strategii badania etapowego zminimalizuje potrzeb´ badania in vivo szczególnie gdy substancja prawdopodobnie spowoduje

silnà reakcj´.

W celu zdecydowania, o potrzebie przeprowadzenia dodatkowego badania, innego ni˝ badania skórne

in vivo, by móc scharakteryzowaç takie mo˝liwoÊci,

zaleca si´ stosowanie analizy wagi dowodów na podstawie istniejàcych informacji dotyczàcych dzia∏ania

dra˝niàcego i ˝ràcego substancji na skór´. Gdy sà potrzebne dalsze badania, zaleca si´ stosowanie strategii

etapowego badania dla uzyskania istotnych wyników

doÊwiadczalnych. Dla substancji, które nie by∏y dotàd

badane, nale˝y stosowaç strategi´ etapowego badania dla uzyskania wyników potrzebnych do oceny si∏y

dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. Strategi´ badania, opisanà w tym Schemacie, wypracowano na

warsztatach OECD (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa)

oraz zatwierdzono i rozwini´to w Zharmonizowanym

Integralnym Systemie Klasyfikacji Ryzyka Skutków

Zdrowotnych dla Ludzi i Ârodowiska, zaaprobowanym

na 28 Wspólnym Posiedzeniu Komitetu Substancji

Chemicznych i Grupy Roboczej ds. Substancji Chemicznych w listopadzie 1998 r. (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa).

Mimo ˝e strategia etapowego badania nie stanowi integralnej cz´Êci metody badawczej B.4, to wyra˝a zalecany sposób ustalania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. To podejÊcie przedstawia zarówno najlepszà praktyk´, jak i etyczny wyznacznik dla

badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ in vivo.

Metoda badawcza dostarcza wskazówek, jak prowadziç doÊwiadczenie in vivo, i podsumowuje czynniki,

które powinny byç wykorzystane przed rozpocz´ciem

takiego badania. Strategia dostarcza sposób oceny

istniejàcych danych o w∏aÊciwoÊciach dra˝niàcych/˝ràcych badanej substancji na skór´ i zró˝nicowany sposób uzyskiwania znaczàcych danych o substancjach, dla których potrzebne sà dodatkowe badania lub dla których nie przeprowadzono badaƒ. Zaleca si´ równie˝ przeprowadzenie, sprawdzonymi

i przyj´tymi metodami in vitro lub ex vivo, badaƒ

dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ w okreÊlonych przypadkach.

OPIS STRATEGII BADAWCZEJ I OSZACOWANIA

Przed rozpocz´ciem doÊwiadczenia jako cz´Êci

strategii badania etapowego (RYSUNEK) nale˝y oceniç wszystkie dost´pne informacje, dla okreÊlenia potrzeby badania skóry in vivo. Chocia˝ istotne informacje mo˝na uzyskaç z oceny pojedynczych parametrów

(np. skrajne wartoÊci pH), to nale˝y wziàç pod uwag´

ca∏oÊç istniejàcych informacji. Nale˝y oceniç na podstawie analizy wagi dowodów wszystkie znaczàce dane o skutkach dzia∏ania substancji lub jej analogów

i przedstawiç racjonalnoÊç decyzji. G∏ówny nacisk nale˝y po∏o˝yç na istniejàce dane dotyczàce dzia∏ania

substancji na ludzi i zwierz´ta, a nast´pnie wyniki z badaƒ in vitro lub ex vivo. Nale˝y unikaç w miar´ mo˝liwoÊci badaƒ dzia∏ania ˝ràcego substancji in vivo.

Czynniki brane pod uwag´ w strategii badania obejmujà

Ocena istniejàcych danych dotyczàcych dzia∏ania

substancji na ludzi i zwierz´ta (Etap 1). W pierwszej

kolejnoÊci nale˝y braç po uwag´ istniejàce dane dla

ludzi, np. badania kliniczne lub zawodowe i sprawozdania z wypadków i/lub dane z badaƒ przeprowadzonych na zwierz´tach, np. badaƒ toksykologicznych

przy jednokrotnym lub powtarzanym nara˝aniu, gdy˝

dostarczajà one bezpoÊrednich informacji o oddzia∏ywaniu na skór´. Nie nale˝y badaç w teÊcie in vivo substancji o znanym dzia∏aniu dra˝niàcym lub ˝ràcym

i substancji, co, do których istniejà bezsporne dowody

o braku ich dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego.

Analiza zale˝noÊci aktywnoÊci od budowy substancji (SAR) (Etap 2). Je˝eli dost´pne sà wyniki badaƒ

substancji podobnych strukturalnie, to nale˝y je wziàç

pod uwag´. Je˝eli dost´pna jest dostateczna liczba

wyników dotyczàcych substancji o podobnej budowie

lub mieszanin takich substancji wskazujàcych na ich

mo˝liwoÊci dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´

dotyczàcych dzia∏ania na ludzi i/lub zwierz´ta, to mo˝na za∏o˝yç, ˝e oceniana substancja b´dzie wywo∏ywa∏a te same reakcje. W takich przypadkach nie ma potrzeby badania substancji. Wyniki negatywne z badaƒ

substancji o podobnej budowie lub mieszaniny takich

substancji nie stanowià wystarczajàcych dowodów na

brak dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji w strategii etapowego badania. Sprawdzone i przyj´te sposoby z zastosowaniem analizy SAR mogà byç stosowane do identyfikacji potencja∏u zarówno dzia∏ania

dra˝niàcego, jak i ˝ràcego na skór´.

W∏aÊciwoÊci fizykochemiczne i reaktywnoÊç chemiczna (Etap 3). Substancje wykazujàce skrajne wartoÊci pH, takie jak ≤2,0 i ≥11,5, mogà wykazywaç silne

dzia∏anie miejscowe. Je˝eli skrajne wartoÊci pH sà

podstawà do zaklasyfikowania substancji jako ˝ràcej

w stosunku do skóry, to nale˝y braç równie˝ pod uwag´ jej rezerw´ kwasowà/zasadowà (pojemnoÊç buforowà) (zobacz pozycje 3 i 4 piÊmiennictwa). Je˝eli

z pojemnoÊci buforowej wynika, ˝e substancja nie powinna dzia∏aç ˝ràco na skór´, to nale˝y podjàç dalsze

badania dla potwierdzenia tego, najlepiej przy u˝yciu

sprawdzonej i przyj´tej metody in vitro lub ex vivo (zobacz etapy: 5 i 6).

ToksycznoÊç skórna (Etap 4). Gdy sprawdzono, ˝e

substancja chemiczna wykazuje dzia∏anie bardzo toksyczne w kontakcie ze skórà, to badanie in vivo dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego mo˝e byç niewykonalne,

gdy˝ nak∏adana iloÊç badanej substancji mo˝e przekroczyç najwy˝szà dawk´ toksycznà i wywo∏aç w konsekwencji zgon lub silny ból u zwierzàt. Poza tym, gdy

badanie toksycznoÊci ostrej skórnej na królikach albinotycznych prowadzone by∏o z granicznà dawkà toksycznà, wynoszàcà 2000 mg/kg m.c. lub wi´cej, i nie

obserwowano podra˝nienia skóry lub dzia∏ania ˝ràcego, to nie ma potrzeby dodatkowego badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. Oceniajàc wczeÊniej przeprowadzone badanie toksycznoÊci ostrej po

naniesieniu na skór´, nale˝y mieç na uwadze szereg

okolicznoÊci. Mogà byç na przyk∏ad podane w sprawozdaniu niekompletne informacje o uszkodzeniu

skóry. DoÊwiadczenia i obserwacje mog∏y byç przeprowadzone na innym gatunku zwierzàt ni˝ króliki,

którego wra˝liwoÊç na reakcje mog∏a si´ znacznie ró˝niç. Mo˝e równie˝ forma badanej substancji, nanoszonej na skór´ zwierz´cia, nie by∏a odpowiednia dla

oszacowania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´

(np. rozcieƒczanie substancji w badaniu toksycznoÊci

skórnej) (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa). Jednak

w takich przypadkach, gdy dobrze zaplanowane i przeprowadzone badania toksycznoÊci skórnej przeprowadzono na królikach, to negatywne wyniki mogà byç

przyj´te jako wystarczajàcy dowód, ˝e substancja nie

dzia∏a ˝ràco lub dra˝niàco.

Poz. 2119

nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝niàce lub jego brak nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc do

dwóch dodatkowych zwierzàt, nara˝ajàc je przez cztery godziny. Gdy w badaniu wst´pnym obserwuje si´

dzia∏anie dra˝niàce, to badanie potwierdzajàce prowadzi si´ etapowo lub nara˝ajàc dwa dodatkowe zwierz´ta równoczeÊnie.

PIÂMIENNICTWO

1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final

Report on the OECD Workshop on Harmonization

of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna,

Sweden, 22—24 January 1996 (http://www1.

oecd.org/ehs/test/background.htm).

2) OECD (1998). Harmonized Intergrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by

the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee

and Working Party on Chemicals, November 1998

(http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A.,

Curren, R.D., Earl, L.K., Esdail, D.J., Liebsch,

M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD

Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26,

709—720.

4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth,

W.M.H. (1998). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or

Alkaline Substances, Without Testing on Animals.

Toxic In Vitro, 2 (1) pp. 19—26.

Wyniki z badaƒ in vitro i ex vivo (Etap 5 i 6). Substancje, które wykaza∏y w∏aÊciwoÊci ˝ràce lub silnie

dra˝niàce w badaniu przeprowadzonym sprawdzonà

i przyj´tà metodà in vitro i ex vivo (zobacz pozycje 6 i 7

piÊmiennictwa) przeznaczonà do oszacowania tych

specyficznych skutków, nie muszà byç badane na

zwierz´tach. Mo˝na przypuszczaç, ˝e substancje takie

b´dà wywo∏ywa∏y podobnie silne skutki w badaniu

in vivo.

5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996). Animal, Human and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology.

Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31,

411—436.

Badanie in vivo na królikach (Etap 7 i 8). Gdy na

podstawie wagi dowodów podejmuje si´ decyzj´

o przeprowadzeniu doÊwiadczenia in vivo, to nale˝y

rozpoczàç od badania wst´pnego, u˝ywajàc jednego

zwierz´cia. Gdy wynik tego doÊwiadczenia wskazuje,

˝e substancja dzia∏a ˝ràco na skór´, to nie nale˝y prowadziç dalszego badania. Gdy w badaniu wst´pnym

7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham,

P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro test for

skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the

Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.

483—524.

6) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

RYSUNEK B.4.1.

STRATEGIA BADANIA I OCENY DZIA¸ANIA DRA˚NIÑCEGO/˚RÑCEGO NA SKÓR¢

Za∏àcznik nr 6

B.5. TOKSYCZNOÂå OSTRA: DZIA¸ANIE DRA˚NIÑCE/˚RÑCE NA OKO

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 405 (2002).

1.1. Wst´p

Podczas opracowywania niniejszej metody szczególnà uwag´ zwrócono na mo˝liwoÊç jej ulepszenia,

bioràc pod uwag´ dobro zwierzàt i oszacowanie

wszystkich istniejàcych informacji dotyczàcych badanej substancji w celu unikni´cia zb´dnych badaƒ na

zwierz´tach laboratoryjnych. W metodzie tej zaleca si´

przed podj´ciem badania in vivo dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego badanej substancji na oczy wykonanie

oceny wagi dowodów istniejàcych danych (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Je˝eli sà dost´pne niepe∏ne

dane, to mogà byç one uzupe∏nione przez zastosowanie badania sekwencyjnego (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa). Strategia badawcza zawiera wykonanie

zwalidowanych i akceptowanych badaƒ in vitro,

a przedstawiona jest ona w Schemacie za∏àczonym do

niniejszej metody. Ponadto, w celu przewidzenia dzia∏ania ˝ràcego na oczy, przed podj´ciem badania in vivo na oku zaleca si´ wziàç pod uwag´ wyniki badaƒ

in vivo toksycznoÊci ostrej skórnej, dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´.

Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe, jak

i dobro zwierzàt nie nale˝y wykonywaç badaƒ in vivo,

a˝ do momentu oceny, w wyniku analizy wagi dowodów, wszystkich dost´pnych, istotnych danych dotyczàcych potencja∏u dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego

substancji na oczy. Dane takie powinny zawieraç dowody pochodzàce z istniejàcych badaƒ u ludzi i/lub

przeprowadzonych na zwierz´tach laboratoryjnych,

dowody na dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce jednej lub kilku

substancji o podobnej strukturze lub mieszanin takich

substancji, informacje o silnie kwaÊnym lub zasadowym odczynie tej substancji (zobacz pozycje 4 i 5 piÊmiennictwa) i wyniki zwalidowanych i akceptowanych badaƒ in vitro lub ex vivo dzia∏ania dra˝niàcego

lub ˝ràcego na skór´ (zobacz pozycje 6 i 7 piÊmiennictwa). Analiza ta powinna ograniczyç potrzeb´ badania

dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji w teÊcie

in vivo, dla których istniejà ju˝ wystarczajàce dowody

z innych badaƒ dla tych dwóch typów uszkodzeƒ. Badania te powinny byç prowadzone przed, lub jako wynik, analizy wagi dowodów.

Dla pewnych substancji taka analiza mo˝e wskazywaç na potrzeb´ przeprowadzenia badaƒ in vivo potencja∏u dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji na

oczy. We wszystkich takich przypadkach przed podj´ciem decyzji o przeprowadzeniu takiego badania preferowane jest wykonanie badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ (in vivo) oraz ocena wyników badania zgodnie z metodà badawczà B.4 (zobacz pozycja

8 piÊmiennictwa). Zastosowanie analizy wagi dowodów i strategii badania etapowego powinno zmniej-

szyç potrzeb´ przeprowadzania badania dzia∏ania

dra˝niàcego/˝ràcego na oczy (in vivo) dla substancji,

dla której istniejà ju˝ wystarczajàce dowody z innych

badaƒ, ˝e posiada takie w∏aÊciwoÊci. W przypadku

gdy nie mo˝na okreÊliç potencja∏u dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego na oczy za pomocà strategii badania

etapowego, pomimo przeprowadzonego badania

dzia∏ania ˝ràcego i dra˝niàcego na skór´ (in vivo),

mo˝na przeprowadziç badanie dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy (in vivo).

Zalecana strategia badania etapowego, obejmujàca przeprowadzenie badaƒ dzia∏ania ˝ràcego/dra˝nienia za pomocà zwalidowanych i akceptowanych metod in vitro lub ex vivo jest do∏àczona w formie Schematu stanowiàcego dodatek do niniejszej metody.

Strategia ta zosta∏a opracowana i jednomyÊlnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa) oraz przyj´ta jako zalecana

strategia badawcza w Âwiatowym Systemie Zharmonizowanym (GHS) (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).

Zaleca si´, by ww. strategia badawcza by∏a podj´ta

przed wykonaniem badania in vivo. W celu uzyskania

danych o przes∏ankach naukowych dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji dla nowych substancji zaleca si´ sposób badania etapowego. Dla substancji istniejàcych o niewystarczajàcych danych dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ strategi´ t´ nale˝y stosowaç dla uzupe∏nienia brakujàcych

danych. Zastosowanie innej strategii badawczej lub

sposobu post´powania bàdê te˝ podj´cie decyzji

o niestosowaniu etapowego sposobu badania musi

byç uzasadnione.

1.2. Definicje

Dzia∏anie dra˝niàce na oczy: jest to wywo∏ywanie

zmian w oku po podaniu badanej substancji na przednià powierzchni´ oka, które sà w pe∏ni odwracalne

w ciàgu 21 dni od podania.

Dzia∏anie ˝ràce na oczy: jest to wywo∏ywanie

uszkodzenia tkanek oka lub powa˝nej fizycznej utraty

zdolnoÊci widzenia, po podaniu badanej substancji na

przednià powierzchni´ oka, które nie sà w pe∏ni odwracalne w ciàgu 21 dni od podania.

1.3. Zasada metody badawczej

Badanà substancj´ wprowadza si´ w pojedynczej

dawce do jednego oka zwierz´cia doÊwiadczalnego;

drugie oko s∏u˝y jako kontrolne. Stopieƒ dzia∏ania

dra˝niàcego/˝ràcego na oczy jest oceniany w skali

punktowej na podstawie uszkodzeƒ rogówki, t´czówki

i spojówki w ustalonych odst´pach czasu. Dla uzyskania ca∏kowitej oceny skutków nale˝y równie˝ opisaç

inne skutki w oku i negatywne skutki ogólnoustrojowe. Czas trwania badania powinien byç wystarczajàcy

dla oceny odwracalnoÊci lub nieodwracalnoÊci obserwowanych skutków.

Zwierz´ta wykazujàce ciàg∏e oznaki ci´˝kiego

wstrzàsu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badaƒ muszà byç w sposób humanitarny uÊmiercone, a dzia∏anie substancji odpowiednio oszacowane. Kryteria s∏u˝àce do podj´cia decyzji o humanitarnym zabiciu

zwierzàt umierajàcych lub silnie cierpiàcych mo˝na

odnaleêç w pozycji piÊmiennictwa 11.

dodatkowa grupa, nale˝y u˝yç dwóch królików. Nale˝y starannie udokumentowaç warunki przemywania,

np. moment przemywania, sk∏ad i temperatura cieczy

do przemywania, czas trwania przemywania, obj´toÊç

stosowanej cieczy i szybkoÊç przemywania.

1.4. Opis metody badawczej

1.4.2.3.1. Badanie cieczy

1.4.1. Przygotowanie do badania in vivo

W przypadku badania cieczy stosuje si´ jà w iloÊci

0,1 ml. Badanej substancji nie nale˝y bezpoÊrednio

wprowadzaç do oka za pomocà pulweryzatora. Nale˝y

jà najpierw przenieÊç do naczynia, a nast´pnie wkropliç do oka w iloÊci 0,1 ml.

1.4.1.1. Wybór gatunku zwierzàt

Zalecanym gatunkiem jest królik albinotyczny; stosowaç nale˝y zdrowe, m∏ode dojrza∏e króliki. W przypadku stosowania innych gatunków nale˝y podaç uzasadnienie.

1.4.1.2. Przygotowanie zwierzàt

Oczy ka˝dego zwierz´cia wybranego wst´pnie do

badania nale˝y sprawdziç 24 godziny przed rozpocz´ciem doÊwiadczenia. Nie nale˝y u˝ywaç zwierzàt,

u których stwierdza si´ objawy podra˝nienia oczu, wady oczu lub istniejàce wczeÊniej uszkodzenie rogówki.

1.4.1.3. Warunki przetrzymywania i karmienia zwie-rzàt

Zwierz´ta powinny byç przetrzymywane pojedynczo. Temperatura w pomieszczeniu doÊwiadczalnym

dla królików powinna wynosiç 20±3 °C. WilgotnoÊç

wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza

wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ).

Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin

Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt

powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna,

nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody.

1.4.2. Sposób post´powania

1.4.2.1. Podawanie badanej substancji

Badanà substancj´ nale˝y umieÊciç w worku spojówkowym jednego oka ka˝dego zwierz´cia po ∏agodnym odsuni´ciu dolnej powieki od ga∏ki ocznej. Nast´pnie powieki nale˝y ∏agodnie przytrzymaç razem

przez oko∏o jednà sekund´, by zapobiec stratom materia∏u. Drugie oko, które pozostaje nienara˝one, s∏u˝y

jako kontrolne.

1.4.2.2. Przep∏ukiwanie

Oczu zwierzàt doÊwiadczalnych nie nale˝y przemywaç przez 24 godziny po wprowadzeniu badanej

substancji, z wyjàtkiem substancji sta∏ych (patrz

pkt 1.4.2.3.2) i w przypadku bezpoÊredniego dzia∏ania

˝ràcego lub dra˝niàcego. Po 24 godzinach mo˝na stosowaç przemycie, jeÊli jest to potrzebne.

Nie zaleca si´ stosowania dodatkowej grupy zwierzàt celem zbadania wp∏ywu przemywania, dopóki nie

jest to naukowo umotywowane. Gdy potrzebna jest

1.4.2.3. Poziom dawkowania

1.4.2.3.2. Badanie substancji sta∏ych

W badaniu substancji w stanie sta∏ym, past i substancji sypkich stosowana iloÊç powinna mieç obj´toÊç 0,1 ml lub mas´ nie wi´kszà ni˝ 100 mg. Substancj´ nale˝y rozetrzeç na drobny py∏. Obj´toÊç substancji sta∏ej nale˝y mierzyç po delikatnym jej zag´szczeniu, np. przez stukanie pojemnikiem. O ile badana

substancja w postaci sta∏ej nie zostanie wydalona

z oka zwierz´cia za pomocà odruchu fizjologicznego

do pierwszego punktu odczytu, tj. jednej godziny po

podaniu, oko nale˝y przep∏ukaç fizjologicznym roztworem soli lub wodà destylowanà.

1.4.2.3.3. Badanie aerozoli

Zaleca si´, aby substancje z pojemników zaopatrzonych w pulweryzatory oraz z aerozoli zebraç przed

wprowadzeniem do oka. Jedyny wyjàtek stanowià

substancje znajdujàce si´ w ciÊnieniowych pojemnikach aerozolowych, które nie mogà byç zbierane ze

wzgl´du na odparowanie. W takich przypadkach oko

nale˝y trzymaç otwarte i badanà substancj´ wprowadziç na przednià cz´Êç oka z odleg∏oÊci 10 cm pojedynczym strzykni´ciem trwajàcym oko∏o jednej sekundy. Odleg∏oÊç ta mo˝e ulec zmianie w zale˝noÊci

od ciÊnienia w pojemniku i jego zawartoÊci. Nale˝y

zwracaç uwag´, by nie uszkodziç oka p∏ynem z rozpylacza. W stosownych przypadkach mo˝e zajÊç koniecznoÊç oceny mo˝liwoÊci „mechanicznego” uszkodzenia oka spowodowanego silnym dzia∏aniem strumienia.

Dawk´ aerozolu mo˝na ustaliç, symulujàc doÊwiadczenie w nast´pujàcy sposób: substancj´ rozpyla si´ na zwa˝ony papier wielkoÊci oka królika. Przyrost masy papieru odpowiada w przybli˝eniu iloÊci,

która zosta∏a wprowadzona do oka. Dla substancji lotnych dawk´ mo˝na ustaliç na podstawie masy pojemnika przed i po u˝yciu.

1.4.2.4. Badanie wst´pne (badanie dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy in vivo na jednym zwierz´ciu)

Jak przedstawiono w strategii badania sekwencyjnego (zobacz Schemat 1) stanowczo zaleca si´, by badanie in vivo przeprowadziç wst´pnie na jednym

zwierz´ciu.

O ile wyniki tego badania po zastosowaniu opisanej procedury wskazujà, ˝e substancja dzia∏a ˝ràco lub

silnie dra˝niàco na oczy, to nie nale˝y przeprowadzaç

dalszych badaƒ dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego na

oczy.

1.4.2.5. Miejscowe znieczulenie

Miejscowe znieczulenie nale˝y stosowaç w okreÊlonych przypadkach. Je˝eli analiza wagi dowodów

wskazuje, ˝e substancja mo˝e wywo∏aç ból, lub

wst´pne badanie pokazuje, ˝e nast´puje reakcja bólowa, to nale˝y przed wprowadzeniem badanej substancji zastosowaç miejscowe znieczulenie. Nale˝y

starannie dobraç rodzaj, st´˝enie i dawk´ substancji

znieczulajàcej tak, aby zapewniç, ˝e jej zastosowanie

nie wywo∏a znaczàcych ró˝nic w reakcji badanej substancji. W ten sam sposób nale˝y znieczuliç oko kontrolne.

1.4.2.6. Badanie potwierdzajàce (badanie dzia∏ania

dra˝niàcego na oczy in vivo na dodatkowych

zwierz´tach)

Gdy w badaniu wst´pnym nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝niàce lub brak takiego

dzia∏ania nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc w dalszych badaniach do dwóch dodatkowych zwierzàt. Gdy w badaniu wst´pnym obserwowano silne dzia∏anie dra˝niàce, wskazujàce na mo˝liwy silny (nieodwracalny)

skutek w badaniu potwierdzajàcym, zaleca si´, by badanie potwierdzajàce prowadziç w sposób etapowy,

ka˝dorazowo raczej na jednym zwierz´ciu, ni˝ nara˝aç

dwa dodatkowe zwierz´ta równoczeÊnie. W przypadku gdy u drugiego zwierz´cia wyst´pujà skutki dzia∏ania ˝ràcego lub silnie dra˝niàcego, to doÊwiadczenia

nie nale˝y kontynuowaç. W celu potwierdzenia s∏abych lub umiarkowanych objawów dzia∏ania dra˝niàcego potrzebne b´dà dodatkowe zwierz´ta.

dzenia: perforacja rogówki lub znaczàce owrzodzenie

rogówki ∏àcznie z garbiakiem rogówki, krew w przedniej komorze oka, 4 stopieƒ nieprzezroczystoÊci rogówki utrzymujàcej si´ przez 48 godzin, brak reakcji

na Êwiat∏o (2 stopieƒ reakcji t´czówki), utrzymujàce

si´ przez 72 godziny, owrzodzenie b∏on spojówkowych, martwica b∏on spojówkowych lub mru˝nych

lub linienie. Tego typu uszkodzenia sà zazwyczaj nieodwracalne.

Zwierz´ta niewykazujàce uszkodzeƒ oka nale˝y zabijaç nie wczeÊniej ni˝ przed up∏ywem 3 dni po wprowadzeniu substancji. Zwierz´ta wykazujàce ∏agodne

lub umiarkowane uszkodzenia nale˝y obserwowaç,

dopóki zmiany si´ nie ustabilizujà lub przez 21 dni,

a po tym czasie zakoƒczyç doÊwiadczenie. Obserwacje

nale˝y przeprowadzaç w 7, 14 i 21 dniu celem ustalenia stanu uszkodzeƒ i ich odwracalnoÊci lub braku odwracalnoÊci.

Stopnie uszkodzenia oka (rogówki, t´czówki i spojówki) nale˝y zapisywaç podczas ka˝dego badania (Tabela B.5.1). Nale˝y równie˝ zapisywaç wszystkie inne

uszkodzenia oka (np. ∏uszczka, zabarwienie) lub szkodliwe skutki ogólnoustrojowe.

Badanie reakcji mo˝na u∏atwiç, u˝ywajàc lupy binokularowej, r´cznej lampy szczelinowej, biomikroskopu lub innych odpowiednich przyrzàdów. Po zapisaniu

obserwacji po 24 godzinach oczy mo˝na dalej badaç

przy pomocy fluoresceiny.

Ocena reakcji oczu wg skali punktowej jest z koniecznoÊci subiektywna. W celu ujednolicenia oceny

reakcji oczu wg skali punktowej i wsparcia laboratoriów przeprowadzajàcych doÊwiadczenia w przeprowadzeniu i interpretacji obserwacji, personel je przeprowadzajàcy nale˝y odpowiednio przeszkoliç w zakresie odpowiedniego systemu punktowania.

1.4.2.7. Okres obserwacji

2. WYNIKI

Czas trwania obserwacji musi byç wystarczajàcy

do pe∏nej oceny wielkoÊci i odwracalnoÊci obserwowanych skutków. DoÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç

w ka˝dym momencie, gdy zwierz´ta wykazujà oznaki

silnego bólu lub ci´˝ki stan 9). Dla ustalenia odwracalnoÊci skutków zwierz´ta nale˝y obserwowaç do 21 dni

od podania substancji. Gdy odwracalnoÊç widoczna

jest przed up∏ywem 21 dnia, doÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w tym czasie.

2.1. Ocena wyników

1.4.2.7.1. Obserwacje kliniczne i stopniowanie oddzia∏ywania na oko

Oczy powinny zostaç zbadane po up∏ywie 1, 24,

48 i 72 godzin po podaniu substancji. Zaraz po uzyskaniu rozstrzygajàcej informacji uczestnictwo zwierzàt w badaniu powinno trwaç nie d∏u˝ej ni˝ jest to

konieczne. Zwierz´ta objawiajàce ciàg∏y silny ból lub

ci´˝ki stan powinny byç bezzw∏ocznie w sposób humanitarny uÊmiercone, a substancja odpowiednio

oceniona. Zwierz´ta nale˝y w sposób humanitarny

uÊmierciç, je˝eli po wprowadzeniu badanej substancji do oka wystàpià nast´pujàce rodzaje jego uszko-

Poz. 2119

Punktowà ocen´ dzia∏ania dra˝niàcego na oczy nale˝y oceniaç w powiàzaniu z charakterem i nasileniem

uszkodzeƒ, ich odwracalnoÊcià lub brakiem odwracalnoÊci. Indywidualna punktacja nie prezentuje bezwzgl´dnego standardu w∏aÊciwoÊci dra˝niàcych substancji. Nale˝y równie˝ oceniç inne skutki wywo∏ane

przez badany materia∏. Natomiast indywidualnà punktacj´ nale˝y uwa˝aç jako wartoÊç odniesienia i ma ona

tylko wtedy znaczenie, gdy jest poparta pe∏nym opisem i ocenà wszystkich obserwacji.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie z badaƒ

Sprawozdanie z badaƒ musi zawieraç nast´pujàce

informacje

Racjonalne uzasadnienie do przeprowadzenia badania in vivo; analiz´ istniejàcych wyników badaƒ,

∏àcznie z wynikami strategii dzia∏ania etapowego

— opis istotnych wyników dost´pnych z wczeÊniejszych badaƒ,

— s∏owny opis rodzaju i stopnia obserwowanego

dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego,

— wyniki uzyskane na ka˝dym etapie wynikajàce ze

strategii badania,

— opis jakichkolwiek innych uszkodzeƒ obserwowanych w oku (np. unaczynienie, tworzenie si´

∏uszczki, zrosty, zabarwienia),

— opis przeprowadzonych doÊwiadczeƒ in vitro,

∏àcznie z szczegó∏ami post´powania, wyniki uzyskane dla badanej substancji/referencyjnej,

— opis przeprowadzonego badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ ∏àcznie z otrzymanymi

wynikami,

— analiza wagi dowodów dla przeprowadzonego doÊwiadczenia in vivo.

Badana substancja

— dane identyfikacyjne (np. numer CAS; êród∏o

otrzymania; znane zanieczyszczenia; numer serii),

— stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne

(np. wartoÊç pH, lotnoÊç, rozpuszczalnoÊç, trwa∏oÊç),

— w przypadku mieszanin sk∏ad i udzia∏ procentowy

sk∏adników,

— je˝eli stosowano miejscowe znieczulenie, to˝samoÊç Êrodka, zanieczyszczenia, typ, dawka i potencjalne wspó∏dzia∏anie z badanà substancjà.

NoÊnik

— identyfikacja, st´˝enie (o ile dotyczy), stosowana

obj´toÊç,

— uzasadnienie wyboru noÊnika.

Zwierz´ta doÊwiadczalne

— stosowany gatunek/szczep, uzasadnienie w przypadku stosowania innych zwierzàt ni˝ króliki albinotyczne,

— wiek ka˝dego zwierz´cia na poczàtku doÊwiadczenia,

— liczba zwierzàt ka˝dej p∏ci w grupach nara˝anych

i kontrolnych (o ile potrzebne),

— masa ka˝dego zwierz´cia na poczàtku i po zakoƒczeniu doÊwiadczenia,

— êród∏o pozyskania zwierzàt, warunki przebywania,

pasza itp.

Wyniki

— opis metody stosowanej do oceny dzia∏ania dra˝niàcego w ka˝dym czasie obserwacji (np. u˝ycie

r´cznej lampy szczelinowej, biomikroskopu, fluoresceiny),

— zestawienie w tabelach wyników dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego dla ka˝dego zwierz´cia z ka˝dego

czasu obserwacji, a˝ do usuni´cia zwierz´cia z doÊwiadczenia,

— opis miejscowych i uk∏adowych skutków szkodliwych innych ni˝ zwiàzane z okiem i zmian histopatologicznych, o ile wystàpi∏y.

Dyskusja wyników.

3.2. Interpretacja wyników

Ekstrapolacja wyników z badania dzia∏ania dra˝niàcego na oczy u zwierzàt laboratoryjnych na cz∏owieka jest mo˝liwa tylko w ograniczonym stopniu.

W wielu przypadkach królik albinotyczny jest bardziej

wra˝liwy na dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na oczy od cz∏owieka.

Podczas interpretacji wyników nale˝y zwróciç

uwag´, by wykluczyç wyniki dzia∏ania dra˝niàcego

spowodowanego wtórnà infekcjà.

4. PIÂMIENNICTWO

1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I.,

Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.j., Provan,

W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden,

P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410—429.

2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill,

R.N. (1997). Evaluation of Eye Irritation Potential

Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159—164.

3) Worth, A.P. and Fentem, J.H. (1999). A general approach for evaluating stepwise testing strategies.

ATLA 27, 161—177.

4) Young J.R., How M.J., Walker A.P. Worth W.M.H.

(1988). Classification as Corrosive or Irritant to

Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline

Substances Without Testing on Animals. Toxicol.

In Vitro, 2, 19—26.

5) Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the

Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at

a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12,

227—231.

6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham,

P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for

skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the

Management Team. Toxicology in vitro 12,

pp. 483—524.

7) Testing Method B. 40 Skin Corrosion.

8) Testing Method B.4. Acute toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.

9) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme

Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for

Alternative Toxicological Test Methods. Held

in Solna, Sweden, 22—24 January 1996

(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

10) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard

Classification System for Human Health and

Environmental Effects of Chemical Substancecs,

as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/

ehs /Class/HCL6.htm).

11) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used

in Safety Evaluation. OECD Environmental Health

and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/

monos.htm).

TABELA B.5.1: STOPNIOWANIE USZKODZENIA OKA

Rogówka

Zm´tnienie: stopieƒ g´stoÊci (odczytuje si´ na obszarze najwi´kszego nasilenia)*)

Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4

* Nale˝y zapisaç wielkoÊç pola zm´tnienia rogówki.

T´czówka

Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 2

Spojówka

Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 3

Obrz´k spojówki

Obrz´k (odnosi si´ do powieki i/lub b∏on mru˝nych)

Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4

SCHEMAT

Strategia etapowego badania dzia∏ania dra˝niàcego

i ˝ràcego na oczy

przypadkach (zobacz pozycje 3 i 4 piÊmiennictwa).

OPIS ETAPOWEJ STRATEGII BADAWCZEJ

ROZWA˚ANIA OGÓLNE

Przed rozpocz´ciem doÊwiadczeƒ jako cz´Êci strategii badania etapowego (Rysunek B.5.1) nale˝y oceniç wszystkie dost´pne informacje, dla okreÊlenia potrzeby badania oka in vivo. Chocia˝ istotne informacje

mo˝na uzyskaç z oceny pojedynczych parametrów

(np. skrajne wartoÊci pH), nale˝y oceniç ca∏oÊç istniejàcych informacji. Nale˝y oceniç na podstawie analizy

wagi dowodów wszystkie znaczàce dane o skutkach

dzia∏ania substancji lub jej analogów strukturalnych

i przedstawiç uzasadnienie decyzji. G∏ówny nacisk nale˝y po∏o˝yç na istniejàce dane o substancji uzyskane

dla ludzi i zwierzàt, a nast´pnie wyniki z badaƒ in vitro

lub ex vivo. Nale˝y unikaç w miar´ mo˝liwoÊci badaƒ

dzia∏ania ˝ràcego substancji in vivo. Czynniki brane

pod uwag´ w strategii badania obejmujà

Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe, jak

i dobro zwierzàt, wa˝ne jest, by unikaç niepotrzebnego stosowania zwierzàt i zmniejszaç liczb´ badaƒ, które mog∏yby wywo∏aç silne reakcje u zwierzàt. Przed

badaniem in vivo nale˝y oceniç wszystkie istotne informacje o substancji dotyczàce jej w∏aÊciwoÊci ˝ràcych i dra˝niàcych na oczy. Byç mo˝e istniejà ju˝ wystarczajàce dowody do klasyfikacji badanej substancji

pod kàtem jej mo˝liwego dzia∏ania dra˝niàcego i ˝ràcego na oczy, bez potrzeby prowadzenia doÊwiadczeƒ

na zwierz´tach laboratoryjnych. Dlatego stosowanie

analizy wagi dowodów i strategii badania etapowego

zminimalizuje potrzeb´ badania in vivo, szczególnie

gdy substancja prawdopodobnie spowoduje silnà reakcj´.

W celu zdecydowania o potrzebie przeprowadzenia dodatkowego badania innego ni˝ badania oczu in

vivo, by móc scharakteryzowaç takie dzia∏ania, zaleca

si´ stosowanie analizy wagi dowodów na podstawie

istniejàcych informacji dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego i ˝ràcego substancji na oczy. Gdy sà potrzebne

dalsze badania, zaleca si´ stosowanie strategii badania etapowego dla uzyskania istotnych wyników doÊwiadczalnych. Dla substancji, które nie by∏y dotàd

badane, nale˝y stosowaç strategi´ etapowego badania dla uzyskania zestawu wyników potrzebnych do

oceny si∏y dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oko. Strategi´ badania opisanà w niniejszym Schemacie wypracowano na warsztatach OECD (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). By∏a ona póêniej zatwierdzona i rozwini´ta w Zharmonizowanym Integralnym Systemie

Klasyfikacji Ryzyka Skutków Zdrowotnych dla ludzi

i dla Êrodowiska wywo∏anego przez substancje chemiczne, zaaprobowanego na 28 Wspólnym Posiedzeniu Komitetu Substancji Chemicznych i Grupy Roboczej d/s Substancji Chemicznych w listopadzie 1998 r.

(zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa).

Mimo ˝e strategia badania etapowego nie stanowi

integralnej cz´Êci metody badawczej B.5, to wyra˝a

zalecany sposób ustalania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy. To podejÊcie przedstawia zarówno najlepszà praktyk´, jak i etyczny wyznacznik dla badaƒ

dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy in vivo. Metoda

badawcza dostarcza wskazówek, jak prowadziç doÊwiadczenie in vivo i podsumowuje czynniki, które powinny byç wykorzystane przed rozpocz´ciem takiego

badania. Strategia badania etapowego dostarcza na

podstawie wagi dowodów sposób na ocen´ istniejàcych danych o w∏aÊciwoÊciach dra˝niàcych/˝ràcych

badanej substancji na oczy i zró˝nicowany sposób

uzyskiwania znaczàcych danych o substancjach, dla

których potrzebne sà dodatkowe badania lub dla których nie przeprowadzono badaƒ. Strategia obejmuje

przeprowadzenie najpierw sprawdzonymi i przyj´tymi

metodami in vitro lub ex vivo badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego, a nast´pnie metodà badawczà B.4 dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ w okreÊlonych

Ocena istniejàcych danych dotyczàcych dzia∏ania

substancji na ludzi i zwierz´ta (Etap 1). W pierwszej

kolejnoÊci nale˝y braç po uwag´ istniejàce dane dla

ludzi, np. badania kliniczne lub zawodowe i sprawozdania z wypadków i/lub dane z badaƒ przeprowadzonych na zwierz´tach, gdy˝ dostarczajà one bezpoÊrednich informacji o oddzia∏ywaniu na oczy. Nast´pnie

nale˝y oceniç dost´pne dane z badaƒ na ludziach i/lub

zwierz´tach dotyczàce dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego

na skór´. Substancje o znanym silnym dzia∏aniu dra˝niàcym lub ˝ràcym na oczy, jak równie˝ substancje

wykazujàce dzia∏anie ˝ràce lub silnie dra˝niàce na skór´ nie powinny byç wkraplane do oka zwierz´cia; takie

substancje nale˝y uznaç za ˝ràce lub dra˝niàce równie˝ na oczy. Nie nale˝y badaç w teÊcie in vivo substancji o znanym dzia∏aniu dra˝niàcym lub ˝ràcym

i substancji, co do których istniejà bezsporne dowody

o braku ich dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego.

Analiza zale˝noÊci aktywnoÊci od struktury substancji (SAR)(Etap 2). Je˝eli dost´pne sà wyniki badaƒ

substancji o podobnej strukturze, to nale˝y je wziàç

pod uwag´. Je˝eli dost´pna jest dostateczna liczba

wyników dotyczàcych substancji o podobnej budowie

lub mieszanin takich substancji wskazujàcych na ich

mo˝liwoÊci dzia∏ania ˝ràcego/dra˝niàcego na oczy dotyczàcych dzia∏ania na ludzi i/lub zwierz´ta, to mo˝na

za∏o˝yç, ˝e oceniana substancja b´dzie wywo∏ywa∏a te

same reakcje. W takich przypadkach nie ma potrzeby

badania substancji. Wyniki negatywne z badaƒ substancji o podobnej budowie lub mieszanin takich substancji nie stanowià wystarczajàcych dowodów na

brak dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji w strategii etapowego badania. Sprawdzone i przyj´te sposoby z zastosowaniem analizy SAR mogà byç stosowane do identyfikacji potencja∏u zarówno dzia∏ania

˝ràcego jak i dra˝niàcego na oczy.

W∏aÊciwoÊci fizykochemiczne i reaktywnoÊç chemiczna (Etap 3). Substancje wykazujàce skrajne wartoÊci pH, takie jak ≤2,0 i ≥11,5, mogà wykazywaç silne

dzia∏anie miejscowe. Je˝eli skrajne wartoÊci pH sà

podstawà do zaklasyfikowania substancji jako ˝ràcej

w stosunku do skóry, to nale˝y braç równie˝ pod uwag´ jej rezerw´ kwasowà/zasadowà (pojemnoÊç buforowà) (zobacz pozycje 5 i 6 piÊmiennictwa). Je˝eli

z pojemnoÊci buforowej wynika, ˝e substancja nie powinna dzia∏aç ˝ràco na oczy, to nale˝y podjàç dalsze

badania dla potwierdzenia tego, najlepiej przy u˝yciu

sprawdzonej i przyj´tej metody in vitro lub ex vivo (zobacz etapy: 5 i 6).

Badanie in vivo na królikach (Etap 8 i 9). Badanie

oka in vivo nale˝y rozpoczàç od badania wst´pnego,

u˝ywajàc jednego królika. O ile wyniki tego badania

wska˝à, ˝e substancja dzia∏a silnie dra˝niàco lub ˝ràco

na oczy, nie nale˝y przeprowadziç dalszego badania.

Je˝eli w badaniu tym nie wystàpià skutki dzia∏ania ˝ràcego lub silnie dra˝niàcego, nale˝y przeprowadziç badanie sprawdzajàce na dwóch dalszych zwierz´tach.

Uwzgl´dnianie innych istniejàcych informacji (Etap

4). Na tym etapie nale˝y oceniç wszystkie dost´pne informacje o toksycznoÊci ogólnoustrojowej w nara˝eniu przez skór´. Nale˝y równie˝ oceniç toksycznoÊç

ostrà po naniesieniu na skór´ badanej substancji. O ile

badana substancja okaza∏a si´ wysoce toksyczna po

podaniu na skór´, nie ma potrzeby badania jej na

oczach. Chocia˝ zale˝noÊç pomi´dzy toksycznoÊcià

ostrà skórnà a dzia∏aniem ˝ràcym/dra˝niàcym na oczy

niekoniecznie musi istnieç, to mo˝na przypuÊciç, ˝e

gdy jakaÊ substancja jest wysoce toksyczna poprzez

skór´, wywo∏a równie˝ wysokà toksycznoÊç po wprowadzeniu do oka. Takie dane powinny byç brane równie˝ pod uwag´ pomi´dzy etapem 2 i 3.

PIÂMIENNICTWO

Wyniki z badaƒ in vitro lub ex vivo (Etap 5 i 6).

Substancje, które wykaza∏y w badaniu przeprowadzonym metodà in vitro lub ex vivo (zobacz pozycje 7 i 8

piÊmiennictwa), która by∏a sprawdzona i przyj´ta do

szacowania szczególnie dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego

na oczy lub skór´, dzia∏ania silnie dra˝niàce lub ˝ràce

nie muszà byç badana na zwierz´tach. Mo˝na przypuszczaç, ˝e substancje takie b´dà wywo∏ywa∏y podobnie silne skutki w badaniu in vivo. Gdy sprawdzone i przyj´te metody in vitro/ex vivo sà niedost´pne,

nale˝y ominàç etapy 5 i 6 oraz przejÊç wprost do etapu 7.

Oszacowanie in vivo dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego substancji na skór´ (Etap 7). Gdy istniejàce dowody nie stanowià wystarczajàcej podstawy do przeprowadzenia rozstrzygajàcej analizy wagi dowodów

o potencjalnym dzia∏aniu ˝ràcym/dra˝niàcym na oczy

przez danà substancj´ na bazie danych z badaƒ wyszczególnionych powy˝ej, nale˝y najpierw oceniç potencjalne dzia∏anie ˝ràce/dra˝niàce po naniesieniu na

skór´ in vivo, stosujàc metod´ badawczà B.4 (zobacz

pozycja 4 piÊmiennictwa) i za∏àczony do niej Schemat

(zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). O ile substancja

wyka˝e dzia∏anie ˝ràce lub silnie dra˝niàce na skór´,

nale˝y przyjàç, ˝e dzia∏a ˝ràco na oczy, chyba ˝e inne

informacje sk∏onià do innego wniosku. Tak wi´c nie

ma potrzeby przeprowadzenia badania oka in vivo.

O ile substancja nie wykazuje dzia∏ania ˝ràcego lub silnie dra˝niàcego na skór´ nale˝y przeprowadziç badanie oka in vivo.

1) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme

Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria

for Alternative Toxicological Test Methods. Held

on Solna, Sweden, 22—24 January 1996

(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

2) OECD (1998). Harmonized Intergrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals

Committee and Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/

HCL6.htm).

3) Worth, A.P. and Fentem, J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies.

ATLA 27, 161—177.

4) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.

5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth,

W.M.H. (1998). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or

Alkaline Substances Without Testing on Animals.

Toxic In Vitro, 2 (1) pp. 19—26.

6) Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye

Irritation Potential of Solutions Prepared at

a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12,

227—231.

7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham,

P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM

international validation study on in vitro test for

skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the

Management Team. Toxicology in vitro 12,

pp. 483—524.

8) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

9) Annex to testing Method B.4.: A Sequential Testing

Strategy for Skin Irritation and Corrosion.

Rysunek B.5.1.

STRATEGIA BADANIA I OCENY DZIA¸ANIA DRA˚NIÑCEGO/˚RÑCEGO NA OCZY

Za∏àcznik nr 7

B.31. BADANIE TOKSYCZNOÂCI W ROZWOJU PRZEDPORODOWYM

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 414 (2001).

1.1. Wst´p

Niniejsza metoda — badania toksycznoÊci w rozwoju przedporodowym zosta∏a opracowana w celu

dostarczania ogólnych informacji dotyczàcych skutków nara˝enia w okresie przedporodowym na badane

ci´˝arne zwierz´ i p∏ód rozwijajàcy si´ w macicy. Mogà one zawieraç ocen´ skutków nara˝enia na matk´,

a tak˝e padni´cie, nieprawid∏owoÊci strukturalne lub

zaburzenia rozwoju p∏odu. Zaburzenia czynnoÊciowe,

chocia˝ sà wa˝nà cz´Êcià rozwoju, nie sà brane pod

uwag´ w niniejszej metodzie. Mo˝na je oceniaç w oddzielnych lub równolegle przeprowadzonych badaniach wed∏ug metody dotyczàcej neurotoksycznoÊci

w okresie rozwojowym. Informacji dotyczàcych badania zaburzeƒ czynnoÊciowych i innych skutków poporodowych nale˝y poszukiwaç za pomocà metody badania toksycznoÊci reprodukcyjnej w teÊcie dwupokoleniowym oraz metody badania neurotoksycznoÊci

rozwojowej.

W niniejszej metodzie badawczej mogà byç konieczne, w szczególnych przypadkach, modyfikacje

w oparciu o okreÊlonà wiedz´, np. dotyczàcà w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych lub toksykologicznych badanej substancji. Takie modyfikacje sà dopuszczalne,

gdy przekonujàce dowody naukowe sugerujà, ˝e modyfikacja b´dzie prowadziç do dostarczenia wi´kszej

iloÊci danych wynikajàcych z badania. W takim przypadku te naukowe dowody powinny byç dok∏adnie

przedstawione w sprawozdaniu koƒcowym z badania.

podczas rozwoju przedporodowego lub w okresie poporodowym do czasu osiàgni´cia dojrza∏oÊci p∏ciowej. Do g∏ównych objawów toksycznoÊci rozwojowej

zalicza si´: 1) zgon, 2) nieprawid∏owoÊci budowy,

3) zaburzenia rozwoju i 4) zaburzenia czynnoÊciowe.

Toksykologia rozwoju by∏a uprzednio cz´sto nazywana teratologià.

Szkodliwe skutki: jakiekolwiek zmiany zwiàzane

z nara˝eniem powodujàce obni˝enie zdolnoÊci organizmu do prze˝ywania, rozmna˝ania lub przystosowania si´ do Êrodowiska. Bioràc pod uwag´ toksykologi´

rozwoju rozumianà w najszerszym jej uj´ciu, zalicza

si´ tutaj ka˝dy skutek, który zak∏óca normalny rozwój

zarodka zarówno przed, jak i po narodzinach.

Zmieniony wzrost: zmiana masy lub wielkoÊci narzàdu lub cia∏a potomstwa.

Zmiany (nieprawid∏owoÊci): zmiany strukturalne

w rozwoju, do których zalicza si´ zniekszta∏cenia

i zmiennoÊç (zobacz pozycja 28 piÊmiennictwa)

Zniekszta∏cenie/nieprawid∏owoÊç

wi´ksza

zmiana strukturalna uwa˝ana za szkodliwà dla

zwierz´cia (mo˝e byç tak˝e Êmiertelna) i jest zazwyczaj rzadka.

ZmiennoÊç/nieprawid∏owoÊç mniejsza: zmiana strukturalna uwa˝ana za majàcà ma∏y lub niemajàcà ˝adnego szkodliwego wp∏ywu na zwierz´;

mo˝e byç przejÊciowa bàdê stosunkowo cz´sto

wyst´powaç w populacji kontrolnej.

1.2. DEFINICJE

Zarodek: sumaryczne okreÊlenie wszystkich form

pochodzàcych od zap∏odnionego jaja w jakiejkolwiek

fazie rozwoju od zap∏odnienia a˝ do porodu, w tym

b∏ony zarodkowe, a tak˝e zarodek lub p∏ód.

Toksykologia rozwoju: badania skutków dzia∏ania

szkodliwego na rozwijajàcy si´ organizm, które mogà

byç nast´pstwem nara˝enia przed zap∏odnieniem,

Implantacja (zagnie˝d˝enie): przy∏àczenie blastocysty do nab∏onka macicy, w tym jej penetracj´ przez

ten nab∏onek i jej osadzenie w endometrium.

Zarodek: wczesna faza rozwojowa organizmu,

w szczególnoÊci rozwijajàcy si´ produkt zap∏odnienia

jaja po pojawieniu si´ osi pod∏u˝nej, a˝ do pojawienia

si´ wszystkich g∏ównych struktur.

woju przedporodowym. Zalecanym gatunkiem wÊród

gryzoni jest szczur, a z pozosta∏ych zwierzàt królik.

W przypadku, u˝ycia innego gatunku zwierz´cia nale˝y podaç uzasadnienie.

EmbriotoksycznoÊç: szkodliwe dzia∏anie dla normalnej struktury, rozwoju, wzrostu i/lub ˝ywotnoÊci

zarodka.

1.5.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt

P∏ód: nienarodzone potomstwo w okresie pozarodkowym.

ToksycznoÊç p∏odowa: szkodliwe dzia∏anie dla

normalnej struktury, rozwoju, wzrostu i/lub ˝ywotnoÊci p∏odu.

Poronienie: przedwczesne wydalenie z macicy

produktu zap∏odnienia: zarodka lub p∏odu niezdolnego do ˝ycia.

Resorpcja: zarodek, który po zagnie˝d˝eniu w macicy obumar∏ i jest lub zosta∏ wch∏oni´ty

Resorpcja wczesna: dowód zagnie˝d˝enia bez

rozpoznawalnego zarodka/p∏odu.

Resorpcja póêna: martwy zarodek lub p∏ód

z zewn´trznymi zmianami zwyrodnieniowymi.

NOAEL: skrót dla poziomu dawkowania bez obserwowanego szkodliwego skutku, jest to najwy˝szy poziom dawki, przy którym nie obserwuje si´ szkodliwych skutków zwiàzanych z nara˝eniem.

1.3. Substancja kontrolna

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Badana substancja podawana jest zwierz´tom b´dàcym w cià˝y przynajmniej od momentu zagnie˝d˝enia do jednego dnia przed planowanym uÊmierceniem, które powinno nastàpiç, w miar´ mo˝liwoÊci,

jak najbli˝ej dnia normalnego porodu, bez ryzykowania utraty danych wynikajàcych z porodu przedwczesnego. Niniejsza metoda badawcza nie jest przeznaczona, w celu badania jedynie okresu organogenezy

(np.: 5—15 dzieƒ u gryzoni i 6—18 dzieƒ u królika), ale

tak˝e w przypadku gdy to w∏aÊciwe, równie˝ skutków

nara˝enia z okresu przed zagnie˝d˝eniem przez ca∏y

okres cià˝y, a˝ do dnia przed ci´ciem cesarskim. Tu˝

przed cesarskim ci´ciem samice sà uÊmiercane, zawartoÊç macicy przebadana, a p∏ody ocenione pod

wzgl´dem widocznych zmian zewn´trznych, szkieletowych oraz w tkankach mi´kkich.

1.5. Opis metody badawczej

1.5.1. Wybór gatunku zwierzàt

Zaleca si´, by badanie by∏o wykonane na najbardziej odpowiednim gatunku, a stosowane powinny

byç gatunki i rasy zwierzàt laboratoryjnych u˝ywanych powszechnie w badaniach toksycznoÊci w roz-

Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych powinna wynosiç 22±3 °C dla gryzoni

i 18±3 °C dla królików. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna

wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach

mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas

czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne

oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci.

Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody.

Kojarzenie w pary powinno byç przeprowadzone

w klatkach odpowiednich do tych celów. Preferowane

jest przetrzymywanie pojedynczych osobników, ale

dopuszczalne jest tak˝e przetrzymywanie osobników

w ma∏ych grupach.

1.5.3. Przygotowanie zwierzàt

Powinny byç stosowane zdrowe zwierz´ta, aklimatyzowane przynajmniej przez 5 dni do warunków laboratoryjnych i nieu˝ywane wczeÊniej w innych doÊwiadczeniach. Powinny byç znane: rasa, êród∏a pochodzenia, p∏eç, waga i/lub wiek zwierzàt. Zwierz´ta

wszystkich grup badanych powinny byç, na ile to mo˝liwe, w tym samym wieku i mieç takà samà mas´ cia∏a. Na ka˝dym poziomie dawkowania stosuje si´ m∏ode doros∏e dziewicze samice. Samice powinny byç kojarzone z samcami tego samego gatunku i rasy, nale˝y unikaç kojarzenia osobników spokrewnionych.

W przypadku gryzoni zerowym dniem cià˝y jest ten,

w którym zaobserwuje si´ czop pochwowy i/lub nasienie; w przypadku królików dniem zerowym jest zazwyczaj dzieƒ pokrycia lub sztucznej inseminacji, je˝eli taka technika jest stosowana. Klatki nale˝y ustawiç w taki sposób, by zminimalizowaç mo˝liwy wp∏yw ich

ustawienia na wyniki badania. Ka˝demu zwierz´ciu

nale˝y przypisaç jego w∏asny numer identyfikacyjny.

Samice powinny byç przypisane do grupy kontrolnej

i grup nara˝anych w sposób losowy. Je˝eli samice by∏y kojarzone grupowo, to zwierz´ta z ka˝dej partii powinny zostaç równomiernie rozdzielone pomi´dzy

grupy. Podobnie samice inseminowane przez tego samego samca powinny byç równomiernie rozdzielone

pomi´dzy grupy.

1.6. Sposób post´powania

1.6.1. Liczba i p∏eç zwierzàt

Ka˝da grupa kontrolna i badana powinna zawieraç

wystarczajàcà liczb´ samic, by uzyskaç w przybli˝eniu

20 samic z miejscami zagnie˝d˝enia podczas autopsji.

Grupy z mniej ni˝ 16 zwierz´tami z miejscami zagnie˝d˝enia mogà byç nieodpowiednie. Wyst´pujàca

ÊmiertelnoÊç osobników rodzicielskich nie musi byç

przyczynà uniewa˝nienia badania, pod warunkiem ˝e

nie przekracza 10 %.

1.6.2. Przygotowanie dawek

Je˝eli stosowany jest noÊnik lub inny dodatkowy

zwiàzek umo˝liwiajàcy podawanie substancji, to nale˝y braç pod uwag´ jego nast´pujàce charakterystyczne cechy: wp∏yw na absorpcj´, rozmieszczenie, metabolizm i retencj´ lub wydalanie badanej substancji;

wp∏yw na w∏aÊciwoÊci chemiczne badanej substancji,

które mogà zmieniç jej charakterystyk´ toksykologicznà; wp∏yw na spo˝ywanie pokarmu i pobieranie wody przez zwierz´ta. NoÊnik nie powinien byç ani toksyczny dla rozwoju, ani nie mo˝e mieç wp∏ywu na

rozrodczoÊç.

Poz. 2119

zmu i toksykokinetyki badanej substancji lub substancji podobnych strukturalnie. Informacje te pomogà

w doborze w∏aÊciwego sposobu dawkowania.

Równolegle nale˝y stosowaç grup´ kontrolnà. Tej

grupie podaje si´ placebo lub noÊnik, je˝eli taki jest

stosowany podczas podawania substancji. Wszystkie

grupy powinny otrzymywaç takà samà obj´toÊç badanej substancji lub noÊnika. Ze zwierz´tami w grupach

kontrolnych nale˝y obchodziç si´ w taki sam sposób,

jak ze zwierz´tami nara˝anymi. Grupy kontrolne z noÊnikiem powinny otrzymywaç noÊnik w najwy˝szej zastosowanej iloÊci (jak w grupie o najni˝szej stosowanej dawce).

1.6.3. Podawanie substancji

1.6.4. Badanie dawki granicznej

W zasadzie badana substancja powinna byç podawana codziennie od zagnie˝d˝enia (np. 5 dnia po skojarzeniu) do dnia przed planowanym porodem za pomocà cesarskiego ci´cia. W przypadku gdy dost´pne

sà wyniki badania wst´pnego, które nie wskazujà na

wysoki potencja∏ strat przed zagnie˝d˝eniem, to podawanie substancji mo˝e byç przed∏u˝one na ca∏y okres

cià˝y, od dnia skojarzenia do dnia przed planowanym

uÊmierceniem. Ogólnie wiadomo jest, ˝e niew∏aÊciwe

obchodzenie si´ ze zwierz´tami lub stres podczas cià˝y mo˝e powodowaç poronienia. Aby zapobiec poronieniom spowodowanym przez czynniki niezwiàzane

z podawanà substancjà, nale˝y unikaç niepotrzebnego

zak∏ócania spokoju ci´˝arnych samic, a tak˝e stresu

spowodowanego przez czynniki zewn´trzne takie jak

ha∏as.

Nale˝y stosowaç przynajmniej trzy poziomy dawek i równoleg∏à grup´ kontrol´. Zdrowe zwierz´ta

powinny zostaç przypisane do grup nara˝anych i kontrolnych w sposób losowy. Poziomy dawkowania powinny zostaç ustalone tak, by spowodowaç stopniowanie skutków toksycznych. Najwy˝sza dawka powinna zostaç dobrana w taki sposób, by indukowaç toksycznoÊç rozwojowà i/lub objawy toksyczne u samic

(objawy kliniczne lub spadek masy cia∏a), ale nie ich

zgon bàdê powa˝ne cierpienie, chyba ˝e jest to ograniczone w∏aÊciwoÊciami fizykochemicznymi lub w∏aÊciwoÊciami biologicznymi badanej substancji. Przynajmniej jedna dawka poÊrednia powinna powodowaç minimalne skutki toksyczne mo˝liwe do zaobserwowania. Najni˝sza dawka nie powinna powodowaç

jakiejkolwiek toksycznoÊci rozwojowej lub toksycznoÊci dla osobników rodzicielskich. Sekwencja malejàcych dawek powinna zostaç dobrana tak, by mo˝na

by∏o wykazaç odpowiedê typu dawka–skutek i wyznaczyç poziom bez obserwowanego szkodliwego skutku

(NOAEL). Optymalne dla ustalenia sekwencji malejàcych dawek sà wspó∏czynniki o wartoÊci 2—4, a cz´sto

dodanie czwartej badanej grupy jest lepsze ni˝ stosowanie bardzo du˝ych wspó∏czynników pomi´dzy dawkami (np. wi´kszych ni˝ 10). Chocia˝ celem jest ustalenie wartoÊci NOAEL dla matek, to badania, w których

nie ustalono takiego poziomu, równie˝ sà mo˝liwe do

zaakceptowania (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa).

Poziomy dawek powinny zostaç ustalone

z uwzgl´dnieniem istniejàce danych o toksycznoÊci,

a tak˝e informacji dodatkowych na temat metaboli-

Je˝eli badanie w jednej dawce na poziomie przynajmniej 1000 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ po podaniu do˝o∏àdkowym i przy zastosowaniu procedur opisanych

w niniejszej metodzie nie powoduje powstawania

mo˝liwych do zaobserwowania skutków toksycznych

i je˝eli nie nale˝a∏o si´ spodziewaç takich skutków na

podstawie istniejàcych danych (np. w przypadku

zwiàzków strukturalnie i/lub metabolicznie podobnych) to wtedy pe∏ne badanie z trzema poziomami dawek mo˝e byç uwa˝ane za niepotrzebne. Spodziewane nara˝enie ludzi mo˝e wskazywaç na potrzeb´ zastosowania wy˝szej dawki stosowanej do˝o∏àdkowo

w badaniu st´˝eƒ granicznych. W przypadku innych

sposobów podawania, takich jak inhalacyjne bàdê

skórne, w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne badanej substancji cz´sto mogà wskazywaç na maksymalny mo˝liwy do uzyskania poziom nara˝enia (np. zastosowanie po naniesieniu na skór´ nie powinno powodowaç

ostrej toksycznoÊci miejscowej).

1.6.5. Podawanie substancji

Badana substancja lub noÊnik sà zazwyczaj podawane do˝o∏àdkowo za pomocà sondy do˝o∏àdkowej

lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Je˝eli stosowany jest inny sposób podawania, to nale˝y podaç jego

uzasadnienie; konieczne mogà byç wtedy pewne modyfikacje (zobacz pozycje 2, 3 i 4 piÊmiennictwa). Badana substancja powinna byç podawana codziennie,

w przybli˝eniu o tej samej porze dnia.

Dawka dla ka˝dego zwierz´cia powinna opieraç si´

na najbardziej aktualnych pomiarach masy cia∏a osobnika. Nale˝y byç jednak˝e ostro˝nym w dostosowywaniu dawki w ostatnim trymestrze cià˝y. Do wyboru

dawki stosowane powinny byç istniejàce dane, by zapobiec nadmiernej toksycznoÊci dla osobnika macierzystego. Je˝eli jednak takie objawy toksycznoÊci pojawià si´, to zwierz´ta te powinny zostaç w sposób humanitarny uÊmiercone. Je˝eli objawy takie pojawià

si´ u kilku ci´˝arnych samic z nara˝anej grupy, to nale˝y wziàç pod uwag´ zakoƒczenie doÊwiadczenia z tà

grupà. Gdy substancja podawana jest przez zg∏´bnik,

to powinna byç podawana w pojedynczej dawce przy

pomocy sondy do˝o∏àdkowej lub kaniuli intubacyjnej.

Maksymalna obj´toÊç, jaka mo˝e zostaç podana jednorazowo zwierz´ciu, zale˝y od jego rozmiarów. Obj´toÊç ta nie powinna przekraczaç 1 ml/100 g masy cia-

∏a, z wyjàtkiem przypadku roztworów wodnych gdzie

stosowane mo˝e byç 2 ml/100 g masy cia∏a. Je˝eli jako noÊnik stosuje si´ olej kukurydziany, to obj´toÊç nie

powinna przekraczaç 0,4 ml/100 g masy cia∏a. ZmiennoÊç obj´toÊci powinna byç zminimalizowana przez

dostosowanie st´˝enia tak, aby zapewniç sta∏à obj´toÊç na wszystkich poziomach dawek.

1.6.6. Obserwacje samic ci´˝arnych

Obserwacje kliniczne powinny byç dokonywane,

a wyniki zapisywane przynajmniej raz dziennie, najlepiej o tej samej porze dnia, bioràc pod uwag´ szczytowy okres przewidywanych skutków po podawaniu

substancji. Kondycja zwierzàt powinna byç opisywana

z uwzgl´dnieniem ÊmiertelnoÊci, stanów agonalnych,

sta∏ych zmian w zachowaniu i wszystkich innych objawów wyraênej toksycznoÊci.

1.6.7. Masa cia∏a i spo˝ycie pokarmu

Zwierz´ta powinny byç wa˝one w dniu zerowym

lub nie póêniej ni˝ w trzecim dniu (zwierz´ta po skojarzeniu dostarczone przez dostawc´ zewn´trznego), nast´pnie pierwszego dnia nara˝enia i przynajmniej co

trzy dni podczas okresu podawania substancji oraz

w dniu przewidywanego uÊmiercenia.

Spo˝ycie pokarmu powinno byç zapisywane w odst´pach trzydniowych i zbiegaç si´ w czasie z pomiarami masy cia∏a.

1.6.8. Badanie sekcyjne

Samice powinny zostaç uÊmiercone na dzieƒ

przed przewidywanym porodem. Samice wykazujàce

objawy poronienia lub przedwczesnego porodu przed

zaplanowanym uÊmierceniem powinny zostaç

uÊmiercone i poddane dok∏adnym ogl´dzinom makroskopowym.

W czasie zakoƒczenia doÊwiadczenia lub zgonu

podczas doÊwiadczenia samice powinny zostaç przebadane makroskopowo pod kàtem nieprawid∏owoÊci

w budowie i zmian patologicznych. W celu unikni´cia

zasugerowania wyniku, badania samic podczas ci´cia

cesarskiego oraz p∏odów powinny byç wykonane bez

wiedzy o tym, z jakiej grupy one pochodzi∏y.

1.6.9. Badanie zawartoÊci macicy

Natychmiast po zakoƒczeniu porodu lub tu˝ po

Êmierci macice powinny byç usuni´te, a stopieƒ zaawansowania cià˝y okreÊlony. Macice, których wyglàd

nie wskazuje na cià˝´, powinny zostaç poddane dalszym badaniom (np. barwienie siarczkiem amonu

u gryzoni i barwienie Salewskiego lub innà odpowiednià metodà dla królików), by potwierdziç brak cià˝y

(zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa).

Nale˝y zwa˝yç macice samic ci´˝arnych wraz

z szyjkà macicy. Nie nale˝y zapisywaç masy macic samic ci´˝arnych uzyskanych od zwierzàt, które pad∏y

podczas doÊwiadczenia.

Poz. 2119

U zwierzàt ci´˝arnych nale˝y okreÊliç liczb´ cia∏ek

˝ó∏tych.

ZawartoÊç macicy powinna zostaç przebadana

pod kàtem liczby martwych zarodków lub p∏odów oraz

p∏odów ˝ywych. W celu oszacowania wzgl´dnego czasu Êmierci zarodka nale˝y opisaç stopieƒ resorpcji (zobacz pkt 1.2).

1.6.10. Badanie p∏odów

Nale˝y okreÊliç p∏eç i mas´ cia∏a ka˝dego p∏odu.

U ka˝dego p∏odu powinny zostaç przebadane

zmiany zewn´trzne (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa).

Nale˝y przebadaç p∏ody pod kàtem zmian w szkielecie i tkankach mi´kkich (np. zmiany, zniekszta∏cenia

i nieprawid∏owoÊci) (zobacz pozycje 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24 piÊmiennictwa). Po˝àdana, ale niewymagana jest kategoryzacja

zmian p∏odowych. Je˝eli jednak jest ona wykonywana, to nale˝y wyraênie podaç kryteria definicji ka˝dej

kategorii. Szczególnà uwag´ nale˝y zwróciç na uk∏ad

rozrodczy, który powinien zostaç przebadany pod kàtem zmian w rozwoju.

W przypadku gryzoni oko∏o po∏owa miotów powinna byç przebadana pod kàtem zmian szkieletowych. Pozosta∏a cz´Êç powinna byç przebadana pod

wzgl´dem zmian w tkankach mi´kkich przy zastosowaniu uznanych w∏aÊciwych metod serii przekrojów

lub techniki przekrojów ca∏oÊciowych.

W przypadku zwierzàt innych ni˝ gryzonie, np.

króliki, wszystkie p∏ody powinny zostaç przebadane

pod wzgl´dem zmian w szkielecie jak i tkankach mi´kkich. Cia∏a tych p∏odów powinny byç ocenione przez

sekcj´ pod kàtem zmian w tkankach mi´kkich, do czego zalicza si´ równie˝ procedury do dalszego szacowania wewn´trznej struktury serca (zobacz pozycja 25

piÊmiennictwa). G∏owy po∏owy p∏odów przebadanych

w ten sposób powinny zostaç oddzielone i poddane

badaniom pod wzgl´dem zmian w tkankach mi´kkich

(oczy, mózg, komory nosowe i j´zyk) przy zastosowaniu standardowych metod serii przekrojów (zobacz

pozycja 26 piÊmiennictwa) lub innych równie czu∏ych

metod. Cia∏a tych p∏odów i pozosta∏e nienaruszone

p∏ody powinny zostaç przebadane pod wzgl´dem

zmian w szkielecie przy zastosowaniu tych samych

metod, jak opisane dla gryzoni.

2. WYNIKI

2.1. Opracowanie wyników

Dane powinny byç zapisywane oddzielnie dla ka˝dej samicy, jak i jej potomstwa i zestawione w formie

tabel. Nale˝y wykazaç dla ka˝dej badanej grupy i ka˝dego pokolenia liczb´ zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia, liczb´ zwierzàt martwych podczas badania lub

uÊmierconych z powodów humanitarnych, czas zgonu

lub uÊmiercenia, liczb´ samic w cià˝y, liczb´ zwierzàt

wykazujàcych objawy toksycznoÊci, opis zaobserwowanych objawów toksycznoÊci, w tym czas ich poja-

wienia si´, trwanie i nasilenie objawów, rodzaje obserwacji zarodków/p∏odów i wszystkie inne znaczàce

dane dotyczàce p∏odów.

Dane liczbowe powinny byç oszacowane w∏aÊciwà

metodà statystycznà. Ka˝dy p∏ód nale˝y traktowaç

w analizie danych jako jednostk´. Stosowane powinny byç ogólnie uznane metody statystyczne; wybrane

jako cz´Êç sk∏adowa uk∏adu doÊwiadczenia, a ich wybór powinien byç uzasadniony. Dane zwierzàt, które

nie prze˝y∏y do planowanego uÊmiercenia, tak˝e powinny byç podane. Mogà one równie˝ byç uwzgl´dnione w obliczonych wartoÊciach Êrednich z ka˝dej

grupy. Znaczenie takich wyników oraz ich uwzgl´dnienie bàdê te˝ nieuwzgl´dnienie w Êrednich dla grup(y)

w ka˝dym przypadku powinno byç oszacowane i uzasadnione.

2.2. Ocena wyników

Obserwacje poczynione w przeprowadzonym badaniu toksycznoÊci rozwoju przedporodowego powinny byç ocenione pod wzgl´dem zaobserwowanych

skutków. Ocena ta powinna zawieraç nast´pujàce informacje

— wyniki badania zarodków/p∏odów i samic w tym

ocena powiàzaƒ lub ich brak pomi´dzy nara˝eniem zwierzàt badanych na badanà substancj´

oraz wyst´powaniem i nasileniem wszystkich obserwacji,

— kryteria stosowane w kategoryzacji zmian zewn´trznych, tkanek mi´kkich i szkieletu p∏odów,

je˝eli dokonano takiej kategoryzacji,

— w celu wspomo˝enia interpretacji danych z doÊwiadczenia, dane z wczeÊniej przeprowadzonych

badaƒ jako dane kontrolne, je˝eli jest to w∏aÊciwe,

— dane liczbowe stosowane w obliczaniu wszystkich

wartoÊci procentowych i odpowiednich wspó∏czynników,

— odpowiednià analiz´ statystycznà uzyskanych wyników, w tym wystarczajàce informacje na temat

metody analizy tak, aby niezale˝ny recenzent/statystyk móg∏ ponownie dokonaç obliczeƒ i odtworzyç analiz´.

W badaniach, które wykazujà brak objawów dzia∏ania toksycznego, pod uwag´ nale˝y braç dalsze badania dotyczàce absorpcji i biodost´pnoÊci badanej

substancji.

2.3. Interpretacja wyników

Badanie toksycznoÊci w rozwoju przedporodowym dostarcza informacji na temat skutków dzia∏ania

toksycznego na samice i wewnàtrzmaciczny rozwój

ich potomstwa powtarzanego podawania drogà pokarmowà substancji w czasie cià˝y. Wyniki badaƒ powinny byç interpretowane w po∏àczeniu z wynikami

z badaƒ podprzewlek∏ych, rozmna˝ania, toksykokinetycznych i innych. Poniewa˝ nacisk po∏o˝ony jest zarówno na toksycznoÊç ogólnà, jak i rozwojowà, to wy-

Poz. 2119

niki badania pozwalajà na rozró˝nienie pomi´dzy

skutkami rozwojowymi nast´pujàcymi przy niewystàpieniu toksycznoÊci ogólnej i tymi, które wyst´pujà

tylko w warunkach nara˝enia na dawki toksyczne dla

zwierzàt rodzicielskich.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje

Badana substancja

— stan fizyczny i gdy to ma znaczenie równie˝ w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne,

— identyfikacja, w tym numer CAS, je˝eli jest znany/ustalony,

— czystoÊç.

NoÊnik (je˝eli by∏ stosowany)

— uzasadnienie wyboru noÊnika, je˝eli zosta∏ zastosowany inny noÊnik ni˝ woda.

Badane zwierz´ta

— gatunek/szczep,

— liczba i wiek zwierzàt,

— êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania,

pasza itp.,

— masy poszczególnych zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia.

Warunki badania

— uzasadnienie wybranych dawek,

— szczegó∏y dotyczàce formulacji badanej substancji, w tym przygotowania pokarmu, osiàgni´te st´˝enie, trwa∏oÊç i jednorodnoÊç preparatu,

— szczegó∏y dotyczàce podawania badanej substancji,

— przeliczenie st´˝enia (ppm) badanej substancji

z zawartoÊci w paszy/wodzie pitnej na dawk´ rzeczywistà (mg/kg masy cia∏a/dzieƒ), je˝eli istnieje

taka koniecznoÊç,

— warunki Êrodowiskowe,

— szczegó∏y dotyczàce paszy i wody pitnej.

Wyniki

Dane o toksycznoÊci dla samic wed∏ug dawki powinny zawieraç, ale nie ograniczaç si´ do

— liczby zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia, liczby

zwierzàt prze˝ywajàcych badanie, liczby zwierzàt

ci´˝arnych, liczby poronieƒ i przedwczesnych porodów,

— dni padni´ç podczas badania i liczby zwierzàt, które prze˝y∏y do koƒca badania,

— danych zwierzàt, które nie prze˝y∏y do koƒca badania, powinny byç podane, ale nie nale˝y ich

uwzgl´dniaç w statystycznych porównaniach pomi´dzy grupami,

— dnia zaobserwowania ka˝dego nietypowego objawu klinicznego i jego nast´pstw,

— masy cia∏a, zmiany masy cia∏a i masy macicy samicy ci´˝arnej, w tym opcjonalnie zmiany masy

cia∏a skorygowanej o mas´ macicy samicy ci´˝arnej,

— spo˝ycia paszy i, je˝eli mierzone, spo˝ycie wody,

— wyników z sekcji, w tym masy macicy,

— wartoÊci NOAEL dla skutków dzia∏ania na osobniki pokolenia rodzicielskiego i dla skutków dzia∏ania

na rozwój.

Rozwojowe wartoÊci koƒcowe wed∏ug dawki dla

samic z zagnie˝d˝eniami

— liczba cia∏ek ˝ó∏tych,

— liczba zagnie˝d˝eƒ, liczba i procent martwych i ˝ywych p∏odów i resorpcji,

— liczba i procent poronieƒ przed i po zagnie˝d˝eniu.

Rozwojowe wartoÊci koƒcowe wed∏ug dawki dla

samic z ˝ywymi p∏odami

— liczba i wartoÊci procentowe dla ˝ywego potomstwa,

— stosunek p∏ci,

— masa cia∏a p∏odów najlepiej zebrana wed∏ug p∏ci,

— zniekszta∏cenia zewn´trzne, tkanki mi´kkiej i szkieletu oraz inne wa˝ne zmiany,

— kryteria kategoryzacji, je˝eli zosta∏a ona zastosowana,

— ca∏kowita liczba i wartoÊci procentowe dla p∏odów

i matek z jakimikolwiek zmianami zewn´trznymi,

zmianami tkanki mi´kkiej i szkieletu, a tak˝e rodzaje i wyst´powanie poszczególnych nieprawid∏owoÊci i inne wa˝ne zmiany.

Omówienie wyników.

Wnioski.

Poz. 2119

2) Kimmel, C.A., Fransic, E.Z. (1990). Proceedings

of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies.

Fundam. Appl. Toxicol. 14, 386—398.

3) Wong, B.A. et al. (1997). Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17, 1—8.

4) US EPA (1985) Subpart E — Specific Organ Tissue

Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.

5) Salewski E. (1964). Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen

am Uterus der Ratte. Nauyn–Schmeidebergs

Arch. Pharmakol. Exp. Pathol. 247, 367.

6) Edwards J.A. (1968). The External Development

of the Rabbit and Rat Embryo. In: Adv. Teratol.

D.H.M. Woolam (ed.), Vol. 3. Academic Press, NY.

7) Inouye M. (1976). Differential Staining of Cartilage

and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue

and Alizarin Red S. Congen. Anom. 16, 171—173.

8) Igarashi E. et al. (1992). Frequency of Spontaneous

Axial Skeletal Variations Detected by the Double

Staining Technique for Ossified and Cartilaginous

Skeleton in Rat Fetuses. Congen. Anom. 32,

381—391.

9) Kimmel C.A. et al. (1993). Skeletal Developmental

Following Heat Exposure in Rat. Teratology 47,

229—242.

10) Marr M.C. et al. (1988). Comparison of Sinle and

Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: the Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD

Rats. Teratology 37, 476.

11) Barrow M.V., Taylor W.J. (1969). A Rapid Method

for Detecting Malformations in Rat Fetuses.

J. Morphol. 127, 291—306.

12) Fritz H. (1974). Prenatal Ossification in Rabbits

as Indicative of Fetal Maturity, Teratology 11,

313—320.

13) Gibson J.P. et al. (1966). Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 9,

398—408.

14) Kimmel C.A., Wilson J.G. (1973). Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8, 309—316.

15) Marr M.C. et al. (1992). Developmental Stages

of the CD (Sprague–Dawley) Rat Skeleton After

Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology

46, 169—181.

4. PIÂMIENNICTWO

1) Kavlock R.J et al. (1996). A Simulation Study of the

Influence of Study Desigh on the Estimation

of Benchmark Doses for Developmental Toxicity.

Risk Anal. 16, 399—400.

16) Monie I.W. et al. (1965). Dissection Procedures for

Rat Fetuses Permitting Alizarin Red Staining

of Skeleton and Histological Study of Viscera.

Supplement to Teratology Workshop Manual,

pp. 163—173.

17) Spark C. Dawson A.B. (1928). The Order and Time

of Appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, With Special

Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. Am. J. Anat. 41, 411—445.

18) Staples R.E. Schnell V.L. (1964). Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red

S Method for Fetal Bone. Stain Technol. 39,

61—63.

19) Strong R.M. (1928). The Order, Time and Rate

of Ossification of the Albino Rat (Mus norvegicus

albinus) Skeleton. Am. J. Anat. 36, 313–355.

20) Stuckhardt J.L. and Poppe S.M. (1984). Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Fetuses

Used in Teratogenicity Testing. Teratogen. Carcinogen. Mutagen. 4, 181—188.

Poz. 2119

23) Wilson J.G. and Fraser F.C. (eds.) (1977). Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.

24) Varnagy L. (1980). Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28,

233—239.

25) Staples R.E. (1974). Detection of Visceral Alternations in Mammalian Fetuses. Teratology 9, 37—38.

26) Van Julsingha E.B. and C.G. Bennett (1977). A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies

in the Rabbit Fetal Head. In: Methods in Prenatal

Toxicology (eds. D. Neubert, H.J. Merker and T.E.

Kwasigroch). Universoity of Chicago, Chicago, IL,

pp. 126—144.

21) Walker D.G. Wirtschafter Z.T. (1957). The Genesis

of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.

27) US EPA (1991). Guidelines for Developmental

Toxicity Risk Assessment. Fed. Register 56,

63798—63826.

22) Wilson J.G. (1965). Embryological Considerations

in Teratology. In: Teratology: Principles and Techniques, J.G. Wilson and J. Warkany (eds.), University of Chicago, Chicago, IL, pp. 251—277.

28) Wise D.L. et al (1997). Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory

Mammals (Version 1). Teratology 55, 249—292.

Za∏àcznik nr 8

B.35. DZIA¸ANIE TOKSYCZNE NA ROZRODCZOÂå W WARUNKACH TESTU DWUPOKOLENIOWEGO

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 416 (2001).

toksycznoÊci rozwojowej, bàdê te˝ mogà byç one cz´Êcià osobnych badaƒ z u˝yciem odpowiednich metod

badawczych.

1.2. Zasada metody badawczej

1.1. Wst´p

Niniejsza metoda — dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu dwupokoleniowego — zosta∏a opracowana w celu dostarczenia ogólnych informacji dotyczàcych wp∏ywu badanej substancji na nienaruszalnoÊç i wydajnoÊç uk∏adów rozrodczych samca i samicy, w tym na funkcjonowanie gonad, cykl rujowy, zachowanie w czasie kojarzenia, zap∏odnienie,

cià˝´, poród, laktacj´ i odsadzanie oraz rozwój i wzrost

potomstwa. Badania mogà tak˝e dostarczyç informacji o wp∏ywie badanej substancji na zachorowalnoÊç

noworodków, ÊmiertelnoÊç w okresie neonatalnym,

wst´pnych danych o przedporodowym i poporodowym dzia∏aniu toksycznym. Wyniki uzyskane w przedstawionym badaniu mogà s∏u˝yç jako wskazówki dla

nast´pnych badaƒ. Oprócz badania wzrostu i rozwoju

pokolenia F1 dzi´ki niniejszej metodzie mo˝na tak˝e

oceniç integralnoÊç i wydajnoÊç uk∏adów rozrodczych

samców i samic, a tak˝e wzrost i rozwój pokolenia F2.

Dalsze informacje o dzia∏aniu toksycznym na rozwój

p∏odu i zaburzeniach czynnoÊciowych mogà byç uzyskane w badaniach dodatkowych do badania zaprezentowanego w niniejszej metodyce przy zastosowaniu metody dla toksycznoÊci rozwojowej i/lub neuro-

Badana substancja podawana jest w stopniowanych dawkach kilku grupom samców i samic. W celu

wywo∏ania jakichkolwiek szkodliwych skutków dla

spermatogenezy samce pokolenia P powinny otrzymywaç badanà substancj´ w okresie wzrostu i przynajmniej przez jeden pe∏ny cykl spermatogenetyczny

(w przybli˝eniu 56 dni u myszy i 70 dni u szczura). Dzia∏anie na nasienie jest oceniane z wykorzystaniem kilku

parametrów (np. morfologia nasienia i jego ruchliwoÊç) oraz w badaniach histopatologicznych. Je˝eli

dost´pne sà archiwalne dane o spermatogenezie pochodzàce z poprzednio przeprowadzonych badaƒ

o wystarczajàcym okresie powtarzanego nara˝enia,

np. badanie 90-dniowe, to samce pokolenia P nie muszà byç uwzgl´dniane w szacowaniu. Zaleca si´ jednak˝e, aby próbki lub zapisy cyfrowe dotyczàce nasienia pokolenia P by∏y zachowane tak, by umo˝liwiç ich

póêniejsze oszacowanie. Samice pokolenia P powinny

otrzymywaç badanà substancj´ w okresie wzrostu

i przez kilka pe∏nych cyklów rujowych tak, aby wykryç

jakikolwiek szkodliwy wp∏yw tej substancji na cykl rujowy. Badanà substancj´ podaje si´ zwierz´tom rodzicielskim (P) podczas ich kojarzenia, podczas cià˝y i do

odsadzenia potomstwa F1. Po odsadzeniu podawanie

substancji pokoleniu F1 kontynuuje si´ w okresie ich

wzrostu, a˝ do osiàgni´cia dojrza∏oÊci, w okresie kojarzenia i do uzyskania potomstwa — pokolenia F2 a nast´pnie a˝ do usamodzielnienia pokolenia F2.

Obserwacje kliniczne i badania patologiczne prowadzi si´ u wszystkich zwierzàt pod kàtem objawów

dzia∏ania toksycznego ze zwróceniem szczególnej

uwagi na skutki wskazujàce na zaburzenia budowy

i czynnoÊci uk∏adów rozrodczych samic i samców oraz

na wzrost i rozwój potomstwa.

1.3. Opis metody badawczej

1.3.1. Wybór gatunku zwierzàt

Zalecanym gatunkiem jest szczur. Je˝eli stosowany jest inny gatunek zwierz´cia, to nale˝y to uzasadniç. W takiej sytuacji konieczne wówczas b´dà pewne

modyfikacje badania. W badaniu nie powinny byç stosowane rasy charakteryzujàce si´ niskà p∏odnoÊcià

lub dobrze znanà wysokà cz´stotliwoÊcià wyst´powania wad rozwojowych. Na poczàtku badania ró˝nica

w masie cia∏a badanych zwierzàt powinna byç jak najmniejsza i nie powinna przekraczaç 20 % Êredniej masy cia∏a ka˝dej z p∏ci.

1.3.2. Warunki przetrzymywania i karmienie

Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych

powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç

stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. Wybór paszy mo˝e zale˝eç od koniecznoÊci zapewnienia odpowiedniej

domieszki badanej substancji, je˝eli jest ona podawana tà metodà.

Zwierz´ta mogà byç przetrzymywane pojedynczo

lub w ma∏ych grupach tej samej p∏ci. Kojarzenie powinno odbywaç si´ w klatkach przystosowanych do

tych celów. Po kopulacji skojarzone samice powinny

byç przetrzymywane pojedynczo w klatkach przystosowanych do porodu i macierzyƒstwa. Skojarzone

szczury mogà tak˝e byç trzymane w ma∏ych grupach

i rozdzielone na jeden lub dwa dni przed porodem.

Skojarzonym zwierz´tom nale˝y dostarczyç odpowiedni materia∏ do budowy gniazda, gdy okres porodu jest bliski.

1.3.3. Przygotowanie zwierzàt

Stosowane powinny byç zdrowe zwierz´ta aklimatyzowane przynajmniej przez 5 dni do warunków laboratoryjnych i nieu˝ywane wczeÊniej w innych doÊwiadczeniach. Powinny byç znane: gatunek, szczep, êród∏o

pochodzenia, p∏eç, masa cia∏a i/lub wiek. Pokrewieƒstwa pomi´dzy zwierz´tami powinny byç znane tak, by

uniknàç krzy˝owania zwierzàt spokrewnionych. Zwierz´ta przypisuje si´ losowo do grupy kontrolnej i grupy nara˝anej (zalecany jest dobór wed∏ug masy cia∏a).

Poz. 2119

Klatki nale˝y ustawiç w taki sposób, by zminimalizowaç mo˝liwy wp∏yw ich ustawienia na wyniki badania.

Ka˝demu zwierz´ciu nale˝y przypisaç jego w∏asny numer identyfikacyjny. Dla pokolenia P nale˝y to uczyniç

przed rozpocz´ciem podawania substancji. W przypadku pokolenia F1 nale˝y to uczyniç przy odsadzaniu

zwierzàt, które zosta∏y wybrane do kojarzenia. Zapisy

wskazujàce na pochodzenie miotu powinny byç zachowane dla wszystkich wybranych zwierzàt pokolenia F1.

Ponadto tak szybko, jak to jest mo˝liwe, po porodzie

w przypadku, gdy bierze si´ pod uwag´ badania czynnoÊciowe lub wa˝enie poszczególnych osobników, zaleca si´ identyfikacj´ osobników m∏odych.

Zwierz´ta rodzicielskie (P) w momencie rozpocz´cia podawania badanej substancji powinny byç w wieku 5 do 9 tygodni. Zwierz´ta ze wszystkich grup badanych powinny, na tyle, na ile to mo˝liwe, byç w tym

samym wieku i mieç takà samà mas´ cia∏a.

1.4. Sposób post´powania

1.4.1. Liczba i p∏eç zwierzàt

Ka˝da grupa nara˝ana i kontrolna powinna sk∏adaç si´ z odpowiedniej liczby zwierzàt, tj. powinna liczyç nie mniej ni˝ 20 samic ci´˝arnych lub bliskich porodu. W przypadku substancji powodujàcych niektóre

niepo˝àdane skutki zwiàzane z nara˝eniem (np. sterylnoÊç lub nadmierna toksycznoÊç w przypadku stosowania wysokich dawek) spe∏nienie tego warunku mo˝e byç niemo˝liwe. Celem jest uzyskanie takiej iloÊci

ci´˝arnych samic, by zapewniç odpowiednie oszacowanie potencja∏u substancji w zakresie wp∏ywu na

p∏odnoÊç, cià˝´, zachowanie osobników rodzicielskich

i osesków oraz wzrost i rozwój potomstwa F1 od zap∏odnienia do osiàgni´cia dojrza∏oÊci oraz rozwój ich

potomstwa (F2) do momentu odsadzenia. Dlatego te˝

brak po˝àdanej iloÊci samic w cià˝y (tj. 20) nie zawsze

oznacza uniewa˝nienie badania, a ka˝dy przypadek

powinien byç oceniany indywidualnie.

1.4.2. Przygotowanie substancji w okreÊlonych dawkach

Zaleca si´, by substancj´ podawaç drogà pokarmowà (z pokarmem, wodà pitnà lub za pomocà sondy), chyba ˝e inna droga podawania wydaje si´ bardziej w∏aÊciwa.

Je˝eli jest to konieczne, to badana substancja powinna byç rozpuszczana lub zawieszana w odpowiednim noÊniku. Zaleca si´, o ile jest to mo˝liwe, stosowanie w pierwszej kolejnoÊci roztworów/zawiesin

wodnych, a w nast´pnej kolejnoÊci roztworów/emulsji

olejowych (w oleju kukurydzianym) i w koƒcu innych

noÊników. W przypadku stosowania noÊników innych

ni˝ woda powinny byç znane ich w∏aÊciwoÊci toksykologiczne. Nale˝y okreÊliç trwa∏oÊç badanej substancji

w noÊniku.

1.4.3. Dawkowanie

Nale˝y stosowaç przynajmniej trzy poziomy dawek i równoleg∏à kontrol´. Najwy˝sza dawka powinna

byç dobrana w taki sposób, by wywo∏aç dzia∏anie toksyczne, ale nie powodowaç Êmierci lub cierpienia

zwierzàt, chyba ˝e jest to ograniczone w∏aÊciwoÊciami

fizykochemicznymi lub skutkami biologicznymi badanej substancji. W przypadku niespodziewanej ÊmiertelnoÊci wynoszàcej w przybli˝eniu mniej ni˝ 10 %

w pokoleniu zwierzàt rodzicielskich (P) badanie w dalszym ciàgu mo˝liwe jest do zaakceptowania. Sekwencja malejàcych dawek powinna zostaç dobrana tak, by

mo˝na by∏o wykazaç odpowiedê typu dawka-skutek

i wyznaczyç poziom bez obserwowanego skutku szkodliwego (NOAEL). Optymalne dla ustalenia sekwencji

malejàcych dawek sà wspó∏czynniki o wartoÊci od

2—4, a cz´sto dodanie czwartej badanej grupy jest

lepsze ni˝ stosowanie bardzo du˝ych wspó∏czynników

pomi´dzy dawkami (np. wi´kszych ni˝ 10). W przypadku badaƒ drogà pokarmowà odst´p pomi´dzy dawkami nie powinien byç wi´kszy ni˝ 3. Poziomy dawek powinny zostaç ustalone z uwzgl´dnieniem istniejàcych

danych o toksycznoÊci, a tak˝e informacji dodatkowych na temat metabolizmu i toksykokinetyki badanej

substancji lub substancji o podobnej strukturze. Informacje te pomogà w doborze w∏aÊciwego sposobu

dawkowania.

Równolegle nale˝y stosowaç grup´ kontrolnà. Tej

grupie podaje si´ placebo lub noÊnik, je˝eli taki jest

stosowany podczas podawania substancji. Wszystkie

grupy powinny otrzymywaç takà samà obj´toÊç badanej substancji lub noÊnika. Ze zwierz´tami w grupach

kontrolnych nale˝y obchodziç si´ w taki sam sposób,

jak ze zwierz´tami nara˝anymi. Grupy kontrolne z noÊnikiem powinny otrzymywaç ten noÊnik w najwy˝szej

z zastosowanych obj´toÊci. Je˝eli badana substancja

podawana w paszy powoduje zmniejszenie pobierania

lub wykorzystania paszy, to pod uwag´ mo˝e byç brana koniecznoÊç zastosowania pary grup kontrolnych.

Zamiast pary grup kontrolnych mo˝na wykorzystaç dane z kontrolowanych badaƒ szacujàcych skutki obni˝onego spo˝ycia pokarmu na parametry rozmna˝ania.

Nale˝y braç pod uwag´ nast´pujàce cechy charakterystyczne noÊnika i innych dodatków: wp∏ywy na absorpcj´, rozmieszczenie, metabolizm lub retencj´ badanej substancji; wp∏ywy na w∏asnoÊci chemiczne badanej substancji, które mogà zmieniç jej w∏aÊciwoÊci

toksykologiczne; wp∏ywy na spo˝ywanie pokarmu lub

wody i wp∏yw na stan fizjologiczny zwierz´cia.

1.4.4. Badanie dawki granicznej

Pe∏ne badanie z u˝yciem substancji podawanej

w ró˝nych dawkach mo˝e byç uwa˝ane za niepotrzebne w przypadku, gdy

— badanie prowadzone drogà pokarmowà przy zastosowaniu jednej dawki na poziomie przynajmniej 1000 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ albo podania

w paszy lub w wodzie substancji w iloÊci stanowiàcej odpowiedni ekwiwalent procentowy badanej substancji i przy zastosowaniu procedur opisanych w niniejszej metodzie nie powoduje powstawania mo˝liwych do zaobserwowania objawów

dzia∏ania toksycznego zarówno u zwierzàt rodzicielskich, jak i u ich potomstwa,

Poz. 2119

— je˝eli nie nale˝a∏o si´ spodziewaç takich skutków

na podstawie istniejàcych danych (np. w przypadku zwiàzków strukturalnie i/lub metabolicznie podobnych).

Spodziewane nara˝enie ludzi mo˝e wskazywaç na

potrzeb´ zastosowania wy˝szej dawki podawanej drogà pokarmowà ni˝ w badaniu dawki granicznej.

W przypadku innych sposobów podawania, takich jak

inhalacyjne bàdê skórne, w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne

badanej substancji, takie jak jej rozpuszczalnoÊç cz´sto mogà wskazywaç na maksymalny mo˝liwy do uzyskania poziom nara˝enia.

1.4.5. Podawanie substancji

Badana substancja powinna byç podawana zwierz´tom 7 dni w tygodniu. Preferowane jest podawanie

substancji drogà pokarmowà (w paszy, w wodzie lub

za pomocà sondy do˝o∏àdkowej). Je˝eli stosowany

jest inny sposób podawania, to nale˝y podaç jego uzasadnienie; konieczne mogà byç wtedy pewne modyfikacje. Badana substancja powinna byç podawana

wszystkim zwierz´tom tà samà metodà podczas w∏aÊciwego okresu doÊwiadczenia. Je˝eli substancj´ podaje si´ do˝o∏àdkowo, to powinno stosowaç si´ sond´

do˝o∏àdkowà. Obj´toÊç podawanej cieczy jednorazowo nie powinna przekraczaç 1 ml/100 g masy cia∏a

(0,4 ml/100 g masy cia∏a w przypadku oleju kukurydzianego), z wyjàtkiem roztworów wodnych, gdy stosowaç mo˝na 2 ml/100 g masy cia∏a. Z wyjàtkiem substancji dra˝niàcych lub ˝ràcych, które zwi´kszajà skutki swego dzia∏ania ze wzrostem st´˝enia, zmiennoÊç

obj´toÊci powinna byç minimalizowana przez dostosowanie st´˝enia tak, by zapewniç sta∏à obj´toÊç we

wszystkich dawkach. W badaniach z zastosowaniem

sondy m∏ode b´dà otrzymywaç badanà substancj´

poÊrednio z mlekiem, dopóki nie rozpocznie si´ po odsadzeniu podawanie substancji w typowy dla nich

sposób. W badaniach z paszà lub wodà pitnà m∏ode

b´dà dodatkowo otrzymywaç badanà substancj´ bezpoÊrednio, gdy rozpocznà samodzielnie spo˝ywaç pokarm podczas ostatniego tygodnia okresu laktacji.

W przypadku substancji podawanych w pokarmie

lub w wodzie pitnej wa˝ne jest upewnienie si´, ˝e dodane iloÊci badanej substancji nie zak∏ócajà normalnej

równowagi pokarmowej i wodnej. Je˝eli badana substancja podawana jest w pokarmie, to jej iloÊç mo˝e

byç wyra˝ona w postaci sta∏ego st´˝enia w pokarmie

(ppm) lub w postaci sta∏ej dawki wzgl´dem masy cia∏a

zwierz´cia; ka˝dy inny sposób wyra˝enia dawki musi

byç opisany. W przypadku podawania sondà substancja podawana powinna byç o ustalonych porach dnia

i dostosowywana przynajmniej raz w tygodniu tak, aby

utrzymaç sta∏y jej poziom wzgl´dem masy cia∏a zwierz´cia. Pod uwag´ powinno si´ braç informacje o przenikaniu przez barier´ ∏o˝yska, dostosowujàc dawk´

substancji podawanej sondà wzgl´dem masy.

1.4.6. Uk∏ady doÊwiadczalne

Codzienne podawanie substancji w okreÊlonych

dawkach samcom i samicom rodzicielskim (P) powinno rozpoczàç si´ wtedy, gdy sà one w wieku 5 do 9 ty-

godni. Codzienne podawanie substancji samcom i samicom pokolenia F1 powinno rozpoczàç si´ przy odsadzeniu; nale˝y pami´taç, ˝e w przypadku podawania badanej substancji z paszà lub wodà pitnà bezpoÊrednie nara˝enie m∏odych F1 na badanà substancj´

mo˝e wystàpiç ju˝ w okresie laktacji. Dla obu p∏ci

(P i F1) podawanie substancji powinno byç kontynuowane przez przynajmniej 10 tygodni przed okresem

kojarzenia. Podawanie substancji powinno byç kontynuowane u obu p∏ci podczas 2 tygodni okresu kojarzenia. Samce nale˝y w sposób humanitarny uÊmierciç

i przebadaç, je˝eli nie sà niezb´dne do oceny skutków

reprodukcyjnych. W przypadku samic rodzicielskich

(P) podawanie substancji powinno byç kontynuowane

przez okres cià˝y, a˝ do odsadzenia pokolenia F1. Pod

uwag´ powinno si´ braç modyfikacje schematu podawania substancji w zale˝noÊci od dost´pnych informacji dotyczàcych badanej substancji; nale˝y uwzgl´dniç

istniejàce dane o jej toksycznoÊci, indukcji metabolicznej lub bioakumulacji. Dawka stosowana dla ka˝dego

zwierz´cia powinna byç wyznaczona przy uwzgl´dnieniu najnowszych pomiarów masy jego cia∏a. Nale˝y

byç ostro˝nym podczas dostosowywania dawki

w ostatnim trymestrze cià˝y.

Nara˝anie samców i samic P i F1 powinno trwaç a˝

do zakoƒczenia doÊwiadczenia. Wszystkie doros∏e

samce i samice P i F1 powinny zostaç w sposób humanitarny uÊmiercone, je˝eli nie sà potrzebne do dalszych ocen skutków. Potomstwo F1 niewybrane do kojarzenia i potomstwo F2 powinno byç w sposób humanitarny uÊmiercone po odsadzeniu.

Poz. 2119

Pary, które nie majà potomstwa, powinny byç

zbadane w celu stwierdzenia przyczyny niep∏odnoÊci.

Konieczne mogà byç takie procedury, jak dopuszczenie do ponownego kojarzenia z innymi samcami lub

samicami, mikroskopowe badanie organów rozrodczych oraz badanie cyklu rujowego lub spermatogenezy.

1.4.7.3. Drugie kojarzenie

W pewnych przypadkach, takich jak zmiany liczebnoÊci miotów spowodowane nara˝eniem na badanà

substancj´ lub obserwacja podobnych skutków

w pierwszym kojarzeniu zaleca si´ ponowne skojarzenie doros∏ych P lub F1 w celu uzyskania drugiego miotu. Zaleca si´ ponowne kojarzenie samic lub samców,

które nie wyda∏y miotu ze sprawdzonymi osobnikami

przeciwnej p∏ci. Je˝eli wytworzenie drugiego miotu

jest uznane za konieczne w którymkolwiek pokoleniu

to zwierz´ta powinny byç ponownie kojarzone mniej

wi´cej tydzieƒ po odsadzeniu ostatniego miotu.

1.4.7.4. WielkoÊç miotu

Zwierz´tom nale˝y pozwoliç na normalne wydanie

miotu i wychowywanie potomstwa, a˝ do jego odsadzenia. Standaryzacja rozmiarów miotu jest post´powaniem opcjonalnym. Je˝eli stosuje si´ standaryzacj´

miotów, to zastosowana metoda powinna byç szczegó∏owo opisana.

1.5. Obserwacje

1.4.7. Sposób kojarzenia

1.5.1. Obserwacje kliniczne

1.4.7.1. Kojarzenie rodziców (P)

Ogólne obserwacje kliniczne powinny byç dokonywane codziennie, a w przypadku podawania sondà

czas przeprowadzenia obserwacji powinien uwzgl´dniaç przewidywany szczytowy okres nasilenia skutków

po nara˝eniu. Zmiany w zachowaniu, objawy trudnej

lub przed∏u˝onej cià˝y i wszystkie objawy cià˝y powinny byç zapisane. Ponadto bardziej szczegó∏owe badanie ka˝dego zwierz´cia powinno byç przeprowadzone

przynajmniej raz w tygodniu; najdogodniej uczyniç to

podczas jego wa˝enia. Dwa razy dziennie, a podczas

weekendu raz dziennie wszystkie zwierz´ta obserwuje

si´, poszukujàc zwierzàt w stanie agonalnym oraz pad∏ych.

Dla ka˝dego kojarzenia, ka˝da samica powinna byç

umieszczona z jednym samcem z tej samej grupy nara˝anej (kojarzenie 1:1) a˝ do kopulacji lub do zakoƒczenia dwutygodniowego okresu. Ka˝dego dnia samice powinny byç badane na obecnoÊç nasienia lub czopa pochwowego. Dzieƒ zerowy cià˝y okreÊla si´ jako

dzieƒ odkrycia nasienia lub czopa pochwowego.

W przypadku niepowodzenia kojarzenia pod uwag´

mo˝na wziàç ponowne kojarzenie z samcami tej samej

grupy. Kojarzone pary nale˝y wyraênie okreÊliç w danych. Nale˝y unikaç kojarzenia rodzeƒstwa.

1.4.7.2. Kojarzenie pokolenia F1

Do kojarzenia potomstwa F1 przynajmniej jeden

samiec i jedna samica powinny byç wybrane przy odsadzaniu z ka˝dego miotu do kojarzenia z innymi m∏odymi tej samej grupy nara˝anej, ale innego miotu, aby

daç pokolenie F2. Wybór m∏odych z ka˝dego miotu

powinien mieç charakter losowy, je˝eli nie obserwuje

si´ znaczàcych ró˝nic w masie cia∏a lub wyglàdzie

w obr´bie miotu. W przypadku zaobserwowania takich ró˝nic wybrani powinni byç najlepsi przedstawiciele z ka˝dego miotu. Najlepiej opieraç si´ w tym

przypadku na zapisach masy cia∏a, ale w∏aÊciwszym

mo˝e byç wybór w oparciu o wyglàd. Potomstwo F1

nie powinno byç kojarzone, a˝ do osiàgni´cia pe∏nej

dojrza∏oÊci p∏ciowej.

1.5.2. Masa cia∏a i spo˝ycie paszy/wody osobników rodzicielskich

Samice rodzicielskie (P i F1) powinny byç zwa˝one

pierwszego dnia nara˝enia, a nast´pnie przynajmniej

raz na tydzieƒ. Samice rodzicielskie (P i F1) powinny

byç zwa˝one przynajmniej w 0, 7, 14 i 20 lub 21 dniu

cià˝y, a podczas laktacji w tych samych dniach, w których odbywa si´ wa˝enie m∏odych, oraz w dniu

uÊmiercenia zwierzàt. Obserwacje te powinny byç zapisywane dla ka˝dego doros∏ego zwierz´cia oddzielnie. W okresie przed kojarzeniem i podczas cià˝y mierzone powinno byç spo˝ycie paszy przynajmniej w odst´pach tygodniowych. Je˝eli badana substancja podawana jest w wodzie, to spo˝ycie wody powinno byç

mierzone przynajmniej w odst´pach tygodniowych.

1.5.3. Cykl rujowy

D∏ugoÊç cyklu rujowego i jego normalnoÊç ocenia

si´ u samic P i F1 przez rozmazy pochwowe wykonywane przed kojarzeniem i opcjonalnie podczas kojarzenia, dopóki nie nastàpi skojarzenie. Podczas pobierania komórek pochwowych/szyjki macicy nale˝y byç

ostro˝nym, by nie podra˝niç b∏ony Êluzowej i w nast´pstwie nie sprowokowaç cià˝y urojonej (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa).

1.5.4. Parametry nasienia

W czasie zakoƒczenia doÊwiadczenia u wszystkich samców P oraz F1 nale˝y zapisaç mas´ jàder

i najàdrzy. Do badaƒ histopatologicznych nale˝y zachowaç po jednym z tych organów (zobacz pkt 1.5.7

i pkt 1.5.8.1). Pozosta∏e jàdra i najàdrza uzyskane

z przynajmniej 10 zwierzàt z ka˝dej grupy samców

P i F1 powinny byç u˝yte odpowiednio do policzenia

spermatyd odpornych na homogenizacj´ i zapasów

nasienia z ogona najàdrza. Od tych samych samców

powinno pobraç si´ nasienie z ogona najàdrza lub nasieniowodów w celu oszacowania jego ruchliwoÊci

i morfologii. Je˝eli obserwuje si´ skutki zwiàzane z nara˝aniem lub gdy istniejà dowody z innych badaƒ takich wp∏ywów na spermatogenez´, to ocena nasienia

powinna zostaç dokonana u wszystkich samców

w ka˝dej grupie nara˝anej; w pozosta∏ych przypadkach liczenie mo˝e ograniczaç si´ do grupy kontrolnej

i grupy samców P i F1 otrzymujàcych substancj´

w najwy˝szej dawce.

Policzona powinna zostaç ca∏kowita liczba spermatyd jàdrowych odpornych na homogenizacj´ oraz

liczba nasienia ogona najàdrza (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa). Zapasy nasienia ogona najàdrza mogà

byç oszacowane na podstawie st´˝enia i obj´toÊci nasienia w zawiesinie stosowanej w oszacowaniach jakoÊciowych, a tak˝e iloÊci nasienia odzyskanego

w czasie homogenizacji pozosta∏ej tkanki ogona najàdrza. Liczenie powinno byç wykonane na wybranej

grupie samców ze wszystkich grup nara˝anych natychmiast po uÊmierceniu zwierzàt, chyba ˝e dokonywane sà zapisy video lub zapisy cyfrowe lub okazy sà

zamra˝ane, a analizy sà wykonywane póêniej. W tych

przypadkach grupy kontrole i grupy otrzymujàce substancj´ w najwy˝szej dawce powinny byç oceniane

w pierwszej kolejnoÊci. Je˝eli nie obserwuje si´ ˝adnych skutków zwiàzanych z nara˝eniem (np. wp∏yw na

liczb´ nasienia, jego ruchliwoÊç i morfologi´), to inne

grupy nara˝ane nie muszà byç analizowane. Gdy takie

skutki zostanà jednak zauwa˝one w grupie otrzymujàcej substancj´ w najwy˝szej dawce, to wtedy zwierz´ta otrzymujàce substancj´ w ni˝szych dawkach tak˝e

muszà byç przeanalizowane.

RuchliwoÊç nasienia najàdrza (lub nasieniowodu)

powinno si´ oszacowaç lub filmowaç natychmiast po

uÊmierceniu zwierzàt. Nasienie pobiera si´, minimalizujàc uszkodzenia i rozcieƒczajàc do analizy ruchliwoÊci przy zastosowaniu uznanych metod (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa). WielkoÊç procentowa ruchliwego nasienia powinna zostaç okreÊlona subiektywnie

lub obiektywnie. Je˝eli stosowana jest komputerowa

Poz. 2119

analiza ruchliwoÊci (zobacz pozycje 5, 6, 7, 8, 9 i 10 piÊmiennictwa), to wyliczenie ruchliwoÊci zale˝y od progów Êredniej pr´dkoÊci wyznaczonych przez operatora oraz prostoliniowoÊci lub indeksu liniowoÊci. Je˝eli

próbki sà filmowane (zobacz pozycja 11 piÊmiennictwa), lub obrazy zapisywane sà w inny sposób w czasie sekcji to ocenia si´ jedynie grup´ kontrolnà i grup´ samców P i F1 otrzymujàcych substancje w najwy˝szej dawce, je˝eli nie obserwuje si´ skutków zwiàzanych z nara˝aniem; je˝eli takie skutki istniejà, to zwierz´ta otrzymujàce substancje w ni˝szych dawkach tak˝e muszà byç analizowane. W przypadku braku filmowania lub zapisu cyfrowego podczas sekcji powinny

byç analizowane wszystkie próbki wszystkich grup.

Nale˝y wykonaç morfologicznà analiz´ próbki nasienia najàdrza (lub nasieniowodu). Nasienie (przynajmniej 200 na próbk´) powinno si´ badaç w postaci

utrwalonych mokrych preparatów (zobacz pozycja 12

piÊmiennictwa) i klasyfikowaç jako normalne lub nienormalne. Przyk∏adem morfologicznych nieprawid∏owoÊci nasienia jest fuzja, oddzielone g∏ówki, zniekszta∏cone g∏ówki i/lub ogony. Szacowanie powinno

byç dokonane na wybranej podgrupie samców

wszystkich grup nara˝anych natychmiast po uÊmierceniu zwierzàt lub z wykorzystaniem zapisu cyfrowego

lub filmowego w póêniejszym czasie. Rozmazy po

utrwaleniu tak˝e mogà byç analizowane w póêniejszym terminie. W tych przypadkach w pierwszej kolejnoÊci analizuje si´ grup´ kontrolnà i grup´ zwierzàt

otrzymujàcych substancje w najwy˝szej dawce. Je˝eli

nie obserwuje si´ skutków zwiàzanych z nara˝aniem

(np. zmiany w morfologii), to zwierz´ta z grup otrzymujàcych substancje w innych dawkach nie muszà

byç analizowane. Gdy takie skutki jednak wyst´pujà to

analizuje si´ wszystkie zwierz´ta otrzymujàce substancje we wszystkich dawkach.

Je˝eli jakikolwiek z powy˝szych parametrów nasienia by∏ analizowany jako cz´Êç badaƒ toksycznoÊci

przynajmniej w badaniach 90-dniowych, to niekoniecznie musi byç on ponownie powtarzany w badaniu dwupokoleniowym. Zaleca si´ jednak zachowanie

próbek lub zapisów cyfrowych nasienia pokolenia P w przypadku koniecznoÊci póêniejszej analizy.

1.5.5. Potomstwo

Ka˝dy miot powinno si´ zbadaç jak najszybciej po

porodzie (dzieƒ 0 laktacji) w celu ustalenia liczby i p∏ci

m∏odych, martwych i ˝ywych oraz wystepowania nieprawid∏owoÊci. M∏ode martwe w dniu zerowym, je˝eli nie uleg∏y maceracji, powinny zostaç przebadane

pod kàtem mo˝liwych wad i przyczyn Êmierci oraz powinny byç zachowane (utrwalone). ˚ywe m∏ode powinno si´ policzyç i zwa˝yç pojedynczo tu˝ po urodzeniu (dzieƒ zerowy laktacji) lub w dniu 1 i w nast´pnych

dniach, np. w dniu 4, 7, 14 i 21 laktacji. Nieprawid∏owoÊci fizyczne lub behawioralne zaobserwowane

u samic lub potomstwa powinny byç zanotowane.

Fizyczny rozwój potomstwa powinien byç zapisywany g∏ównie na podstawie przyrostu masy cia∏a. Inne

parametry fizyczne (np. rozwarcie szpary powiekowej

i zewn´trznego przewodu s∏uchowego, wyr˝ni´cie si´

z´bów, wzrost w∏osów) mogà dostarczyç dodatkowych

informacji, ale dane te powinny byç szacowane w kontekÊcie dojrzewania p∏ciowego (np.: wiek i masa cia∏a

przy rozwarciu zewn´trznego ujÊcia pochwy i rozwoju

gruczo∏u napletkowego) (zobacz pozycja 13 piÊmiennictwa). Badania czynnoÊciowe (aktywnoÊç motoryczna,

czynnoÊç sensoryczna, odruchy) pokolenia F1 przed

i po odsadzeniu, w szczególnoÊci te zwiàzane z dojrzewaniem p∏ciowym, sà zalecane, je˝eli nie sà cz´Êcià

osobnych badaƒ. Przy rozwarciu zewn´trznego ujÊcia

pochwy i rozwoju gruczo∏u napletkowego powinny byç

okreÊlone dla odsadzonych m∏odych F1 wybranych do

kojarzenia. Odleg∏oÊç anogenitalna powinna zostaç

zmierzona w dniu zerowym po urodzeniu u m∏odych F2, je˝eli spowodowane sà przez zmiany w stosunku p∏ci F1 lub zmiany czasu dojrzewania p∏ciowego.

Obserwacje czynnoÊciowe mogà byç pomini´te

w grupach, które przejawiajà wyraêne objawy szkodliwych skutków (np.: znaczàcy spadek przyrostu masy).

Je˝eli badania czynnoÊciowe sà wykonywane, to nie

powinny byç one robione na m∏odych wybranych do

kojarzenia.

1.5.6. Ogólne badania sekcyjne

Wszystkie zwierz´ta rodzicielskie (P i F1) po zakoƒczeniu badania i zwierz´ta pad∏e podczas badania lub

wszystkie m∏ode, u których stwierdzono zewn´trzne

nieprawid∏owoÊci lub nietypowe objawy kliniczne,

a tak˝e przynajmniej jedno losowo wybrane m∏ode/p∏eç/miot zarówno z pokolenia F1, jak i F2 powinno

badaç si´ makroskopowo na wyst´powanie wad rozwojowych lub zmian patologicznych. Szczególnà uwag´ nale˝y zwracaç na narzàdy uk∏adu rozrodczego.

M∏ode uÊmiercone w sposób humanitarny lub b´dàce

w agonii i m∏ode martwe, je˝eli nie podleg∏y maceracji, powinny byç przebadane pod wzgl´dem mo˝liwych wad i/lub przyczyn Êmierci oraz powinny byç zachowane (utrwalone).

Macice wszystkich samic pierworódek powinny

byç zbadane w sposób, który nie wyklucza badaƒ histopatologicznych, pod wzgl´dem obecnoÊci i liczby

miejsc zagnie˝d˝eƒ.

1.5.7. Masa narzàdów

Po zakoƒczeniu badania powinno si´ okreÊliç mas´ cia∏a wszystkich zwierzàt oraz mas´ nast´pujàcych

narzàdów wszystkich zwierzàt rodzicielskich P i F1 (narzàdy wyst´pujàce parami powinny byç wa˝one pojedynczo)

— macica, jajniki,

— jàdra, najàdrza (ca∏e i ogon),

— prostata,

— p´cherzyki nasienne z gruczo∏ami koagulujàcymi

i ich p∏yny oraz prostatà (razem),

— mózg, wàtroba, nerki, Êledziona, przysadka, gruczo∏y tarczycowy i nadnercza oraz znane narzàdy

krytyczne.

Poz. 2119

Koƒcowe masy cia∏a powinny byç okreÊlone dla

m∏odych pokolenia F1 i F2, które zosta∏y wybrane do

sekcji. Nast´pujàce narzàdy z jednego losowo wybranego m∏odego/p∏eç/miot (zobacz pkt 1.5.6) powinny

byç zwa˝one: mózg, Êledziona i grasica.

Wyniki sekcji i masy narzàdów powinny byç oszacowane w kontekÊcie obserwacji poczynionych w innych badaniach, je˝eli by∏y one prowadzone.

1.5.8. Badania histopatologiczne

1.5.8.1. Zwierz´ta rodzicielskie

Nast´pujàce narzàdy i tkanki zwierzàt rodzicielskich (P i F1), bàdê ich reprezentatywne próbki, powinny byç utrwalone i przechowywane w odpowiednim

medium do badaƒ histopatologicznych

— pochwa, macica z szyjkà i jajniki (zachowane w odpowiednim utrwalaczu),

— jedno jàdro (zachowane w utrwalaczu Bouina lub

porównywalnym), jedno najàdrze, p´cherzyki nasienne, prostata i gruczo∏ koagulujàcy,

— uprzednio okreÊlone narzàd(y) krytyczne wszystkich zwierzàt P i F1 wybranych do kojarzenia.

Pe∏ne wyniki badaƒ histopatologicznych zachowanych narzàdów i tkanek podanych powy˝ej powinny

zostaç wykonane u wszystkich zwierzàt P i F1 otrzymujàcych substancj´ w najwy˝szej dawce i u zwierzàt

z grupy kontrolnej wybranych do kojarzenia. Badanie

jajników zwierzàt P jest badaniem opcjonalnym. Narzàdy wykazujàce zmiany zwiàzane z nara˝eniem powinny byç tak˝e zbadane u zwierzàt otrzymujàcych

substancj´ w ni˝szych dawkach tak, aby wspomóc

oszacowanie NOAEL. Ponadto narzàdy rozrodcze

zwierzàt otrzymujàcych ni˝sze dawki, u których mo˝na

podejrzewaç zmniejszonà p∏odnoÊç, np. takich, u których nie dochodzi∏o do kojarzenia lub nie dochodzi∏o

do zap∏odnienia, lub nie da∏y zdrowego potomstwa

bàdê te˝ u których zmieniona by∏a cyklicznoÊç rujowa,

liczba nasienia, jego ruchliwoÊç lub morfologia, powinny byç poddane badaniom histopatologicznym.

Wszystkie zwierz´ta, u których stwierdzono wi´ksze

uszkodzenia, takie jak atrofia lub guzy, powinny byç

tak˝e zbadane.

Szczegó∏owe badania histopatologiczne jàder (np.

z zastosowaniem utrwalacza Bouina, techniki parafinowej i wykonaniem przekrojów poprzecznych o gruboÊci 4—5 µm) powinny byç przeprowadzone w celu

okreÊlenia skutków zwiàzanych z nara˝eniem, takich

jak wstrzymane spermatydy, brakujàce komórki nab∏onka lub ich rodzaje, wielojàdrowe komórki ogromne lub odpadanie tkanki komórek spermatogenetycznych w Êwiat∏o przewodu (zobacz pozycja 14 piÊmiennictwa). Badanie nienaruszonego najàdrza powinno

sk∏adaç si´ z badania jego g∏owy, trzonu i ogona, co

mo˝e byç osiàgni´te w badaniu przekroju pod∏u˝nego. Najàdrze powinno byç przebadane pod wzgl´dem

infiltracji leukocytów, zmian wyst´pujàcych w typach

komórek, rodzajów komórek niew∏aÊciwych oraz fago-

cytozy nasienia. Barwienie PAS i hematoksylinà mo˝e

byç stosowane w badaniu narzàdów rozrodczych

samców.

Jajnik po okresie laktacji powinien zawieraç pierwotne i wzrastajàce p´cherzyki, a tak˝e du˝e cia∏ka

˝ó∏te laktacji. Badanie histopatologiczne powinno wykryç jakoÊciowe niedobory populacji p´cherzyków

pierwotnych. IloÊciowe oszacowanie p´cherzyków

pierwotnych powinno byç przeprowadzone dla samic F1; liczba zwierzàt, wybór przekrojów jajnika oraz

rozmiar próbki powinny byç statystycznie odpowiednie do zastosowanej procedury oszacowania. Dla porównania jajników nara˝onych i kontrolnych badanie

powinno zawieraç policzenie p´cherzyków pierwotnych, które mogà byç liczone wspólnie z ma∏ymi p´cherzykami wzrastajàcymi (zobacz pozycje 15, 16, 17,

18 i 19 piÊmiennictwa).

Poz. 2119

nale˝y powiàzanie, lub jego brak, pomi´dzy dawkà badanej substancji i obecnoÊcià lub nieobecnoÊcià, wyst´powaniem i nasileniem nieprawid∏owoÊci, w tym

powa˝nych uszkodzeƒ zidentyfikowanych organów

krytycznych, zmienionà p∏odnoÊç, nieprawid∏owoÊci

kliniczne, zmienionà wydajnoÊç reprodukcyjnà i liczb´

miotów, zmiany masy cia∏a, wp∏ywy na ÊmiertelnoÊç

i inne skutki dzia∏ania toksycznego. Podczas oszacowania wyników powinno wziàç si´ pod uwag´ w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne badanej substancji oraz, je˝eli dost´pne, to tak˝e dane o toksykokinetyce.

W∏aÊciwie przeprowadzone badanie toksycznoÊci

reprodukcyjnej powinno umo˝liwiç przeprowadzenie

w zadowalajàcy sposób oszacowania poziomu bez widocznych skutków oraz umo˝liwiç zrozumienie szkodliwych wp∏ywów na rozmna˝anie, cià˝´, laktacj´, rozwój poporodowy, w tym wzrost i rozwój p∏ciowy.

1.5.8.2. M∏ode odsadzone

2.3. Interpretacja wyników

Nietypowo wyglàdajàce tkanki i narzàdy krytyczne

wszystkich m∏odych, u których wystàpi∏y nieprawid∏owoÊci zewn´trzne lub nietypowe objawy kliniczne, a tak˝e przynajmniej od jednego losowo wybranego m∏odego/p∏eç/miot z pokolenia F1 i F2, które nie zosta∏o wybrane do kojarzenia, powinny byç utrwalone i zachowane w odpowiednim medium do badaƒ histopatologicznych. Pe∏na charakterystyka histopatologiczna zachowanej tkanki powinna byç wykonana ze szczególnym

naciskiem po∏o˝onym na narzàdy uk∏adu rozrodczego.

Badanie toksycznoÊci w teÊcie dwupokoleniowym

ma dostarczyç informacji na temat wp∏ywów powtarzanego nara˝enia na substancj´ podczas wszystkich

faz cyklu reprodukcyjnego. W szczególnoÊci badanie

to dostarcza informacji o parametrach reprodukcji,

rozwoju, wzrostu i prze˝ywalnoÊci potomstwa. Wyniki

badania powinny byç interpretowane w po∏àczeniu

z wynikami badaƒ podprzewlek∏ych, przedporodowych rozwojowych, toksykokinetycznych i innych dost´pnych. Wyniki niniejszego badania mogà byç stosowane w szacowaniu potrzeby dalszych badaƒ substancji chemicznej. Ekstrapolacja uzyskanych wyników na cz∏owieka jest wiarygodna tylko w ograniczonym stopniu. Najlepiej stosowaç je do dostarczania

informacji o dopuszczalnym nara˝eniu cz∏owieka

i o poziomie bez widocznych skutków (zobacz pozycje

20, 21, 22 i 23 piÊmiennictwa).

2. WYNIKI

2.1. Opracowanie wyników

Dane powinny byç zapisywane indywidualnie i zestawiane w formie tabel. Nale˝y wykazaç dla ka˝dej

badanej grupy i ka˝dego pokolenia liczb´ zwierzàt na

poczàtku badania, liczb´ zwierzàt pad∏ych podczas badania lub uÊmierconych z powodów humanitarnych,

czas Êmierci lub uÊmiercenia, liczb´ zwierzàt p∏odnych, liczb´ samic w cià˝y, liczb´ zwierzàt wykazujàcych objawy toksycznoÊci, opis zaobserwowanych objawów toksycznoÊci, w tym czas ich pojawienia si´,

trwanie i nasilenie objawów, rodzaje zmian histopatologicznych i wszystkie inne znaczàce dane.

Dane liczbowe powinny byç oszacowane w∏aÊciwà

ogólnie uznanà metodà statystycznà; metody statystyczne powinny byç wybrane jako cz´Êç sk∏adowa

uk∏adu doÊwiadczalnego. Do analizowania danych

stosowane mogà byç modele statystyczne typu dawka-odpowiedê. Sprawozdanie powinno zawieraç

szczegó∏owe informacje o metodzie analizy i zastosowanym programie komputerowym, tak by niezale˝ny

recenzent/statystyk móg∏ odtworzyç przebieg analizy

i ponownie jà oszacowaç.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie musi zawieraç nast´pujàce informacje

Badana substancja

— stan fizyczny i gdy to ma znaczenie równie˝ w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne,

— dane identyfikacyjne,

— czystoÊç.

NoÊnik (je˝eli by∏ stosowany)

— uzasadnienie wyboru noÊnika, je˝eli by∏ inny ni˝

woda.

Badane zwierz´ta

2.2. Oszacowanie wyników

— gatunek/szczep,

Wyniki badania dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç

w warunkach testu dwupokoleniowego powinny byç

ocenione pod wzgl´dem zaobserwowanych skutków,

w tym wyniki sekcji i dane mikroskopowe. Oszacowaç

— liczba, p∏eç i wiek zwierzàt,

— êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania,

pasza, materia∏ u˝ywany na gniazdo itp.,

— masy cia∏a poszczególnych zwierzàt na poczàtku

doÊwiadczenia.

Warunki badania

— uzasadnienie wybranych dawek,

— szczegó∏y dotyczàce formulacji badanej substancji/przygotowania pokarmu, osiàgni´te st´˝enie,

Poz. 2119

— czas trwania cià˝y,

— liczba zagnie˝d˝eƒ, cia∏ek ˝ó∏tych i rozmiar miotu,

— liczba zwierzàt ˝ywo narodzonych i strat po zagnie˝d˝eniu,

— liczba m∏odych z widocznymi nieprawid∏owoÊciami, je˝eli okreÊlona liczba skar∏owacia∏ych to nale˝y podaç,

— trwa∏oÊç i jednorodnoÊç u˝ywanego preparatu,

— dane o rozwoju poporodowym m∏odych,

— szczegó∏y dotyczàce podawania badanej substancji,

— przeliczenie st´˝enia (ppm) badanej substancji

z pokarmu/wody pitnej na dawk´ rzeczywistà

(mg/kg masy cia∏a/dzieƒ), je˝eli istnieje taka koniecznoÊç,

— szczegó∏y dotyczàce paszy i wody pitnej.

— dane o obserwacjach czynnoÊciowych u m∏odych

i doros∏ych,

— statystyczna analiza wyników.

Omówienie wyników.

Wnioski, w tym wartoÊci NOAEL dla skutów dzia∏ania na potomstwo i na osobniki doros∏e.

Wyniki

— spo˝ycie paszy i, je˝eli dost´pne, to spo˝ycie wody,

wykorzystanie paszy (przyrost masy cia∏a na gram

spo˝ytej paszy) i spo˝ycie materia∏u badanego dla

zwierzàt P i F1 z wyjàtkiem okresu kojarzenia i przynajmniej ostatniej jednej trzeciej okresu laktacji,

— dane o absorpcji (je˝eli dost´pne),

— dane dotyczàce masy cia∏a zwierzàt P i F1 wybranych do kojarzenia,

— masa cia∏a m∏odych i liczebnoÊç miotów,

— masa cia∏a przy uÊmierceniu oraz wzgl´dne i bezwzgl´dne masy narzàdów zwierzàt rodzicielskich,

— istota, nasilenie i czas trwania obserwacji klinicznych (odwracalne czy nie),

4. PIÂMIENNICTWO

1) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles ands Seasons, In

Reproduction In Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.

2) Gray L.E. et al. (1989). A Dose-Response Analysis

of Methoxychlor-Induced Alternations of Reproductive Development and Function in the Rat.

Fundamental and Applied Toxicology 12: 92—108.

3) Robb G.W. et al. (1978). Daily Sperm Production

and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and

Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility

54: 103—107.

— czas padni´cia podczas badania lub czy zwierz´ta

prze˝y∏y do zakoƒczenia badania,

4) Klinefelter G.R. et al. (1991) The method of Sperm

Collection Significantly Influences Sperm Motion

Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate

Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5: 39–44.

— reakcja toksyczna wed∏ug p∏ci i dawki, w tym indeksy kojarzenia, p∏odnoÊci, cià˝y, porodu, ˝ywotnoÊci i laktacji; sprawozdanie powinno wykazywaç

liczby zastosowane do obliczeƒ tych indeksów,

5) Seed J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm

Motility, Morphology and Counts in the Rat, Rabbit and Dog: a Consensus Report. Reproductive

Toxicology 10: 237—244.

— skutki toksyczne lub inne na reprodukcj´, potomstwo, wzrost po porodzie itp.,

6) Chapin R.E. et al. (1992). Methods for Assessing

Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology

6: 267—273.

— wyniki sekcji,

— szczegó∏owy opis wszystkich zmian histopatologicznych,

— liczba samic P i F1 o normalnym cyklu rujowym

i d∏ugoÊç cyklu,

— ca∏kowita liczba nasienia ogona najàdrza, procent

nasienia ruchliwego, procent nasienia normalnego morfologicznie, procent nasienia w przypadku

ka˝dej zidentyfikowanej nieprawid∏owoÊci,

— czas kojarzenia, w tym liczba dni potrzebnych do

skojarzenia,

7) Klinefelter G.R. et al. (1992). Direct effects of Ethane Dimethanesulfonate on Epididymal Function in

Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of

Andrology 13: 409—421.

8) Slott V.L. et al. (1991). Rat Sperm Motility Analysis

Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5: 449—458.

9) Slott V.L. and Parreault S.D. (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal

Sperm Motility Using Hamilton-Thorn Motility

Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319—333.

10) Toth G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of

Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and

Statistical Consideration. Journal of Andrology

10:401–415.

11) Working P.K. and M. Hurtt (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility.

Journal of Andrology 8: 330—337.

12) Linder R.E. et al. (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to

Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive

Toxicology 6: 491—505.

13) Korenbrot C.C. et al. (1977). Preputial Separation

as an external Sign of Pubertal Development

in the Male Rat. Biological Reproduction 17

298—303.

14) Russell L.D. et al. (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River

Press, Clearwater, Florida.

15) Heindel J.J. and R.E. Chapin (eds.) (1993). Part B.

Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.

16) Heindel J.J. et al. (1989). Histological Assessment

of Ovarian Follicle Number in Mice as a Screen

of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the

Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York,

pp. 421—426.

Poz. 2119

17) Manson J.M. and Y.J. Kang (1989). Test Methods

for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods

in Toxicology, A.W. Hayes (ed.)., Raven, New York.

18) Smith B.J. et al. (1991). Comparison of Random

and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5: 379—383.

19) Heindel J.J. (1991). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health

Risk Assessment, G. Datson and C.A. Kimmel

(eds.) ILSI Press, Washington DC.

20) Thomas J.A. (1991). Toxic Responses of Reproductive System. In: Casarett and Doull’s Toxicology,

M.O. Amdur, J. Doull and C.D. Klaassen (eds.).

Pergamon, New York.

21) Zenick H. and E.D. Clegg (1989). Assessment

of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment

Approach. In: Principles and Methods in Toxicology, A.W. Hayes (ed.)., Raven, New York.

22) Palmer A.K. (1981). In: Developmental Toxicology,

Kimmel C.A. and F.C. Fraser (eds.), Raven Press,

New York.

23) Palmer A.K. (1978). In: Handbook of Teratology,

Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum

Press, New York.

Za∏àcznik nr 9

B.42. UCZULANIE SKÓRY: PRÓBA NA MIEJSCOWYM W¢èLE CH¸ONNYM

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 429 (2002).

natywna, gdy wyniki pozytywne i negatywne nie wymagajà z regu∏y dalszego potwierdzenia.

Próba na Miejscowym W´êle Ch∏onnym (PMWCh)

zosta∏a wystarczajàco uwierzytelniona i zaakceptowana, tak aby przyjàç jà jako nowà metod´ badawczà

(zobacz pozycje 1, 2 i 3 piÊmiennictwa). Jest to druga

metoda s∏u˝àca ocenie potencja∏u dzia∏ania uczulajàcego substancji chemicznych na skór´ zwierzàt. Inna

metoda opiera si´ na badaniu na Êwinkach morskich,

a dok∏adniej jest to test maksymalizacji (B.6) i test Buehlera (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa).

PMWCh ma pewne zalety zarówno z punktu widzenia post´pu naukowego, jak i dobrostanu zwierzàt.

W metodzie tej bada si´ faz´ indukcji uczulania skóry

i uzyskuje iloÊciowe dane przydatne w szacowaniu zale˝noÊci dawka-odpowiedê. Szczegó∏y walidacji

PMWCh i przeglàd towarzyszàcych prac opublikowano w piÊmiennictwie (zobacz pozycje 5, 6, 7 i 8 piÊmiennictwa). Ponadto nale˝y odnotowaç, ˝e substancje dzia∏ajàce ∏agodnie/umiarkowanie uczulajàco, które sà zalecane jako odpowiednie do kontroli pozytywnej w metodach badaƒ na Êwinkach morskich, równie˝

sà odpowiednie w PMWCh (zobacz pozycje 6, 8 i 9 piÊmiennictwa).

PMWCh jest metodà alternatywnà dla wykrywania

substancji chemicznych dzia∏ajàcych uczulajàco na

skór´ lub dla potwierdzenia, ˝e substancje chemiczne

nie posiadajà znaczàcego potencja∏u wywo∏ujàcego

uczulanie skóry. Nie oznacza to, ˝e w ka˝dym przypadku mo˝na stosowaç PMWCh zamiast badaƒ przeprowadzanych na Êwinkach morskich, ale raczej, ˝e próba

ta ma równà wartoÊç i mo˝e byç stosowana jako alter-

PMWCh jest metodà in vivo i w konsekwencji nie

eliminuje stosowania zwierzàt w ocenie kontaktowej

aktywnoÊci uczulajàcej. Potencjalnie mo˝e jednak

zmniejszyç liczb´ zwierzàt potrzebnych do osiàgni´cia

tego celu. Ponadto PMWCh stwarza znacznie ∏agodniejsze warunki, w jakich zwierz´ta sà stosowane

w kontaktowym badaniu uczulenia. PMWCh opiera si´

na immunologicznych zjawiskach stymulowanych

1.1. Wst´p

przez substancje chemiczne w fazie indukcyjnej uczulania. W przeciwieƒstwie do badaƒ na Êwinkach morskich PMWCh nie wymaga wywo∏ywania reakcji nadwra˝liwoÊci skórnej. Ponadto PMWCh nie wymaga

stosowania adjuwanta, tak jak w metodzie maksymalizacji na Êwinkach morskich. Dlatego PMWCh zmniejsza obcià˝enie zwierzàt. Pomimo zalet PMWCh w porównaniu do tradycyjnej metody na Êwinkach morskich, istniejà jednak pewne ograniczenia zmuszajàce

do zastosowania tradycyjnej metody z Êwinkami morskimi (np. fa∏szywie negatywne wyniki dla niektórych

metali w PMWCh, fa∏szywie pozytywne wyniki z niektórymi substancjami dra˝niàcymi skór´) (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).

Zobacz tak˝e Wprowadzenie cz´Êç B.

1.2. Zasada metody badawczej

Zasadà le˝àcà u podstaw PMWCh jest to, ˝e substancje uczulajàce pobudzajà pierwotne namna˝anie

si´ limfocytów w w´êle ch∏onnym poddanemu miejscowemu dzia∏aniu substancji chemicznej. Namna˝anie to jest proporcjonalne do podanej dawki (i do potencja∏u alergenu) i daje prosty sposób otrzymania

obiektywnego, iloÊciowego pomiaru uczulenia.

W PMWCh namna˝anie to wycenia si´ jako zale˝noÊç

dawka-odpowiedê, a namna˝anie w grupach nara˝anych porównuje si´ z namna˝aniem w grupie kontrolnej z noÊnikiem. Oznaczany jest stosunek namna˝ania

w grupach nara˝anych i grupie kontrolnej, który nazywany jest Wskaênikiem Stymulacji (WS). Aby badana

substancja mog∏a byç oceniona jako potencjalnie

uczulajàca skór´, musi on wynosiç przynajmniej trzy.

W opisanej metodzie do pomiarów namna˝ania si´

komórek stosuje si´ substancje znaczone radioaktywnie. Mo˝na jednak stosowaç inne sposoby do szacowania namna˝ania si´ komórek, pod warunkiem ˝e

jest to umotywowane i znajduje odpowiednie poparcie naukowe, zawierajàce pe∏ne cytowania i opis metodologii.

1.3. Opis metody badawczej

1.3.1. Przygotowania

1.3.1.1. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt

Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych

powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç

stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody.

1.3.1.2. Przygotowanie zwierzàt

Zwierz´ta nale˝y dobieraç losowo, znakowaç dla

umo˝liwienia indywidualnej identyfikacji (lecz nie za

pomocà jakiegokolwiek znakowania uszu), przetrzymywaç w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpocz´-

Poz. 2119

ciem podawania substancji w celu aklimatyzacji do

warunków laboratoryjnych. Przed rozpocz´ciem doÊwiadczenia nale˝y sprawdziç wszystkie zwierz´ta, dla

upewnienia si´, czy nie posiadajà widocznych uszkodzeƒ skóry.

1.3.2. Warunki badania

1.3.2.1. Zwierz´ta doÊwiadczalne

W tym badaniu gatunkiem z wyboru jest mysz. Nale˝y u˝yç do badaƒ samice myszy szczepu CBA/Ca lub

CBA/J, które sà dziewicze i nieci´˝arne. Przy rozpocz´ciu badania zwierz´ta powinny byç w wieku 8—12 tygodni, a ró˝nica w masie cia∏a zwierzàt powinna byç

jak najmniejsza i nie przekraczaç 20 % Êredniej masy.

Mo˝na u˝ywaç innych szczepów i samców, gdy sà wystarczajàce dane dla wykazania, ˝e nie istniejà istotne

specyficzne ró˝nice w odpowiedzi w PMWCh zale˝ne

od szczepu i/lub p∏ci.

1.3.2.2. Sprawdzenie wiarygodnoÊci

Do wykazania w∏aÊciwego przeprowadzenia próby

i kompetencji laboratorium do prawid∏owego wykonania doÊwiadczenia stosuje si´ kontrol´ pozytywnà.

Kontrola pozytywna powinna daç w PMWCh pozytywnà odpowiedê na poziomie nara˝enia, dla którego

przewiduje si´ wzrost wskaênika stymulacji (WS) >3

w stosunku do kontroli negatywnej. Dawk´ w kontroli

pozytywnej nale˝y dobraç tak, by indukcja by∏a wyraêna, lecz nie nadmierna. Zalecanymi substancjami sà

aldehyd heksylocynamonowy (No CAS 101-86-1, No

EINECS 202-983-3) i merkaptobenzotiazol (No CAS

149-30-4, No EINECS 205-736-8). W okreÊlonych warunkach, po odpowiednim uzasadnieniu, mo˝na u˝yç

innych substancji kontrolnych spe∏niajàcych powy˝sze kryteria. Kontrola pozytywna wymagana jest zazwyczaj w ka˝dym doÊwiadczeniu, lecz mogà byç sytuacje, gdy laboratoria badawcze posiadajà dane archiwalne dotyczàce kontroli pozytywnej, wskazujàce

na sta∏oÊç zadowalajàcych reakcji przez okres szeÊciu

miesi´cy lub d∏u˝szy. W takich sytuacjach rzadsze

sprawdzanie za pomocà kontroli pozytywnej jest w∏aÊciwe, lecz w odst´pach nie d∏u˝szych ni˝ 6 miesi´cy.

Chocia˝ pozytywnà kontrol´ substancji nale˝y sprawdzaç w noÊniku, o którym wiadomo, ˝e wywo∏uje sta∏à odpowiedê (np. aceton: oliwa z oliwek), to mogà

wystàpiç szczególne okolicznoÊci okreÊlone w odr´bnych przepisach, w których b´dzie równie˝ konieczne

przebadanie w niestandardowym noÊniku (odpowiednia formulacja o znaczeniu klinicznym/chemicznym).

W takich sytuacjach nale˝y przebadaç mo˝liwà interakcj´ pozytywnej kontroli z niekonwencjonalnym noÊnikiem.

1.3.2.3. Liczba zwierzàt, poziom dawkowania i wybór

noÊnika

Nale˝y stosowaç minimum po cztery zwierz´ta

w grupach nara˝anych i co najmniej trzy st´˝enia badanej substancji, grup´ kontroli negatywnej otrzymujàcej jedynie noÊnik badanej substancji i grup´ kontroli pozytywnej, o ile stosowne. W przypadkach, w których wycenia si´ dane indywidualnych zwierzàt, nale-

˝y stosowaç minimum pi´ç zwierzàt w grupie. Zwierz´ta z grup kontrolnych nale˝y traktowaç w ten sam

sposób jak z grup nara˝onych, z wyjàtkiem podawania

badanej substancji.

Dobór dawek i noÊnika nale˝y opieraç o zalecenia

z publikacji (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Dawki

nale˝y dobraç z serii st´˝eƒ 100 %, 50 %, 25 %, 10 %,

5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Gdy sà dost´pne wyniki

ostrej toksycznoÊci skórnej i dra˝nienia skóry, nale˝y

je braç pod uwag´ przy doborze tych trzech kolejnych

st´˝eƒ tak, by przy nara˝eniu na najwy˝sze st´˝enie

uniknàç toksycznoÊci ogólnoustrojowej i nadmiernego miejscowego podra˝nienia skóry (zobacz pozycje 2

i 11 piÊmiennictwa).

NoÊnik nale˝y dobieraç, uwzgl´dniajàc maksymalne st´˝enia substancji stosowanej w badaniu i maksymalnà rozpuszczalnoÊç, by mo˝na uzyskaç roztwory/zawiesiny odpowiednie dla podawania badanej

substancji. Zaleca si´ noÊniki w nast´pujàcej kolejnoÊci: aceton/oliwa z oliwek (4:1 v/v), dimetyloformamid,

keton metyloetylowy, propylenoglikol i dimetylosulfotlenek (zobacz pozycje 2 i 10 piÊmiennictwa), ale mogà byç równie˝ stosowane inne noÊniki, o ile dysponuje si´ o nich odpowiednià wiedzà naukowà. W niektórych przypadkach konieczne mo˝e byç u˝ywanie,

jako dodatkowej kontroli, rozpuszczalnika stosowanego jako materia∏ do formulacji handlowej badanej

substancji lub rozpuszczalnika wa˝nego z klinicznego

punktu widzenia. W szczególnoÊci nale˝y zapewniç,

aby materia∏y hydrofilne by∏y podawane z zastosowaniem noÊnika, który zwil˝a skór´ i nie sp∏ywa natychmiast. Dlatego nale˝y unikaç stosowania jedynie wodnych noÊników.

1.3.3. Sposób post´powania

1.3.3.1. Plan doÊwiadczenia

Plan doÊwiadczenia jest nast´pujàcy

— Dzieƒ 1

Ustalanie i zapisywanie indywidualnej masy cia∏a

dla ka˝dego zwierz´cia. Nanoszenie 25 µl odpowiedniego roztworu badanej substancji, samego

noÊnika lub kontroli pozytywnej (je˝eli sà stosowane) na grzbietowà stron´ ka˝dego ucha zwierz´cia.

— Dzieƒ 2 i 3

Powtórzyç procedur´ nanoszenia jak w dniu 1.

— Dzieƒ 4 i 5

Brak nara˝enia.

— Dzieƒ 6

Zapisaç mas´ cia∏a ka˝dego zwierz´cia. Ka˝dej

myszy, której podawano substancj´, i myszy z grupy kontrolnej wstrzyknàç do ˝y∏y ogonowej po

250 µl roztworu buforu fosforanowego (PBS) zawierajàcego 20 µCi (7,4e+8 Bq) 3H-metylotymidyny. Alternatywnie wstrzyknàç 250 (l roztworu PBS

zawierajàcego 2 µCi (7,4e+7 Bq) 125I-jododeoksy-

Poz. 2119

urydyny i 10–5 M fluorodeoksyurydyny wszystkim

myszom do ˝y∏y ogonowej.

Po pi´ciu godzinach zwierz´ta nale˝y uÊmierciç.

Zwierz´tom nara˝onym na substancj´ nale˝y

z ka˝dego ucha wyciàç przyuszne w´z∏y ch∏onne

i zanurzyç w PBS. Z ka˝dej badanej grupy (badanie

w sposób grupowy) alternatywnie nale˝y wyciàç

pary w´z∏ów ch∏onnych od ka˝dego zwierz´cia

i zanurzyç w PBS osobno dla ka˝dego zwierz´cia

(sposób indywidualny). Szczegó∏y i wykresy identyfikacji w´z∏ów i analizy mo˝na znaleêç w za∏àczniku I do pozycji piÊmiennictwa (zobacz pozycja 10

piÊmiennictwa).

1.3.3.2. Przygotowanie zawiesiny komórek

Zawiesiny komórek w´z∏a ch∏onnego otrzymane

ze zwierzàt, badanych zarówno grupowo lub jak i od

pojedynczych zwierzàt, przygotowuje si´ poprzez ∏agodne mechaniczne rozdrobnienie na nierdzewnej

siatce stalowej o oczkach 200 µm. Komórki w´z∏a

ch∏onnego przemywa si´ dwukrotnie PBS dodanym

w nadmiarze i wytràca 5 % kwasem trichlorooctowym (TCA) w temp. 4 °C przez 18 godzin (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa). Granulki nale˝y ponownie zawiesiç w 1 ml kwasu trichlorooctowego i przenieÊç do

fiolki scyntylacyjnej zawierajàcej 10 ml p∏ynu scyntylacyjnego dla zliczenia 3H, lub przenieÊç bezpoÊrednio

do probówki pomiarów gamma dla zliczenia 125I.

1.3.3.3. Oznaczanie namna˝ania si´ komórek (radioaktywnoÊç zwiàzana)

Zwiàzanie 3H-metylotymidyny mierzy si´ za pomocà licznika β-scyntylacyjnego jako liczb´ rozpadów na

minut´. Zwiàzanie 125 I-jododeoksyurydyny mierzy si´

za pomocà licznika 125I scyntylacyjnego i wyra˝a si´

równie˝ w postaci liczby rozpadów na minut´. W zale˝noÊci od stosowanego sposobu badania wiàzania

wyra˝a si´ w postaci liczby rozpadów na minut´/nara˝ana grupa (sposób grupowy) lub rozpad na minut´/zwierz´ (sposób indywidualny).

1.3.3.4. Obserwacje

1.3.3.4.1. Obserwacje kliniczne

Zwierz´ta nale˝y obserwowaç starannie raz w ciàgu dnia pod kàtem objawów klinicznych albo miejscowego dra˝nienia w miejscach podania lub toksycznoÊci ogólnoustrojowej. Wszystkie obserwacje ∏àcznie

z zapisami dla pojedynczych zwierzàt nale˝y systematycznie zapisywaç.

1.3.3.4.2. Masa cia∏a

Jak podano w pkt 1.3.3.1, masy cia∏a pojedynczych

zwierzàt nale˝y ustalaç na poczàtku doÊwiadczenia

i przed planowym uÊmierceniem zwierzàt.

1.3.4. Obliczanie wyników

Wyniki nale˝y wyraziç w formie Wskaênika Stymulacji (WS). Gdy stosuje si´ sposób grupowy, WS otrzy-

muje si´ dzielàc, zwiàzanà radioaktywnoÊç dla ka˝dej

nara˝anej grupy przez przy∏àczonà radioaktywnoÊç

grupy kontrolnej z noÊnikiem; to daje Êredni WS. Gdy

stosuje si´ sposób indywidualny, WS oblicza si´, dzielàc Êredni rozpad na minut´/mysz w ramach ka˝dej

nara˝anej grupy i grup´ pozytywnej kontroli przez

Êredni rozpad na minut´/mysz dla grupy kontrolnej

rozpuszczalnik/noÊnik. Âredni WS dla grup kontrolnych z noÊnikiem wynosi wtedy 1.

Zastosowanie sposobu indywidualnego do wyliczenia WS umo˝liwia przeprowadzenie statystycznej

analizy wyników. Przy wyborze odpowiedniej metody

analizy statystycznej badacz musi byç Êwiadomy mo˝liwych nierównoÊci wariancji i innych zwiàzanych

z tym problemów, co mo˝e wymagaç przetworzenia

danych lub zastosowania nieparametrycznej analizy

statystycznej. Za pomocà odpowiedniego sposobu interpretacji nale˝y oceniç wszystkie indywidualne dane

nara˝anych i kontrolnych zwierzàt i dopasowaç na tej

podstawie stosownà krzywà zale˝noÊci dawka-odpowiedê, bioràc pod uwag´ przedzia∏y ufnoÊci (zobacz

pozycje 8, 12 i 13 piÊmiennictwa). Jednak badacz musi uwa˝aç na mo˝liwe skrajne reakcje indywidualnych

zwierzàt wewnàtrz grup, co mo˝e wymagaç stosowania alternatywnych miar reakcji (np. raczej mediany,

a nie Êredniej) lub eliminowania skrajnych danych.

Proces podejmowania decyzji odnoÊnie pozytywnej reakcji obejmuje WS ≥3, ∏àcznie z rozwa˝eniem reakcji dawka-odpowiedê, i, o ile stosowne, istotnoÊci

statystycznej (zobacz pozycje 3, 6, 8, 12 i 14 piÊmiennictwa).

Je˝eli zachodzi potrzeba objaÊnienia otrzymanych

wyników, nale˝y zwróciç uwag´ na ró˝ne w∏aÊciwoÊci

badanej substancji, w tym strukturalne podobieƒstwo

do znanych substancji uczulajàcych skór´, czy zdolnoÊç powodowania silnego dra˝nienia skóry i rodzaj

reakcji dawka-odpowiedê. Te i inne okolicznoÊci dyskutowane sà szczegó∏owo w innym miejscu (zobacz

pozycja 7 piÊmiennictwa).

2. WYNIKI

Wyniki nale˝y zestawiç w formie tabel, wykazujàc

Êrednie i pojedyncze wartoÊci rozpadu na minut´

i wskaêniki stymulacji dla ka˝dej badanej grupy

(w tym grupa kontrolna z noÊnikiem).

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje

Badana substancja

— dane identyfikacyjne (np. numer CAS (je˝eli jest

dost´pny); êród∏o pochodzenia; stopieƒ czystoÊci;

znane zanieczyszczenia; numer serii),

— stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (np.

lotnoÊç, trwa∏oÊç, rozpuszczalnoÊç),

— w przypadku mieszanin sk∏ad i zawartoÊç sk∏adników.

Poz. 2119

NoÊnik

— dane identyfikacyjne (stopieƒ czystoÊci; st´˝enie,

o ile dotyczy; stosowana obj´toÊç),

— uzasadnienie wyboru noÊnika.

Zwierz´ta doÊwiadczalne

— szczep stosowanych myszy,

— stan mikrobiologiczny zwierzàt, je˝eli jest znany,

— liczba, wiek i p∏eç zwierzàt,

— êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania,

pasze itd.

Warunki przeprowadzania badania

— szczegó∏y przygotowania badanej substancji i jej

podawanie,

— uzasadnienie wyboru dawek (∏àcznie z wynikami

testu poszukiwania zakresu dawek, je˝eli prowadzono); stosowane st´˝enia badanej substancji

i noÊnika i ogólna iloÊç podawanej substancji,

— szczegó∏y jakoÊci paszy i wody (∏àcznie z typem

paszy i êród∏em dostawy, êród∏o wody).

Sprawdzenie wiarygodnoÊci

— podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia

wiarygodnoÊci, ∏àcznie z informacjami o substancji, st´˝eniu i stosowanym noÊniku,

— równolegle uzyskane i/lub archiwalne pozytywne

i negatywne dane kontrolne dla badajàcego laboratorium.

Wyniki

— indywidualne masy cia∏a zwierzàt na poczàtku nara˝enia i przy planowanym ich uÊmiercaniu;

— tabela z podaniem wartoÊci Êredniej/mediany

(sposób grupowy) lub indywidualnych (sposób indywidualny) rozpadu na minut´, jak równie˝ zakres wartoÊci dla obu sposobów i wskaêników stymulacji dla ka˝dej badanej grupy (∏àcznie z kontrolà noÊnika),

— analiza statystyczna, gdy by∏a stosowana,

— czas wystàpienia i objawy toksyczne, w∏àcznie

z podra˝nieniem skóry w miejscu na∏o˝enia, gdy

wystàpi∏o, dla ka˝dego zwierz´cia.

Dyskusja wyników

— krótki komentarz do wyników, do analizy zale˝noÊci dawka-odpowiedê i analizy statystycznej, gdy

by∏y stosowane, z wnioskiem czy badana substancja mo˝e byç uznana za uczulajàcà skór´.

4. PIÂMIENNICTWO

1) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine

local lymph node assay; collaborative studies and

new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology, 30, 165—169.

2) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay

developments and applications. Toxicology, 93,

13—31.

3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F.,

Ryan, C.A. Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V.,

Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998).

Assessment of the skin sensitisation potential of

topical medicaments using the local lymph node

assay: An interlaboratory exercise. Journal of

Toxicology and Environmental Health, 53, 563—79

(1998).

4) OECD (1992). Guideline 406 Skin Sensitisation.

5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food

and Chemical Toxicology, 34, 999—1002.

6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996) The local lymph node assay

Aviable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34,

985—997.

Poz. 2119

method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49—59.

9) Dearman, R.J., Hilton, J, Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl

cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281—4.

10) National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The murine local lymph node Assay

A test method for assessing the allergic contact

dermatitis potential of chemicals/compounds: The

results of an independent peer review evaluation

coordinated by the Interagency Coordinating

Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication

No: 99—4494, Research Triangle Park, N.C.

(http://iccvam.niehs.nih.gov.).

11) OECD (2002). Guideline 404 Acute Dermal Irritation/Corrosion.

12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W., Lees, D.,

Kimber, I. and Botham, P.A. (1993). Results with

OECD recommended positive control sensitisers in

the maximisation. Buehler and local lymph node

assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63—67.

7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I.

(1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and

Chemical Toxicology. (in press) 36, 327—33.

13) Basketter, D.A., Lea, L.J., Dickens, A., Briggs, D.,

Pate, I., Dearman, R.J., Kimber, I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of

EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261—266.

8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative

method for assessing the sensitising potency of

low molecular weight chemicals using a local

lymph node assaay: employment of a regression

14) Basketter, D.A., Blaikie, L., Dearman, R.J., Kimber, I.,

Ryan, C.A., Gerberick, G.F., Harvey, P., Evans, P., White, I.R. and Rycroft, R.T.G. (2000). Use of local lymph

node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis, 42, 344—48.

Za∏àcznik nr 10

B.43. BADANIE NEUROTOKSYCZNOÂCI NA GRYZONIACH

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 424 (1997).

Badanie przeprowadzone zgodnie z niniejszà metodà badawczà ma na celu dostarczenie informacji koniecznych dla potwierdzenia lub dalszego scharakteryzowania potencjalnej neurotoksycznoÊci substancji

chemicznych u doros∏ych zwierzàt. Mo˝e ona byç ∏àczona z innymi metodami badawczymi przy powtarzanym podawaniu dawki bàdê te˝ mo˝e byç wykonywana jako oddzielne badanie. W projektowaniu badaƒ

opartych o niniejszà metod´ badawczà zaleca si´ korzystanie z Dokumentu Przewodniego OECD dotyczàcego strategii i metod badawczych neurotoksycznoÊci

(zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Jest to szczególnie

wa˝ne, gdy dokonuje si´ modyfikacji obserwacji i procedur badawczych zalecanych przy rutynowym stosowaniu niniejszej metody. Dokument Przewodni zosta∏

przygotowany dla u∏atwienia wyboru innych procedur

badawczych stosowanych w szczególnych okolicznoÊciach.

Oszacowanie neurotoksycznoÊci rozwojowej nie

jest przedmiotem niniejszej metody.

1.1. Wst´p

W szacowaniu i ocenie toksycznego charakteru

substancji chemicznych wa˝ne jest, aby wziàç pod

uwag´ potencjalne wystàpienie skutków neurotoksycznych. Ju˝ metoda badawcza przy powtarzanym

podawaniu dawki uwzgl´dnia obserwacje pod kàtem

potencjalnej neurotoksycznoÊci. Niniejsza metoda badawcza mo˝e byç stosowana w planowaniu badania

majàcego na celu uzyskanie dalszych informacji, bàdê

ich potwierdzeniu, co do skutków neurotoksycznych

obserwowanych w badaniach toksycznoÊci przy powtarzanym nara˝eniu. Uwzgl´dnienie jednak mo˝liwej

neurotoksycznoÊci pewnych klas substancji chemicznych mo˝e sugerowaç, ˝e jest ona bardziej w∏aÊciwie

oszacowana przez niniejszà metod´ bez wczeÊniejszych ustaleƒ mo˝liwej neurotoksycznoÊci w badaniach przy powtarzanym dawkowaniu. Takie rozwa˝ania zawierajà na przyk∏ad

— obserwacje objawów neurologicznych lub zmian

neuropatologicznych w badaniach toksycznoÊci

innych ni˝ te z powtarzanym dawkowaniem lub

— strukturalne pokrewieƒstwo lub inne informacje

∏àczàce je ze znanymi substancjami o dzia∏aniu

neurotoksycznym.

Ponadto mogà wystàpiç inne przypadki, gdy zastosowanie niniejszej metody badawczej jest w∏aÊciwe;

dalsze szczegó∏y mo˝na znaleêç w piÊmiennictwie (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa).

Niniejszà metod´ opracowano w taki sposób, aby

mog∏a byç przystosowana do spe∏nienia szczególnych

potrzeb, potwierdziç specyficznà neurotoksycznoÊç histopatologicznà lub behawioralnà substancji chemicznej, a tak˝e dostarczyç charakterystyk´ i ocen´ iloÊciowà reakcji neurotoksycznych.

Poz. 2119

sycznych zalicza si´ procedury histopatologiczne i behawioralne, które mogà byç dalej uzupe∏nione przez

badania elektrofizjologiczne i/lub biochemiczne (zobacz pozycje 1, 2, 3 i 4 piÊmiennictwa).

Substancje neurotoksyczne mogà dzia∏aç na wiele

miejsc w obr´bie uk∏adu nerwowego za pomocà wielu mechanizmów. ˚aden pojedynczy zestaw testów

nie jest w stanie w pe∏ni oszacowaç potencja∏u neurotoksycznego wszystkich substancji chemicznych, dlatego konieczne mo˝e byç zastosowanie innych badaƒ

in vivo lub in vitro specyficznych dla rodzaju obserwowanej lub przewidywanej neurotoksycznoÊci.

Niniejsza metoda badawcza mo˝e byç tak˝e stosowana w po∏àczeniu z wytycznymi zawartymi w Dokumencie Przewodnim OECD na temat strategii i metod

badawczych neurotoksycznoÊci (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa), do planowania badaƒ zamierzajàcych

dalej charakteryzowaç lub zwi´kszaç czu∏oÊç oceny

iloÊciowej typu dawka-odpowiedê lub lepiej oszacowaç poziom bez obserwowanego szkodliwego dzia∏ania lub uzasadniç znane lub spodziewane zagro˝enia

powodowane przez substancj´. Na przyk∏ad mo˝na

zaplanowaç badanie majàce na celu identyfikacj´

i oszacowanie mechanizmów neurotoksycznych lub

uzupe∏niç dane ju˝ istniejàce z podstawowych obserwacji neurobehawioralnych i neuropatologicznych.

Takie badania nie muszà powtarzaç danych, które by∏yby wygenerowane z zastosowania standardowych

procedur niniejszej metody, je˝eli takie dane ju˝ istniejà i nie sà uwa˝ane za niezb´dne do interpretacji wyników badania.

Badanie neurotoksycznoÊci, wykonywane osobno

lub w po∏àczeniu, dostarcza informacji, które mogà

— stwierdzaç, czy badana substancja dzia∏a na uk∏ad

nerwowy w sposób odwracalny lub nieodwracalny,

W przesz∏oÊci neurotoksycznoÊç przyrównywano

do neuropatii obejmujàcej zmiany neuropatologiczne

lub zaburzenia neurologiczne, takie jak napad padaczkowy, parali˝ lub dr˝enie. Chocia˝ neuropatia jest wa˝nym objawem neurotoksycznoÊci to obecnie oczywistym jest, ˝e istnieje wiele innych objawów toksycznoÊci w uk∏adzie nerwowym (np.: utrata koordynacji motorycznej, os∏abienie czucia, zaburzenia w uczeniu i zapami´tywaniu), które nie majà odbicia w neuropatii

lub innych rodzajach badaƒ.

— przyczyniç si´ do charakterystyki zmian w uk∏adzie nerwowym towarzyszàcym nara˝eniu na badanà substancj´ i do zrozumienia mechanizmów

le˝àcych u podstaw tych zmian,

Niniejsza metoda badawcza dotyczàca neurotoksycznoÊci przeznaczona jest do wykrywania g∏ównych

skutków neurobehawioralnych i neuropatologicznych

u doros∏ych gryzoni. Podczas gdy skutki behawioralne, nawet pod nieobecnoÊç zmian morfologicznych,

mogà odzwierciedlaç szkodliwy wp∏yw na organizm,

to nie wszystkie zmiany behawioralne sà specyficzne

dla uk∏adu nerwowego. Dlatego ka˝da obserwowana

zmiana powinna byç oszacowana w po∏àczeniu z danymi histopatologicznymi, hematologicznymi lub biochemicznymi, jak równie˝ wynikami innego rodzaju

badaƒ toksycznoÊci uk∏adowej. Do badaƒ uj´tych

w niniejszej metodzie majàcych na celu dostarczenie

charakterystyki i oceny iloÊciowej reakcji neurotok-

Niniejsza metoda badawcza opiera si´ na podawaniu badanej substancji drogà pokarmowà. Inne drogi

podawania (np.: przez skór´ lub drogà inhalacyjnà) mogà byç bardziej w∏aÊciwe, ale mogà wtedy wymagaç

modyfikacji zalecanych procedur. Wybór drogi podawania zale˝y od sposobu nara˝enia cz∏owieka i dost´pnych informacji toksykologicznych lub kinetycznych.

— okreÊliç zale˝noÊci mi´dzy wielkoÊcià dawki a czasem wystàpienia odpowiedzi (reakcji) celem oszacowania poziomu bez obserwowanego dzia∏ania

szkodliwego (stosowanego do okreÊlenia kryteriów bezpieczeƒstwa substancji chemicznej).

1.2. Definicje

Szkodliwy skutek: jest ka˝dà zmianà w stosunku

do wyjÊciowej zale˝nà od nara˝enia, która zmniejsza

zdolnoÊç organizmu do prze˝ycia, rozmna˝ania si´ lub

przystosowania do Êrodowiska.

Dawka: jest iloÊcià podanej substancji. Dawk´ wyra˝a si´ jako mas´ (np. mg) lub jako mas´ badanej

substancji na jednostk´ masy zwierz´cia doÊwiadczalnego (np. mg/kg), lub jako sta∏e st´˝enie w paszy.

Dawkowanie: jest poj´ciem ogólnym obejmujàcym dawk´, jej cz´stotliwoÊç i czas trwania jej podawania.

NeurotoksycznoÊç: jest szkodliwà zmianà w strukturze lub funkcjonowaniu uk∏adu nerwowego, która

wynika z nara˝enia na czynnik biologiczny, chemiczny

lub fizyczny.

Czynnik neurotoksyczny: to ka˝dy czynnik biologiczny, chemiczny lub fizyczny posiadajàcy mo˝liwoÊç

spowodowania neurotoksycznoÊci.

NOAEL: skrót dla poziomu dawkowania bez obserwowanego szkodliwego skutku, jest to najwy˝szy poziom dawki, przy którym nie obserwuje si´ szkodliwych skutków zwiàzanych z nara˝eniem.

Poz. 2119

1.4. Opis metody badawczej

1.4.1. Wybór gatunku zwierzàt

Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝

inne gatunki gryzoni równie˝ mogà byç stosowane po

odpowiednim uzasadnieniu. Stosowaç nale˝y powszechnie u˝ywane szczepy laboratoryjne m∏odych,

zdrowych zwierzàt. Samice powinny byç dziewicze

i nieci´˝arne. Dawkowanie powinno rozpoczàç si´ jak

najszybciej po odstawieniu nie póêniej ni˝ w wieku

6 tygodni, a w ˝adnym przypadku w wieku ponad 9 tygodni. Je˝eli jednak niniejsze badanie jest ∏àczone

z innymi, to wymagania co do wieku zwierzàt mogà

ulec pewnym modyfikacjom. Na poczàtku doÊwiadczenia ró˝nica masy cia∏a nie powinna przekraczaç

±20 % Êredniej masy cia∏a ka˝dej p∏ci. Je˝eli doÊwiadczenie krótkoterminowe z powtarzanym dawkowaniem prowadzone jest jako wst´p do badania d∏ugoterminowego, to w obydwu doÊwiadczeniach nale˝y

stosowaç takie same szczepy zwierzàt.

1.4.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt

1.3. Zasada metody badawczej

Badana substancja podawana jest drogà pokarmowà w szeregu dawek kilku grupom gryzoni laboratoryjnych. Wymagane jest powtarzane podawanie dawek, a czas dawkowania powinien byç 28-dniowy,

podprzewlek∏y (90 dni) lub przewlek∏y (1 rok lub d∏u˝ej). Procedury przedstawione w niniejszej metodzie

badawczej mogà byç tak˝e wykorzystane do badania

ostrej neurotoksycznoÊci. Zwierz´ta sà badane celem

wykrycia lub scharakteryzowania nieprawid∏owoÊci

behawioralnych i/lub neurologicznych. Rozpi´toÊç

zmian behawioralnych, które mogà byç spowodowane przez substancj´ neurotoksycznà, jest okreÊlana

w ka˝dym okresie obserwacji. Pod koniec badania

cz´Êç zwierzàt ka˝dej p∏ci z ka˝dej grupy poddaje si´

perfuzji in situ i wykonuje sekcj´ mózgu, rdzenia kr´gowego i nerwów obwodowych.

Gdy doÊwiadczenie jest prowadzone jako samodzielne badanie s∏u˝àce stwierdzeniu neurotoksycznoÊci lub charakterystyce skutków neurotoksycznych, to

zwierz´ta w ka˝dej grupie nieu˝yte do perfuzji i badaƒ

histopatologicznych (zobacz tabela B.43.1) mogà byç

u˝yte do specyficznych badaƒ neurobehawioralnych,

neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych, które uzupe∏nià dane otrzymane

w standardowych badaniach wymaganych przez niniejszà metod´ (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Te

dodatkowe procedury mogà byç szczególnie u˝yteczne, gdy obserwacje empiryczne lub przewidywane

skutki wskazujà na specyficzny rodzaj lub cel neurotoksycznoÊci substancji chemicznej. Pozosta∏e zwierz´ta mogà byç tak˝e stosowane alternatywnie do

oszacowaƒ, takich jak te podane w metodach badawczych przy powtarzanym dawkowaniu na gryzoniach.

Gdy post´powanie wed∏ug niniejszej metody jest

∏àczone z post´powaniem wymaganym przez te inne

metody, to wtedy potrzebna jest wystarczajàca liczba

zwierzàt, by zapewniç obserwacje w obydwu badaniach.

Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych

powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie

podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç

sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin

ciemnoÊci. Nat´˝enie ha∏asu nale˝y ograniczyç do minimum. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. Na wybór pokarmu mo˝e wp∏ywaç koniecznoÊç zapewnienia odpowiedniego

zmieszania badanej substancji, gdy taki jest jej sposób

podawania. Zwierz´ta mo˝na przetrzymywaç indywidualnie lub w ma∏ych grupach tej samej p∏ci.

1.4.3. Przygotowanie zwierzàt

Zdrowe, m∏ode zwierz´ta sà w sposób losowy

przypisywane do grup nara˝anych i kontrolnej. Klatki

powinny byç umiejscowione w taki sposób, aby zminimalizowaç ewentualne skutki wynikajàce z ich usytuowania. Zwierz´ta sà jednoznacznie znakowane

i trzymane w klatkach przez przynajmniej 5 dni przed

rozpocz´ciem badania celem aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa).

1.4.4. Sposób podawania i przygotowanie dawek

Niniejsza metoda badawcza przeznaczona jest do

podawania badanej substancji drogà pokarmowà. Podawanie drogà pokarmowà mo˝e byç wykonywane za

pomocà sondy, w paszy, wodzie pitnej lub kapsu∏kach.

Inne sposoby podawania (np. przez skór´ lub drogà

inhalacyjnà) mogà byç stosowane, ale mogà wymagaç modyfikacji stosowanych procedur. Wybór drogi

nara˝ania zale˝y od profilu nara˝enia ludzi i dost´pnych informacji toksykologicznych i kinetycznych. Nale˝y podaç uzasadnienie wyboru drogi nara˝enia i wynikajàce stàd modyfikacje procedur metody badawczej.

Je˝eli to konieczne, to badana substancja mo˝e

byç rozpuszczona lub zawieszona w odpowiednim noÊniku. W pierwszej kolejnoÊci zaleca si´ stosowanie

roztworów/zawiesin wodnych, a w dalszej kolejnoÊci

roztworów/zawiesin olejowych (np. w oleju kukurydzianym) i w koƒcu roztworów/zawiesiny w innych

noÊnikach. Charakterystyka toksykologiczna noÊnika

powinna byç znana. Ponadto nale˝y uwzgl´dniç nast´pujàce w∏aÊciwoÊci noÊnika: wp∏ywy noÊnika na absorpcj´, rozmieszczenie, metabolizm i retencj´ badanej substancji, które mogà zmieniç jej charakterystyk´

toksykologicznà, wp∏ywy na konsumpcj´ paszy i spo˝ycie wody lub stan od˝ywienia zwierzàt.

1.5. Sposoby post´powania

1.5.1. Liczba i p∏eç zwierzàt

Je˝eli badanie wykonywane jest jako oddzielne, to

wtedy nale˝y stosowaç przynajmniej 20 zwierzàt

(10 samic i 10 samców) w ka˝dej grupie nara˝anej

i kontroli celem dokonania szczegó∏owych obserwacji

klinicznych i czynnoÊciowych. Przynajmniej pi´ç samic i pi´ç samców z tych dziesi´ciu samców i dziesi´ciu samic powinno byç poddane perfuzji in situ i u˝ytych do szczegó∏owych badaƒ neurohistopatologicznych pod koniec doÊwiadczenia. W przypadkach gdy

tylko ograniczona liczba zwierzàt w danej grupie dawkowej przejawia oznaki skutków neurotoksycznych,

nale˝y uwzgl´dniç te zwierz´ta wÊród tych przeznaczonych do perfuzji. Je˝eli badanie jest wykonywane

w po∏àczeniu z innym przy powtarzanym dawkowaniu, to nale˝y stosowaç odpowiednie liczby zwierzàt

tak, by spe∏niç wymagania obydwu metod. Minimalne

liczby zwierzàt na grup´ w ró˝nych kombinacjach badaƒ podano w tabeli B.43.1. Je˝eli planuje si´ likwidacj´ zwierzàt w trakcie doÊwiadczenia bàdê te˝ dodatkowe grupy celem obserwacji odwracalnoÊci, trwa∏oÊci lub opóênionego wystàpienia skutków toksycznych

po nara˝eniu lub gdy planuje si´ dodatkowe obserwacje, to wtedy liczba zwierzàt powinna byç zwi´kszona

tak, by zapewniç zwierz´ta potrzebne do obserwacji

i badaƒ histopatologicznych.

Poz. 2119

konania badania i czu∏oÊç stosowanych sposobów

post´powania. Takie dane powinny dostarczaç dowodów na zdolnoÊç do wykrywania i iloÊciowej oceny, o ile dotyczy, zmian w ró˝nych parametrach zalecanych do obserwacji, takich jak objawy autonomiczne, reakcje na bodêce, si∏a uchwytu i aktywnoÊç ruchowa. Informacje o substancjach, które powodujà

ró˝ne rodzaje reakcji neurotoksycznych i mogà byç

stosowane jako kontrola pozytywna, mo˝na znaleêç

w pozycjach od 2 do 9 piÊmiennictwa. Dane archiwalne mogà byç stosowane, je˝eli podstawowe aspekty

sposobów post´powania pozostajà takie same. Zalecana jest okresowa aktualizacja danych archiwalnych. Nowe dane wykazujàce ciàg∏à czu∏oÊç sposobów post´powania powinny byç wygenerowane,

gdy jakieÊ podstawowe elementy badania lub sposobu post´powania zosta∏y zmienione przez laboratorium wykonujàce.

1.5.4. Wybór dawek

Przy doborze poziomu dawek powinny byç brane

pod uwag´ jakiekolwiek wczeÊniejsze obserwacje

toksykologiczne i kinetyczne dost´pne dla badanego

zwiàzku lub materia∏ów podobnych. Najwy˝szy poziom dawkowania nale˝y dobraç w taki sposób, by

wywo∏aç skutki neurotoksyczne lub wyraêne toksyczne skutki ogólnoustrojowe. W dalszej kolejnoÊci malejàca sekwencja dawek powinna byç dobrana w taki

sposób, by wykazaç zale˝noÊç typu dawka-odpowiedê i poziom bez obserwowanego dzia∏ania szkodliwego (NOAEL) w najni˝szej dawce. W zasadzie poziomy dawkowania nale˝y dobraç w taki sposób, by

pierwotne dzia∏anie toksyczne na uk∏ad nerwowy

mo˝na by∏oby odró˝niç od wp∏ywów zwiàzanych

z toksycznoÊcià ogólnoustrojowà. Stosowanie dwóch

do trzech przedzia∏ów jest optymalne, a cz´sto dodatkowa czwarta grupa jest lepsza ni˝ stosowanie bardzo

du˝ych przedzia∏ów (np. wi´kszych ni˝ 10) pomi´dzy

dawkami. Tam gdzie istnieje wiarygodna ocena nara˝enia ludzi, to tak˝e ona powinna byç brana pod

uwag´.

1.5.2. Grupy nara˝ane i kontrolne

1.5.5. Badanie przy zastosowaniu dawki granicznej

Ogólnie stosowaç nale˝y przynajmniej trzy grupy

nara˝ane i grup´ kontrolnà, ale je˝eli na podstawie innych danych nie przewiduje si´ skutków przy powtarzanym dawkowaniu dawki 100 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ, to mo˝na wykonaç badanie przy zastosowaniu dawki granicznej. Je˝eli brak jest wiarygodnych

danych, to mo˝na przeprowadziç badanie wst´pne celem ustalenia zakresu dawek w badaniu w∏aÊciwym.

Zwierz´ta grupy kontrolnej powinny byç traktowane

tak samo pod ka˝dym wzgl´dem jak zwierz´ta nara˝ane, z wyjàtkiem podawania badanej substancji. Je˝eli

przy podawaniu badanej substancji stosuje si´ noÊnik,

to grupa kontrolna powinna otrzymywaç noÊnik

w najwy˝szej zastosowanej obj´toÊci.

Je˝eli badanie w jednej dawce na poziomie przynajmniej 1000 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ, przy zastosowaniu procedury opisanej w niniejszej metodzie, nie

daje rezultatu w postaci mo˝liwych do zaobserwowania skutków neurotoksycznych i je˝eli nie nale˝a∏o si´ spodziewaç skutków na podstawie istniejàcych

danych co do strukturalnie podobnych zwiàzków, to

wtedy pe∏ne badanie z trzema poziomami dawek

mo˝e byç uwa˝ane za niepotrzebne. Spodziewane

nara˝enie ludzi mo˝e wskazywaç na potrzeb´ zastosowania wy˝szej dawki stosowanej doustnie w badaniu dawki granicznej. W przypadku innych sposobów podawania, takich jak inhalacyjne bàdê skórne,

w∏asnoÊci fizykochemiczne badanej substancji, takie

jak rozpuszczalnoÊç, cz´sto mogà wskazywaç na

maksymalny mo˝liwy do uzyskania poziom nara˝enia. W badaniu ostrym doustnym dawka w badaniu

dawki granicznej powinna wynosiç przynajmniej

2000 mg/kg.

1.5.3. Sprawdzenie wiarygodnoÊci

Laboratorium wykonujàce badanie powinno

przedstawiç dane wykazujàce jego zdolnoÊç do wy-

1.5.6. Podawanie dawek

Zwierz´ta sà nara˝ane codziennie, siedem dni

w tygodniu, przez przynajmniej 28 dni; zastosowanie

5-dniowego re˝imu dawkowania lub krótszego czasu

nara˝enia musi byç uzasadnione. Gdy substancja podawana jest sondà, nale˝y podawaç pojedyncze dawki, stosujàc odpowiednià sond´ ˝o∏àdkowà lub kaniul´ intubacyjnà. Maksymalna obj´toÊç cieczy, która mo˝e byç podana jednorazowo, zale˝y od rozmiarów

zwierz´cia. Obj´toÊç nie powinna przekraczaç

1 ml/100 g masy cia∏a. Jednak˝e w przypadku roztworów wodnych mo˝na braç pod uwag´ u˝ycie

2 ml/100 g masy cia∏a. Nale˝y zminimalizowaç zmiany

obj´toÊci, dostosowujàc st´˝enia tak, by zapewniç sta∏à obj´toÊç na wszystkich poziomach dawek poza substancjami dra˝niàcymi i ˝ràcymi, które w wy˝szych

st´˝eniach mogà zwi´kszyç skutki dzia∏ania.

W przypadku substancji podawanych z paszà lub

wodà pitnà wa˝ne jest, by zapewniç, ˝e wprowadzenie

odpowiedniej iloÊci badanej substancji nie zak∏óci

normalnego ˝ywienia lub bilansu wodnego zwierz´cia. Gdy badana substancja podawana jest w paszy,

nale˝y stosowaç sta∏e st´˝enie w paszy (ppm) lub sta∏e dawki w stosunku do masy cia∏a; nale˝y opisaç stosowany sposób. Je˝eli substancja podawana jest sondà, to powinno to nast´powaç o mniej wi´cej sta∏ych

porach ka˝dego dnia i byç dostosowywane na sta∏ym

poziomie wzgl´dem masy cia∏a. Gdy badanie przy powtarzanym podawaniu pokarmowym jest stosowane

jako wst´p do badania d∏ugoterminowego, to w obydwu badaniach stosowaç nale˝y takà samà pasz´.

W badaniach ostrych, je˝eli zastosowanie pojedynczej

dawki jest niemo˝liwe, to nale˝y podawaç substancj´

w mniejszych cz´Êciach przez okres czasu nieprzekraczajàcy 24 godzin.

1.6. Obserwacje

1.6.1. Cz´stotliwoÊç obserwacji i badaƒ

W badaniach z powtarzanym dawkowaniem okres

obserwacji powinien pokrywaç okres dawkowania.

W badaniach ostrych po nara˝eniu nale˝y stosowaç

14-dniowy okres obserwacji. Dla zwierzàt grup satelitarnych, które sà przetrzymywane bez nara˝ania przez

ustalony czas po zakoƒczeniu dawkowania, obserwacje powinny pokrywaç si´ z tym czasem.

Obserwacje nale˝y czyniç z odpowiednià cz´stotliwoÊcià celem maksymalizacji prawdopodobieƒstwa

wykrycia jakichkolwiek nieprawid∏owoÊci behawioralnych i/lub neurologicznych. Obserwacje najlepiej prowadziç o tej samej porze ka˝dego dnia, bioràc pod

uwag´ szczytowy okres przewidywanych skutków po

dawkowaniu. Cz´stotliwoÊç obserwacji klinicznych

i badaƒ czynnoÊciowych jest podana w tabeli B.43.2.

Je˝eli dane kinetyczne i inne uzyskane w poprzednich

badaniach wskazujà na potrzeb´ zastosowania innych

czasów obserwacji, badaƒ lub okresów poobserwacyjnych, to nale˝y przyjàç alternatywny schemat celem

uzyskania maksimum mo˝liwych obserwacji. Nale˝y

przedstawiç uzasadnienie zmian schematu obserwacji.

Poz. 2119

1.6.1.1. Obserwacje ogólnego stanu zdrowia i ÊmiertelnoÊci/zachorowalnoÊci

Wszystkie zwierz´ta nale˝y dok∏adnie obserwowaç

pod wzgl´dem stanu ich zdrowia przynajmniej raz

dziennie, a tak˝e przynajmniej dwa razy dziennie pod

wzgl´dem ÊmiertelnoÊci i zachorowalnoÊci.

1.6.1.2. Szczegó∏owe obserwacje kliniczne

Szczegó∏owe obserwacje kliniczne nale˝y prowadziç dla wszystkich zwierzàt wybranych do tego celu

(zobacz tabela B.43.1) raz przed pierwszym nara˝eniem (by umo˝liwiç dalsze porównania) i nast´pnie

w ró˝nych odst´pach w zale˝noÊci od czasu trwania

badania (zobacz tabela B.43.2). Szczegó∏owe obserwacje kliniczne w grupie satelitarnej nale˝y prowadziç na

koniec okresu rekonwalescencji. Szczegó∏owe obserwacje kliniczne nale˝y prowadziç poza klatkà w standardowych warunkach. Stosowane kryteria i skale

punktowe powinny byç wyraênie okreÊlone przez laboratorium badawcze. Nale˝y do∏o˝yç staraƒ, aby

zmiennoÊç warunków doÊwiadczalnych by∏a minimalna (niezwiàzana uk∏adowo z nara˝eniem) i by obserwacje by∏y dokonywane przez wyszkolony personel

nieznajàcy poziomu nara˝enia zwierzàt.

Zaleca si´, aby obserwacje by∏y prowadzone

w sposób strukturalny o dobrze okreÊlonych kryteriach (wliczajàc definicj´ normalnego „zakresu”), które sà systematycznie stosowane dla ka˝dego zwierz´cia w ka˝dym czasie obserwacji. „Normalny zakres”

powinien byç odpowiednio udokumentowany. Wszelkie zaobserwowane oznaki powinny byç zapisane.

Kiedy tylko jest to mo˝liwe, notowaç tak˝e nale˝y wielkoÊç obserwowanych zmian. Obserwacje kliniczne powinny obejmowaç, ale nie ograniczaç si´ do zmian na

skórze, sierÊci, oczach, b∏onach Êluzowych, wyst´powaniu wydzielin i wydalin oraz objawów autonomicznych (∏zawienie, stroszenie sierÊci, rozmiar êrenicy,

nietypowy sposób oddychania i/lub oddychania ustami, oznaki nietypowego oddawania moczu i wydalania ka∏u, zmiany zabarwienia moczu).

Notowaç nale˝y wszelkie nietypowe reakcje dotyczàce pozycji cia∏a, poziomu aktywnoÊci (np. zwi´kszenie lub zmniejszenie penetracji standardowego obszaru) i koordynacji ruchów. Zapisywaç nale˝y zmiany

w chodzie (np. chód kaczkowaty, niezbornoÊç koƒczyn), postawie (np. zgrabiony grzbiet) i reakcji na

traktowanie zwierzàt lub inne bodêce otoczenia, a tak˝e pojawienie si´ ruchów tonicznych lub klonicznych,

konwulsji lub drgawek, stereotypii (np. nadmierne

czyszczenie si´, niezwyk∏e ruchy g∏owy, krà˝enie

w kó∏ko) lub dziwaczne zachowanie si´ (np. kàsanie

lub nadmierne lizanie si´, samookaleczanie, chodzenie ty∏em, wydawanie dêwi´ków) lub agresja.

1.6.1.3. Badania czynnoÊciowe

Podobnie do badaƒ klinicznych badania czynnoÊciowe nale˝y przeprowadziç raz przed nara˝eniem

i cz´sto w dalszej kolejnoÊci na wszystkich zwierz´tach

przeznaczonych do tego celu (zobacz tabela B.43.1).

Cz´stotliwoÊç badaƒ czynnoÊciowych jest tak˝e zale˝-

na od czasu trwania badania (zobacz tabela B.43.2).

W uzupe∏nieniu okresów obserwacji ustalonych w tabeli B.43.2 obserwacje czynnoÊciowe grup satelitarnych powinny byç wykonane mo˝liwie blisko terminu

likwidacji zwierzàt. Do badaƒ czynnoÊciowych zalicza

si´ reaktywnoÊç czuciowà na bodêce ró˝nej modalnoÊci, np.: bodêce s∏uchowe, wizualne i proprioceptywne

(zobacz pozycje 5, 6 i 7 piÊmiennictwa), oszacowanie

si∏y uÊcisku (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) i oszacowanie aktywnoÊci motorycznej (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). AktywnoÊç motoryczna powinna byç

mierzona urzàdzeniem automatycznym zdolnym do

wykrywania wzrostu i spadku aktywnoÊci. Je˝eli stosowany jest inny zdefiniowany system, to powinien

on dawaç wyniki iloÊciowe, a jego czu∏oÊç i wiarygodnoÊç powinny byç wykazane. Ka˝de urzàdzenie powinno byç sprawdzone celem zapewnienia powtarzalnoÊci w czasie i zgodnoÊci pomi´dzy urzàdzeniami.

Dalsze szczegó∏y co do post´powania podano w odpowiednich pozycjach piÊmiennictwa. Je˝eli brak jest

danych (np.: struktura-aktywnoÊç, dane epidemiologiczne, inne badania toksykologiczne) wykazujàcych

mo˝liwe skutki neurotoksyczne, to nale˝y wziàç pod

uwag´ wykonanie bardziej specjalistycznych badaƒ

czynnoÊci sensorycznych i motorycznych lub uczenia

si´ i zapami´tywania celem zbadania tych skutków

bardziej szczegó∏owo. Wi´cej informacji na temat badaƒ specjalistycznych i ich zastosowania podano

w pozycji 1 piÊmiennictwa.

W wyjàtkowych sytuacjach zwierz´ta wykazujàce

oznaki toksycznoÊci w stopniu znacznie zak∏ócajàcym

badania czynnoÊciowe mo˝na wykluczyç z tych badaƒ. Nale˝y przedstawiç uzasadnienie wykluczenia

zwierzàt z badaƒ czynnoÊciowych.

1.6.2. Masa cia∏a i spo˝ycie paszy/wody

W badaniach, które trwajà do 90 dni, wszystkie

zwierz´ta powinny byç wa˝one przynajmniej raz w tygodniu, a pomiary spo˝ycia paszy (wody, gdy badana

substancja podawana jest w tym noÊniku) w odst´pach przynajmniej tygodniowych. W przypadku badaƒ

d∏ugoterminowych wszystkie zwierz´ta powinny byç

wa˝one przez pierwszych 13 tygodni raz w tygodniu

i nast´pnie przynajmniej co 4 tygodnie. Pomiary spo˝ycia paszy (wody, gdy badana substancja podawana

jest w tym noÊniku) powinny byç dokonywane przez

pierwszych 13 tygodni raz w tygodniu i nast´pnie

w oko∏o 3-miesi´cznych odst´pach, chyba ˝e stan

zdrowia lub zmiany masy cia∏a sugerujà inny sposób

post´powania.

1.6.3. Badania okulistyczne

W badaniach o czasie trwania d∏u˝szym ni˝ 28 dni

badanie okulistyczne przy pomocy oftalmoskopu lub

innego równorz´dnego urzàdzenia powinno byç wykonane przed podaniem badanej substancji i na koniec badania u wszystkich zwierzàt lub, co najmniej

u zwierzàt otrzymujàcych najwy˝szà dawk´ i zwierzàt

z grupy kontrolnej. Je˝eli wykryte zostanà zmiany

w oczach lub je˝eli oznaki kliniczne wskazujà na potrzeb´ badaƒ, to wszystkie zwierz´ta nale˝y poddaç takim badaniom. W przypadku badaƒ d∏ugotermino-

Poz. 2119

wych badania nale˝y tak˝e przeprowadziç po 13 tygodniach. Nie ma potrzeby prowadzenia badaƒ okulistycznych, je˝eli takie wyniki sà ju˝ dost´pne z innych

badaƒ o podobnym czasie trwania i podobnych poziomach dawek.

1.6.4. Hematologia i biochemia kliniczna

Gdy badanie neurotoksycznoÊci jest wykonywane

∏àcznie z ogólnoustrojowym badaniem toksycznoÊci

o powtarzanym dawkowaniu, to badania hematologiczne i biochemia kliniczna powinny byç wykonane

w odpowiednim czasie zgodnie z odpowiednià metodà badania toksycznoÊci ogólnoustrojowej. Pobranie

próbek powinno byç wykonane w taki sposób, by zminimalizowaç jakiekolwiek potencjalne skutki neurobehawioralne.

1.6.5. Badania histopatologiczne

Badanie neuropatologiczne powinno uzupe∏niaç

i rozszerzaç obserwacje poczynione podczas fazy in vivo badania. Tkanki z przynajmniej 5 zwierzàt/p∏eç/grup´ (zobacz tabela B.43.1 i nast´pny akapit) powinny

byç utrwalone in situ przy zastosowaniu ogólnie uznanych metody perfuzji i utrwalania (zobacz pozycja 3

rozdzia∏ 5 piÊmiennictwa i pozycja 4 rozdzia∏ 50 piÊmiennictwa). Zapisywaç nale˝y wszelkie zmiany makroskopowe. Gdy badanie jest wykonywane jako samodzielne lub w celu wykrycia neurotoksycznoÊci lub

okreÊlenia skutków neurotoksycznych, pozosta∏e zwierz´ta mogà byç u˝yte do badaƒ neurobehawioralnych

(zobacz pozycje 10 i 11 piÊmiennictwa), neuropatologicznych (zobacz pozycje 10, 11, 12 i 13 piÊmiennictwa), neurochemicznych (zobacz pozycje 10, 11, 14

i 15 piÊmiennictwa) lub elektrofizjologicznych (zobacz

pozycje 10, 11, 16 i 17 piÊmiennictwa) uzupe∏niajàcych

procedury niniejszej metody lub do zwi´kszenia liczby

zwierzàt do badaƒ histopatologicznych. Te procedury

uzupe∏niajàce majà szczególne znaczenie, gdy obserwacje empiryczne lub przewidywane skutki wskazujà

na specyficzny rodzaj lub sposób dzia∏ania neurotoksycznego (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa). Pozosta∏e zwierz´ta mo˝na tak˝e odpowiednio u˝yç do badaƒ patologicznych opisanych w metodach z zastosowaniem powtarzanego dawkowania.

Wszystkie próbki tkanek nale˝y wybarwiç ogólnie

stosowanymi technikami barwienia z wykorzystaniem

hematoksyliny i eozyny (H&E), zatopiç w parafinie

i zbadaç technikà mikroskopowà. Je˝eli obserwuje si´

lub podejrzewa oznaki ogólnej neuropatii obwodowej,

to nale˝y badaç próbki tkanki nerwu obwodowego zatopione w tworzywie sztucznym. Objawy kliniczne

mogà tak˝e sugerowaç badania dodatkowych miejsc

bàdê te˝ zastosowanie specjalnych technik barwienia.

Wskazówki dotyczàce badania innych miejsc mo˝na

znaleêç w pozycjach 3 i 4 piÊmiennictwa. Pomocne

mogà byç odpowiednie barwienia celem wykazania

specyficznych rodzajów zmian patologicznych (zobacz

pozycja 18 piÊmiennictwa).

Reprezentatywne skrawki centralnego i obwodowego uk∏adu nerwowego powinny byç badane histologicznie (zobacz pozycja 3 rozdzia∏ 5 piÊmiennictwa

i pozycja 4 rozdzia∏ 50 piÊmiennictwa). Badane powinno byç: przodomózgowie, cz´Êç centralna mózgu,

w tym przekrój przez podwzgórze, Êródmó˝d˝e, mó˝d˝ek, most, rdzeƒ przed∏u˝ony, oko z nerwem wzrokowym i siatkówkà, rdzeƒ kr´gowy z odcinka szyjnego

i zgrubienia l´dêwiowego, zwój górny nerwu b∏´dnego, grzbietowe i brzuszne w∏ókna nerwu b∏´dnego,

proksymalny nerw kulszowy, proksymalny nerw piszczelowy (przy kolanie), nerw piszczelowy mi´Ênia ∏ydkowego. Sekcja rdzenia kr´gowego i nerwu obwodowego powinna zawieraç przekroje pod∏u˝ne i poprzeczne. Szczególnà uwag´ nale˝y zwróciç na unaczynienie uk∏adu nerwowego. Zbadaç nale˝y tak˝e

próbk´ mi´Ênia szkieletowego, w szczególnoÊci ∏ydkowego. Uwag´ nale˝y tak˝e zwróciç na miejsca o strukturze komórkowej i w∏óknistej w centralnym i obwodowym uk∏adzie nerwowym, o których wiadomo, ˝e

szczególnie podlegajà wp∏ywom przez substancje

neurotoksyczne.

Wskazówki dotyczàce zmian neuropatologicznych

typowych po nara˝eniu na substancj´ toksycznà mo˝na znaleêç w pozycjach 3, 4 piÊmiennictwa. Zaleca si´

etapowe badanie próbek tkanek, gdzie wycinki uzyskane od zwierzàt z grupy otrzymujàcej substancj´

w najwy˝szej dawce sà najpierw porównywane z tymi

uzyskanymi od zwierzàt z grupy kontrolnej. Je˝eli nie

obserwuje si´ zmian neuropatologicznych w wycinkach z tych grup, to dalsza analiza nie jest konieczna.

Je˝eli w wycinkach uzyskanych od zwierzàt z grupy

otrzymujàcej substancj´ w najwy˝szej dawce obserwuje si´ zmiany, to próbki tkanek uzyskanych od zwierzàt, które mog∏y podlegaç potencjalnym wp∏ywom

substancji podawanej w dawkach poÊrednich i najni˝szej, muszà zostaç zakodowane i kolejno przebadane.

Je˝eli w badaniach jakoÊciowych zostanà stwierdzone zmiany neuropatologiczne, to nale˝y przeprowadziç drugie badanie we wszystkich miejscach uk∏adu nerwowego wykazujàcych te zmiany. Skrawki uzyskane od zwierzàt otrzymujàcych substancje w dawkach na wszystkich badanych poziomach z ka˝dego

potencjalnie zmienionego regionu nale˝y zakodowaç

i zbadaç losowo bez znajomoÊci kodu. Nale˝y zapisaç

cz´stoÊç ka˝dej zmiany i jej nasilenie. Po zbadaniu

wszystkich regionów ze wszystkich grup otrzymujacych substancje w ró˝nych dawkach kod nale˝y z∏amaç i wykonaç analiz´ statystycznà celem oszacowania zale˝noÊci dawka-odpowiedê. Nale˝y opisaç przyk∏ady ró˝nych stopni nasilenia ka˝dej zmiany.

Zmiany neuropatologiczne nale˝y oceniaç w kontekÊcie obserwacji i pomiarów behawioralnych, a tak˝e innych danych z poprzednich i obecnego badania

toksycznoÊci substancji.

Poz. 2119

nia lub uÊmierconych w humanitarny sposób oraz

czas ich padni´cia lub uÊmiercenia, liczb´ zwierzàt wykazujàcych oznaki toksycznoÊci, opis zaobserwowanych oznak toksycznoÊci wraz z czasem ich pojawienia

si´, czasem trwania, rodzajem i nasileniem wszelkich

skutków toksycznych, liczbà zwierzàt wykazujàcych

zmiany chorobowe wraz z ich rodzajem i nasileniem.

2.2. Oszacowanie i interpretacja wyników

Dane z badaƒ nale˝y wyceniç pod wzgl´dem wyst´powania, nasilenia i korelacji skutków neurobehawioralnych i neuropatologicznych (neurochemicznych

lub elektrofizjologicznych skutków tak˝e, je˝eli prowadzone by∏y badania uzupe∏niajàce) oraz jakichkolwiek

innych obserwowanych skutków. O ile to mo˝liwe, to

dane liczbowe powinny zostaç poddane w∏aÊciwej

i ogólnie uznanej analizie statystycznej. Metody statystyczne nale˝y dobraç na etapie projektowania doÊwiadczenia.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje

Badana substancja

— w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (w tym izomeryzacja, czystoÊç),

— dane identyfikacyjne.

NoÊnik (o ile by∏ stosowany)

— uzasadnienie wyboru noÊnika.

Zwierz´ta doÊwiadczalne

— stosowany gatunek/szczep,

— liczba, wiek i p∏eç zwierzàt,

— êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania,

pasza itd.,

— masy zwierzàt (ka˝de zwierz´ oddzielnie) na poczàtku doÊwiadczenia.

Warunki przeprowadzania badania

— szczegó∏y dotyczàce formulacji badanej substancji/przygotowania paszy, uzyskane st´˝enie, trwa∏oÊç i jednorodnoÊç u˝ywanego preparatu,

— podawane dawki, w tym dane dotyczàce noÊnika,

jego obj´toÊci i stanu skupienia,

— szczegó∏y podawania badanej substancji,

2. WYNIKI

— uzasadnienie wyboru dawek,

2.1. Opracowanie wyników

— uzasadnienie sposobu podawania i czasu trwania

nara˝enia,

Nale˝y przedstawiç wyniki dla poszczególnych

zwierzàt. Ponadto wszystkie dane nale˝y zestawiç

w postaci tabelarycznej, wykazujàc dla ka˝dej grupy

i grupy kontrolnej liczb´ zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia, liczb´ zwierzàt martwych w trakcie bada-

— przeliczenie st´˝enia badanej substancji w paszy/wodzie (ppm) na rzeczywistà dawk´ (mg/kg

masy cia∏a/dzieƒ), gdy podawano w paszy/wodzie,

— szczegó∏y dotyczàce jakoÊci paszy i wody.

Obserwacje i procedury badaƒ

— szczegó∏y dotyczàce przypisania poszczególnych

zwierzàt w ka˝dej grupie do podgrup przeznaczonych do perfuzji,

— szczegó∏y systemu punktacji wraz z kryteriami

i skalà punktowà dla ka˝dego pomiaru w szczegó∏owych obserwacjach klinicznych,

— szczegó∏y badaƒ czynnoÊciowych oddzia∏ywania

czuciowego na bodêce o ró˝nej modalnoÊci (np.

s∏uchowe, wzrokowe, proprioceptywne); szacowanie si∏y chwytnoÊci, szacowanie aktywnoÊci ruchowej (wraz ze szczegó∏ami z badaƒ wykrywania

aktywnoÊci urzàdzeniami automatycznymi) oraz

inne stosowane procedury,

— szczegó∏y badaƒ okulistycznych i, o ile wykonywano, badaƒ hematologicznych, biochemii klinicznej wraz z wartoÊciami uzyskanymi u zwierzàt

z grupy kontrolnej,

— szczegó∏y dotyczàce poszczególnych procedur

neurobehawioralnych, neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych.

Wyniki

— masy cia∏a/zmiany masy cia∏a zwierzàt tak˝e tych

po uÊmierceniu,

— spo˝ycie paszy i wody, o ile dotyczy,

— dane dotyczàce reakcji toksycznych wed∏ug p∏ci

i poziomu dawkowania, w tym oznaki toksycznoÊci lub ÊmiertelnoÊç,

— charakter, nasilenie i czas trwania (czas pojawienia si´ i przebieg) szczegó∏owych obserwacji klinicznych (odwracalne czy nie),

— szczegó∏owy opis wszystkich wykonanych badaƒ

czynnoÊciowych,

— wyniki badania sekcyjnego,

— szczegó∏y wszelkich zmian neurobehawioralnych,

neuropatologicznych, neurochemicznych lub

elektrofizjologicznych,

— dane o absorpcji i metabolizmie, o ile dost´pne,

— analiza statystyczna, gdy stosowano.

Dyskusja wyników

— zale˝noÊç dawka-odpowiedê,

— zwiàzek jakichkolwiek innych skutków toksycznych z wnioskiem o potencjale neurotoksycznym

badanej substancji,

— poziom dawki bez obserwowanego dzia∏ania

szkodliwego.

Wnioski

— okreÊlenie ogólnej neurotoksycznoÊci badanej

substancji.

Poz. 2119

4. PIÂMIENNICTWO

1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris,

In Preparation.

2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity

Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.

3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles

and Methods for the Assessment of Neurotoxicity

associated with Exposure to Chemicals.

4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and

Wilkins, Baltimore/ London.

5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the

Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol.

Exp., 40, 999—1003.

6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use

in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691—704.

7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M.

(1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using

a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol.,

108, 267—283.

8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley,

M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment

of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and

Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233—236.

9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill,

M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C.

(1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13,

599—609.

10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven

Press, New York.

11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.

12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for

Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol.,

10, 689—695.

13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and

MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic

Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and

Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18,

343—352.

14) O’Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic

Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity.

Eurotoxicol. Teratol., 10, 445—452.

15) O’Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute

Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and

Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244,

368—378.

17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental

and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and

Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co.,.

Baltimore/London, pp. 726—742.

16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G.

(1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp. 299—335.

18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and

Pratice of Histological Techniques. Chapter 17,

Neuropathological Techniques. Lowe, James and

Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.

* W tym pi´ç zwierzàt przeznaczonych do badaƒ czynnoÊciowych i szczegó∏owych obserwacji klinicznych jako cz´Êç badania neurotoksycznoÊci.

Minimalne liczby zwierzàt w grupie, gdy badanie neurotoksycznoÊci wykonuje si´ oddzielnie lub w kombinacji z innymi badaniami

Tabela B.43.1

Tabela B.43.2

Cz´stotliwoÊç obserwacji klinicznych i badaƒ czynnoÊciowych

Za∏àcznik nr 11

C.21. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN AZOTU

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 216 (2000).

1.1. Wst´p

Niniejsza metoda opisuje laboratoryjnà metod´

badawczà s∏u˝àcà do oceny d∏ugoterminowego wp∏ywu substancji chemicznych, po jednorazowym nara˝eniu, na aktywnoÊç mikroorganizmów glebowych

w przemianach azotu. Badanie opiera si´ g∏ównie na

zaleceniach Europejskiej i Âródziemnomorskiej Organizacji Ochrony RoÊlin (zobacz pozycja 1 piÊmiennic-

twa). Uwzgl´dnione zosta∏y równie˝ inne wytyczne,

takie jak niemieckie Biologicznego Urz´du Federalnego (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa), amerykaƒskiej

Agencji Ochrony Ârodowiska US EPA (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa), SETAC (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa) oraz Mi´dzynarodowej Organizacji

Standaryzacji ISO (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa).

Podczas posiedzenia OECD na temat wyboru gleby/osadu w Belgirate, W∏ochy w 1995 r. (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa), uzgodniono liczb´ i rodzaj gleby,

które mo˝na zastosowaç w badaniach wykonanych

wg niniejszej metody. Zalecenia w zakresie pobierania, opracowania i przechowywania próbek glebowych, opierajà si´ na Dokumencie Przewodnim ISO

(zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa) oraz na ustaleniach

podj´tych podczas spotkania roboczego w Belgirate.

Podczas okreÊlania i szacowania charakterystyki toksykologicznej badanych substancji konieczne mo˝e

okazaç si´ oznaczenie ich wp∏ywu na aktywnoÊç mikroorganizmów glebowych, np.: gdy wymagane sà

dane dotyczàce potencjalnych skutków ubocznych

Êrodków ochrony roÊlin na mikroflor´ glebowà lub

gdy spodziewane jest nara˝enie mikroorganizmów

glebowych na substancje chemiczne inne ni˝ Êrodki

ochrony roÊlin. Badanie przemian azotu wykonuje si´

w celu okreÊlenia wp∏ywu takich substancji chemicznych na mikroflor´ glebowà. Podczas badania agrochemikaliów (Êrodki ochrony roÊlin, nawozy, chemikalia stosowane w leÊnictwie) wykonuje si´ zarówno badanie przemian azotu, jak i badanie przemian w´gla.

Przy badaniach innych substancji wystarczajàce jest

badanie przemian azotu. Je˝eli jednak wartoÊç EC50

w badaniu przemian azotu dla takich substancji znajduje si´ w tym samym zakresie jak dla handlowo dost´pnych inhibitorów procesu nitryfikacji (np. nitrapyrina), to w celu zebrania dalszych informacji powinno

byç wykonane badanie przemian w´gla.

byç badane jako substancje aktywne (s.a.) lub w postaci gotowych form u˝ytkowych. Jednak˝e niniejsze

badanie nie ogranicza si´ tylko do agrochemikaliów.

Zmieniajàc zarówno iloÊç badanej substancji stosowanej do gleby, jak i sposób opracowania danych, badanie mo˝e byç równie˝ wykonane w przypadku substancji chemicznych, w stosunku do których nie jest

znana spodziewana ich iloÊç w glebie. Dlatego dla

substancji innych ni˝ agrochemikalia oznacza si´

wp∏yw serii st´˝eƒ na przemiany azotu. Dane z tych

badaƒ u˝ywane sà do wyznaczenia krzywej zale˝noÊci

dawka-odpowiedê i wyliczenia wartoÊci ECx, gdzie

x jest zdefiniowanym % skutku.

Gleby sk∏adajà si´ z ˝ywych i nieo˝ywionych sk∏adników, które istniejà w z∏o˝onych i heterogenicznych

mieszaninach. Mikroorganizmy odgrywajà wa˝nà rol´

w rozk∏adzie i przemianach materii organicznej w ˝yznych glebach, z wieloma gatunkami majàcymi wk∏ad

w ró˝ne aspekty u˝yênienia gleby. D∏ugoterminowe

zak∏ócenie tych procesów biochemicznych mo˝e potencjalnie oddzia∏ywaç na krà˝enie sk∏adników od˝ywczych i poprzez to zmieniaç ˝yznoÊç gleby. Przemiany

azotu i w´gla nast´pujà we wszystkich ˝yznych glebach. Chocia˝ zespo∏y mikroorganizmów odpowiedzialne za te procesy ró˝nià si´ mi´dzy glebami, to

szlaki przemian sà zasadniczo takie same.

EC50 (Medialne st´˝enie efektywne): jest st´˝eniem badanej substancji w glebie powodujàcym 50 %

inhibicj´ przemian azotu do azotanów.

Badanie opisane w niniejszej metodzie ma s∏u˝yç

wykrywaniu d∏ugoterminowych szkodliwych wp∏ywów substancji na proces przemiany azotu w aerobowych glebach powierzchniowych. Metoda badawcza

pozwala tak˝e na oszacowanie wp∏ywów substancji

na przemiany w´gla przez mikroflor´ glebowà. Powstawanie azotanów ma miejsce w nast´pstwie rozpadu wiàzaƒ w´giel-azot. Dlatego te˝, je˝eli w glebach

kontrolnych i badanych znajduje si´ równe iloÊci wytwarzanych azotanów, to wysoce prawdopodobny jest

fakt, ˝e g∏ówne szlaki przemian w´gla sà nienaruszone

i funkcjonalne. Substrat wybrany do badania (sproszkowana lucerna) ma korzystny stosunek w´gla do azotu (zazwyczaj pomi´dzy 12:1 i 16:1). Z tego powodu

zredukowany jest niedobór w´gla w czasie badania

i je˝eli zespo∏y mikroorganizmów sà zniszczone przez

substancj´ chemicznà, to mogà si´ one odrodziç

w ciàgu 100 dni.

Badanie, z którego wywodzi si´ niniejsza metoda

badawcza, by∏o pierwotnie zaprojektowane dla substancji, których iloÊç w glebie mo˝na by∏o przewidzieç.

Tak jest na przyk∏ad w przypadku Êrodków ochrony roÊlin, dla których znana jest ich iloÊç stosowana w polu. W przypadku agrochemikaliów wystarczajàce jest

badanie dwóch dawek, jakie przewiduje si´ lub przypuszcza, ˝e b´dà stosowane. Agrochemikalia mogà

1.2. Definicje

Przemiany azotu: to rozk∏ad przez mikroorganizmy

materii organicznej zawierajàcej azot poprzez procesy

amonifikacji i nitryfikacji do odpowiedniego nieorganicznego azotanowego produktu koƒcowego.

ECx (St´˝enie efektywne): jest st´˝eniem badanej

substancji w glebie powodujàcym x procent inhibicji

przemian azotu do azotanów.

1.3. Substancje kontrolne

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Do przesianej gleby dodaje si´ sproszkowany substrat roÊlinny, a próbk´ poddaje si´ dzia∏aniu badanej

substancji lub pozostawia bez dodatku badanej substancji (badanie kontrolne). Je˝eli badane sà agrochemikalia, to zaleca si´ minimum dwa st´˝enia, które powinny byç wybrane w odniesieniu do najwy˝szego

st´˝enia, jakie przewiduje si´ w warunkach polowych.

Po 0, 7, 14 i 28 dniach inkubacji próbki gleby badanej

i kontrolnej sà poddawane ekstrakcji z odpowiednim

rozpuszczalnikiem i w ekstraktach oznacza si´ iloÊci

azotanów. IloÊç wytworzonych azotanów w próbkach

badanych jest porównywana z wartoÊcià w próbkach

kontrolnych. Nast´pnie oblicza si´ procent odchylenia

w stosunku do gleby kontrolnej. Wszystkie badania

prowadzone sà przez przynajmniej 28 dni. Je˝eli

28 dnia ró˝nica mi´dzy próbkami kontrolnymi i badanymi jest równa lub wi´ksza ni˝ 25 %, to pomiary kontynuowane sà maksymalnie 100 dni. Je˝eli badane sà

substancje inne ni˝ agrochemikalia, to do próbek gleby dodaje si´ badanà substancj´ w st´˝eniach stanowiàcych seri´, a iloÊci azotanów w próbce kontrolnej

i próbkach badanych oznacza si´ po 28 dniach inkubacji. Wyniki badaƒ z wieloma st´˝eniami analizowane

sà przy pomocy modelu regresji. Wyliczane sà wartoÊci ECx (np.: EC50, EC25 i/lub EC10).

1.5. WiarygodnoÊç badania

Szacowanie wyników badania dla agrochemikaliów opiera si´ na stosunkowo ma∏ych ró˝nicach (tj.

Êrednia wartoÊç (25 %) pomi´dzy st´˝eniami azotanów w próbkach kontrolnych i próbkach badanych,

wi´c du˝e odchylenia w grupie kontrolnej mogà prowadziç do fa∏szywych wyników. Dlatego zmiennoÊç

pomi´dzy powtórzeniami w grupie kontroli powinna

wynosiç mniej ni˝ ±15 %.

1.6. Opis metody badawczej

1.6.1. Wyposa˝enie

W badaniu stosuje sà naczynia wykonane z oboj´tnego chemicznie materia∏u. Powinny byç one odpowiedniej wielkoÊci w zale˝noÊci od zastosowanej procedury inkubacji gleb, tj. inkubacji ca∏ej partii gleby

lub jako seria poszczególnych próbek glebowych (zobacz pkt 1.7.1.2). Nale˝y poczyniç starania, by zminimalizowaç straty wody z jednej strony, a z drugiej by

umo˝liwiç wymian´ gazowà podczas badania (np.: naczynia stosowane w badaniu mogà byç przykryte perforowanà folià polietylenowà). Gdy badane sà substancje lotne, powinny byç stosowane szczelne i nieprzepuszczalne dla gazu naczynia. Powinny one mieç

takie rozmiary, aby próbka gleby wype∏nia∏a w przybli˝eniu jednà czwartà ich obj´toÊci.

Stosowane jest standardowe wyposa˝enie laboratoryjne

— urzàdzenie wytrzàsajàce: wytrzàsarka mechaniczna lub inne odpowiednie,

— wirówka (3000 g) lub urzàdzenie do filtracji (z wykorzystaniem filtrów papierowych wolnych od

azotanów),

— urzàdzenie o odpowiedniej czu∏oÊci i powtarzalnoÊci do analizy azotanów.

1.6.2. Wybór i liczba gleb

Powinno stosowaç si´ gleb´ jednego rodzaju. Zaleca si´ stosowaç gleb´ o nast´pujàcej charakterystyce

— zawartoÊç piasku: nie mniej ni˝ 50 % i nie wi´cej

ni˝ 75 %,

— wartoÊç pH: 5,5—7,5,

— zawartoÊç w´gla organicznego: 0,5—1,5 %,

— biomasa mikroorganizmów powinna byç oznaczona (zobacz pozycje 8 i 9 piÊmiennictwa), a zawartoÊç w´gla powinna stanowiç przynajmniej

1 % ca∏kowitego w´gla organicznego gleby.

Najcz´Êciej gleba o takiej charakterystyce jest najbardziej niekorzystnym przypadkiem, poniewa˝ adsorpcja badanej substancji jest minimalna, a jej dost´pnoÊç dla mikroflory maksymalna. Dlatego te˝ badania z innymi glebami sà w zasadzie niepotrzebne.

Jednak˝e w pewnych okolicznoÊciach, np. gdy przewidywane zastosowanie badanej substancji b´dzie mia∏o miejsce na szczególnych glebach, takich jak kwaÊne

gleby leÊne, lub w przypadku substancji chemicznych

na∏adowanych elektrostatycznie, konieczne mo˝e si´

okazaç zastosowanie dodatkowej gleby.

Poz. 2119

1.6.3. Pobieranie i przechowywanie próbek gleby

1.6.3.1. Pobieranie próbek gleby

Dost´pne powinny byç szczegó∏owe informacje

dotyczàce historii miejsca, z którego pobierana jest

gleba do badaƒ. Podaç nale˝y dok∏adne miejsce, rodzaj roÊlinnoÊci pokrywajàcej, daty zastosowania

Êrodków ochrony roÊlin, zastosowanie nawozów organicznych i nieorganicznych, dodatki materia∏ów

biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia.

Miejsce, z którego pobiera si´ próby gleby do badaƒ,

powinno byç tak dobrane, aby umo˝liwiç d∏ugoterminowe jego u˝ycie. Odpowiednie sà pastwiska stale

wypasane, pola uprawne z jednorocznymi uprawami

zbó˝ (z wyjàtkiem kukurydzy) lub g´sto zasiane zielone ∏àki. Miejsce wybrane do pobierania próbek nie powinno byç poddawane zabiegom z u˝yciem Êrodków

ochrony roÊlin przez minimum jeden rok przed pobraniem próbek. Ponadto przez przynajmniej szeÊç miesi´cy przed pobieraniem prób nie powinno stosowaç

si´ ˝adnego nawozu organicznego. Zastosowanie nawozu mineralnego jest mo˝liwe tylko w przypadku

wymagania tego przez roÊliny uprawne, a próbki gleby nie powinny byç pobierane wczeÊniej ni˝ trzy miesiàce po zastosowaniu nawozu. Nale˝y unikaç wykorzystywania gleb, na których stosowano nawozy

o znanych skutkach dzia∏ania biobójczego (np. cyjanamid wapnia).

Nale˝y unikaç pobierania próbek podczas lub tu˝

po d∏ugich okresach suszy (d∏u˝sze ni˝ 30 dni) lub

sp∏ywów wody. W przypadku gleb ornych próbki nale˝y pobieraç z g∏´bokoÊci 0 do 20 cm. W przypadku ∏àk

(pastwisk) lub innych gleb, gdzie orka nie by∏a przeprowadzana przez d∏ugie okresy (przynajmniej jeden

sezon), maksymalna g∏´bokoÊç pobierania próbek

mo˝e wynosiç nieco wi´cej ni˝ 20 cm (np. do 25 cm).

Próbki gleby powinny byç transportowane w pojemnikach i temperaturze, które gwarantujà, ˝e pierwotne

w∏aÊciwoÊci gleby nie zostanà znaczàco zmienione.

1.6.3.2. Przechowywanie próbek gleby

Najbardziej w∏aÊciwe jest stosowanie gleby Êwie˝o pobranej z pola. Je˝eli jednak nie ma sposobu na

unikni´cie przechowywania w laboratorium, to gleby

mogà byç przechowywane w ciemnoÊci w temperaturze 4±2 °C przez maksimum trzy miesiàce. Podczas

przechowywania gleby nale˝y zapewniç warunki tlenowe. Je˝eli gleby pobiera si´ z miejsc, gdzie sà one

zamarzni´te przez przynajmniej trzy miesiàce w roku,

to mo˝na rozwa˝yç ich przechowywanie przez szeÊç

miesi´cy w temperaturze od –18 °C do –22 °C. Biomas´ mikroorganizmów w przechowywanych glebach

oznacza si´ przed ka˝dym doÊwiadczeniem. W´giel

w biomasie powinien stanowiç przynajmniej 1 % ca∏kowitego w´gla organicznego (zobacz pkt 1.6.2).

1.6.4. Obróbka i przygotowanie gleby przed badaniem

1.6.4.1. Inkubacja wst´pna

Je˝eli gleba by∏a przechowywana (zobacz

pkt 1.6.3.2), zaleca si´ inkubacj´ wst´pnà przez odpo-

wiedni okres wynoszàcy od 2 do 28 dni. Temperatura

i wilgotnoÊç gleby podczas inkubacji wst´pnej powinny byç podobne do tych stosowanych w badaniu (zobacz pkt 1.6.4.2. i pkt 1.7.1.3).

1.6.4.2. Parametry fizykochemiczne

Gleb´ oczyszcza si´ r´cznie z du˝ych zanieczyszczeƒ (np. kamieni, cz´Êci roÊlin) i nast´pnie przesiewa

do czàstek o rozmiarach równych lub mniejszych ni˝

2 mm. WilgotnoÊç gleby powinna byç dostosowana

za pomocà wody destylowanej lub dejonizowanej do

wartoÊci pomi´dzy 40 i 60 % maksymalnej pojemnoÊci wodnej.

1.6.4.3. Dodanie substratu organicznego

Do gleby nale˝y dodaç odpowiedni substrat organiczny, np. sproszkowanà lucern´ (g∏ówny sk∏adnik

Medicago sativa), w którym stosunek C:N zawarty jest

pomi´dzy 12:1 a 16:1. Zaleca si´ stosowaç 5 g lucerny

na kilogram gleby (sucha masa).

1.6.5. Przygotowanie badanej substancji w celu dodania do gleby

Badanà substancj´ podaje si´ z noÊnikiem. NoÊnikiem mo˝e byç woda (dla substancji rozpuszczalnych

w wodzie) lub oboj´tna sta∏a substancja, taka jak drobny piasek kwarcowy (rozmiar czàstek: 0,1—0,5 mm).

Nale˝y unikaç stosowania p∏ynnych noÊników innych

ni˝ woda (np.: rozpuszczalniki organiczne, takie jak

aceton, chloroform), poniewa˝ mogà one zniszczyç

mikroflor´. Je˝eli jako noÊnik stosuje si´ piasek, to

mo˝e on zawieraç badanà substancj´ rozpuszczonà

lub zawieszonà w odpowiednim rozpuszczalniku.

W takich przypadkach rozpuszczalnik powinien byç

usuni´ty przez odparowanie przed wymieszaniem

z glebà. Dla równomiernego rozprowadzenia badanej

substancji w glebie zaleca si´ stosowanie 10 g piasku

na kilogram gleby (sucha masa). Do próbek kontrolnych dodaje si´ takà samà iloÊç wody i/lub piasku.

Badajàc substancje lotne nale˝y, na tyle na ile to

mo˝liwe, unikaç strat podczas ich wprowadzania, a tak˝e nale˝y poczyniç starania, by w sposób jednorodny

rozprowadziç substancj´ w glebie (np. substancja powinna zostaç podana do gleby w kilku miejscach).

1.6.6. St´˝enia substancji badanej

Je˝eli badane sà agrochemikalia, to powinny byç

zastosowane przynajmniej dwa st´˝enia. Ni˝sze st´˝enie powinno odpowiadaç przynajmniej maksymalnej

iloÊci substancji, jakiej mo˝na si´ spodziewaç w glebie

w warunkach praktycznych, natomiast wy˝sze st´˝enie

powinno byç wielokrotnoÊcià st´˝enia ni˝szego. St´˝enia badanej substancji dodanej do gleby oblicza si´

przy za∏o˝eniu jednorodnego rozmieszczenia do g∏´bokoÊci 5 cm i g´stoÊci gleby 1,5. W przypadku agrochemikaliów stosowanych bezpoÊrednio do gleby lub dla

substancji chemicznych, których iloÊç w glebie mo˝na

przewidzieç, zalecane st´˝enia badane to maksymalne

Przewidywane St´˝enie w Ârodowisku (PEC) i jego pi´ciokrotnoÊç. W przypadku substancji, które stosuje si´

Poz. 2119

kilkakrotnie w czasie sezonu, badane st´˝enia wyznacza si´, mno˝àc PEC przez maksymalnà przewidywanà

liczb´ stosowaƒ. Jednak˝e najwy˝sze stosowane st´˝enie nie powinno przekraczaç dziesi´ciokrotnoÊci

maksymalnej jednorazowo zastosowanej dawki. Je˝eli

badane sà substancje inne ni˝ agrochemikalia, nale˝y

stosowaç seri´ pi´ciu st´˝eƒ w post´pie geometrycznym. Badane st´˝enia powinny obejmowaç zakres konieczny do wyznaczenia wartoÊci ECx.

1.7. Wykonanie badania

1.7.1. Warunki nara˝enia

1.7.1.1. St´˝enia substancji badanej i kontrola

Je˝eli badane sà agrochemikalia, badanà próbk´

gleby dzieli si´ na trzy cz´Êci o równej masie. Dwie

cz´Êci miesza si´ z noÊnikiem zawierajàcym badany

produkt, a trzecià cz´Êç miesza si´ z noÊnikiem bez badanego produktu (kontrola). Zaleca si´ stosowanie minimum trzech powtórzeƒ dla st´˝eƒ i kontroli. W przypadku badania substancji innych ni˝ agrochemikalia

gleb´ dzieli si´ na szeÊç cz´Êci o równej masie. Pi´ç

z nich miesza si´ z noÊnikiem zawierajàcym badanà

substancj´, a szóstà miesza si´ z noÊnikiem bez badanej substancji. Zarówno dla kontroli, jak i badanych

serii st´˝eƒ zaleca si´ prowadzenie trzech powtórzeƒ.

Nale˝y podjàç wszelkie starania w celu zapewnienia

jednorodnego rozprowadzenia badanej substancji

w próbkach gleby. Podczas mieszania nale˝y unikaç

ubijania i zgniatania gleby.

1.7.1.2. Inkubacja próbek glebowych

Inkubacja próbek glebowych mo˝e byç przeprowadzona na dwa sposoby: ca∏ej partii gleby z badanà substancjà i gleby kontrolnej lub z wykorzystaniem równych cz´Êci poszczególnych próbek gleby kontrolnej

i z badanà substancjà. Je˝eli inkubuje si´ ca∏e partie

gleby, to nale˝y przygotowaç du˝à iloÊç próbek kontrolnych i z badanà substancjà, ˝eby podczas badania pobieraç z nich ma∏e próbki do analizy. WyjÊciowa masa

przygotowanej gleby pierwotnej i w st´˝eniach zale˝y

od rozmiaru próbek pobieranych do analizy, liczby zastosowanych powtórzeƒ w analizie oraz przewidywanej maksymalnej krotnoÊci pobierania. Gleby inkubowane w ca∏oÊci przed pobieraniem próbek do analizy

powinny zostaç dobrze wymieszane. Je˝eli gleby sà inkubowane jako poszczególne próbki, to ka˝da z nich,

zarówno kontrolna, jak i z badanà substancjà dzielona

jest na wymaganà liczb´ mniejszych próbek i te sà wykorzystywane wed∏ug potrzeby. W doÊwiadczeniach,

gdzie przewiduje si´ wi´cej ni˝ dwa pobrania próbek

do analizy, mniejsze próbki powinny byç przygotowane w iloÊci wystarczajàcej dla wszystkich powtórzeƒ

we wszystkich punktach czasowych pobierania próbek. Powinny byç inkubowane przynajmniej trzy powtórzenia badanej gleby w warunkach tlenowych (zobacz pkt 1.7.1.1). Podczas wszystkich badaƒ stosowane

powinny byç odpowiednie pojemniki o powierzchni

pozwalajàcej na unikni´cie rozwoju warunków beztlenowych. Je˝eli badane sà substancje lotne, badania

nale˝y prowadziç z serià poszczególnych próbek.

1.7.1.3. Warunki i czas trwania badania

2. WYNIKI

Badanie jest wykonywane w ciemnoÊci w temperaturze pokojowej 20±2 °C. WilgotnoÊç próbek gleby

powinna byç utrzymywana w czasie badania pomi´dzy 40 % a 60 % maksymalnej pojemnoÊci wodnej gleby (zobacz pkt 1.6.4.2) z odchyleniem ±5 %. W miar´

potrzeby mo˝na dodaç wod´ destylowanà lub dejonizowanà.

2.1. Obliczanie wyników

Minimalny czas trwania badania wynosi 28 dni.

Je˝eli badane sà agrochemikalia, to porównywane sà

iloÊci wytworzonych azotanów w próbkach kontrolnych i z badanà substancjà. Je˝eli po 28 dniach ró˝nià

si´ one o wi´cej ni˝ 25 %, to badanie jest kontynuowane a˝ osiàgnie si´ ró˝nic´ równà lub mniejszà ni˝ 25 %

lub przez maksimum 100 dni w zale˝noÊci od tego, co

nastàpi wczeÊniej. Dla substancji innych ni˝ agrochemikalia badanie koƒczy si´ po 28 dniach. Po 28 dniach

w próbkach kontrolnych i próbkach gleby z badanà

substancjà oznacza si´ iloÊç azotanów i oblicza wartoÊci ECx.

1.7.2. Pobieranie próbek i analiza gleb

1.7.2.1. Terminy pobierania próbek gleby

Je˝eli bada si´ agrochemikalia, to próbki gleby do

analizy azotanów pobiera si´ w 0, 7, 14 i 28 dniu. Je˝eli konieczne jest przed∏u˝enie badania, dalsze pomiary powinno wykonywaç si´ w odst´pach 14-dniowych.

Je˝eli bada si´ substancje inne ni˝ agrochemikalia,

to nale˝y stosowaç przynajmniej pi´ç st´˝eƒ, a próbki

gleby badaç na zawartoÊç azotanów na poczàtku

(dzieƒ 0) i na koniec okresu nara˝enia (28 dzieƒ). Dodatkowy pomiar, np. w 7 dniu, mo˝e byç równie˝ wykonany, je˝eli zostanie to uznane za konieczne. Dane

otrzymane w 28 dniu sà u˝ywane do wyznaczenia

wartoÊci ECx dla substancji chemicznej. Je˝eli jest to

wymagane, to dane z próbek kontrolnych z dnia 0 mogà zostaç wykorzystane do podania poczàtkowej iloÊci

azotanów w glebie.

1.7.2.2. Analiza próbek glebowych

IloÊç wytworzonych azotanów w ka˝dym powtórzeniu próbek z badanà substancja i glebie kontrolnej

oznacza si´ za ka˝dym razem podczas pobierania próbek. Azotany ekstrahuje si´ z gleby przez wytrzàsanie

z odpowiednim rozpuszczalnikiem, np. 0,1 M roztworem chlorku potasu. Zaleca si´ stosowanie 5 ml roztworu KCl na gram suchej masy gleby. W celu optymalizacji ekstrakcji naczynia zawierajàce gleb´ do ekstrakcji i roztwór ekstrakcyjny powinny byç nape∏nione

nie wi´cej ni˝ do po∏owy. Mieszaniny wytrzàsa si´

przez 60 minut, przy pr´dkoÊci 150 obrotów na minut´. Mieszaniny odwirowywuje si´ lub filtruje. Fazy ciek∏e analizuje si´ na zawartoÊç azotanów. Ekstrakty

wolne od czàsteczek mogà byç przechowywane przed

analizà w temperaturze minus 20±5 °C do szeÊciu miesi´cy.

Poz. 2119

Je˝eli badanie wykonuje si´ z agrochemikaliami, to

iloÊç wytworzonych azotanów w ka˝dej podwójnej

próbce powinna byç zapisana, a Êrednie wartoÊci ze

wszystkich powtórzeƒ powinny zostaç zestawione

w formie tabeli. Przemiany azotu powinny zostaç oszacowane za pomocà odpowiedniej i ogólnie uznanej

metody statystycznej (np. test F, poziom istotnoÊci 5 %).

IloÊci wytworzonego azotanu wyra˝a si´ w mg azotanu/kg suchej masy gleby/dzieƒ. IloÊç wytworzonego

azotanu w ka˝dym st´˝eniu porównuje si´ z iloÊcià

w glebie kontrolnej i obliczany jest procent odchylenia

wzgl´dem kontroli.

Je˝eli badanie wykonywane jest dla substancji innych ni˝ agrochemikalia, to okreÊla si´ iloÊç wytworzonych azotanów w ka˝dym powtórzeniu i dla oszacowania wartoÊci ECx wyznacza si´ krzywà zale˝noÊci

dawka-odpowiedê. IloÊci azotanów (tj. mg azotanu/kg

suchej masy gleby) oznaczonych w próbkach traktowanych po 28 dniach porównuje si´ z próbkami kontrolnymi. Z tych danych oblicza si´ procent inhibicji

dla ka˝dego st´˝enia. WartoÊci wyra˝one w procentach nale˝y korelowaç z odpowiednimi st´˝eniami.

Procedury statystyczne powinny umo˝liwiç obliczenie

wartoÊci ECx. Przy zastosowaniu standardowych procedur (zobacz pozycje 10, 11 i 12 piÊmiennictwa) dla

obliczonych wartoÊci ECx wyznacza si´ tak˝e przedzia∏y ufnoÊci (p=0,95).

Badane substancje, które zawierajà du˝e iloÊci

azotu, mogà spowodowaç wzrost iloÊci azotanów wytwarzanych w czasie badania. Je˝eli takie substancje

badane sà w wysokich st´˝eniach (np. substancje stosowane wielokrotnie), to w badaniu musi zostaç zastosowana w∏aÊciwa kontrola (tj. gleba plus badana

substancja, ale bez substratu roÊlinnego). Dane z takiej kontroli nale˝y uwzgl´dniç w obliczeniach wartoÊci ECx.

2.2. Interpretacja wyników

Je˝eli szacuje si´ wyniki z badania agrochemikaliów, a ró˝nica w iloÊci wytworzonych azotanów pomi´dzy ni˝szà dawkà (tj. maksymalnym przewidywanym st´˝eniem w Êrodowisku) a dawkà stosowanà

w badaniu kontrolnym jest równa lub ni˝sza ni˝ 25 %

w jakimkolwiek czasie pobierania próbki po 28 dniu, to

produkt mo˝e zostaç scharakteryzowany jako niemajàcy d∏ugoterminowego wp∏ywu na przemiany azotu

w glebie. Przy szacowaniu wyników z badaƒ substancji innych ni˝ agrochemikalia stosuje si´ wartoÊci

EC50, EC25 i/lub EC10.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie z badania powinno zawieraç nast´pujàce informacje

Dok∏adna identyfikacja stosowanej gleby

— umiejscowienie geograficzne (d∏ugoÊç, szerokoÊç),

— informacje o historii miejsca (tj. rodzaj roÊlinnoÊci

pokrywajàcej, zastosowane Êrodki ochrony roÊlin,

nawozy, przypadkowe zanieczyszczenia),

— liczba powtórzeƒ,

— zastosowanie gleby (gleba rolnicza, leÊna, itp.),

— metoda stosowana do ekstrakcji azotanów z gleby.

— informacja o tym, ile razy pobierano próbki,

— g∏´bokoÊç pobierania gleby (cm),

Wyniki

— zawartoÊç piasku/i∏u/gliny (% suchej masy),

— wartoÊç pH (w wodzie),

— zawartoÊç w´gla organicznego (% suchej masy),

— zawartoÊç azotu (% suchej masy),

— poczàtkowe st´˝enie azotanów (mg azotanów/kg

suchej masy),

— zdolnoÊç wymiany jonowej (mmol/kg),

— biomasa mikroorganizmów wyra˝ona w procentach ca∏kowitej zawartoÊci w´gla organicznego,

— metody stosowane do oznaczenia ka˝dego parametru,

— wszystkie informacje dotyczàce pobierania i przechowywania próbek,

— szczegó∏y dotyczàce wst´pnej inkubacji gleby.

Badana substancja

— postaç fizyczna i istotne w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne,

— nazwa chemiczna oraz wzór strukturalny, czystoÊç

(tj. dla Êrodków ochrony roÊlin procentowa zawartoÊç substancji aktywnej), zawartoÊç azotu.

Substrat

— êród∏o substratu,

— sk∏ad (tj. lucerna, lucerna — trawa),

— zawartoÊç w´gla i azotu (% suchej masy),

— rozmiar sita (mm).

Warunki badania

— szczegó∏y dotyczàce wzbogacenia gleby substratem organicznym,

— liczba st´˝eƒ badanej substancji i uzasadnienie

wyboru st´˝eƒ,

— szczegó∏y dotyczàce sposobu podania badanej

substancji do gleby,

— temperatura inkubacji,

— wilgotnoÊç gleby na poczàtku i podczas trwania

badania,

— zastosowana metoda inkubacji gleby (ca∏a partia

gleby czy jako seria poszczególnych próbek gleby),

— procedura analityczna i sprz´t stosowany do analizy azotanów,

— dane zawierajàce poszczególne wyniki i wartoÊci

Êrednie pomiarów azotanów w postaci tabeli,

— odchylenia pomi´dzy powtórzeniami w próbkach

nara˝anych i kontrolnych,

— wyjaÊnienia poprawek w obliczeniach, je˝eli konieczne,

— odchylenia w wytwarzaniu azotanów w ka˝dym

czasie pobierania próbek wyra˝one w procentach

lub w postaci wartoÊci EC50 z 95 % przedzia∏ami

ufnoÊci, inne wartoÊci ECx (tj. EC25 lub EC10)

z przedzia∏ami ufnoÊci oraz wykres krzywej zale˝noÊci dawka-odpowiedê,

— statystyczne opracowanie wyników,

— wszystkie informacje i obserwacje pomocne w interpretacji wyników.

4. PIÂMIENNICTWO

1) EPPO (1994). Decision — Making Scheme for the

Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO

Bulletin 24: 1—16, 1994.

2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of

Plant Protection Products, VI, 1—1 (2nd eds., 1990).

3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity

Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances

Control Act Test Guidelines; Proposed Rule. September 28, 1987.

4) SETAC — Europe (1995). Procedures for assessing

the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC — Europe, Brussels.

5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in

Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality — Biological Methods. PN-ISO

14238:2000 JakoÊç gleby — Metody biologiczne —

Oznaczanie mineralizacji azotu i nitryfikacji w glebach oraz wp∏ywu zwiàzków chemicznych na te

procesy.

6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop

on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy,

18—20 January 1995.

7) ISO 10381—6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of

soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. PN-ISO 10381—6:1998

JakoÊç gleby — Pobieranie próbek — Zasady dotyczàce pobierania, post´powania z próbkami

i przechowywania próbek gleby przeznaczonych

do badania tlenowych (aerobowych) procesów

mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych.

8) ISO 14240—1 (1997). Soil quality — Determination

of soil microbial biomass — Part 1: Substrate —

induced respiration method. PN-ISO 14240—

1:2001 JakoÊç gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy

mikroorganizmów w glebie — Metoda indukcji oddychania przez dodanie substratu.

Poz. 2119

9) ISO 14240—2 (1997). Soil quality — Determination

of microbial biomass — Part 2: Fumigation —

extraction method. PN-ISO 14240—2:2001 JakoÊç

gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorganizmów w glebie — Metoda fumigacji — ekstrakcji.

10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified

method of evaluating dose — effect experiments.

Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99—113.

11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.

12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

Za∏àcznik nr 12

C.22. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN W¢GLA

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 217 (2000).

1.1. Wst´p

Niniejsza metoda badawcza opisuje laboratoryjnà

metodyk´ s∏u˝àcà do badania d∏ugoterminowych

wp∏ywów Êrodków ochrony roÊlin i innych substancji

chemicznych, po jednorazowym nara˝eniu, na aktywnoÊç mikroorganizmów glebowych w przemianach

w´gla. Badanie opiera si´ g∏ównie na zaleceniach Europejskiej i Âródziemnomorskiej Organizacji Ochrony

RoÊlin (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Brano równie˝ pod uwag´ inne wytyczne, takie jak niemieckiego

Biologicznego Urz´du Federalnego (zobacz pozycja 2

piÊmiennictwa), amerykaƒskiej Agencji Ochrony Ârodowiska US EPA (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa)

oraz SETAC (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa). Podczas posiedzenia OECD na temat wyboru gleby/osadu

w Belgirate, W∏ochy w 1995 r. (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa), uzgodniono liczb´ i rodzaj gleby, które

mo˝na zastosowaç w badaniach wykonanych wg niniejszej metody. Zalecenia co do pobierania, obróbki

i przechowywania próbek glebowych opierajà si´ na

Dokumencie Przewodnim ISO (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa) oraz na ustaleniach podj´tych podczas

spotkania roboczego w Belgirate.

Podczas okreÊlania i oceny charakterystyki toksykologicznej badanych substancji konieczne mo˝e okazaç si´ oznaczenie ich wp∏ywów na aktywnoÊç mikroorganizmów glebowych, np. gdy wymagane sà dane

dotyczàce potencjalnych skutków ubocznych dzia∏ania

Êrodków ochrony roÊlin na mikroflor´ glebowà lub

gdy spodziewane jest nara˝enie mikroorganizmów

glebowych na substancje chemiczne inne ni˝ Êrodki

ochrony roÊlin. Badanie przemian w´gla wykonuje

si´, aby okreÊliç wp∏ywy takich substancji chemicznych na mikroflor´ glebowà. Podczas badania agrochemikaliów (Êrodki ochrony roÊlin, nawozy, chemikalia stosowane w leÊnictwie) wykonuje si´ zarówno badanie przemian w´gla, jak i badanie przemian azotu.

Przy badaniach innych substancji wystarczajàce jest

badanie przemian azotu. Je˝eli jednak wartoÊç EC50

w badaniu przemian azotu dla takich substancji przyjmuje wartoÊç zawartà w tym samym zakresie jak dla

handlowo dost´pnych inhibitorów nitryfikacji (np. nitrapyrina), to badanie przemian w´gla mo˝e byç wykonane celem zebrania dalszych informacji.

Gleby sk∏adajà si´ z ˝ywych i nieo˝ywionych

sk∏adników, które istniejà w z∏o˝onych i heterogenicznych mieszaninach. Mikroorganizmy wraz z wieloma

gatunkami majàcymi wk∏ad w ró˝ne aspekty u˝yênienia gleby odgrywajà wa˝nà rol´ w rozk∏adzie i przemianach materii organicznej w ˝yznych glebach. D∏ugoterminowe zak∏ócenie tych procesów biochemicznych mo˝e potencjalnie oddzia∏ywaç na krà˝enie

sk∏adników od˝ywczych i poprzez to zmieniaç ˝yznoÊç

gleby. Przemiany w´gla i azotu nast´pujà we wszystkich ˝yznych glebach. Chocia˝ zespo∏y mikroorganizmów odpowiedzialne za te procesy ró˝nià si´ mi´dzy

glebami, to szlaki przemian sà zasadniczo takie same.

Badanie opisane w niniejszej metodzie ma s∏u˝yç

wykrywaniu d∏ugoterminowych szkodliwych wp∏ywów substancji na proces przemiany w´gla w aerobowych glebach powierzchniowych. Niniejsze badanie

jest wra˝liwe na wszelkie zmiany wielkoÊci i aktywnoÊci zespo∏ów mikroorganizmów odpowiedzialnych za

przemiany w´gla, poniewa˝ poddaje te zespo∏y zarówno stresowi chemicznemu, jak i pozbawia je w´gla. Stosowana jest gleba piaszczysta o niskiej zawartoÊci materii organicznej. Do tej gleby dodaje si´ badanà substancj´ i inkubuje w warunkach, które pozwalajà na szybki metabolizm mikroorganizmów.

W takich warunkach êród∏a ∏atwo dost´pnego w´gla

w glebie szybko si´ wyczerpujà. Powoduje to niedobór w´gla, co zarówno zabija komórki mikroorganizmów, jak i indukuje diapauz´ i/lub sporulacj´. Je˝eli

badanie trwa d∏u˝ej ni˝ 28 dni, to suma tych reakcji

mo˝e byç oznaczona w badaniu kontrolnym (gleby

nietraktowane) jako post´pujàca utrata metabolicznie

aktywnej biomasy mikroorganizmów (zobacz pozycja

7 piÊmiennictwa). Je˝eli na biomas´ w glebie obcià˝onej w´glem, w warunkach badania, ma wp∏yw obecnoÊç substancji chemicznej, to mo˝e ona nie powróciç

do tego samego poziomu co w badaniu kontrolnym.

Dlatego zak∏ócenia spowodowane przez badanà substancj´ w jakimkolwiek momencie podczas badania

cz´sto b´dà trwa∏y a˝ do jego zakoƒczenia.

Badanie, z którego wywodzi si´ niniejsza metoda

badawcza, by∏o pierwotnie zaprojektowane dla substancji, których iloÊç w glebie mo˝na by∏o przewidzieç.

Tak jest na przyk∏ad w przypadku Êrodków ochrony roÊlin, dla których znana jest ich iloÊç stosowana w polu.

W przypadku agrochemikaliów wystarczajàce jest badanie dwóch dawek, jakie przewiduje si´ lub przypuszcza, ˝e b´dà stosowane. Agrochemikalia mogà byç badane jako substancje aktywne (s.a.) lub jako gotowe

formy u˝ytkowe. Jednak˝e niniejsze badanie nie ogranicza si´ tylko do substancji chemicznych o mo˝liwym

do przewidzenia st´˝eniu w Êrodowisku. Zmieniajàc

zarówno iloÊç badanej substancji stosowanej do gleby,

jak i sposób opracowania danych, badanie mo˝e byç

równie˝ wykonane w przypadku substancji chemicznych, co do których nie jest znana ich spodziewana

iloÊç w glebie. Dlatego dla substancji innych ni˝ agrochemikalia oznacza si´ wp∏yw serii st´˝eƒ na przemiany w´gla. Dane z tych badaƒ u˝ywane sà do wyznaczenia krzywej zale˝noÊci dawka-odpowiedê i wyliczenia

wartoÊci ECx, gdzie x jest zdefiniowanym % skutku.

1.2. Definicje

Przemiany w´gla: to rozk∏ad przez mikroorganizmy materii organicznej prowadzàcy do wytworzenia

dwutlenku w´gla jako produktu koƒcowego.

ECx (St´˝enie efektywne): jest st´˝eniem badanej

substancji w glebie powodujàcym x procent inhibicji

przemian w´gla do dwutlenku w´gla.

EC50 (Medialne st´˝enie efektywne): jest st´˝eniem badanej substancji w glebie powodujàcym 50 %

inhibicj´ przemian w´gla do dwutlenku w´gla.

1.3. Substancje kontrolne

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Do przesianej gleby dodaje si´ badanà substancj´

lub gleb´ pozostawia si´ bez dodatku badanej substancji (kontrola). Je˝eli badane sà agrochemikalia, to zaleca si´ minimum dwa st´˝enia badanej substancji, które

powinny byç wybrane w odniesieniu do najwy˝szego

st´˝enia, jakie przewiduje si´ w warunkach polowych.

Po 0, 7, 14 i 28 dniach inkubacji próbki gleby z substan-

Poz. 2119

cjà badanà i próbki gleby kontrolnej sà mieszane z glukozà i po kolejnych 12 godzinach oznacza si´ oddychanie indukowane glukozà. Oddychanie jest wyra˝one jako iloÊç uwolnionego dwutlenku w´gla (mg dwutlenku

w´gla/kg suchej masy gleby/godzin´) lub iloÊç zu˝ytego tlenu (mg tlenu/kg gleby/godzin´). Oddychanie

w próbkach z substancjà badanà jest porównywane

z wartoÊcià kontrolnà i oblicza si´ procent odchylenia

wzgl´dem kontroli. Wszystkie badania prowadzone sà

przynajmniej przez 28 dni. Je˝eli w 28 dniu ró˝nica mi´dzy próbkami kontrolnymi i próbkami z substancjà badanà jest równa lub wi´ksza ni˝ 25 %, to pomiary sà

kontynuowane w odst´pach 14-dniowych do maksymalnie 100 dni. Je˝eli badane sà substancje inne ni˝

agrochemikalia, to do próbek gleby dodaje si´ substancj´ w st´˝eniach stanowiàcych seri´, a oddychanie indukowane glukozà (tj. Êrednie iloÊci wytworzonego

dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu) oznacza si´ po

28 dniach inkubacji. Wyniki badaƒ z wieloma st´˝eniami analizowane sà przy pomocy modelu regresji. Wyliczane sà wartoÊci ECx (np.: EC50, EC25 i/lub EC10).

1.5. WiarygodnoÊç badania

Szacowanie wyników badania dla agrochemikaliów opiera si´ na stosunkowo ma∏ych ró˝nicach

(tj. Êrednia wartoÊç ±25 %) pomi´dzy uwolnionym

dwutlenkiem w´gla lub zu˝ytym tlenem w kontroli

i próbkach badanych, wi´c du˝e odchylenia w kontroli mogà prowadziç do fa∏szywych wyników. Dlatego

zmiennoÊç pomi´dzy powtórzeniami w kontroli powinna wynosiç mniej ni˝ ±15 %.

1.6. Opis metody badawczej

1.6.1. Wyposa˝enie

W badaniu stosuje si´ naczynia testowe wykonane

z oboj´tnego chemicznie materia∏u. Powinny byç one

odpowiedniej wielkoÊci w zale˝noÊci od zastosowanej

procedury inkubacji gleb, tj. inkubacji ca∏ej partii gleby lub jako seria poszczególnych próbek glebowych

(zobacz pkt 1.7.1.2). Nale˝y poczyniç starania, by zminimalizowaç straty wody z jednej strony, a z drugiej by

umo˝liwiç wymian´ gazowà podczas badania (np. naczynia stosowane w badaniu mogà byç nakryte perforowanà folià polietylenowà). Gdy badane sà substancje lotne, powinny byç stosowane szczelne i nieprzepuszczalne dla gazu naczynia. Powinny one mieç takie

rozmiary, by próbka gleby wype∏nia∏a w przybli˝eniu

jednà czwartà ich obj´toÊci.

Do oznaczenia oddychania indukowanego glukozà

wymagane sà uk∏ady inkubacyjne oraz urzàdzenia do

pomiarów wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu. Przyk∏ady takich uk∏adów i urzàdzeƒ sà opisane w pozycji 8, 9, 10, 11 piÊmiennictwa.

1.6.2. Wybór i liczba gleb

Stosowana jest gleba jednego rodzaju. Zalecana

charakterystyka gleby jest nast´pujàca

— zawartoÊç piasku: nie mniej ni˝ 50 % i nie wi´cej

ni˝ 75 %,

— wartoÊç pH: 5,5—7,5,

— zawartoÊç w´gla organicznego: 0,5—1,5 %,

— biomasa mikroorganizmów powinna byç oznaczona (zobacz pozycje 12 i 13 piÊmiennictwa), a zawartoÊç w´gla powinna stanowiç przynajmniej

1 % ca∏kowitego w´gla organicznego gleby.

Gleba o takich w∏aÊciwoÊciach jest najbardziej niekorzystnym przypadkiem, poniewa˝ adsorpcja badanej substancji jest minimalna, a jej dost´pnoÊç dla mikroflory maksymalna. Dlatego badania z innymi glebami ogólnie sà niepotrzebne. Jednak˝e w pewnych

okolicznoÊciach, np. gdy przewidywane zastosowanie

badanej substancji b´dzie mia∏o miejsce na szczególnych glebach, takich jak kwaÊne gleby leÊne lub

w przypadku substancji chemicznych na∏adowanych

elektrostatycznie, konieczne mo˝e si´ okazaç zastosowanie dodatkowej gleby.

1.6.3. Pobieranie i przechowywanie próbek gleby

1.6.3.1. Pobieranie próbek gleby

Dost´pne powinny byç szczegó∏owe informacje

dotyczàce historii miejsca, z którego pobierana jest

gleba do badaƒ. Podaç nale˝y dok∏adne miejsce, rodzaj roÊlinnoÊci pokrywajàcej, daty zastosowania Êrodków ochrony roÊlin, zastosowanie nawozów organicznych i nieorganicznych, dodatki materia∏ów biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia. Miejsce,

z którego pobiera si´ próby gleby do badaƒ, powinno

byç tak dobrane, by umo˝liwiç d∏ugoterminowe jego

u˝ycie. Odpowiednie sà pastwiska stale wypasane, pola uprawne z jednorocznymi uprawami zbó˝ (z wyjàtkiem kukurydzy) lub g´sto zasiane zielone ∏àki. Miejsce

wybrane do pobierania próbek nie powinno byç podawane zabiegom z u˝yciem Êrodków ochrony roÊlin

przez minimum jeden rok przed pobraniem próbek.

Ponadto przez przynajmniej szeÊç miesi´cy przed pobieraniem prób nie powinno stosowaç si´ ˝adnego nawozu organicznego. Zastosowanie nawozu mineralnego jest mo˝liwe tylko w przypadku wymagania tego

przez roÊliny uprawne, a próbki gleby nie powinny byç

pobierane wczeÊniej ni˝ trzy miesiàce po zastosowaniu

nawozu. Nale˝y unikaç stosowania gleb, na których

stosowano nawozy o znanych skutkach dzia∏ania biobójczego (np. cyjanamid wapnia).

Nale˝y unikaç pobierania próbek podczas lub tu˝

po d∏ugich okresach suszy (wi´ksze ni˝ 30 dni) lub

sp∏ywów wody. W przypadku gleb ornych próbki nale˝y pobieraç z g∏´bokoÊci 0 do 20 cm. W przypadku ∏àk

(pastwisk) lub innych gleb, gdzie orka nie by∏a przeprowadzana przez d∏ugie okresy (przynajmniej jeden

sezon), maksymalna g∏´bokoÊç pobierania próbek

mo˝e wynosiç nieco wi´cej ni˝ 20 cm (np. do 25 cm).

Próbki gleby powinny byç transportowane w pojemnikach i temperaturze, które gwarantujà, ˝e pierwotne

w∏aÊciwoÊci gleby nie zostanà znaczàco zmienione.

Poz. 2119

unikni´cie przechowywania w laboratorium, to gleby

mogà byç przechowywane w ciemnoÊci w temperaturze 4±2 °C przez maksimum trzy miesiàce. Podczas

przechowywania gleby nale˝y zapewniç warunki tlenowe. Je˝eli gleby pobiera si´ z miejsc, gdzie sà one

zamarzni´te przez przynajmniej trzy miesiàce w roku,

to mo˝na rozwa˝yç przechowywanie ich próbek przez

szeÊç miesi´cy w temperaturze –18 °C. Biomas´ mikroorganizmów w przechowywanych glebach oznacza

si´ przed ka˝dym doÊwiadczeniem. W´giel w biomasie powinien stanowiç przynajmniej 1 % ca∏kowitego

w´gla organicznego (zobacz pkt 1.6.2).

1.6.4. Obróbka i przygotowanie gleby przed badaniem

1.6.4.1. Inkubacja wst´pna

Je˝eli gleba by∏a przechowywana (zobacz

pkt 1.6.4.2 i pkt 1.7.1.3), zaleca si´ inkubacj´ wst´pnà

przez odpowiedni okres wynoszàcy od 2 do 28 dni.

Temperatura i wilgotnoÊç gleby podczas inkubacji

wst´pnej powinny byç podobne do tych stosowanych

w badaniu (zobacz pkt 1.6.4.2 i pkt 1.7.1.3).

1.6.4.2. Parametry fizykochemiczne

Gleb´ oczyszcza si´ r´cznie z du˝ych zanieczyszczeƒ (np. kamieni, cz´Êci roÊlin) i nast´pnie przesiewa

do czàstek o rozmiarach równych lub mniejszych ni˝

2 mm. WilgotnoÊç gleby powinna byç dostosowana

za pomocà wody destylowanej lub dejonizowanej do

wartoÊci pomi´dzy 40 i 60 % maksymalnej pojemnoÊci wodnej.

1.6.5. Przygotowanie badanej substancji w celu dodania do gleby

Badanà substancj´ podaje si´ z noÊnikiem. NoÊnikiem mo˝e byç woda (dla substancji rozpuszczalnych

w wodzie) lub oboj´tna sta∏a substancja, taka jak drobny piasek kwarcowy (rozmiar czàstek: 0,1—0,5 mm).

Nale˝y unikaç stosowania p∏ynnych noÊników innych

ni˝ woda (np. rozpuszczalniki organiczne, takie jak

aceton, chloroform), poniewa˝ mogà one zniszczyç

mikroflor´. Je˝eli jako noÊnik stosuje si´ piasek, to

mo˝e on zawieraç badanà substancj´ rozpuszczonà

lub zawieszonà w odpowiednim rozpuszczalniku.

W takich przypadkach rozpuszczalnik powinien byç

usuni´ty przez odparowanie przed wymieszaniem

z glebà. Dla równomiernego rozprowadzenia badanej

substancji w glebie zaleca si´ stosowanie 10 g piasku

na kilogram gleby (sucha masa). Do próbek kontrolnych dodaje si´ takà samà iloÊç wody i/lub piasku.

Badajàc substancje lotne, nale˝y na tyle, na ile to

mo˝liwe unikaç strat podczas ich wprowadzania,

a tak˝e nale˝y poczyniç starania, by w sposób jednorodny rozprowadziç substancj´ w glebie (np. substancja powinna zostaç podana do gleby w kilku miejscach).

1.6.3.2. Przechowywanie próbek gleby

1.6.6. St´˝enia substancji badanej

Najbardziej w∏aÊciwe jest stosowanie gleby Êwie˝o pobranej z pola. Je˝eli jednak nie ma sposobu na

Je˝eli badane sà agrochemikalia lub inne substancje chemiczne o mo˝liwym do przewidzenia st´˝eniu

w Êrodowisku, to powinny byç zastosowane przynajmniej dwa st´˝enia. Ni˝sze st´˝enie powinno odpowiadaç przynajmniej maksymalnej iloÊci spodziewanej w glebie w warunkach praktycznych, natomiast

wy˝sze st´˝enie powinno byç wielokrotnoÊcià st´˝enia ni˝szego. St´˝enia badanej substancji dodanej do

gleby oblicza si´ przy za∏o˝eniu jednorodnego rozmieszczenia do g∏´bokoÊci 5 cm i g´stoÊci gleby równej 1,5. W przypadku agrochemikaliów stosowanych

bezpoÊrednio do gleby lub substancji chemicznych,

których iloÊç w glebie mo˝na przewidzieç, zalecane

badane st´˝enia to maksymalne Przewidywane St´˝enie w Ârodowisku (PEC) i jego pi´ciokrotnoÊç. W przypadku substancji, które stosuje si´ kilkakrotnie w czasie sezonu, badane st´˝enia wyznacza si´, mno˝àc

PEC przez maksymalnà przewidywanà liczb´ zastosowaƒ. Jednak˝e najwy˝sze stosowane st´˝enie nie powinno przekraczaç dziesi´ciokrotnoÊci maksymalnej

jednorazowo zastosowanej dawki.

Je˝eli badane sà substancje inne ni˝ agrochemikalia, nale˝y stosowaç geometrycznà seri´ pi´ciu st´˝eƒ.

Badane st´˝enia powinny obejmowaç zakres konieczny do wyznaczenia wartoÊci ECx.

1.7. Wykonanie badania

1.7.1. Warunki nara˝enia

1.7.1.1. St´˝enia substancji badanej i kontrola

Je˝eli badane sà agrochemikalia, badanà próbk´

gleby dzieli si´ na trzy cz´Êci o równej masie. Dwie

cz´Êci miesza si´ z noÊnikiem zawierajàcym badany

produkt, a trzecià cz´Êç z noÊnikiem bez badanego

produktu (kontrola). Zaleca si´ stosowanie minimum

trzech powtórzeƒ dla st´˝eƒ i kontroli. W przypadku

badania substancji innych ni˝ agrochemikalia gleb´

dzieli si´ na szeÊç cz´Êci o równej masie. Pi´ç z nich

miesza si´ z noÊnikiem zawierajàcym badanà substancj´, a szóstà z noÊnikiem bez badanej substancji. Zarówno dla kontroli, jak i badanych serii st´˝eƒ zaleca

si´ prowadzenie trzech powtórzeƒ. Nale˝y podjàç

wszelkie starania w celu zapewnienia jednorodnego

rozprowadzenia badanej substancji w próbkach gleby.

Podczas mieszania nale˝y unikaç ubijania i zgniatania

gleby.

1.7.1.2. Inkubacja próbek glebowych

Inkubacja próbek glebowych mo˝e byç przeprowadzona na dwa sposoby: ca∏ej partii gleby z badanà

substancjà i gleby kontrolnej lub z wykorzystaniem

równych cz´Êci poszczególnych próbek gleby kontrolnej i z badanà substancjà. Je˝eli badane sà substancje

lotne, to badania nale˝y prowadziç z serià poszczególnych próbek. Je˝eli inkubuje si´ ca∏e partie gleby, to

nale˝y przygotowaç du˝à iloÊç próbek kontrolnych

i z badanà substancjà, ˝eby podczas badania pobieraç

z nich ma∏e próbki do analizy. WyjÊciowa masa przygotowanej gleby pierwotnej i w st´˝eniach zale˝y od

rozmiaru próbek pobieranych do analizy, liczby zastosowanych powtórzeƒ w analizie oraz przewidywanej

maksymalnej krotnoÊci pobierania. Gleby inkubowane w ca∏oÊci przed pobieraniem próbek do analizy po-

Poz. 2119

winny zostaç dobrze wymieszane. Je˝eli gleby sà inkubowane jako poszczególne próbki, to ka˝da z nich,

zarówno kontrolna, jak i z badanà substancjà dzielona

jest na wymaganà liczb´ mniejszych próbek i te sà wykorzystywane wed∏ug potrzeby. W doÊwiadczeniach

gdzie przewiduje si´ wi´cej ni˝ dwa pobrania próbek

do analizy, mniejsze próbki powinny byç przygotowane w iloÊci wystarczajàcej dla wszystkich powtórzeƒ

we wszystkich punktach czasowych pobierania próbek. Powinny byç inkubowane przynajmniej trzy powtórzenia badanej gleby w warunkach tlenowych (zobacz pkt 1.7.1.1). Podczas wszystkich badaƒ stosowane powinny byç odpowiednie pojemniki o powierzchni pozwalajàcej na unikni´cie rozwoju warunków beztlenowych. Je˝eli badane sà substancje lotne, badania

nale˝y prowadziç z serià poszczególnych próbek.

1.7.1.3. Warunki i czas trwania badania

Badanie jest wykonywane w ciemnoÊci w temperaturze pokojowej 20±2 °C. WilgotnoÊç próbek gleby

powinna byç utrzymywana w czasie badania pomi´dzy 40 % a 60 % maksymalnej pojemnoÊci wodnej

gleby (zobacz pkt 1.6.4.2) z odchyleniem ±5 %. W miar´ potrzeby mo˝na dodaç wod´ destylowanà lub dejonizowanà.

Minimalny czas trwania badania wynosi 28 dni.

Je˝eli badane sà agrochemikalia, to porównywane sà

iloÊci uwolnionego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu w próbkach kontrolnych i z badanà substancjà. Je˝eli w 28 dniu ró˝nià si´ one o wi´cej ni˝ 25 %, to badanie jest kontynuowane, a˝ osiàgnie si´ ró˝nic´ równà lub mniejszà ni˝ 25 % lub przez maksimum 100 dni

w zale˝noÊci od tego, co nastàpi wczeÊniej. Dla substancji innych ni˝ agrochemikalia badanie koƒczy si´

po 28 dniach. Po 28 dniach w próbkach kontrolnych

i gleby z badanà substancjà oznacza si´ iloÊç uwolnionego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu i oblicza

wartoÊci ECx.

1.7.2. Pobieranie próbek i analiza gleb

1.7.2.1. Terminy pobierania próbek gleby

Je˝eli bada si´ agrochemikalia, to próbki gleby do

analizy oddychania indukowanego glukozà pobiera

si´ w 0, 7, 14 i 28 dniu. Je˝eli konieczne jest przed∏u˝enie badania, dalsze pomiary powinny byç wykonywane w odst´pach 14-dniowych po 28 dniu.

Je˝eli bada si´ substancje inne ni˝ agrochemikalia

to nale˝y stosowaç przynajmniej pi´ç st´˝eƒ, a oddychanie indukowane glukozà w próbkach glebowych

oznacza si´ na poczàtku (dzieƒ 0) i na koniec okresu

nara˝enia (28 dzieƒ). Dodatkowy pomiar np. w 7 dniu

mo˝e byç równie˝ wykonany, je˝eli zostanie to uznane

za konieczne. Dane otrzymane 28 dnia sà u˝ywane do

wyznaczenia wartoÊci ECx dla substancji chemicznej.

Je˝eli jest to wymagane, to dane z próbek kontrolnych

z dnia 0 mogà zostaç wykorzystane do podania poczàtkowej iloÊci metabolicznie aktywnej biomasy mikroorganizmów w glebie (zobacz pozycja 12 piÊmiennictwa).

1.7.2.2. Oznaczanie oddychania indukowanego glukozà

Oddychanie indukowane glukozà w ka˝dym powtórzeniu próbek z badanà substancjà i kontroli oznacza si´ za ka˝dym razem podczas pobierania próbek.

Próbki gleby miesza si´ z odpowiednià iloÊcià glukozy,

by wywo∏aç natychmiastowà maksymalnà reakcj´ oddychania. IloÊç glukozy potrzebna do wywo∏ania maksymalnej reakcji oddychania dla danej gleby mo˝e byç

oznaczona w badaniu wst´pnym przy zastosowaniu

serii st´˝eƒ glukozy (zobacz pozycja 14 piÊmiennictwa). Zazwyczaj iloÊcià wystarczajàcà w przypadku

gleby piaszczystej o 0,5—1,5 % zawartoÊci w´gla organicznego jest 2000 mg do 4000 mg glukozy na kg

suchej masy gleby. Glukoza mo˝e byç zmielona do postaci proszku z czystym piaskiem kwarcowym

(10 g piasku/kg suchej masy gleby) i w sposób jednorodny wymieszana z glebà.

Poz. 2119

cedur (zobacz pozycje 15, 16 i 17 piÊmiennictwa) dla

obliczonych wartoÊci ECx wyznacza si´ tak˝e przedzia∏y ufnoÊci (p=0,95).

2.2. Interpretacja wyników

Je˝eli szacuje si´ wyniki z badania agrochemikaliów, a ró˝nica w oddychaniu pomi´dzy ni˝szà dawkà

(tj. maksymalnym przewidywanym st´˝eniem w Êrodowisku) a kontrolà jest równa lub ni˝sza ni˝ 25 %

w jakimkolwiek czasie pobierania próbki po 28 dniu, to

produkt mo˝e zostaç scharakteryzowany jako niemajàcy d∏ugoterminowego wp∏ywu na przemiany w´gla

w glebie. Przy szacowaniu wyników z badaƒ substancji innych ni˝ agrochemikalia stosuje si´ wartoÊci

EC50, EC25 i/lub EC10.

3. SPRAWOZDANIE

Próbki gleby z dodanà glukozà sà inkubowane

w odpowiednim urzàdzeniu do ciàg∏ego pomiaru oddychania, co godzin´ lub co dwie godziny (zobacz

pkt 1.6.1) w temperaturze 20±2 °C. Przez kolejnych

12 godzin oznacza si´ iloÊç wytworzonego dwutlenku

w´gla lub zu˝ytego tlenu, a pomiary powinny zaczàç

si´ jak najwczeÊniej, tj. w ciàgu 1 do 2 godzin po dodaniu glukozy. Podczas 12 godzin mierzy si´ ca∏kowite iloÊci wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego

tlenu i oznacza si´ Êrednià wartoÊç oddychania.

Sprawozdanie z badania powinno zawieraç nast´pujàce informacje

2. WYNIKI

— zastosowanie gleby (gleba rolnicza, leÊna itp.),

2.1. Obliczanie wyników

— g∏´bokoÊç pobierania gleby (cm),

Je˝eli badanie wykonuje si´ z agrochemikaliami,

to iloÊç wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego

tlenu w ka˝dej próbce powinna byç zapisana, a Êrednie wartoÊci ze wszystkich powtórzeƒ powinny zostaç

zestawione w formie tabeli. Wyniki powinny zostaç

oszacowane za pomocà odpowiedniej i ogólnie uznanej metody statystycznej (np. test F, poziom istotnoÊci

5 %). Oddychanie indukowane glukozà wyra˝a si´

w mg dwutlenku w´gla/kg suchej masy gleby/godzin´

lub w mg tlenu/kg suchej masy gleby/godzin´. Ârednià iloÊç wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu w ka˝dym st´˝eniu porównuje si´ z iloÊcià

w glebie kontrolnej i oblicza si´ procent odchylenia

wzgl´dem kontroli.

— zawartoÊç piasku/i∏u/gliny (% suchej masy),

Je˝eli badanie wykonywane jest dla substancji innych ni˝ agrochemikalia, to okreÊla si´ iloÊç wytworzonego dwutlenku w´gla lub zu˝ytego tlenu w ka˝dym powtórzeniu i dla oszacowania wartoÊci ECx wyznacza si´ krzywà zale˝noÊci dawka-odpowiedê. Oddychanie indukowane glukozà (tj. mg dwutlenku w´gla/kg suchej masy gleby/godzin´ lub w mg tlenu/kg

suchej masy gleby/godzin´) oznaczone w próbkach

z badanà substancjà po 28 dniach jest porównywane

z kontrolà. Z tych danych oblicza si´ procent inhibicji

dla ka˝dego st´˝enia. WartoÊci wyra˝one w procentach nale˝y korelowaç z odpowiednimi st´˝eniami.

Procedury statystyczne powinny umo˝liwiç obliczenie

wartoÊci ECx. Przy zastosowaniu standardowych pro-

Dok∏adna identyfikacja stosowanej gleby

— umiejscowienie geograficzne (d∏ugoÊç, szerokoÊç),

— informacje o historii miejsca (tj. rodzaj roÊlinnoÊci

pokrywajàcej, zastosowane Êrodki ochrony roÊlin,

nawozy, przypadkowe zanieczyszczenia itp.),

— wartoÊç pH (w wodzie),

— zawartoÊç w´gla organicznego (% suchej masy),

— zawartoÊç azotu (% suchej masy),

— poczàtkowe st´˝enie azotanów (mg azotanów/kg

suchej masy),

— zdolnoÊç wymiany jonowej (mmol/kg),

— biomasa mikroorganizmów wyra˝ona w procentach ca∏kowitej zawartoÊci w´gla organicznego,

— metody stosowane do oznaczenia ka˝dego parametru,

— wszystkie informacje dotyczàce pobierania i przechowywania próbek,

— szczegó∏y dotyczàce wst´pnej inkubacji gleby.

Badana substancja

— postaç fizyczna i istotne w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne,

— nazwa chemiczna oraz wzór strukturalny, czystoÊç

(tj. dla Êrodków ochrony roÊlin procent substancji

aktywnej), zawartoÊç azotu.

Warunki badania

— szczegó∏y dotyczàce wzbogacenia gleby substratem organicznym,

— liczba st´˝eƒ badanej substancji i uzasadnienie

wyboru st´˝eƒ,

— szczegó∏y dotyczàce podania badanej substancji

do gleby,

— temperatura inkubacji,

— wilgotnoÊç gleby na poczàtku i podczas trwania

badania,

— zastosowana metoda inkubacji gleby (ca∏a partia

gleby, czy jako seria poszczególnych próbek gleby),

— informacja o tym, ile razy pobierano próbki,

— czas pobrania próbek.

Wyniki

— metoda i sprz´t stosowany do pomiarów respiracji,

— dane zawierajàce poszczególne wyniki i wartoÊci

Êrednie pomiarów dwutlenku w´gla lub tlenu

w formie tabel,

— odchylenia pomi´dzy powtórzeniami w próbkach

z badanà substancjà i kontrolnych,

— wyjaÊnienia poprawek w obliczeniach, je˝eli by∏y

konieczne,

— odchylenia w oddychaniu indukowanym glukozà

w ka˝dym czasie pobierania próbek wyra˝one

w procentach lub w postaci wartoÊci EC50 z 95 %

przedzia∏ami ufnoÊci, inne wartoÊci ECx (tj. EC25

lub EC10) z przedzia∏ami ufnoÊci oraz wykres krzywej zale˝noÊci dawka-odpowiedê,

— statystyczne opracowanie wyników, je˝eli jest konieczne,

— wszystkie informacje i obserwacje pomocne w interpretacji wyników.

4. PIÂMIENNICTWO

1) EPPO (1994). Decision — Making Scheme for the

Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO

Bulletin 24: 1—16, 1994.

Poz. 2119

4) SETAC — Europe (1995). Procedures for assessing

the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC — Europe, Brussels.

5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop

on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy,

18—20 January 1995.

6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of

soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. PN-ISO 10381-6:1998 JakoÊç gleby — Pobieranie próbek — Zasady dotyczàce pobierania, post´powania z próbkami i przechowywania próbek gleby przeznaczonych do badania tlenowych (aerobowych) procesów mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych.

7) Anderson J. P. E. (1987). Handling and Storage of

Soils for Pesticides Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora”. Eds. L. Somerville and

M. P. Greaves, Chap. 3: 45—60.

8) Anderson J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. Agronomy Monograph

N° 9. Eds. A. L. Page, R.H. Miller and D. R. Keeney.

41: 831—871.

9) ISO 11266-1 (1993). Soil Quality — Guidance on

Laboratory Tests for Biodegradation in Soil

Part 1. Aerobic Conditions. PN-ISO 11266:1997 JakoÊç gleby — Zasady prowadzenia badaƒ laboratoryjnych nad biodegradacjà zwiàzków organicznych w glebie w warunkach tlenowych.

10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory incubation systems for measuring mineralisations

of organic chemicals in soil under aerobic conditions. PN-ISO 14239:2000 JakoÊç gleby — Laboratoryjne metody inkubacji do pomiaru mineralizacji zwiàzków organicznych w glebie w warunkach

tlenowych.

11) Heinemeyer O., Insam H., Kaiser E. A. and Walenzik G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116

77—81.

12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination

of soil microbial biomass — Part 1: Substrate —

induced respiration method. PN-ISO 14240-1:2001

JakoÊç gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorganizmów w glebie — Metoda indukcji oddychania przez dodanie substratu.

2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of

Plant Protection Products, VI, 1—1 (2nd eds., 1990).

13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination

of microbial biomass — Part 2: Fumigation —

extraction method. PN-ISO 14240-2:2001 JakoÊç

gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorganizmów w glebie — Metoda fumigacji — ekstrakcji.

3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity

Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances

Control Act Test Guidelines; Proposed Rule. September 28, 1987.

14) Malkomes H.P. (1986). Einfluß von Glukosemenge

auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden

Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am

Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount

of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113—120.

ments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96,

99—113.

16) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose — effect experi-

17) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

Za∏àcznik nr 13

C.23. PRZEMIANY TLENOWE I BEZTLENOWE W GLEBIE

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 307 (2002).

1.1. Wst´p

Niniejsza metoda badawcza opiera si´ na istniejàcych wytycznych (zobacz pozycje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 i 9

piÊmiennictwa). Badanie wykonane wg niniejszej metody ma na celu oszacowanie tlenowych i beztlenowych przemian substancji chemicznych w glebie. DoÊwiadczenie wykonuje si´, aby okreÊliç (i) stopieƒ

przemian badanej substancji i (ii) rodzaj i iloÊci powstajàcych i ulegajàcych rozk∏adowi produktów przemian, na które mogà byç nara˝one organizmy glebowe i roÊliny. Takie badania sà wymagane dla substancji chemicznych bezpoÊrednio stosowanych do gleby

lub dla tych, które z du˝ym prawdopodobieƒstwem

osiàgnà Êrodowisko glebowe. Wyniki takich badaƒ laboratoryjnych mogà byç tak˝e wykorzystane przy

opracowywaniu metod pobierania próbek i ich analizy w badaniach polowych.

Badania tlenowe i beztlenowe przeprowadzane na

jednym rodzaju gleby sà na ogó∏ wystarczajàce do

oszacowania szlaków przemian (zobacz pozycje 8, 10

i 11 piÊmiennictwa). Stopieƒ przemian powinien byç

oszacowany przynajmniej w trzech rodzajach gleb (zobacz pozycje 8 i 10 piÊmiennictwa).

Na Warsztatach OECD dotyczàcych wyboru gleb

i osadów, które odbywa∏y si´ we W∏oszech, Belgirate

w 1995 r. (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa), uzgodniono liczb´ i rodzaje gleb, które mogà byç stosowane

w badaniu. Rodzaje badanych gleb powinny byç reprezentatywne dla regionu, w którym nastàpi zastosowanie lub uwolnienie substancji. Na przyk∏ad substancje, które b´dà stosowane w regionach tropikalnych i subtropikalnych, powinny byç badane na glebach typu Ferrasol i Nitosol (wed∏ug klasyfikacji FAO).

Na Warsztatach podj´to tak˝e zalecenia w zakresie pobierania, opracowania i przechowywania próbek glebowych na bazie Wytycznych ISO (zobacz pozycja 15

piÊmiennictwa). W metodzie uwzgl´dnia si´ tak˝e stosowanie gleb spod upraw ry˝owych.

1.2. Definicje

Badana substancja: ka˝da substancja, w tym zwiàzek wyjÊciowy i odpowiednie produkty przemian.

Produkty przemian: wszystkie substancje pochodzàce z reakcji przemian biotycznych lub abiotycznych

badanej substancji, w tym CO2 i produkty, które sà

w zwiàzanych pozosta∏oÊciach.

Zwiàzane pozosta∏oÊci: „Zwiàzane pozosta∏oÊci”

stanowià zwiàzki w glebie, roÊlinie lub zwierz´ciu, które trwajà w matrycy w postaci zwiàzku wyjÊciowego

lub jego metabolitów/produktów przemian po ekstrakcji. Metoda ekstrakcji nie powinna znaczàco zmieniaç

samych zwiàzków lub struktury matrycy. Sposób wiàzania mo˝e byç cz´Êciowo wyjaÊniony przez zmian´

sposobu ekstrakcji z matrycy lub wyspecjalizowane

techniki analityczne. W taki sposób zidentyfikowano

na przyk∏ad wiàzania kowalencyjne jonowe i sorpcyjne, a tak˝e „pu∏apki”. Ogólnie tworzenie zwiàzanych

pozosta∏oÊci redukuje znaczàco biodost´pnoÊç i bioprzyst´pnoÊç (zobacz pozycja 12 piÊmiennictwa)

[zmodyfikowane wed∏ug IUPAC 1984 r. (zobacz pozycja 13 piÊmiennictwa)].

Przemiany tlenowe: reakcje zachodzàce w obecnoÊci tlenu czàsteczkowego (zobacz pozycja 14 piÊmiennictwa).

Przemiany beztlenowe: reakcje zachodzàce pod

nieobecnoÊç tlenu czàsteczkowego (zobacz pozycja 14

piÊmiennictwa).

Gleba: jest mieszaninà mineralnych i chemicznych

organicznych sk∏adników, przy czym te drugie sk∏adajà si´ ze zwiàzków o wysokiej zawartoÊci w´gla i azotu i o du˝ych masach czàsteczkowych, o˝ywionych

przez ma∏e (najcz´Êciej mikro-) organizmy. Gleby mogà znajdowaç si´ w dwóch stanach

a) niewzruszony, czyli tak jak gleba rozwija∏a si´

w czasie z charakterystycznymi pow∏okami ró˝nych jej rodzajów,

b) wzruszony, czyli taki, który dotyczy gleb uprawianych lub wtedy gdy pobiera si´ próbki przez wykopywanie i stosuje w niniejszej metodzie (zobacz

pozycja 14 piÊmiennictwa).

Mineralizacja: jest pe∏nym rozk∏adem zwiàzku organicznego do CO2 i H2O w warunkach tlenowych

oraz CH4, CO2 i H2O w warunkach beztlenowych.

W kontekÊcie niniejszej metody gdy stosuje si´ zwiàzek znakowany 14C, mineralizacja oznacza rozk∏ad,

podczas którego znakowany atom w´gla jest utleniany z uwolnieniem odpowiedniej iloÊci 14CO2 (zobacz

pozycja 14 piÊmiennictwa).

Okres pó∏rozk∏adu: t0,5, jest czasem potrzebnym

na zajÊcie 50 % przemian badanej substancji, je˝eli

przemiany mo˝na opisaç kinetykà pierwszego rz´du;

czas ten nie zale˝y od st´˝enia.

DT50 (Okres Zanikania 50): jest czasem, w którym

st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o 50 %;

jest inne od okresu pó∏rozpadu t0,5, gdy przemiany nie

nast´pujà wed∏ug kinetyki pierwszego rz´du.

DT75 (Okres Zanikania 75): jest czasem, w którym

st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o 75 %.

DT90 (Okres Zanikania 90): jest czasem, w którym

st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o 90 %.

Poz. 2119

a) rozpuszczalnoÊç w wodzie (wg Metody A.6),

b) rozpuszczalnoÊç w rozpuszczalnikach organicznych,

c) pr´˝noÊç par (wg metody A.4) i sta∏a Henry’ego,

d) wspó∏czynnik podzia∏u n-oktanol/woda (wg metody A.8),

e) trwa∏oÊç chemiczna w ciemnoÊci (hydroliza)

(wg metody C.7),

f) wartoÊç pKa, je˝eli substancja jest podatna na

protonowanie lub deprotonowanie [Wytyczna

OECD nr 112] (zobacz pozycja 16 piÊmiennictwa).

Inne u˝yteczne informacje to dane o toksycznoÊci

badanej substancji dla mikroorganizmów glebowych

[wg metod badawczych C.21 i C.22], zobacz pozycja 16

pismiennictwa.

1.3. Substancje kontrolne

Substancje kontrolne powinny byç stosowane

w celu charakteryzacji i/lub identyfikacji produktów

przemian metodami spektroskopowymi lub chromatograficznymi.

Dost´pne powinny byç metody analityczne (w tym

metody ekstrakcji i oczyszczania) dla iloÊciowego

oznaczania i identyfikacji badanej substancji i jej produktów przemian.

1.6. Zasada metody badawczej

1.4. Zastosowanie badania

Metoda ma zastosowanie dla wszystkich substancji chemicznych (nieznakowanych lub znakowanych),

dla których istnieje metoda analityczna o odpowiedniej czu∏oÊci i dok∏adnoÊci. Badanie stosuje si´ dla

zwiàzków o niewielkiej lotnoÊci, nielotnych, rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w wodzie. Badania nie

nale˝y wykonywaç dla substancji o wysokiej lotnoÊci

z gleby (np.: fumiganty, rozpuszczalniki organiczne),

których nie mo˝na utrzymaç w glebie w warunkach

doÊwiadczalnych badania.

1.5. Informacje o badanej substancji

Dla pomiaru stopnia przemian stosowaç mo˝na

substancje znakowane i nieznakowane. Materia∏ znakowany jest wymagany do badania szlaków przemian

i ustalania bilansu masy. Zalecane jest znakowanie

14C, ale zastosowanie innych izotopów, takich jak 13C,

15N, 3H, 32P, tak˝e mo˝e byç u˝yteczne.

Na tyle, na ile to mo˝liwe, znacznik powinien byç

umiejscowiony w najbardziej stabilnej cz´Êci czàsteczki11. CzystoÊç badanej substancji powinna wynosiç

przynajmniej 95 %.

Przed wykonaniem badania przemian tlenowych

i beztlenowych w glebie na temat badanej substancji

powinny byç dost´pne nast´pujàce informacje

———————

11 Na przyk∏ad je˝eli badana substancja zawiera jeden pierÊcieƒ, wymagane jest znakowanie w tym pierÊcieniu; je˝eli badana substancja zawiera dwa lub wi´cej pierÊcieni,

to konieczne mogà okazaç si´ dodatkowe badania celem

okreÊlenia losu ka˝dego znakowanego pierÊcienia, aby

uzyskaç odpowiednie informacje o tworzeniu produktów

przemian.

Próbki gleby poddaje si´ dzia∏aniu badanej substancji i inkubuje w ciemnoÊci w kolbkach biometrycznych lub w systemach przep∏ywowych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (w sta∏ej temperaturze i wilgotnoÊci gleby). Po odpowiednich odst´pach

czasowych próbki gleby poddaje si´ procesowi ekstrakcji i oznacza si´ substancj´ wyjÊciowà i produkty

przemian. Produkty lotne zbiera si´ do analizy przy

u˝yciu odpowiednich urzàdzeƒ absorpcyjnych. Stosujàc materia∏ znakowany 14C, mo˝na zmierzyç ró˝ne

stopnie mineralizacji badanej substancji przez zwiàzanie uwolnionego 14CO2 i bilans masy, w tym tworzenie zwiàzanych pozosta∏oÊci.

1.7. Kryteria jakoÊci

1.7.1. Odzysk

Ekstrakcja i analiza przynajmniej podwójnych próbek gleby tu˝ po dodaniu badanej substancji do gleby

daje pierwsze wskazówki co do powtarzalnoÊci metody analitycznej i jednorodnoÊci zaaplikowania badanej

substancji do gleby. Odzyski dla dalszych faz badania

mo˝na ustaliç przez odpowiednie bilansy mas. Odzysk

powinien mieÊciç si´ w granicach 90 % do 110 % dla

substancji znakowanych (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) i 70 % do 110 % dla substancji nieznakowanych (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa).

1.7.2. PowtarzalnoÊç i czu∏oÊç metody analitycznej

PowtarzalnoÊç metody analitycznej (z wy∏àczeniem wydajnoÊci poczàtkowej ekstrakcji) w iloÊciowym oznaczaniu substancji i produktów przemian

mo˝na sprawdziç przez podwójnà analiz´ tego samego ekstraktu glebowego inkubowanego na tyle d∏ugo,

aby powsta∏y produkty przemiany.

Granica wykrywalnoÊci (LOD) metody analitycznej

badanej substancji i produktów przemiany powinna

wynosiç przynajmniej 0,01 mg/kg gleby (jako badana

substancja) lub 1 % zastosowanej dawki, w zale˝noÊci

która z wartoÊci jest ni˝sza. Powinno si´ tak˝e okreÊliç

granic´ oznaczalnoÊci (LOQ).

1.7.3. Dok∏adnoÊç danych przemian

Analiza regresji st´˝eƒ badanej substancji jako

funkcja czasu daje w∏aÊciwà informacj´ o wiarygodnoÊci krzywej przemian i pozwala na obliczenie przedzia∏ów ufnoÊci dla okresów pó∏rozk∏adu (w przypadku reakcji zachodzàcej wg kinetyki pseudopierwszego

rz´du) lub wartoÊci DT50 i, je˝eli to w∏aÊciwe, tak˝e

wartoÊci DT75 i DT90.

1.8. Opis metody badawczej

1.8.1. Sprz´t i odczynniki

Systemy inkubacyjne sk∏adajà si´ z uk∏adów statycznych zamkni´tych lub z odpowiednich uk∏adów

przep∏ywowych (zobacz pozycje 7 i 17 piÊmiennictwa).

Przyk∏ady uk∏adów przep∏ywowych dla gleby i biometrycznych kolb przedstawiono odpowiednio na rysunkach C.23.1 i C.23.2. Obydwa rodzaje systemów inkubacji majà swoje wady i zalety (zobacz pozycje 7 i 17

piÊmiennictwa).

Wymagany jest standardowy sprz´t laboratoryjny,

a w szczególnoÊci

— instrumenty analityczne, takie jak GLC, HPLC, TLC

wraz z odpowiednimi systemami detekcji do analizowania substancji znakowanych lub nieznakowanych lub do metody rozcieƒczeƒ inwertowanych izotopów,

— instrumenty dla celów identyfikacyjnych (np. MS,

GC-MS, HPLC-MS, NMR),

— licznik scyntylacyjny,

— utleniacz dla spalania materia∏u radioaktywnego,

— wirówka,

— sprz´t do ekstrakcji (na przyk∏ad probówki wirówkowe do zimnej ekstrakcji i aparat Soxhleta do

metody ekstrakcji ciàg∏ej),

— sprz´t do zat´˝ania roztworów i ekstraktów (np.

wyparka obrotowa),

— ∏aênia wodna,

— urzàdzenia do mieszania mechanicznego.

Stosowane odczynniki chemiczne to na przyk∏ad

— NaOH czystoÊci analitycznej, 2 mol/dm3 lub inna

w∏aÊciwa zasada (np. KOH, etanoloamina),

— H2SO4 czystoÊci analitycznej, 0,05 mol/dm3,

— glikol etylenowy czystoÊci analitycznej,

Poz. 2119

— materia∏y do absorpcji na cia∏o sta∏e, takie jak poliuretany lub wapno sodowe,

— rozpuszczalniki analityczne czystoÊci analitycznej,

takie jak aceton, metanol itp.,

— ciecz do scyntylacji.

1.8.2. Zastosowanie badanej substancji

W celu dodania do gleby i rozprowadzenia w niej

badanej substancji nale˝y t´ substancj´ rozpuÊciç

w wodzie (dejonizowanej lub destylowanej) lub gdy to

konieczne w minimalnej iloÊci acetonu lub innych rozpuszczalników organicznych (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa), w których badana substancja jest wystarczajàco rozpuszczalna i trwa∏a. Jednak˝e iloÊç wykrywanego rozpuszczalnika nie powinna mieç znaczàcego wp∏ywu na aktywnoÊç mikrobiologicznà gleby

(zobacz pkt 1.5 i pkt 1.9.2—1.9.3). Nale˝y unikaç stosowania rozpuszczalników hamujàcych aktywnoÊç mikrobiologicznà, takich jak chloroform, dichlorometan

i inne rozpuszczalniki halogenowane.

Badana substancja mo˝e byç tak˝e dodana w postaci cia∏a sta∏ego, np.: zmieszana z piaskiem kwarcowym (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa) lub w ma∏ej

próbce gleby, która zosta∏a wysuszona na powietrzu

i wyja∏owiona. Je˝eli badanà substancj´ dodaje si´ za

pomocà rozpuszczalnika, to nale˝y doprowadziç do

wyparowania rozpuszczalnika przed dodaniem do

próbki gleby i nast´pnie do ca∏ej niesterylnej gleby do

badania.

Dla ogó∏u substancji chemicznych, których g∏ówny

szlak dostawania si´ do gleby to osady Êciekowe/dzia∏alnoÊç rolnicza, badanà substancj´ powinno si´ najpierw dodaç do osadu, a nast´pnie wprowadziç do

próbki gleby (zobacz pkt 1.9.2 i pkt 1.9.3).

Nie zaleca si´ stosowania produktów w postaci

gotowych formulacji. Jednak w przypadku substancji

o s∏abej rozpuszczalnoÊci zastosowanie materia∏u

w formulacji mo˝e byç w∏aÊciwà alternatywà.

1.8.3. Gleby

1.8.3.1. Wybór gleby

Aby okreÊliç szlak przemian, stosowaç mo˝na gleb´ reprezentatywnà; zalecane jest stosowanie gleby

piaszczysto-ilastej lub gliniasto-ilastej, lub ilastej, lub

ilasto-piaskowej [wed∏ug klasyfikacji FAO i USDA (zobacz pozycja 18 piÊmiennictwa)] o wartoÊci pH

w granicach 5,5—8,0, zawartoÊci w´gla organicznego 0,5—2,5 % i masie mikroorganizmów przynajmniej odpowiadajàcej 1 % ogólnego w´gla organicznego (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).

W badaniach stopnia przemian stosowaç nale˝y

przynajmniej trzy dodatkowe rodzaje gleb, reprezentatywne dla zakresu odpowiednich gleb. Gleby powinny

ró˝niç si´ co do zakresu zawartoÊci w´gla organicznego, wartoÊci pH, zawartoÊci gliny i mikroorganizmów

(zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).

Wszystkie gleby powinny byç scharakteryzowane

przynajmniej pod wzgl´dem struktury (% zawartoÊç

piasku, % zawartoÊç i∏u, % zawartoÊç gliny) [wed∏ug

klasyfikacji FAO i USDA, zobacz pozycja 18 piÊmiennictwa], wartoÊci pH, zdolnoÊci wymiany kationów, zawartoÊç w´gla organicznego, g´stoÊci, cech retencji

wody12 oraz biomasy mikroorganizmów (tylko w przypadku badaƒ tlenowych). Dodatkowe informacje

o w∏asciwoÊciach gleby mogà byç u˝yteczne podczas

interpretacji wyników. Dla okreÊlania cech gleby mo˝na stosowaç metody podane w piÊmiennictwie (zobacz pozycje 19, 20, 21, 22 i 23 piÊmiennictwa). Biomas´ mikroorganizmów powinno si´ oznaczaç metodà

oddychania indukowanego substratem (SIR) (zobacz

pozycje 25 i 26 piÊmiennictwa) lub metodami alternatywnymi (zobacz pozycja 20 piÊmiennictwa).

1.8.3.2. Pobieranie, opracowanie i przechowywanie

gleb

Dost´pne powinny byç szczegó∏owe informacje

o historii miejsca, z którego pobiera si´ gleb´ do badaƒ. Do szczegó∏ów tych zalicza si´ dok∏adnà lokalizacj´ miejsca, pokryw´ wegetacyjnà, zabiegi chemiczne,

zabiegi z zastosowaniem nawozów organicznych i nieorganicznych, dodawanie materia∏ów biologicznych

lub informacje o innych zanieczyszczeniach. Je˝eli do

gleb, w ciàgu ostatnich czterech lat, dodawana by∏a

badana substancja lub jej strukturalne pochodne, to

gleby te nie powinny byç stosowane do badania przemian (zobacz pozycje 10 i 15 piÊmiennictwa).

Gleba powinna byç Êwie˝o pobrana z pola (z przekroju A lub z górnej 20 cm warstwy) przy zawartoÊci

wody pozwalajàcej na przesiewanie. Dla wszystkich

gleb z wyjàtkiem uzyskanych z pól ry˝owych pobieranie nie powinno byç wykonywane podczas lub tu˝ po

d∏ugich okresach (>30 dni) suszy, zmarzni´cia lub zalania (zobacz pozycja 14 piÊmiennictwa). Próbki powinny byç transportowane w sposób minimalizujàcy

zmiany w zawartoÊci wody w glebie i trzymane

w ciemnoÊci z wolnym dost´pem powietrza na tyle,

na ile to mo˝liwe. Na ogó∏ odpowiednim do tych celów jest luêno zawiàzany worek polietylenowy.

Poz. 2119

ny). Zaleca si´, aby badania by∏y wykonane na Êwie˝o

pobranej glebie; ale je˝eli pobrana i obrobiona gleba

musi byç przechowywana przed badaniem, to powinno si´ zapewniç do tego odpowiednie warunki i jest to

mo˝liwe tylko przez ograniczony czas (4±2 °C przez

maksimum trzy miesiàce) tak, by utrzymaç aktywnoÊç

mikrobiologicznà13. Szczegó∏owe informacje dotyczàce pobierania, obróbki i przechowywania gleb stosowanych w badaniach biotransformacji mo˝na znaleêç

w pozycjach 8, 10, 15, 26 i 27 piÊmiennictwa.

Przed obrobieniem gleby, która b´dzie stosowana

w badaniu, powinna byç ona preinkubowana tak, aby

wykie∏kowa∏y nasiona i mo˝na je by∏o usunàç, a nast´pnie ponownie ustali∏a si´ równowaga metabolizmu mikrobiologicznego po zmianie warunków z pobierania lub przechowywania na warunki inkubacyjne.

Okres preinkubacji trwajàcy pomi´dzy 2 a 28 dni

w warunkach temperatury i wilgotnoÊci zbli˝onych do

warunków doÊwiadczenia jest na ogó∏ wystarczajàcy

(zobacz pozycja 15 piÊmiennictwa). W sumie czas

przechowywania i preinkubacji nie powinien przekraczaç trzech miesi´cy.

1.9. Wykonanie badania

1.9.1. Warunki doÊwiadczenia

1.9.1.1. Temperatura doÊwiadczenia

Podczas ca∏ego okresu doÊwiadczenia gleby powinny byç inkubowane w ciemnoÊci w sta∏ej temperaturze odpowiedniej dla warunków klimatycznych,

w których stosowana lub uwolniona b´dzie badana

substancja. Zaleca si´ stosowanie temperatury

20±2 °C dla wszystkich substancji chemicznych, które

mogà byç stosowane i uwolnione do gleb klimatu

umiarkowanego. Temperatura powinna byç monitorowana. Dla substancji chemicznych, które mogà byç

stosowane i uwolnione do gleb w klimacie zimniejszym (np. kraje pó∏nocne, podczas okresów jesienno-zimowych), dodatkowe próbki gleby powinny byç inkubowane w ni˝szej temperaturze (np. 10±2 °C).

1.9.1.2. ZawartoÊç wilgoci

Gleba powinna byç poddana obróbce jak najszybciej po pobraniu. W celu usuni´cia ma∏ych kamieni,

fauny i pozosta∏oÊci roÊlin nale˝y, przed przesianiem

przez sito o oczkach 2 mm, usunàç r´cznie roÊlinnoÊç,

wi´ksze kamienie i faun´. Nale˝y unikaç nadmiernego

wysuszenia i rozdrobnienia gleby przed przesiewaniem (zobacz pozycja 15 piÊmiennictwa).

Gdy pobieranie gleby w zimie jest trudne (gleba zamarzni´ta lub pokryta Êniegiem), to mo˝na pobieraç jà

partiami z gleby przechowywanej w szklarni pod pokrywà roÊlin (np. trawà lub mieszaninà trawy i koniczy———————

12 Retencja wody w glebie mo˝e byç zmierzona jako wydajnoÊç polowa, jako pojemnoÊç wodna lub jako napi´cie

ssania wody (pF). WyjaÊnienia podano w tabeli C.23.1.

W sprawozdaniu koƒcowym nale˝y podaç, czy cechy retencji wody i g´stoÊç ogólna gleby by∏y okreÊlane

w próbkach polowych gleby niewzruszonej lub w próbkach gleby wzruszonej (obrabianej).

W badaniach przemian w warunkach tlenowych

zawartoÊç wilgoci w glebie14 powinna byç dostosowana i utrzymywana w zakresie pF od 2,0 do 2,5 (zobacz

pozycja 3 piÊmiennictwa). ZawartoÊç wilgoci jest wyra˝ana jako masa wody przypadajàca na mas´ suchej

———————

13 Wyniki najnowszych badaƒ wykazujà, ˝e gleby ze strefy

klimatu umiarkowanego mogà byç przechowywane

w –20 °C przez wi´cej ni˝ trzy miesiàce (zobacz pozycje

28, 29 piÊmiennictwa) bez znaczàcej utraty ich aktywnoÊci mikrobiologicznej.

14 Gleba nie powinna byç zbyt wilgotna ani te˝ zbyt sucha,

by utrzymaç odpowiednie natlenienie i status od˝ywczy

dla mikroflory glebowej. Zalecana zawartoÊç wilgoci

optymalna dla wzrostu mikroorganizmów mieÊci si´ w zakresie 40—60 % pojemnoÊci wodnej i od 0,1 do 0,33 bar

(zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa). Ten drugi zakres odpowiada zakresowi pF od 2,0 do 2,5. Typowe zawartoÊci wilgotnoÊci ró˝nych gleb podano w tabeli C.23.2.

gleby i powinna byç regularnie kontrolowana

(np. w dwutygodniowych odst´pach) przez wa˝enie

kolbek inkubacyjnych, a straty wody kompensowane

przez jej dodawanie (najlepiej stosowaç wod´ kranowà wyja∏owionà metodà filtracji). Nale˝y podjàç

wszelkie starania, aby zminimalizowaç straty badanej

substancji i/lub produktów przemian przez ulatnianie

i/lub fotodegradacj´ (je˝eli wyst´puje) podczas regulowania wilgotnoÊci.

5 cm warstw´ gleby. System powinien byç wentylowany powietrzem tak, jak w warunkach tlenowych.

WartoÊç pH, st´˝enie tlenu i potencja∏ red-oks warstwy wodnej powinien byç monitorowany i przedstawiony w sprawozdaniu. Przed rozpocz´ciem badania

przemian konieczny jest przynajmniej dwutygodniowy okres preinkubacji (zobacz pkt 1.8.3.2).

W przypadku badaƒ w warunkach beztlenowych

i poletka ry˝owego gleba jest nasycona wodà przez zalanie.

Badania stopnia i szlaków przemian w zasadzie nie

powinny przekraczaç 120 dni (zobacz pozycje 3, 6 i 8

piÊmiennictwa)16, poniewa˝ po tym czasie w sztucznym uk∏adzie laboratoryjnym izolowanym od Êrodowiska nale˝y spodziewaç si´ spadku aktywnoÊci biomasy mikroorganizmów glebowych. Je˝eli konieczne

jest ustalenie rozpadu badanej substancji oraz tworzenia i rozpadu g∏ównych produktów przemian, to badanie mo˝e byç kontynuowane przez d∏u˝sze okresy

(np. 6 lub 12 miesi´cy) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Stosowanie d∏u˝szych okresów inkubacji nale˝y

uzasadniç w sprawozdaniu; nale˝y jednoczeÊnie prowadziç pomiary biomasy podczas tego okresu i na jego zakoƒczenie.

1.9.1.3. Warunki inkubacji tlenowej

W systemach przep∏ywowych warunki tlenowe sà

utrzymywane przez przerywane przep∏ywy lub ciàg∏e

napowietrzanie nawilgoconym powietrzem. W kolbach biometrycznych wymiana powietrza nast´puje

przez dyfuzj´.

1.9.1.4. Ja∏owe warunki tlenowe

Dla uzyskania informacji o istotnoÊci przemian

abiotycznych badanej substancji próbki gleby mogà

byç wyja∏owione (metody sterylizacji podano w pozycji 16 i 29 piÊmiennictwa), traktowane ja∏owà badanà

substancjà (np. podanie roztworu przez sterylny filtr)

i napowietrzane sterylnym nawilgoconym powietrzem, jak opisano w pkt 1.9.1.3. W przypadku gleb

z poletek ry˝owych sterylizowana powinna byç gleba

i woda, a inkubacja powinna byç przeprowadzona jak

podano w pkt 1.9.1.6.

1.9.1.5. Warunki inkubacji beztlenowej

W celu stworzenia i utrzymania warunków beztlenowych gleba poddana dzia∏aniu badanej substancji

i inkubowana w warunkach tlenowych przez 30 dni lub

okres pó∏rozk∏adu lub DT50 (w zale˝noÊci, która z tych

wartoÊci jest krótsza) jest nast´pnie zalewana wodà

(pokrywa wodna 1—3 cm), a system inkubacyjny przemywany strumieniem oboj´tnego gazu (np. azot lub

argon)15. System badawczy musi umo˝liwiaç pomiar

wartoÊci pH, st´˝enia tlenu i potencja∏u red-oks oraz

zawieraç materia∏y do poch∏aniania produktów lotnych. System biometryczny powinien byç zamkni´ty

tak, aby uniknàç wnikania powietrza przez dyfuzj´.

1.9.1.6. Warunki inkubacji gleb poletka ry˝owego

Dla zbadania przemian w warunkach poletka ry˝owego gleb´ zalewa si´ 1—5 cm pokrywà wodnà, a badanà substancj´ podaje si´ do fazy wodnej (zobacz

pozycja 9 piÊmiennictwa). Zaleca si´ przynajmniej

———————

15 Warunki tlenowe sà dominujàcymi w glebach powierzchniowych, a nawet w glebach podpowierzchniowych jak

wykazano w projekcie finansowanym przez UE [K. Takagi

et al. (1992). Microbial diversity and activity in sub-soils

Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270—277, 17—21,

August 1992, Sigtuna, Sweden]. Warunki beztlenowe

mogà wystàpiç okresowo podczas zalania gleb po du˝ych opadach lub na polach ry˝owych.

1.9.1.7. Czas trwania badania

1.9.2. Wykonanie badania

Oko∏o 50 do 200 g gleby (sucha masa) umieszcza

si´ w ka˝dej kolbce inkubacyjnej (zobacz rysunki

C.23.1 i C.23.2 w Schemacie) oraz gleby traktowane

badanà substancjà jednà z metod opisanych

w pkt 1.8.2. Gdy podczas podawania badanej substancji stosuje si´ rozpuszczalniki organiczne, to nale˝y je

usunàç z gleby przez odparowanie. Nast´pnie gleba

jest dok∏adnie mieszana szpatu∏kà i/lub przez wytrzàsanie kolbki. Je˝eli badanie jest wykonywane w warunkach poletka ry˝owego, to gleba i woda powinny

byç dok∏adnie wymieszane po dodaniu badanej substancji. W celu upewnienia si´ o jednorodnym rozproszeniu ma∏e iloÊci gleby traktowanej (np. 1 g) powinny byç analizowane na zawartoÊç badanej substancji.

Alternatywna metoda podana jest poni˝ej.

Dawka substancji powinna odpowiadaç najwy˝szej zalecanej dawce Êrodka ochrony roÊlin. Substancja powinna byç jednorodnie rozprowadzona na w∏aÊciwà g∏´bokoÊç w warunkach polowych (np. górna

pow∏oka 10 cm gleby17). Na przyk∏ad, dla substancji

———————

16 Badania tlenowe mo˝na zakoƒczyç du˝o wczeÊniej ni˝

120 dni, pod warunkiem ˝e wyraênie osiàgni´to ostatecznà przemian´ i mineralizacj´. Zakoƒczenie badania jest

mo˝liwe po 120 dniach lub gdy przemianie uleg∏o przynajmniej 90 % badanej substancji, ale tylko je˝eli powsta∏o przynajmniej 5 % CO2.

17 Obliczenie poczàtkowego st´˝enia na podstawie area∏u

wed∏ug równania

Cgleba = poczàtkowe st´˝enie w glebie [mg/kg]; A = stosowana dawka [kg/ha]; 1 = gruboÊç polowej pokrywy glebowej [m]; d = g´stoÊç nasypowa suchej gleby [kg/m3].

Wed∏ug zasady dawka 1 kg/ha powoduje st´˝enie w glebie 1 mg/kg w 10 cm pokrywie (zak∏adajàc, ˝e g´stoÊç nasypowa gleby wynosi 1 g/cm3).

podawanych na liÊcie lub do gleby, bez inkorporacji,

2,5 cm jest w∏aÊciwà g∏´bokoÊcià do obliczenia iloÊci

substancji w ka˝dej kolbce. Dla substancji wnikajàcych w gleb´ w∏aÊciwà g∏´bokoÊcià jest ta podana na

etykiecie. Ogólnie dla substancji chemicznych dawka

powinna byç oszacowana na podstawie najbardziej

znaczàcego sposobu jej przenikania do gleby; na przyk∏ad gdy sposobem dostawania si´ do gleby sà osady

Êciekowe, to substancja powinna byç dawkowana

w osadach w st´˝eniu, które b´dzie odzwierciedlaç

spodziewane st´˝enie w osadzie i iloÊç osadu dodanego do gleby o zastosowaniu rolniczym. Je˝eli to st´˝enie nie jest na tyle wysokie, aby pozwoliç na okreÊlenie g∏ównych produktów przemian, to pomocna mo˝e

byç inkubacja dodatkowych próbek gleby o zwi´kszonej dawce, ale nale˝y unikaç zbyt du˝ych dawek wp∏ywajàcych na funkcjonowanie mikroorganizmów glebowych (zobacz pkt 1.5 i pkt 1.8.2).

Alternatywnie do wi´kszej partii (tj. 1 do 2 kg) gleby mo˝na dodawaç badanà substancj´, którà nale˝y

ostro˝nie wymieszaç we w∏aÊciwym urzàdzeniu mieszajàcym i nast´pnie przenieÊç w ma∏ych porcjach

50 do 200 g do kolbek inkubacyjnych (na przyk∏ad za

pomocà rozdzielaczy prób). Ma∏e iloÊci (np. 1 g) z gleby traktowanej w ca∏ej partii powinno si´ analizowaç

na zawartoÊç badanej substancji celem upewnienia

si´ o jej jednorodnym rozproszeniu. Preferuje si´ taki

sposób post´powania, poniewa˝ pozwala on na bardziej jednorodne rozprowadzenie badanej substancji

w glebie.

Próbki gleby bez badanej substancji inkubuje si´

w takich samych warunkach (tlenowych), jak próbki

z badanà substancjà. Próbki te wykorzystuje si´ do

oznaczeƒ biomasy pod koniec badania.

Gdy badanà substancj´ dodaje si´ do gleby w postaci rozpuszczonej w rozpuszczalnikach organicznych, do próbek gleby dodaje si´ takà samà iloÊç rozpuszczalnika i inkubuje w takich samych warunkach

(tlenowych), jak próbki z badanà substancjà. W celu

ustalenia wp∏ywu rozpuszczalnika na biomas´ mikroorganizmów próbki te wykorzystuje si´ do oznaczeƒ

biomasy na poczàtku, podczas i pod koniec badania.

Probówki zawierajàce gleb´ z badanà substancjà

sà tak˝e do∏àczane do systemu przep∏ywowego opisanego na rysunku C.23.1 lub zamykane kolumnà absorpcyjnà przedstawionà na rysunku C.23.2 (zobacz

Schemat).

1.9.3. Pobieranie prób i pomiary

Podwójne serie kolb inkubacyjnych usuwa si´ we

w∏aÊciwych odst´pach czasowych, a próbki gleby

poddaje si´ ekstrakcji odpowiednimi rozpuszczalnikami o ró˝nej polarnoÊci i analizuje na zawartoÊç badanej substancji i/lub produktów przemian. Dobrze zaprojektowane badanie zapewnia wystarczajàcà iloÊç

kolb, tak aby u˝ywaç dwóch kolb w ka˝dym badaniu

próbki. Usuwa si´ tak˝e roztwory absorpcyjne lub sta∏e materia∏y absorpcyjne w ró˝nych odst´pach czasowych (7-dniowe odst´py podczas pierwszego miesià-

Poz. 2119

ca, nast´pnie w okresie po pierwszym miesiàcu w odst´pach 17-dniowych) podczas badania i pod koniec

okresu inkubacji ka˝dej próbki i analizuje si´ na zawartoÊç substancji lotnych. Oprócz próbki gleby pobranej

bezpoÊrednio przed podaniem materia∏u badanego

(dzieƒ 0) do∏àczyç nale˝y przynajmniej pi´ç próbek pobranych w dodatkowych terminach. Odst´py czasowe

nale˝y dobraç w taki sposób, aby mo˝na by∏o ustaliç

model rozpadu badanej substancji i model rozpadu

i tworzenia produktów przemiany (np.: dni 0, 1, 3, 7;

tygodnie 2, 3; miesiàce 1, 2, 3).

Je˝eli stosuje si´ substancj´ znakowanà 14C to radioaktywnoÊç, która nie jest ekstrahowalna, b´dzie

okreÊlona przez spalanie. Bilans masy oblicza si´ dla

ka˝dego czasu pobierania próbek.

W przypadku inkubacji w warunkach beztlenowych i w przypadku poletka ry˝owego faz´ glebowà

i wodnà analizuje si´ na zawartoÊç badanej substancji

i produktów przemian razem lub osobno przez filtracj´

lub odwirowanie przed ekstrakcjà i oznaczaniem.

1.9.4. Badania opcjonalne

Przy ustalaniu wp∏ywu temperatury i wilgotnoÊci

gleby na stopieƒ przemian badanej substancji i/lub jej

produktów przemian w glebie pomocne mogà byç badania w warunkach tlenowych, niesterylnych w dodatkowych temperaturach i wilgotnoÊciach gleby.

Mo˝na dokonaç charakterystyki radioaktywnej

cz´Êci, nieulegajàcej ekstrakcji, np. wykorzystujàc metod´ nadkrytycznej ekstrakcji fluidalnej.

2. WYNIKI

2.1. Opracowanie wyników

IloÊci badanej substancji, produktów przemian,

substancji lotnych (wyra˝one tylko w %) i nieulegajàcych ekstrakcji pozosta∏oÊci powinny byç wyra˝one jako % stosowanego st´˝enia poczàtkowego i gdy to

w∏aÊciwe w postaci mg/kg gleby (w przeliczeniu na suchà mas´ gleby) dla ka˝dego okresu pobierania prób.

Bilans masy dla ka˝dego czasu pobierania prób nale˝y przedstawiç jako procent stosowanego st´˝enia poczàtkowego. Graficzne przedstawienie st´˝eƒ badanej

substancji wzgl´dem czasu pozwala na oszacowanie

jej pó∏okresu przemian lub wartoÊci DT50. Nale˝y zidentyfikowaç g∏ówne produkty przemian, a ich st´˝enia powinny byç przedstawione na wykresie wzgl´dem czasu w celu wykazania ich wytworzonych iloÊci

oraz rozpadu. G∏ównym produktem przemian jest ka˝dy produkt stanowiàcy ≥10 % zastosowanej dawki

w jakimkolwiek czasie podczas badania.

Zwiàzane produkty lotne dajà pewnà wiedz´ na temat potencja∏u do lotnoÊci badanej substancji i jej

produktów przemian z gleby.

Bardziej dok∏adne oszacowania okresów pó∏rozk∏adu lub wartoÊci DT50 i, je˝eli to w∏aÊciwe, wartoÊci

DT75 i DT90 powinno si´ otrzymaç przez zastosowanie

odpowiedniego modelu obliczeƒ kinetycznych. Warto-

Êci okresów pó∏rozk∏adu lub wartoÊci DT50 powinny

byç przedstawione wraz z opisem zastosowanego modelu, rz´dowoÊci kinetyki reakcji i okreÊleniem wspó∏czynnika (r2). Preferuje si´ kinetyk´ pierwszego rz´du,

dopóki r2<0,7. Gdy to w∏aÊciwe, to obliczenia nale˝y

tak˝e przedstawiç dla g∏ównych produktów przemian.

Przyk∏ady odpowiednich modeli sà opisane w pozycjach 31, 32, 33, 34 i 35 piÊmiennictwa.

W przypadku badaƒ wykonywanych w ró˝nych

temperaturach stopieƒ przemiany powinien byç opisany w postaci funkcji temperatury w zakresie temperatur doÊwiadczalnych przy zastosowaniu równania

Arrheniusa

gdzie

Poz. 2119

Substancja kontrolna

— nazwa chemiczna i struktura substancji kontrolnej

stosowanej do opisu i/lub identyfikacji produktu

przemiany.

Badane gleby

— szczegó∏y dotyczàce miejsca pobrania,

— data i sposób pobrania,

— w∏aÊciwoÊci gleby, takie jak: wartoÊç pH, zawartoÊç w´gla organicznego, sk∏ad (% piasku, % i∏u, %

gliny), zdolnoÊç wymiany jonów, g´stoÊç ogólna,

retencja wody, biomasa mikroorganizmów,

— d∏ugoÊç okresu przechowywania i warunki przechowywania (je˝eli by∏a przechowywana).

Warunki badania

— ln A i B sà sta∏ymi regresji odpowiednio przeci´ciem i nachyleniem najdok∏adniej dopasowanej

linii powsta∏ej po liniowej regresji ln k wzgl´dem 1/T,

— daty wykonania badania,

— k jest sta∏à w temperaturze T,

— stosowane rozpuszczalniki i metoda zaaplikowania badanej substancji,

— T jest temperaturà wyra˝ona w kelwinach.

Nale˝y wziàç pod uwag´ wàski zakres temperatur,

w którym równanie Arrheniusa jest spe∏nione, gdy

przemiany sà powodowane aktywnoÊcià mikroorganizmów.

— iloÊç dodanej badanej substancji,

— masa gleby traktowanej na poczàtku badania i pobieranej w ka˝dym interwale czasowym,

— opis stosowanego systemu inkubacyjnego,

— iloÊci przep∏ywajàcego powietrza (tylko dla systemów przep∏ywowych),

2.2. Oszacowanie i interpretacja wyników

— temperatura w czasie doÊwiadczenia,

Chocia˝ badania wykonywane sà w sztucznym

uk∏adzie laboratoryjnym, to wyniki pozwalajà na oszacowanie stopnia przemian badanej substancji oraz

stopnia tworzenia i rozpadu produktów przemian

w warunkach polowych (zobacz pozycje 36 i 37 piÊmiennictwa).

Badanie szlaków przemian substancji dostarcza informacji o sposobie zmian strukturalnych badanej

substancji w glebie na drodze reakcji chemicznych

i mikrobiologicznych.

— wilgotnoÊç gleby podczas inkubacji,

— poczàtkowa biomasa mikroorganizmów, nast´pnie podczas badania i na koniec w warunkach tlenowych,

— wartoÊç pH, st´˝enie tlenu i potencja∏ red-oks na

poczàtku badania, podczas i na koniec badania

w warunkach beztlenowych i poletka ry˝owego,

— metody ekstrakcji,

3. SPRAWOZDANIE

— metody oznaczania iloÊciowego i identyfikacji badanej substancji i g∏ównych produktów przemian

w glebie i materia∏ach absorpcyjnych,

Sprawozdanie z badania powinno zawieraç nast´pujàce informacje

— liczba powtórzeƒ i liczba kontroli.

Badana substancja

— nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer

CAS, wzór strukturalny (wskazujàc pozycj´ znaczników, gdy stosowano materia∏ znakowany radioaktywnie) i wa˝ne w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne

(zobacz pkt 1.5),

— czystoÊç (zanieczyszczenia) badanej substancji,

— czystoÊç radiochemiczna znakowanego zwiàzku

i specyficzna aktywnoÊç (gdy to w∏aÊciwe).

Wyniki

— wyniki oznaczenia aktywnoÊci mikrobiologicznej,

— powtarzalnoÊç i czu∏oÊç stosowanych metod analitycznych,

— stopieƒ odzysku (wartoÊci % dla zwalidowanego

badania podano w pkt 1.7.1),

— tabelaryzowane wyniki wyra˝one jako % stosowanej poczàtkowej dawki i, gdy to w∏aÊciwe, jako

mg/kg gleby (na podstawie suchej masy),

— bilans masy podczas i na koniec badania,

— opis nieekstrahowalnej (zwiàzanej) radioaktywnoÊci lub pozosta∏oÊci w glebie,

— iloÊciowe oznaczenie uwolnionego CO2 i innych

lotnych zwiàzków,

— wykresy st´˝eƒ glebowych wzgl´dem czasu dla

badanej substancji i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych produktów przemian,

— okres pó∏rozk∏adu lub DT50, DT75 i DT90 dla badanej substancji i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych

produktów przemian wraz z przedzia∏ami ufnoÊci,

Poz. 2119

organic chemicals in soil under aerobic conditions. PN-ISO 14239:2000 JakoÊç gleby — Laboratoryjne metody inkubacji do pomiaru mineralizacji

zwiàzków organicznych w glebie w warunkach tlenowych.

8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark

R. Lynch, Ed.

9) MAFF — Japan 2000 — Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil — Aerobic

metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).

abiotycznej

10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop

on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy,

18—20 January 1995.

— oszacowanie kinetyki przemian dla badanej substancji i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych produktów przemian,

11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In

Interactions between Herbicides and the Soil

(R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123—157.

— proponowane szlaki przemian, gdy to w∏aÊciwe,

12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley —

VCH (1998).

— oszacowanie stopnia degradacji

w warunkach sterylnych,

— dyskusja i interpretacja wyników,

— dane pierwotne (tj. wybrane chromatogramy, wybrane obliczenia stopnia przemian i sposoby

identyfikacji produktów przemian).

4. PIÂMIENNICTWO

1) US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision

N. Chemistry: Environmental Fate.

2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.

3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant

protection products on the market. Annex II,

Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in

the Environment.

4) Dutch Commission for Registration of Pesticides

(1995). Application for registration of a pesticide.

Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung

von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4—1. Verbleib

von Pflanzenschutzmitteln im Boden-Abbau,

Umwandlung und Metabolismus.

6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality-Guidance on

laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil — Part 1: Aerobic conditions. PN-ISO

11266:1997 JakoÊç gleby — Zasady prowadzenia

badaƒ laboratoryjnych nad biodegradacjà zwiàzków organicznych w glebie w warunkach tlenowych.

7) ISO 14239 (1997). Soil Quality-Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of

13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in

soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945—956

(IUPAC 1984).

14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).

15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality — Sampling —

Part 6: Guidance on the collection, handling and

storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. PN-ISO 10381-6:1998 JakoÊç gleby — Pobieranie próbek — Zasady dotyczàce pobierania, post´powania z próbkami i przechowywania próbek gleby przeznaczonych do badania tlenowych (aerobowych) procesów mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych.

16) Annex V to Dir. 67/548/EEC.

17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to

studying the fate of pesticides in soil. In Progress

in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85—114.

18) Soil Texture Classification (US and FAO systems)

Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci.

Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical

and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.

20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical

and Microbiological Properties. A.L. Page,

R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.

21) ISO Standard Compendium Environment (1994).

Soil Quality — General aspects; chemical and

physical methods of analysis; biological methods

of analysis. First Edition.

22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

Poz. 2119

crobiology and Soil Quality, 68—69 (SETAC-Europe).

23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch

der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.

30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content

and some chemical characteristics. Plant and Soil

102, 197—200.

24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of

microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10,

215—221.

31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur

und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz,

Sonderheft VII, 141—146.

25) ISO 14240–1 and 2 (1997). Soil Quality — Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method. PN-ISO 14240-1:2001 JakoÊç

gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorganizmów w glebie — Metoda indukcji oddychania

przez dodanie substratu. PN-ISO 14240-2:2001 JakoÊç gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorganizmów w glebie — Metoda fumigacji — ekstrakcji.

32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium

Persistence of Insecticides and Herbicides, 181—

199.

26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage

of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45—60.

27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide

transformation in the environment: Aerobic and

biotransformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on

Environmental Science of Pesticide, 105—120.

33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W.,

Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environmental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V.H. Freed, Eds.,

135—172.

34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical

interpretation and graphic representation of the

degradational behaviour of pesticide residues. II.

Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer 39, 188–204.

35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz —Nachrichten Bayer 33, 47—60.

28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of

storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59—63

(SETAC-Europe).

36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on

spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24,

1032—1041.

29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996).

Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Mi-

37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and

the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press,

83—122.

TABELA C.23.1

PR¢˚NOÂå WODY, POJEMNOÂå POLOWA (FC) I CA¸KOWITA POJEMNOÂå WODNA (WHC)1)

(a) pF = log cm s∏upa wody.

(b) 1 bar = 105 Pa.

(c) Odpowiada przybli˝onej 10 % zawartoÊci wody w piasku, 35 % w ile i 45 % w glinie.

(d) PojemnoÊç polowa nie jest sta∏a, ale waha si´ w zale˝noÊci od rodzaju gleby pomi´dzy pF 1,5 i 2,5.

CiÊnienie ssania gleby jest mierzone w cm s∏upa wody lub w barach. Ze wzgl´du na du˝y zakres pr´˝noÊci jest

wyra˝ane jako pF, które jest ekwiwalentem logarytmu cm s∏upa wody.

PojemnoÊç polowa jest definiowana jako iloÊç wody, która mo˝e byç zatrzymana wzgl´dem grawitacji przez

naturalnà gleb´ 2 dni pod d∏u˝szym okresie opadów lub odpowiednim nawodnieniu. OkreÊlana jest w glebie

niewzruszonej in situ w warunkach polowych. Pomiaru nie mo˝na wi´c zastosowaç dla gleb laboratoryjnych.

WartoÊci FC oznaczone w glebach wzruszonych mogà charakteryzowaç si´ wielkà zmiennoÊcià.

PojemnoÊç wodna jest okreÊlana w laboratorium we wzruszonej i niewzruszonej glebie przez nasycenie kolumny gleby wodà przez transport kapilarny. Jest szczególnie u˝yteczna dla gleb wzruszonych i mo˝e byç do 30 %

wi´ksza od pojemnoÊci polowej (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Jest tak˝e doÊwiadczalnie ∏atwiejsza do

okreÊlenia ni˝ wiarygodne wartoÊci FC.

1) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrolo-

gischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

TABELA C.23.2

ZAWARTOÂå WILGOTNOÂCI (g wody na 100 g suchej gleby)

RÓ˚NYCH RODZAJÓW GLEBY Z RÓ˚NYCH KRAJÓW

1) Ca∏kowita pojemnoÊç wodna.

Schemat

Rysunek C.23.1

Przyk∏ad uk∏adu przep∏ywowego do badania przemian substancji chemicznych w glebie

(zobacz pozycje 1 i 2 piÊmiennictwa)

1: zawór iglicowy

2: butla przemywajàca gaz zawierajàca wod´

3: ultra membrana (tylko w warunkach polowych), rozmiar oczka 0,2 µm

4: kolba metabolizmu gleby (zalewana wodà tylko w warunkach beztlenowych I poletka ry˝owego)

5: pu∏apka z glikolem etylenowym dla lotnych zwiàzków organicznych

6: pu∏apka z kwasem siarkowym dla zasadowych zwiàzków lotnych

7, 8: pu∏apka z wodorotlenkiem sodu dla CO2 & inne kwasowe lotne

9: pomiar przep∏ywu

Rysunek C.23.2

Przyk∏ad kolb biometrycznych do badania przemian substancji chemicznych w glebie

(zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa)

1) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123—157.

2) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85—114.

3) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von

Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141—146.

Za∏àcznik nr 14

C.24. PRZEMIANY TLENOWE I BEZTLENOWE W OSADACH WODNYCH

1. METODA

Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 308 (2002).

1.1. Wst´p

Substancje chemiczne mogà wnikaç do p∏ytkich

lub g∏´bokich wód powierzchniowych bezpoÊrednio,

przez sp∏ywy, kanalizacje, ze Êciekami przemys∏owymi, komunalnymi lub rolniczymi i opadami atmosferycznymi. Niniejsza metoda badawcza opisuje sposób

oszacowania tlenowych i beztlenowych przemian

zwiàzków chemicznych w osadach wodnych. Metoda

ta opiera si´ na istniejàcych Wytycznych (zobacz pozycje 1, 2, 3, 4, 5 i 6 piÊmiennictwa). Na Warsztatach

OECD dotyczàcych wyboru gleb i osadów, które odbywa∏y si´ we W∏oszech, Belgirate w 1995 r. (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa), uzgodniono liczb´ i rodzaje

osadów do stosowania w niniejszym badaniu.

Na Warsztatach podj´to tak˝e zalecenia w zakresie pobierania, obróbki i przechowywania próbek osadów

w oparciu o Wytyczne ISO (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Takie badania sà wymagane dla substancji,

które sà stosowane bezpoÊrednio na wod´ lub najprawdopodobniej dostanà si´ do Êrodowiska wodnego opisanymi powy˝ej szlakami.

Warunki panujàce w naturalnych systemach osadów wodnych sà cz´sto tlenowe w górnej warstwie

wodnej. Górna pow∏oka osadu mo˝e byç zarówno tlenowa, jak i beztlenowa, podczas gdy g∏´bsze warstwy

sà zazwyczaj beztlenowe. Dlatego w niniejszym badaniu uj´to metodyk´ zarówno dla warunków tlenowych,

jak i beztlenowych. Badanie w warunkach tlenowych

symuluje kolumn´ wodnà nasyconà tlenem nad tlenowà pow∏okà osadu z beztlenowym pod∏o˝em. Badanie

symuluje ca∏kowicie beztlenowy uk∏ad woda-osad. Je˝eli okolicznoÊci wskazujà na koniecznoÊç zmiany powy˝szych zaleceƒ na przyk∏ad przez zastosowanie nienaruszonych osadów lub osadów, które by∏y nara˝one

na badanà substancj´, to dla takich celów dost´pne sà

inne metody (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa).

1.2. Definicje

Nale˝y stosowaç jednostki Mi´dzynarodowego

Systemu (SI).

Badana substancja: ka˝da substancja, w tym zwiàzek wyjÊciowy i odpowiednie produkty przemian.

Produkty przemian: wszystkie substancje pochodzàce z reakcji przemian biotycznych lub abiotycznych

badanej substancji, w tym CO2 i zwiàzane pozosta∏oÊci.

Zwiàzane pozosta∏oÊci: „Zwiàzane pozosta∏oÊci”

stanowià zwiàzki w glebie, roÊlinie lub zwierz´ciu, które trwajà w matrycy w postaci zwiàzku wyjÊciowego

lub jego metabolitów/produktów przemian po ekstrak-

cji. Metoda ekstrakcji nie powinna znaczàco zmieniaç

samych zwiàzków lub struktury matrycy. Sposób wiàzania mo˝e byç cz´Êciowo wyjaÊniony przez zmian´

sposobu ekstrakcji z matrycy lub wyspecjalizowane

techniki analityczne. W taki sposób zidentyfikowano

na przyk∏ad wiàzania kowalencyjno-jonowe i sorpcyjne, a tak˝e „pu∏apki”. Ogólnie tworzenie zwiàzanych

pozosta∏oÊci redukuje znaczàco biodost´pnoÊç i bioprzyst´pnoÊç (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa) [zmodyfikowane wed∏ug IUPAC 1984 (zobacz pozycja 11 piÊmiennictwa)].

Przemiany tlenowe: (utleniajàce) reakcje zachodzàce w obecnoÊci tlenu czàsteczkowego (zobacz pozycja 12 piÊmiennictwa).

Przemiany beztlenowe: (redukujàce) reakcje zachodzàce pod nieobecnoÊç tlenu czàsteczkowego (zobacz pozycja 12 piÊmiennictwa).

Wody naturalne: wody powierzchniowe pochodzàce ze stawów, rzek, strumieni itp.

Osad: jest mieszaninà mineralnych i organicznych

sk∏adników chemicznych, przy czym te drugie sk∏adajà

si´ ze zwiàzków o wysokiej zawartoÊci w´gla i azotu

i o wysokich masach czàsteczkowych. Tworzy si´ w wodach naturalnych i ma powierzchni´ kontaktowà z wodà.

Mineralizacja: jest pe∏nym rozk∏adem zwiàzku organicznego do CO2 i H2O w warunkach tlenowych

oraz CH4, CO2 i H2O w warunkach beztlenowych.

W kontekÊcie niniejszej metody, gdy stosuje si´ zwiàzek znakowany, mineralizacja oznacza rozk∏ad, podczas którego znakowany atom w´gla jest utleniany lub

redukowany iloÊciowo z uwolnieniem odpowiedniej

iloÊci 14CO2 lub 14CH4.

Okres pó∏rozk∏adu: t0,5, jest czasem potrzebnym

na 50 % przemian badanej substancji, je˝eli przemiany mo˝na opisaç kinetykà pierwszego rz´du; nie zale˝y od st´˝enia poczàtkowego.

DT50 (Okres Zanikania 50): jest czasem, w którym

st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o 50 %.

DT75 (Okres Zanikania 75): jest czasem, w którym

st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o 75 %.

DT90 (Okres Zanikania 90): jest czasem, w którym

st´˝enie badanej substancji jest zredukowane o 90 %.

1.3. Substancje kontrolne

Substancje kontrolne powinny byç stosowane celem charakteryzacji i/lub identyfikacji produktów przemian metodami spektroskopowymi lub chromatograficznymi.

1.4. Informacje o badanej substancji

Dla pomiaru stopnia przemian stosowaç mo˝na

substancje znakowane i nieznakowane, chocia˝ prefe-

ruje si´ materia∏ znakowany. Materia∏ znakowany jest

wymagany do badania szlaków przemian i ustalania

bilansu masy. Zalecane jest znakowanie 14C, ale zastosowanie innych izotopów, takich jak 13C, 15N, 3H,

32P, tak˝e mo˝e byç u˝yteczne. Na tyle, na ile to mo˝liwe, znacznik powinien byç umiejscowiony w najbardziej stabilnej cz´Êci czàsteczki18. CzystoÊç badanej

substancji i/lub czystoÊç radiochemiczna powinny wynosiç przynajmniej 95 %.

Przed wykonaniem badania na temat badanej substancji dost´pne powinny byç nast´pujàce informacje

a) rozpuszczalnoÊç w wodzie (metoda A.6),

b) rozpuszczalnoÊç w rozpuszczalnikach organicznych,

c) pr´˝noÊç par (metoda A.4) i sta∏a Henry’ego,

d) wspó∏czynnik podzia∏u n-oktanol/woda (metoda A.8),

e) wspó∏czynnik adsorpcji (Kd, Kf lub KOC) (metoda C.18),

f) hydroliza (metoda C.7.),

g) sta∏a dysocjacji (pKa) [Wytyczna OECD nr 112], zobacz pozycja 13 piÊmiennictwa,

h) struktura chemiczna badanej substancji i umiejscowienie znacznika, je˝eli by∏ stosowany.

Uwaga: nale˝y podaç temperatur´, w jakiej oznaczano powy˝sze wartoÊci.

Inne u˝yteczne informacje to dane o toksycznoÊci

badanej substancji dla mikroorganizmów glebowych,

dane na temat biodegradacji i dane o przemianach tlenowych i beztlenowych w glebie.

Dost´pne powinny byç metody analityczne (w tym

metody ekstrakcji i oczyszczania) dla iloÊciowego

oznaczania i identyfikacji badanej substancji i jej produktów przemian.

1.5. Zasada metody badawczej

Metoda tutaj opisana opiera si´ na tlenowym

i beztlenowym systemie osadu wodnego (zobacz Wytyczne do beztlenowych i tlenowych uk∏adów badawczych), który pozwala na

(i) pomiar stopnia przemian badanej substancji

w uk∏adzie woda-osad,

(ii) pomiar stopnia przemian badanej substancji

w osadzie,

———————

18 Na przyk∏ad, je˝eli badana substancja zawiera jeden pierÊcieƒ, wymagane jest znakowanie w tym pierÊcieniu; je˝eli badana substancja zawiera dwa lub wi´cej pierÊcieni,

to konieczne mogà okazaç si´ dodatkowe badania celem

okreÊlenia losu ka˝dego znakowanego pierÊcienia, by

uzyskaç odpowiednie informacje o tworzeniu produktów

przemian.

Poz. 2119

(iii) pomiar stopnia mineralizacji badanej substancji

i/lub jej produktów przemian (gdy stosowana

jest substancja znakowana 14C),

(iv) identyfikacj´ i iloÊciowe oznaczenie produktów

przemian w fazie wodnej i osadzie wraz z bilansem wagowym (gdy stosowana jest znakowana

badana substancja),

(v) pomiar rozproszenia badanej substancji i jej produktów przemian pomi´dzy dwie fazy podczas

okresu inkubacji w ciemnoÊci (na przyk∏ad w celu unikni´cia zakwitu glonów) w sta∏ej temperaturze. WartoÊci okresu pó∏rozpadu DT50, DT75

i DT90 sà wyznaczane, gdy pozwalajà na to dane,

ale nie powinny byç ekstrapolowane zbyt daleko

poza czas trwania badania (zobacz pkt 1.2).

Wymagane sà przynajmniej dwa osady i zwiàzane

z nimi fazy wodne zarówno do badaƒ tlenowych, jak

i beztlenowych (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Jednak mogà zaistnieç przypadki, w których trzeba b´dzie

zastosowaç wi´cej ni˝ dwa osady wodne, na przyk∏ad

dla substancji obecnych w Êrodowiskach s∏onowodnych i/lub wodach s∏odkich.

1.6. Zastosowanie badania

Metod´ mo˝na stosowaç ogólnie dla substancji

chemicznych (znakowanych lub nie), dla których dost´pna jest metoda analityczna o odpowiedniej dok∏adnoÊci i czu∏oÊci. Badanie stosuje si´ dla zwiàzków

o niewielkiej lotnoÊci, nielotnych, rozpuszczalnych

i nierozpuszczalnych w wodzie. Badania nie nale˝y

wykonywaç dla substancji o wysokiej lotnoÊci z wody

(np. fumiganty, rozpuszczalniki organiczne), których

nie mo˝na utrzymaç w wodzie i/lub osadzie w warunkach doÊwiadczalnych badania.

Dotychczas metod´ stosowano do badania przemian substancji chemicznych w wodach s∏odkich

i osadach, ale ogólnie mo˝na jà tak˝e stosowaç

w uk∏adach morskich i stref przejÊciowych. Metoda

nie jest odpowiednia do badaƒ w warunkach symulacji wód p∏ynàcych (np. rzeki) lub morza.

1.7. Kryteria jakoÊci

1.7.1. Odzysk

Ekstrakcja i analiza przynajmniej podwójnych próbek wody i osadu tu˝ po dodaniu badanej substancji

daje pierwsze wskazówki co do powtarzalnoÊci metody analitycznej i jednorodnoÊci zaaplikowania badanej

substancji. Odzyski dla dalszych faz badania mo˝na

ustaliç przez odpowiednie bilansy wagowe. Odzysk

powinien mieÊciç si´ w granicach 90 % do 110 % dla

substancji znakowanych (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa) i 70 % do 110 % dla substancji nieznakowanych.

1.7.2. PowtarzalnoÊç i czu∏oÊç metody analitycznej

PowtarzalnoÊç metody analitycznej (z wy∏àczeniem wydajnoÊci poczàtkowej ekstrakcji) w iloÊciowym oznaczaniu substancji i produktów przemian

mo˝na sprawdziç przez podwójnà analiz´ tego samego ekstraktu wody lub osadu inkubowanego na tyle

d∏ugo, by powsta∏y produkty przemiany.

Granica wykrywalnoÊci (LOD) metody analitycznej

badanej substancji i produktów przemiany powinna

wynosiç przynajmniej 0,01 mg/kg wody lub osadu (jako badana substancja) lub 1 % zastosowanej dawki,

w zale˝noÊci która z wartoÊci jest ni˝sza. Granica oznaczalnoÊci (LOQ) powinna byç tak˝e okreÊlona.

1.7.3. Dok∏adnoÊç danych przemian

Analiza regresji st´˝eƒ badanej substancji jako

funkcji czasu daje w∏aÊciwà informacj´ o wiarygodnoÊci krzywej przemian i pozwala na obliczenie przedzia∏ów ufnoÊci dla okresów pó∏rozpadu (w przypadku kinetyki pseudopierwszego rz´du) lub wartoÊci DT50

i, je˝eli to w∏aÊciwe, tak˝e wartoÊci DT75 i DT90.

1.8. Opis metody badawczej

1.8.1. System badawczy i sprz´t

Badanie powinno byç wykonane w naczyniach

szklanych (np. butlach, probówkach wirówkowych),

chyba ˝e wczeÊniej uzyskane informacje (takie jak

wspó∏czynnik podzia∏u oktanol-woda, dane sorpcyjne

itp.) wskazujà, ˝e badana substancja mo˝e adsorbowaç si´ na szkle. W takim przypadku stosowaç nale˝y

naczynia z innego materia∏u (np. z teflonu). Gdy wiadomo, ˝e badana substancja przywiera do szk∏a, problem

ten mo˝na rozwiàzaç wed∏ug nast´pujàcych metod

— okreÊliç mas´ badanej substancji i produktów

przemian sorbowanych na szkle,

— na koniec badania obmyç szk∏o rozpuszczalnikiem,

— stosowaç produkty w postaci formulacji (zobacz

pkt 1.9.2),

— zastosowaç zwi´kszonà iloÊç wspó∏rozpuszczalnika przy dodaniu badanej substancji do uk∏adu; je˝eli taki rozpuszczalnik jest stosowany, to nie powinien on doprowadzaç do rozpadu badanej substancji.

Przyk∏ady typowych systemów badawczych, tj.

przep∏ywowych i biometrycznych, przedstawiono odpowiednio na rysunkach C.24.1 i C.24.2 (zobacz pozycja 14 piÊmiennictwa). Inne systemy inkubacyjne opisano w pozycji 15 piÊmiennictwa. System badawczy

powinien umo˝liwiaç wymian´ powietrza lub azotu

oraz wy∏apywanie produktów lotnych. Wymiary uk∏adu powinny byç takie, by spe∏nione by∏y wszystkie

wymagania badania (zobacz pkt 1.9.1). Wentylacja

mo˝e nast´powaç albo przez ∏agodne bàbelkowanie

lub przepuszczanie powietrza lub azotu nad powierzchnià wody. W tym drugim przypadku ∏agodne

mieszanie wody od góry jest doradzane dla lepszego

rozprowadzenia tlenu lub azotu w wodzie. Powietrze

wolne od CO2 nie powinno byç stosowane, poniewa˝

powoduje to wzrost wartoÊci pH wody. W ka˝dym

z tych przypadków wzburzanie osadu jest niepo˝àdane i nale˝y tego unikaç na tyle, na ile to tylko mo˝liwe.

Substancje w niewielkim stopniu lotne nale˝y badaç

w systemie kolb biometrycznych, ∏agodnie mieszajàc

powierzchni´ wody. Stosowane mogà byç tak˝e naczynia zamkni´te z przestrzenià wype∏nionà powietrzem lub azotem z probówkami w Êrodku dla wy∏apy-

Poz. 2119

wania produktów lotnych (zobacz pozycja 16 piÊmiennictwa). W badaniu w warunkach tlenowych wymagana jest regularna wymiana powietrza celem kompensacji zu˝ycia tlenu przez biomas´.

Odpowiednie pu∏apki do wy∏apywania produktów

lotnych to mi´dzy innymi dla dwutlenku w´gla19 to

1 mol/dm3 roztwory wodorotlenku potasu lub wodorotlenku sodu i glikol etylenowy, etanoloamina lub

2 % parafina w ksylenie dla zwiàzków organicznych.

Substancje lotne powstajàce w warunkach beztlenowych, takie jak metan, mogà byç wychwytywane na

przyk∏ad na sitach molekularnych. Takie substancje

mogà byç na przyk∏ad spalane do CO2 przez przepuszczanie gazu przez szklanà rurk´ z CuO w temperaturze

900 °C i wy∏apywanie CO2 tworzonego w absorberze

z zasadami (zobacz pozycja 17 piÊmiennictwa).

Do analizy chemicznej badanej substancji i produktów przemian wymagany jest odpowiedni sprz´t

laboratoryjny (np. sprz´t do: chromatografii gazowej

(GLC), chromatografii cieczowej (HPLC), chromatografii cienkowarstwowej (TLC), spektroskopii masowej

(MS), chromatografii gazowej sprz´˝onej ze spektroskopià masowà (GC-MS), chromatografii cieczowej

sprz´˝onej ze spektroskopià masowà (LC-MS), jàdrowego rezonansu magnetycznego (NMR) itp.) wraz

z systemami detekcji substancji znakowanych i nieznakowanych. Gdy stosowany jest materia∏ znakowany radioaktywnie, wymagany b´dzie tak˝e licznik

scyntylacyjny i utleniacz (dla spalania próbek osadu

przed analizà radioaktywnoÊci).

Inny standardowy sprz´t laboratoryjny, szk∏o, odczynniki i substancje chemiczne wymagane sà wed∏ug

potrzeb do oznaczeƒ fizykochemicznych i biologicznych (zobacz pkt 1.8.2.2, tabela C.24.1).

1.8.2. Wybór i liczba osadów wodnych

Miejsca pobierania powinny byç wybrane pod kàtem celu badania. Przy wyborze miejsca pobierania

pod uwag´ nale˝y braç mo˝liwe zanieczyszczenia rolnicze, przemys∏owe lub komunalne wnikajàce do wód.

Osady nie powinny byç stosowane, je˝eli by∏y zanieczyszczone badanà substancjà lub jej strukturalnymi

analogami w ciàgu ostatnich czterech lat.

1.8.2.1. Wybór osadu

W badaniach tlenowych stosuje si´ dwa rodzaje

osadu (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Powinny si´

one ró˝niç pod wzgl´dem zawartoÊci w´gla organicznego i sk∏adu. Jeden z osadów powinien charakteryzowaç si´ wysokà zawartoÊcià w´gla organicznego

(2,5—7,5 %) i drobnoziarnistà strukturà, natomiast

drugi powinien charakteryzowaç si´ niskà zawartoÊcià

w´gla organicznego (0,5—2,5 %) i strukturà gruboziarnistà. Ró˝nica w zawartoÊci w´gla organicznego

powinna wynosiç przynajmniej 2 %. Struktura „drob———————

19 Ze wzgl´du na to, ˝e te zasadowe roztwory sorpcyjne

wià˝à tak˝e dwutlenek w´gla z powietrza przechodzàcego przez uk∏ad i ten wytworzony w wyniku respiracji

w doÊwiadczeniach tlenowych, to muszà one byç wymieniane w regularnych odst´pach, by uniknàç ich nasycenia i straty ich zdolnoÊci absorpcyjnych.

noziarnista” jest zdefiniowana jako zawartoÊç [glina +

i∏]20 >50 %, a struktura „gruboziarnista” jako zawartoÊç [glina + i∏] <50 %. Ró˝nica w zawartoÊci [glina +

i∏] powinna wynosiç przynajmniej 20 %. W przypadku

gdy substancja chemiczna mo˝e tak˝e dostaç si´ do

Êrodowiska morskiego, przynajmniej jeden z badanych osadów powinien byç pochodzenia morskiego.

W przypadku badaƒ ÊciÊle beztlenowych dwa osady (wraz z towarzyszàcymi im wodami) nale˝y pobraç

ze strefy beztlenowej wód powierzchniowych (zobacz

pozycja 7 piÊmiennictwa). Zarówno osad, jak i faza

wodna powinny byç transportowane bez dost´pu tlenu.

Przy wyborze osadu wa˝ne mogà byç tak˝e inne

parametry i powinny byç one brane pod uwag´ indywidualnie dla ka˝dego przypadku. Na przyk∏ad zakres

wartoÊci pH osadu powinien byç wa˝ny w badaniu

substancji, których przemiany i/lub sorpcja mogà byç

zale˝ne od wartoÊci pH. Zale˝noÊç sorpcji od wartoÊci

pH mo˝e odzwierciedlaç si´ w wartoÊci pKa badanej

substancji.

Poz. 2119

1.8.2.2. Opis próbek osad-woda

Kluczowe parametry, które muszà byç oznaczane

i przedstawiane w sprawozdaniu (z podaniem stosowanej metody) zarówno dla osadu, jak i wody, oraz faza badania, w której te parametry majà byç oznaczane,

przedstawiono w tabeli C.24.1. Metody oznaczania

tych parametrów podano w pozycjach 18, 19, 20 i 21

piÊmiennictwa.

Ponadto inne parametry mogà byç konieczne do

oznaczania w konkretnych przypadkach (np. dla wód

s∏odkich: zawiesina, zasadowoÊç, twardoÊç, przewodnictwo, NO3/PO4 (stosunek i wartoÊci indywidualne);

dla osadów: zdolnoÊç wymiany jonów, ca∏kowita pojemnoÊç wodna, w´glany, fosfor i azot ca∏kowity; dla

systemów morskich: zasolenie). Analiza osadów i wody pod wzgl´dem zawartoÊci azotanów, siarczanów

biodost´pnego ˝elaza i innych biorców elektronów

mo˝e byç tak˝e u˝yteczna w szacowaniu warunków

red-oks szczególnie w odniesieniu do przemian beztlenowych.

TABELA C.24.1

Pomiar parametrów charakteryzujàcych próbki woda-osad (zobacz pozycje 7, 22 i 23 piÊmiennictwa)

* Wyniki najnowszych badaƒ wykaza∏y, ˝e pomiary st´˝enia tlenu w wodzie i potencja∏u red-oks nie majà wartoÊci mecha-

nicznej ani przewidujàcej, je˝eli rozpatrywany jest wzrost i rozwój populacji mikroorganizmów w wodach powierzchniowych (zobacz pozycje 24 i 25 piÊmiennictwa). Lepszymi narz´dziami do interpretacji i oszacowania szlaków i stopnia

przemian tlenowych jest oznaczenie biologicznego zapotrzebowania na tlen (BZT w miejscu pobierania, na poczàtku i na

koƒcu badania) i st´˝eƒ mikro/makro-elementów Ca, Mg i Mn (na poczàtku i na koƒcu badania) w wodzie oraz ca∏kowitego N i ca∏kowitego P w osadzie (w miejscu pobierania i na koƒcu badania).

** Metoda stopnia oddychania mikroorganizmów (zobacz pozycja 26 piÊmiennictwa), metoda fumigacji (zobacz pozycja 27

piÊmiennictwa) lub p∏ytkowy pomiar iloÊci (np. bakterie, grzyby i kolonie) dla badaƒ tlenowych; stopieƒ metanogenezy

dla badaƒ beztlenowych.

———————

20 [Glina + i∏] jest mineralnà frakcjà osadu o rozmiarach czàstek < 50 µm.

1.8.3. Pobieranie, obróbka i przechowywanie

1.9. Wykonanie badania

1.8.3.1. Pobieranie

1.9.1. Warunki badania

Przy pobieraniu osadów kierowaç nale˝y si´ dokumentem przewodnim ISO na temat pobierania osadów dennych (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Próbki osadu nale˝y pobieraç z ca∏ej warstwy 5 do 10 cm

wg∏àb osadu. Zwiàzana woda powinna byç pobierana

z tego samego miejsca i w tym samym czasie co osad.

W przypadku badaƒ beztlenowych osad i zwiàzana

z nim woda powinny byç pobierane i transportowane

pod nieobecnoÊç tlenu (zobacz pozycja 28 piÊmiennictwa (zobacz pkt 1.8.2.1). Niektóre urzàdzenia do pobierania prób opisano w pozycji 8 i 23 piÊmiennictwa).

Badanie nale˝y wykonaç w urzàdzeniu inkubacyjnym (zobacz pkt 1.8.1) ze stosunkiem obj´toÊciowym

woda-osad pomi´dzy 3:1 a 4:1 oraz pow∏okà osadu

2,5±0,5 cm1. Jako minimalnà iloÊç osadu zaleca si´

50 g (w przeliczeniu na suchà mas´) w ka˝dym naczyniu.

1.8.3.2. Opracowanie

Osad jest oddzielany od wody przez filtracj´,

a osad przesiewany na mokro przez sito o oczkach

2 mm jest odrzucany. Znane iloÊci wody i osadu miesza si´ w po˝àdanym stosunku (zobacz pkt 1.9.1)

w kolbach inkubacyjnych i przygotowuje do okresu

aklimatyzacji (zobacz pkt 1.8.4). W przypadku badaƒ

beztlenowych wszystkie czynnoÊci nale˝y wykonaç

bez dost´pu do tlenu (zobacz pozycje 29, 30, 31, 32 i 33

piÊmiennictwa).

1.8.3.3. Przechowywanie

Zaleca si´ stosowanie Êwie˝o pobranych osadów,

ale je˝eli przechowywanie jest konieczne, to osad i woda powinny byç przesiane, jak opisano powy˝ej, i przechowywane zalane wodà (warstwa wody 6—10 cm)

w ciemnoÊci w 4±2 °C21 przez maksimum 4 tygodnie

(zobacz pozycje 7, 8 i 23 piÊmiennictwa). Próbki, które

b´dà stosowane w badaniach tlenowych, nale˝y przechowywaç przy swobodnym dost´pie powietrza (np.

otwarte pojemniki), podczas gdy próbki przeznaczone

do badaƒ beztlenowych bez dost´pu tlenu. Podczas

transportu i przechowywania nie powinno dojÊç do

zamarzania osadu i wody oraz wysuszania osadu.

1.8.4. Przygotowanie próbek osadu/wody do badania

Przed dodaniem badanej substancji powinien

mieç miejsce okres aklimatyzacji, podczas którego

ka˝da próbka wody/osadu jest umieszczana w naczyniu inkubacyjnym stosowanym póêniej w badaniu,

a aklimatyzacja powinna byç przeprowadzana w takich samych warunkach jak inkubacja w badaniu (zobacz pkt 1.9.1). Okres aklimatyzacji jest czasem potrzebnym do osiàgni´cia stabilnoÊci uk∏adu, co odzwierciedla si´ w wartoÊci pH, st´˝eniu tlenu w wodzie

i potencjale red-oks w wodzie i osadzie oraz makroskopowym rozdzieleniu faz. Okres aklimatyzacji powinien trwaç pomi´dzy jednym a dwoma tygodniami,

a nie powinien przekraczaç czterech tygodni. Nale˝y

przedstawiç wyniki pomiarów i oznaczeƒ dokonanych

podczas tego okresu.

———————

21 Najnowsze badania wykaza∏y, ˝e przechowywanie

w 4 °C mo˝e doprowadziç do spadku zawartoÊci w´gla

organicznego w osadzie i przez to byç mo˝e do spadku

aktywnoÊci mikroorganizmów 34).

Badanie nale˝y wykonaç w ciemnoÊci w sta∏ej

temperaturze w zakresie 10 do 30 °C. Temperatura

20±2 °C jest w∏aÊciwa. Je˝eli to konieczne, to dla ka˝dego indywidualnego przypadku mo˝na rozpatrywaç

badanie w ni˝szej temperaturze (np. 10 °C) w zale˝noÊci od tego, jaki jest cel badania. Temperatura inkubacji powinna byç monitorowana i przedstawiona

w sprawozdaniu.

1.9.2. Podawanie badanej substancji

Stosuje si´ jedno st´˝enie badanej substancji22.

W przypadku Êrodków ochrony roÊlin stosowanych

bezpoÊrednio na powierzchni´ wody maksymalna zalecana dawka powinna byç zastosowana jako dawka

w badaniu obliczona w oparciu o powierzchni´ wody

w naczyniu doÊwiadczalnym. W innych przypadkach

st´˝enie, które ma byç badane, powinno opieraç si´

na przewidywanych emisjach Êrodowiskowych. Nale˝y podjàç wszelkie starania, aby w∏aÊciwie wyznaczyç

badane st´˝enie oraz aby opisaç szlak przemian i tworzenie i rozpad produktów przemian. Konieczne mo˝e

byç stosowanie wy˝szych dawek (np. 10 razy) w sytuacjach, gdzie st´˝enia badanej substancji sà bliskie ich

granicom oznaczalnoÊci na poczàtku badania i/lub gdy

g∏ówne produkty przemian nie mogà byç ∏atwo wykryte, je˝eli sà obecne w 10 % stosowanej dawki badanej

substancji. Je˝eli stosowane sà jednak st´˝enia wy˝sze, to nie powinny one mieç szkodliwych wp∏ywów

na aktywnoÊç mikroorganizmów uk∏adu woda-osad.

W celu osiàgni´cia sta∏ego st´˝enia badanej substancji w naczyniach o ró˝nych wymiarach, konieczne mo˝e byç wzi´cie pod uwag´ dostosowania iloÊci stosowanego materia∏u w oparciu o g∏´bokoÊç kolumny

wody w naczyniu w odniesieniu do g∏´bokoÊci wody

w warunkach polowych (która, zak∏ada si´, ˝e wynosi

100 cm, ale inne g∏´bokoÊci mogà byç stosowane).

Zobacz Przyk∏ad obliczeƒ dawki do naczyƒ doÊwiadczalnych zawierajàcy przyk∏adowe przeliczenia.

Najlepiej badanà substancj´ stosowaç jako roztwór wodny do fazy wodnej uk∏adu badawczego. Je˝eli nie da si´ tego uniknàç, mo˝na stosowaç ma∏e iloÊci rozpuszczalników mieszajàcych si´ z wodà (takie

jak aceton, etanol) celem wprowadzenia i rozproszenia badanej substancji, ale nie powinny one przekraczaç 1 % v/v i nie powinny mieç szkodliwego wp∏ywu

———————

22 Badanie z drugim st´˝eniem mo˝e byç u˝yteczne dla substancji, które wnikajà do wód powierzchniowych ró˝nymi

szlakami, wp∏ywajàc na tworzenie si´ ró˝nych st´˝eƒ tak

d∏ugo, jak ni˝sze st´˝enie mo˝e byç oznaczone analitycznie z odpowiednià dok∏adnoÊcià.

na aktywnoÊç mikroorganizmów uk∏adu badawczego.

Nale˝y podjàç wszelkie starania, aby w∏aÊciwie przygotowaç roztwory wodne badanej substancji — w∏aÊciwe mo˝e byç stosowanie wczeÊniejszego mieszania i kolumn nasycajàcych dla zapewnienia odpowiedniej jednorodnoÊci. Po dodaniu roztworu wodnego do

uk∏adu badawczego zalecane jest ∏agodne mieszanie

fazy wodnej, wzburzajàc osad jak najmniej to mo˝liwe.

Stosowanie gotowych formulacji nie jest zalecane

do rutynowych badaƒ, poniewa˝ sk∏adniki formulacji

mogà wp∏ywaç na rozmieszczenie badanej substancji

i/lub produktów przemian pomi´dzy fazà wodnà i osadem. Jednak w przypadku substancji s∏abo rozpuszczalnych w wodzie zastosowanie gotowej formulacji

mo˝e byç w∏aÊciwà alternatywà.

Poz. 2119

tów przemian powinny byç wykonywane wed∏ug w∏aÊciwych procedur analitycznych. Nale˝y podjàç wszelkie starania, by usunàç materia∏, który móg∏ adsorbowaç si´ na naczyniu inkubacyjnym lub ∏àczàcym przewodzie do wy∏apywania substancji lotnych.

1.9.4. Opcjonalne badanie wst´pne

Je˝eli czasu trwania badania i re˝imu pobierania

prób nie mo˝na ustaliç na podstawie innych badaƒ

badanej substancji, to w∏aÊciwe mo˝e byç wykonanie

badania wst´pnego, które powinno byç wykonane

w takich samych warunkach badania, jak podczas badania Êcis∏ego. Warunki doÊwiadczenia i wyniki badania wst´pnego, je˝eli by∏o wykonane, powinny byç

krótko przedstawione w sprawozdaniu.

1.9.5. Pomiary i analiza

Liczba naczyƒ inkubacyjnych zale˝y od tego, ile razy pobiera si´ próbki (zobacz pkt 1.9.3). Na doÊwiadczenie powinna sk∏adaç si´ wystarczajàca liczba naczyƒ, tak aby w ka˝dym czasie poboru próbek mo˝na

by∏o poÊwi´ciç dwa naczynia. Jednostki kontrolne

ka˝dego uk∏adu osadu wodnego nie powinny byç nara˝ane na badanà substancj´. Jednostki kontrolne

mogà byç wykorzystywane do okreÊlania biomasy mikroorganizmów osadu oraz ca∏kowitego w´gla organicznego wody i osadu na zakoƒczenie badania. Dwie

jednostki kontrolne (tj. jedna jednostka kontrolna

z ka˝dego osadu wodnego) mogà byç stosowane do

monitorowania wymaganych parametrów w osadzie

i wodzie podczas okresu aklimatyzacji (zobacz Tabela

w pkt 1.8.2.2). Nale˝y do∏àczyç dwie dodatkowe jednostki kontrolne, gdy badana substancja jest podawana za pomocà rozpuszczalnika celem oznaczenia szkodliwych wp∏ywów na aktywnoÊç mikroorganizmów

w uk∏adzie badawczym.

1.9.3. Czas trwania badania i pobieranie próbek

Czas trwania badania nie powinien przekraczaç

100 dni (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa), a badanie

powinno byç kontynuowane a˝ do ustalenia szlaku

rozpadu i rozmieszczenia w osadzie/wodzie lub gdy

90 % badanej substancji zanik∏o przez przemiany i/lub

ulotnienie. Próby nale˝y pobieraç przynajmniej szeÊç

razy (w tym czas zerowy) z opcjonalnym badaniem

wst´pnym (zobacz pkt 1.9.4) stosowanym do ustalenia

odpowiedniego re˝imu pobierania prób i czasu trwania badania, chyba ˝e istniejà wystarczajàce dane na

temat badanej substancji z badaƒ wczeÊniejszych.

W przypadku hydrofobowych substancji konieczne

mogà byç dodatkowe pobierania prób, aby okreÊliç

ich rozmieszczenie pomi´dzy osadem i fazà wodnà.

W odpowiednim czasie do analizy pobierane sà

ca∏e naczynia inkubacyjne (w powtórzeniu). Osad

i woda sà analizowane oddzielnie23. Woda powinna

byç zebrana ostro˝nie tak, by nie wzburzyç osadu. Ekstrakcja i charakteryzacja badanej substancji i produk———————

23 W przypadkach gdzie mo˝e ∏atwo nastàpiç gwa∏towna

reoksydacja beztlenowych produktów przemian, warunki

beztlenowe nale˝y utrzymaç podczas pobierania prób

i analizy.

Nale˝y okreÊliç i podaç w sprawozdaniu st´˝enie

badanej substancji (jako st´˝enie i procent stosowanej

dawki) i produktów przemian w ka˝dym okresie pobierania prób. Na ogó∏ zidentyfikowaç nale˝y produkty

przemian wykrywane w ≥10 % zastosowanej radioaktywnoÊci w ca∏ym uk∏adzie woda-osad, w ka˝dym czasie poboru, chyba ˝e istnieje uzasadnienie, by post´powaç inaczej. Produkty przemian, których st´˝enia

wzrastajà przez ca∏y czas badania, tak˝e powinny byç

brane pod uwag´ przy identyfikacji, nawet je˝eli ich

st´˝enia nie przekraczajà granic podanych powy˝ej,

poniewa˝ mo˝e to wskazywaç na ich trwa∏oÊç. Takie

przypadki nale˝y rozpatrywaç indywidualnie, a uzasadnienia przedstawiç w sprawozdaniu.

Dla ka˝dego czasu pobierania prób przedstawiç

nale˝y wyniki oznaczeƒ z uk∏adów wy∏apujàcych gazy/substancje lotne (CO2 i inne tj. lotne zwiàzki organiczne). Nale˝y przedstawiç stopieƒ mineralizacji. Dla

ka˝dego czasu pobierania prób przedstawiç nale˝y

nieekstrahowalne (zwiàzane) pozosta∏oÊci w osadzie.

2. WYNIKI

2.1. Opracowanie wyników

Ca∏kowity bilans wagowy lub odzysk (zobacz

pkt 1.7.1) dodanej radioaktywnoÊci powinien byç obliczony w ka˝dym czasie pobierania próbek. Wyniki nale˝y podaç jako procent dodanej radioaktywnoÊci.

Rozmieszczenie radioaktywnoÊci pomi´dzy fazà wodnà i osadem powinno byç przedstawione jako st´˝enia

i procenty w ka˝dym czasie pobrania prób.

Okres pó∏rozpadu, wartoÊç DT50 i, je˝eli to w∏aÊciwe,

wartoÊci DT75 i DT90 badanej substancji powinny byç obliczone wraz z odpowiednimi przedzia∏ami ufnoÊci (zobacz pkt 1.7.3). Informacje o rozproszeniu badanej substancji w wodzie i osadzie mo˝na otrzymaç poprzez zastosowanie odpowiednich narz´dzi szacowania. Do tych

zalicza si´ kinetyk´ pseudopierwszego rz´du, techniki

empirycznego dopasowania krzywej, stosujàc rozwiàzania graficzne lub liczbowe i bardziej z∏o˝one, jak na przyk∏ad pojedynczo- lub wieloprzedzia∏owe modele. Dalsze

szczegó∏y mo˝na znaleêç w odpowiednim piÊmiennictwie (zobacz pozycje 35, 36 i 37 piÊmiennictwa).

Wszystkie sposoby obliczeƒ majà swoje s∏abe i silne strony i ró˝nià si´ swojà z∏o˝onoÊcià. Za∏o˝enie kinetyki pierwszego rz´du mo˝e byç zbytnim uproszczeniem procesów rozk∏adu i rozmieszczenia, ale je˝eli

jest to mo˝liwe, to dostarcza wartoÊç (sta∏à lub wartoÊç

pó∏rozk∏adu), która jest ∏atwa w zrozumieniu i ma zastosowanie w modelowaniu symulacyjnym i obliczeniach przewidywanych st´˝eƒ Êrodowiskowych. Sposoby empiryczne lub transformacje liniowe mogà dawaç lepsze dopasowanie krzywych do danych i przez

to pozwalaç na lepsze oszacowanie okresów pó∏rozpadu, wartoÊci DT50 i, je˝eli to w∏aÊciwe, wartoÊci DT75

i DT90. Zastosowanie wyprowadzonych sta∏ych jest

jednak ograniczone. Modele przedzia∏owe mogà wygenerowaç wiele po˝ytecznych sta∏ych o wartoÊci

w oszacowaniu ryzyka, które opisujà stopieƒ rozk∏adu

w ró˝nych przedzia∏ach i rozproszenie substancji. Powinny byç one tak˝e stosowane do szacowania sta∏ych

stopnia tworzenia i rozpadu g∏ównych produktów

przemian. We wszystkich przypadkach zastosowana

metoda musi mieç swoje uzasadnienie, a osoba wykonujàca doÊwiadczenie powinna wykazaç graficznie

i/lub statystycznie dobroç dopasowania.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie koƒcowe

Sprawozdanie z badania powinno zawieraç nast´pujàce informacje

Badana substancja

— nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer

CAS, wzór strukturalny (wskazujàc pozycj´ znaczników, gdy stosowano materia∏ znakowany radioaktywnie) i wa˝ne w∏asnoÊci fizykochemiczne,

— czystoÊç (zanieczyszczenia) badanej substancji,

— czystoÊç radiochemiczna znakowanego zwiàzku

i specyficzna aktywnoÊç (gdy to w∏aÊciwe).

Substancja kontrolna

— nazwa chemiczna i struktura substancji kontrolnej

stosowanej do opisu i/lub identyfikacji produktu

przemiany.

Badane osady i wody

— szczegó∏y dotyczàce miejsca pobrania, dodajàc,

je˝eli to mo˝liwe, dane archiwalne dotyczàce zanieczyszczeƒ,

— wszystkie informacje dotyczàce pobierania, okresu przechowywania (je˝eli by∏a przechowywana)

i aklimatyzacji uk∏adów woda-osad,

— w∏asnoÊci prób woda-osad jak przedstawiono

w tabeli C.24.1, w pkt 1.8.2.2.

Poz. 2119

wy wodnej i osadu, rozmiary naczynia doÊwiadczalnego),

— podawanie badanej substancji do uk∏adu badawczego: stosowane st´˝enie, liczba powtórzeƒ

i kontroli, sposób podania badanej substancji (np.

zastosowanie rozpuszczalnika) itp.,

— temperatura inkubacji,

— czasy pobierania prób,

— metody ekstrakcji i ich wydajnoÊci, a tak˝e metody analityczne i granice oznaczalnoÊci,

— metody charakteryzacji/identyfikacji produktów

przemian,

— odchylenia od sposobu post´powania lub warunki podczas doÊwiadczenia.

Wyniki

— dane

pierwotne

reprezentatywnych

analiz

(wszystkie dane pierwotne nale˝y przechowywaç

w archiwum zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki

Laboratoryjnej),

— powtarzalnoÊç i czu∏oÊç stosowanych metod analitycznych,

— stopieƒ odzysku (wartoÊci % dla zwalidowanego

badania podano w pkt 1.7.1),

— przedstawione w postaci tabel wyniki wyra˝one

jako % stosowanej poczàtkowej dawki i jako

mg/kg w wodzie, osadzie i ca∏ym systemie (tylko %) dla badanej substancji i, gdy to w∏aÊciwe,

dla produktów przemian i nieekstrahowalnej radioaktywnoÊci,

— bilans masy podczas i na koniec badania,

— graficzne przedstawienie przemian w wodzie

i osadzie oraz w ca∏ym systemie (w tym mineralizacja),

— stopnie mineralizacji,

— okres pó∏rozpadu i wartoÊç DT50 oraz, gdy to w∏aÊciwe, wartoÊci DT75 i DT90 dla badanej substancji

i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych produktów przemian wraz z przedzia∏ami ufnoÊci w wodzie, osadzie i ca∏ym uk∏adzie,

— oszacowanie kinetyki przemian dla badanej substancji i, gdy to w∏aÊciwe, dla g∏ównych produktów przemian,

— proponowane szlaki przemian, gdy to w∏aÊciwe,

— dyskusja wyników.

4. PIÂMIENNICTWO

Warunki badania

— stosowany uk∏ad badawczy (np.: przep∏ywowy,

biometryczny, sposób wentylacji, metoda mieszania, obj´toÊç wody, masa osadu, gruboÊç pokry-

1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV,

Section 5—1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.

2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part

G. Behaviour of the product and its metabolites in

soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.

3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water

systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.

Poz. 2119

tes. Studies with 14C-labelled model surfactants.

Water Research 21, 661—667.

18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of

Agronomy, Madison.

19) APHA (1989). Standard Methods for Examination

of Water and Wastewater (17th edition). American

Public Health Association, American Water Works

Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.

4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and

fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) — Anaerobic

and aerobic. Canada. pp. 35—37.

20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.

5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982).

Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.

21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038—

1039.

6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for

assessing the environmental fate and ecotoxicity

of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.

22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in

freshwater mesocosms. From the Workshop

„A Meeting of Experts on Guidelines for Static

Field Mesocosms Tests”, 3—4 July 1991.

7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final

Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.

8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality — Sampling — Part 12: Guidance on sampling of bottom

sediments.

9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines

(OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.

10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley–VCH (1998).

11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues

in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945—956

(IUPAC 1984).

12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).

13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals.

Paris. OECD (1994—2000): Addenda 6—11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.

14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M.

(1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC — Pests and Diseases, 3B-4,

149—158.

15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to

studying the fate of pesticides in soil. In Progress

in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85—114. J. Wiley & Sons.

23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays

for freshwater and marine environments. From

the Workshop On Sediment Toxicity Assessment

(WOSTA), 8—10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P.

Matthiessen and F. Heimbach.

24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858—2868.

25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M.

(1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329—338.

26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising

microbial populations under in-situ conditions.

Soil Biol. Biochem. 17, 197—203.

27) ISO–14240–2. (1997). Soil quality — Determination of soil microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method. PN-ISO 14240-2:2001 JakoÊç gleby — Oznaczanie iloÊci biomasy mikroorganizmów w glebie — Metoda fumigacji — ekstrakcji.

28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine.

Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13—21.

16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in

soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631—637.

29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation

potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850—857.

17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxyla-

30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E.,

Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J.

(1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527—1550.

nants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58,

961—968.

31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic

biodegradation tests for organic compounds.

Chemoshpere 27, 1499—1509.

35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation

of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer, 39,

187—203.

32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test

for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597—3603.

33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines

(OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.

34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contami-

36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer, 33, 47—60.

37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of

a compartment model for evaluating the fate of

pesticides in sediment/water systems. Brighton

Crop Protection Conference — Pest and Diseases,

pp. 1349—1354.

WYTYCZNE DO BEZTLENOWYCH I TLENOWYCH UK¸ADÓW BADAWCZYCH

Tlenowy uk∏ad badawczy

Tlenowy uk∏ad badawczy opisany w niniejszej metodzie badawczej sk∏ada si´ z tlenowej warstwy wodnej (typowe st´˝enia tlenu w zakresie od 7 do 10 mg/l)

i warstwy osadu, tlenowej na powierzchni i beztlenowej poni˝ej powierzchni (typowy zakres potencja∏u

red-oks (Eh) w strefie beztlenowej osadu w zakresie

od –80 do –190 mV). Nawilgocone powietrze jest

przepuszczane nad powierzchnià wody w ka˝dej jednostce inkubacyjnej, aby utrzymaç wystarczajàcà

iloÊç tlenu.

Beztlenowy uk∏ad badawczy

W przypadku beztlenowego uk∏adu badawczego

sposób post´powania jest taki sam, jak opisany dla

uk∏adu tlenowego, z wyjàtkiem tego, ˝e nad powierzchnià wody w ka˝dej jednostce inkubacyjnej

przepuszczany jest azot, by utrzymaç jego wystarczajàcà iloÊç. Osad i wod´ uwa˝a si´ za beztlenowe, gdy

potencja∏ red-oks (Eh) jest ni˝szy ni˝ –100 mV.

W badaniu beztlenowym do oszacowania mineralizacji zalicza si´ pomiar powsta∏ego dwutlenku w´gla

i metanu.

RYSUNEK C.24.1

PRZYK¸AD GAZOWEGO URZÑDZENIA PRZEP¸YWOWEGO

RYSUNEK C.24.2

PRZYK¸AD URZÑDZENIA BIOMETRYCZNEGO

PRZYK¸AD OBLICZE¡ DAWKI DO NACZY¡ DOÂWIADCZALNYCH

Wewn´trzna Êrednica cylindra

= 8 cm

G∏´bokoÊç kolumny wody, nie wliczajàc osadu

= 12 cm

Pole powierzchni: 3,142 x 42

= 50,3 cm2

Dawka: 500 g badanej substancji/ha odpowiada 5 µg/cm2

Ca∏kowite µg: 5 x 50,3

251,5 µg

Dostosowaç iloÊç w odniesieniu do g∏´bokoÊci 100 cm

12 x 251,5÷100

30,18 µg

Obj´toÊç kolumny wody: 50,3 x 12

603 ml

St´˝enie w wodzie: 30,18÷603

0,050 µg/ml lub 50 µg/l

Egzemplarze bie˝àce oraz archiwalne mo˝na nabywaç

– w Wydziale Wydawnictw i Poligrafii Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów, ul. Powsiƒska 69/71,

02-903 Warszawa, tel. 0-22 694-67-00, 0-22 694-60-96 — na podstawie nades∏anego zamówienia (wy∏àcznie sprzeda˝ wysy∏kowa);

– w punktach sprzeda˝y Dziennika Ustaw i Monitora Polskiego w Warszawie (sprzeda˝ wy∏àcznie za gotówk´)

– ul. Powsiƒska 69/71, tel. 0-22 694-62-96

– al. Szucha 2/4, tel. 0-22 629-61-73 (od 2000 r.)

Reklamacje z powodu niedor´czenia poszczególnych numerów zg∏aszaç nale˝y na piÊmie do Wydzia∏u Wydawnictw i Poligrafii

Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów, ul. Powsiƒska 69/71, 02-903 Warszawa,

do 15 dni po otrzymaniu nast´pnego kolejnego numeru

O wszelkich zmianach nazwy lub adresu prenumeratora prosimy niezw∏ocznie informowaç na piÊmie Wydzia∏ Wydawnictw i Poligrafii

Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów

Dziennik Ustaw i Monitor Polski (spis treÊci) dost´pne sà w Internecie pod adresem www.cokprm.gov.pl

Wydawca: Kancelaria Prezesa Rady Ministrów

Redakcja: Rzàdowe Centrum Legislacji — Redakcja Dziennika Ustaw Rzeczypospolitej Polskiej

oraz Dziennika Urz´dowego Rzeczypospolitej Polskiej „Monitor Polski”,

Al. Ujazdowskie 1/3, 00-583 Warszawa, tel. 0-22 622-66-56

Sk∏ad, druk i kolporta˝: Wydzia∏ Wydawnictw i Poligrafii Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów

ul. Powsiƒska 69/71, 02-903 Warszawa, tel.: 0-22 694-67-50, 0-22 694-67-52; faks 0-22 694-62-06

Bezp∏atna infolinia: 0-800-287-581 (czynna w godz. 730–1530)

www.cokprm.gov.pl

e-mail: dziust@cokprm.gov.pl

T∏oczono z polecenia Prezesa Rady Ministrów w Wydziale Wydawnictw i Poligrafii Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów,

ul. Powsiƒska 69/71, 02-903 Warszawa

Zam. 2986/W/C/2005

ISSN 0867-3411

Cena 13,20 z∏ (w tym 7 % VAT)

Warszawa, dnia 22 grudnia 2005 r.

Nr 251

TREÂå

Poz.

ROZPORZÑDZENIE

2119 — Ministra Zdrowia z dnia 21 listopada 2005 r. zmieniajàce rozporzàdzenie w sprawie

metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych . . . . . . . . . . . . 16357

2119

ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ZDROWIA1)

z dnia 21 listopada 2005 r.

zmieniajàce rozporzàdzenie w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych,

toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych2)

Na podstawie art. 24 ust. 2 pkt 1 ustawy z dnia

11 stycznia 2001 r. o substancjach i preparatach chemicznych (Dz. U. Nr 11, poz. 84, z póên. zm.3)) zarzàdza

si´, co nast´puje