Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 kwietnia 2004 r. w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum

§ 1. Rozporzàdzenie okreÊla szczegó∏owe sposoby

post´powania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum, powodujàcej chorob´ zwanà Êluzakiem, w celu jej zlokalizowania i okreÊlenia rozprzestrzenienia, niedopuszczenia do jej wystàpienia i rozprzestrzenienia oraz

zwalczenia i zniszczenia tej bakterii, w tym

1) metody zwalczania i zapobiegania rozprzestrzenianiu si´;

2) metody wykrywania i identyfikacji;

3) sposób wyznaczania stref, w których powinny byç

stosowane Êrodki w celu zwalczania lub zapobiegania rozprzestrzenianiu si´ bakterii;

4) warunki prowadzenia produkcji, obrotu, przemieszczania, przechowania, nabywania lub zbywania roÊlin.

§ 2. U˝yte w rozporzàdzeniu okreÊlenia oznaczajà

1) sadzenie — ka˝dà czynnoÊç majàcà na celu

umieszczenie roÊlin w sposób umo˝liwiajàcy ich

wzrost, reprodukcj´ lub rozmno˝enie;

2) roÊliny przeznaczone do sadzenia

a) roÊliny ju˝ posadzone, które majà pozostaç

w pod∏o˝u uprawowym lub byç przesadzone, lub

b) roÊliny nieposadzone w chwili wprowadzania

do obrotu lub przemieszczania, lecz przeznaczone do póêniejszego sadzenia;

3) urz´dowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka —

sadzeniaki ziemniaka uznane w urz´dowej ocenie

za elitarne lub kwalifikowane;

————————

1) Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje dzia∏em administracji rzàdowej — rolnictwo, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 1

rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca

2002 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305).

2) Przepisy niniejszego rozporzàdzenia wdra˝ajà postanowienia dyrektywy 98/57/EEC z dnia 20 lipca 1998 r. w sprawie

zwalczania Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et. al.

(Dz. Urz. WE L 235, z 21.08.1998 r.).

Dane dotyczàce og∏oszenia aktów prawa Unii Europejskiej, zamieszczone w niniejszym rozporzàdzeniu, z dniem

uzyskania przez Rzeczpospolità Polskà cz∏onkostwa

w Unii Europejskiej, dotyczà og∏oszenia tych aktów

w Dzienniku Urz´dowym Unii Europejskiej — wydanie

specjalne.

4) miejsce produkcji — wszelkie obiekty, w szczególnoÊci magazyny, przechowalnie, szklarnie, tunele

foliowe lub pola znajdujàce si´ w obr´bie jednego

gospodarstwa lub jego cz´Êci, lub w obr´bie kilku

gospodarstw, stanowiàce jednà zorganizowanà

ca∏oÊç;

5) sadzeniaki ziemniaka — ziemniaki przeznaczone

do sadzenia, pochodzàce w linii prostej z materia∏u uzyskanego wed∏ug urz´dowo zatwierdzonego

programu, w którym materia∏ uznano za wolny od

organizmów szkodliwych w wyniku badaƒ urz´dowych lub nadzorowanych z urz´du, wykonanych

z zastosowaniem metody okreÊlonej w za∏àczniku

do rozporzàdzenia.

§ 3. Kontroli majàcej na celu sprawdzenie wyst´powania bakterii Ralstonia solanacearum, zwanej dalej „kontrolà urz´dowà”, podlegajà

1) roÊliny ziemniaka (Solanum tuberosum), w tym

bulwy, z wyjàtkiem nasion;

2) roÊliny pomidora (Lycopersicon

z wyjàtkiem owoców i nasion;

esculentum),

3) miejsca produkcji roÊlin, o których mowa w pkt 1

i 2, je˝eli istnieje ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum;

4) inne roÊliny ˝ywicielskie wraz z dziko rosnàcymi

roÊlinami psiankowatymi;

5) wody powierzchniowe wykorzystywane do nawadniania lub oprysków roÊlin wymienionych

w pkt 1 i 2;

6) p∏ynne resztki powstajàce w czasie procesów

przemys∏owych lub w miejscach pakowania roÊlin, o których mowa w pkt 1 i 2, wykorzystywane

do nawadniania lub oprysków tych roÊlin;

7) pod∏o˝a uprawowe, gleba i resztki sta∏e powstajàce w czasie procesów przemys∏owych lub w miejscach pakowania roÊlin, je˝eli istnieje ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum.

§ 4. 1. Kontrole urz´dowe wojewódzki inspektor

ochrony roÊlin i nasiennictwa, zwany dalej „wojewódzkim inspektorem”, przeprowadza w zakresach

i terminach uwzgl´dniajàcych systemy produkcji roÊlin ziemniaka, pomidora lub innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum oraz biologi´ tej

bakterii, a tak˝e wiedz´ naukowà w tym zakresie.

2. Kontrole urz´dowe obejmujà, w przypadku

1) ziemniaka

a) wizualnà inspekcj´ uprawy roÊlin,

b) pobieranie prób, zarówno ziemniaków sadzeniaków, jak i innych ziemniaków, w czasie sezonu uprawy lub w przechowalni,

c) ocen´ makroskopowà bulw po ich przekrojeniu,

d) badanie laboratoryjne ziemniaków sadzeniaków, z zastosowaniem metodyki okreÊlonej

w za∏àczniku do rozporzàdzenia;

2) pomidora — przynajmniej wizualnà inspekcj´ roÊlin, które sà przeznaczone do sadzenia przez podmioty zawodowo trudniàce si´ uprawà pomidorów;

3) innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum oraz pod∏o˝y, wody i resztek powstajàcych w czasie procesów przemys∏owych lub

w miejscach pakowania roÊlin ziemniaka lub pomidora, lub innych roÊlin ˝ywicielskich

a) wizualnà inspekcj´ roÊlin,

b) pobieranie i badanie prób.

§ 5. W przypadku podejrzenia wystàpienia bakterii

Ralstonia solanacearum, wojewódzki inspektor przeprowadza badanie laboratoryjne

1) roÊlin ziemniaka i pomidora — z zastosowaniem

metodyki okreÊlonej w za∏àczniku do rozporzàdzenia;

2) innych roÊlin ˝ywicielskich oraz wód powierzchniowych, p∏ynnych i sta∏ych resztek powstajàcych

w czasie procesów przemys∏owych lub w miejscach pakowania roÊlin ziemniaka, pomidora i innych roÊlin ˝ywicielskich, a tak˝e pod∏o˝y uprawowych i gleby — z zastosowaniem uznanych metod

badawczych.

§ 6. Do czasu zakoƒczenia badaƒ laboratoryjnych

majàcych na celu potwierdzenie lub wykluczenie pora˝enia roÊlin przez bakteri´ Ralstonia solanacearum,

zabezpiecza si´ i przechowuje

1) parti´ materia∏u roÊlinnego lub jej cz´Êç, z której

pobrano prób´, w oryginalnym opakowaniu wraz

z etykietà;

2) pozosta∏à cz´Êç próby, o której mowa w pkt 1, je˝eli to mo˝liwe;

3) pozosta∏y ekstrakt i dodatkowy materia∏ przygotowany do wst´pnych badaƒ umo˝liwiajàcych postawienie wst´pnej diagnozy;

4) ca∏à dokumentacj´ dotyczàcà pobrania próby i badaƒ.

§ 7. 1. W przypadku podejrzenia wystàpienia lub

w przypadku potwierdzenia w czasie badaƒ laboratoryjnych wyst´powania bakterii Ralstonia solanace-

Poz. 775

arum, G∏ówny Inspektor Ochrony RoÊlin i Nasiennictwa powiadamia o tym Komisj´ Europejskà i inne paƒstwa cz∏onkowskie Unii Europejskiej.

2. W przypadku potwierdzenia w czasie badaƒ laboratoryjnych wyst´powania bakterii Ralstonia solanacearum, przez co najmniej miesiàc od dnia powiadomienia, o którym mowa w ust. 1, zabezpiecza si´

i przechowuje

1) ca∏y materia∏ dotyczàcy pobrania próby i badaƒ

wraz z dokumentacjà, o których mowa w § 6;

2) prób´ pora˝onego materia∏u roÊlinnego pomidora

lub ober˝yny, zainokulowanego ekstraktem z bulw

lub roÊlin, je˝eli to mo˝liwe;

3) wyizolowanà kultur´ bakterii Ralstonia solanacearum.

§ 8. W przypadku pobrania prób do badaƒ laboratoryjnych lub w przypadku podejrzenia wystàpienia

pora˝enia przez bakteri´ Ralstonia solanacearum, je˝eli widoczne sà objawy choroby, o których mowa

w za∏àczniku do rozporzàdzenia w cz´Êci II, wywo∏ywanej przez t´ bakteri´, i otrzymano pozytywny wynik

po przeprowadzeniu wst´pnych badaƒ okreÊlonych

w za∏àczniku do rozporzàdzenia w cz´Êci I w ust. 1

i w cz´Êci II albo je˝eli objawy choroby nie sà widoczne, a otrzymano pozytywny wynik po przeprowadzeniu badaƒ okreÊlonych w za∏àczniku do rozporzàdzenia w cz´Êci I w ust. 2 i w cz´Êci III, do czasu uzyskania

wyników potwierdzajàcych lub wykluczajàcych obecnoÊç bakterii Ralstonia solanacearum

1) nie przemieszcza si´ roÊlin lub bulw pochodzàcych ze wszystkich upraw, partii roÊlin lub przesy∏ek, z których pobrano próby, chyba ˝e przemieszczanie to odbywa si´ pod nadzorem wojewódzkiego inspektora i je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´ bakterii Ralstonia solanacearum;

2) roÊliny pochodzàce z upraw, partii roÊlin lub przesy∏ek, z których pobrano próby, nie mogà byç

przeznaczone do sadzenia i nie mogà byç w czasie

zbioru, transportu lub przechowywania, mieszane

z innymi partiami roÊlin;

3) wojewódzki inspektor

a) podejmuje czynnoÊci majàce na celu wykrycie

êród∏a pochodzenia prawdopodobnego pora˝enia,

b) mo˝e wprowadziç inne, ni˝ okreÊlone w pkt 1

i 2, dzia∏ania zapobiegajàce rozprzestrzenianiu

si´ bakterii Ralstonia solanacearum.

§ 9. Je˝eli w badaniach laboratoryjnych, przeprowadzonych z zastosowaniem metodyki okreÊlonej

w za∏àczniku do rozporzàdzenia, zostanie potwierdzona obecnoÊç bakterii Ralstonia solanacearum w próbie, wojewódzki inspektor

1) w przypadku roÊlin ziemniaka, w tym bulw ziemniaka, lub roÊlin pomidora

a) ustala zasi´g i pierwotne êród∏a pora˝enia,

zgodnie z § 10, oraz przeprowadza badania co

najmniej wszystkich rozmno˝eƒ klonalnych sadzeniaków ziemniaka,

b) uznaje za pora˝one roÊliny, przesy∏k´ lub parti´

roÊlin ziemniaka lub pomidora, z których pobierane by∏y próby,

c) uznaje za ska˝one maszyny, urzàdzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich cz´Êci, materia∏y u˝ywane do pakowania i inne przedmioty,

które mia∏y kontakt z pora˝onymi roÊlinami

ziemniaka lub pomidora,

d) uznaje za pora˝one pola, miejsca uprawy pod

os∏onami i miejsca produkcji, w których ros∏y

lub odbywa∏y si´ zbiory pora˝onych roÊlin

ziemniaka lub pomidora, je˝eli ma to zastosowanie,

e) ustala zasi´g prawdopodobnego pora˝enia,

zgodnie z § 11, bioràc pod uwag´: kontakt z pora˝onymi roÊlinami ziemniaka lub pomidora

przed zbiorami lub po zbiorach, kontakt ze ska˝onymi maszynami, urzàdzeniami, pojazdami,

pojemnikami, magazynami lub ich cz´Êciami,

materia∏ami u˝ywanymi do pakowania, o których mowa w lit. c, oraz kontakt z pora˝onym

polem, miejscem uprawy pod os∏onami lub

miejscem produkcji, o których mowa w lit. d,

a tak˝e powiàzania produkcyjne, nawadnianie

lub spryskiwanie, lub pokrewieƒstwo klonalne,

f) ustala zasi´g mo˝liwego rozprzestrzeniania si´

bakterii Ralstonia solanacearum, zgodnie z § 12,

g) na podstawie stwierdzonego pora˝enia i ska˝enia, okreÊlonego zasi´gu prawdopodobnego

pora˝enia i mo˝liwego rozprzestrzeniania si´

bakterii wyznacza stref´, w której podejmowane b´dà dzia∏ania w celu zwalczania i zapobiegania rozprzestrzenianiu si´ bakterii Ralstonia

solanacearum, zwanà dalej „strefà zagro˝enia”;

2) w przypadku upraw innych roÊlin ˝ywicielskich, je˝eli uprawa roÊlin ziemniaka lub pomidora zosta∏a

uznana za zagro˝onà

a) ustala zasi´g i pierwotne êród∏a pora˝enia oraz

przeprowadza testy na co najmniej wszystkich

rozmno˝eniach klonalnych sadzeniaków ziemniaka,

b) okreÊla jako pora˝one przez bakteri´ Ralstonia

solanacearum te roÊliny ˝ywicielskie, z których

pobrano próby,

c) okreÊla prawdopodobne pora˝enie i ska˝enie

oraz wyznacza stref´ zagro˝enia, bioràc pod

uwag´ powiàzania produkcyjne roÊlin ziemniaka lub pomidora;

3) w przypadku wód powierzchniowych lub p∏ynnych resztek powstajàcych w czasie procesów

przemys∏owych lub w miejscach pakowania roÊlin

ziemniaka lub pomidora oraz zwiàzanych z nimi

dziko rosnàcych roÊlin ˝ywicielskich z rodziny

psiankowatych, je˝eli istnieje zagro˝enie dla produkcji roÊlin ziemniaka lub pomidora w zwiàzku

Poz. 775

z nawadnianiem, opryskiwaniem lub zalewaniem

wodami powierzchniowymi

a) ustala zasi´g pora˝enia po przeprowadzeniu

urz´dowego badania prób tych wód, resztek

p∏ynnych lub dziko rosnàcych roÊlin ˝ywicielskich z rodziny psiankowatych, je˝eli one wyst´pujà,

b) okreÊla jako ska˝one wody powierzchniowe,

z których pobrano próby, na podstawie wyników badania, o którym mowa w lit. a,

c) okreÊla prawdopodobne pora˝enie i ska˝enie

oraz wyznacza stref´ zagro˝enia.

§ 10. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu

i pierwotnego êród∏a pora˝enia obejmujà

1) miejsca produkcji, w których

a) sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka pochodzàce z tego samego rozmno˝enia klonalnego,

co roÊliny ziemniaka uznane za pora˝one przez

bakteri´ Ralstonia solanacearum,

b) sà lub by∏y uprawiane roÊliny pomidora pochodzàce z tego samego êród∏a, co roÊliny pomidora uznane za pora˝one przez bakteri´ Ralstonia

solanacearum,

c) sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka lub

pomidora, które zosta∏y poddane urz´dowemu

nadzorowi, ze wzgl´du na podejrzenie wystàpienia bakterii Ralstonia solanacearum,

d) sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka pochodzàce z tego samego rozmno˝enia klonalnego, co roÊliny ziemniaka uprawiane w miejscach produkcji uznanych za pora˝one przez

bakteri´ Ralstonia solanacearum,

e) sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka lub

pomidora, a miejsce ich uprawy po∏o˝one jest

lub by∏o w sàsiedztwie pora˝onych miejsc produkcji, wraz z miejscami produkcji, w których

wspólnie u˝ytkowany jest lub by∏ sprz´t i urzàdzenia u˝ywane w produkcji,

f) do nawadniania lub opryskiwania u˝ywa si´

wód powierzchniowych pochodzàcych

— z jakiegokolwiek êród∏a, które zosta∏o uznane za ska˝one lub podejrzane o ska˝enie

bakterià Ralstonia solanacearum,

— ze êród∏a u˝ytkowanego tak˝e w miejscach

produkcji uznanych za pora˝one lub podejrzane o pora˝enie bakterià Ralstonia solanacearum,

g) pola sà lub by∏y zalewane przez wody powierzchniowe uznane za ska˝one lub podejrzane o ska˝enie przez bakteri´ Ralstonia solanacearum;

2) wody powierzchniowe u˝ywane do nawadniania

lub opryskiwania lub, które zalewajà pola lub

miejsca produkcji, uznane za pora˝one albo podejrzane o pora˝enie bakterià Ralstonia solanacearum.

§ 11. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu

prawdopodobnego pora˝enia obejmujà

1) inne roÊliny ziemniaka lub pomidora, uprawiane

w miejscu produkcji okreÊlonym jako pora˝one;

2) miejsca produkcji, które mia∏y jakikolwiek kontakt

z roÊlinami ziemniaka lub pomidora okreÊlonymi

jako pora˝one, wraz z miejscami produkcji, w których wspólnie u˝ytkowany jest lub by∏ sprz´t

i urzàdzenia u˝ywane w cyklu produkcyjnym;

3) roÊliny ziemniaka lub pomidora produkowane

w miejscach produkcji, o których mowa w pkt 2;

4) roÊliny ziemniaka lub pomidora znajdujàce si´

w miejscach produkcji, o których mowa w pkt 1

lub 2, w okresie, w którym roÊliny ziemniaka lub

pomidora, uznane za pora˝one, znajdowa∏y si´

w miejscach produkcji okreÊlonych jako pora˝one;

5) miejsca przechowywania roÊlin ziemniaka lub pomidora pochodzàcych z miejsc produkcji wymienionych w pkt 1—4;

6) maszyny, urzàdzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich cz´Êci, materia∏y u˝ywane do pakowania i inne przedmioty, które mog∏y mieç kontakt

z roÊlinami ziemniaka lub pomidora uznanymi za

pora˝one;

7) roÊliny ziemniaka lub pomidora przechowywane

lub majàce kontakt z jakimikolwiek obiektami lub

przedmiotami, o których mowa w pkt 6, przed ich

wyczyszczeniem i zdezynfekowaniem;

8) roÊliny, w tym bulwy ziemniaka, okreÊlone zgodnie § 9 pkt 1 lit. a, pochodzàce z tego samego rozmno˝enia klonalnego lub roÊliny pomidora pochodzàce z tego samego êród∏a, co roÊliny ziemniaka lub pomidora uznane za pora˝one, je˝eli istnieje prawdopodobieƒstwo pora˝enia ze wzgl´du

na pokrewieƒstwo klonalne, pomimo uzyskania

negatywnych wyników badaƒ;

9) miejsca produkcji roÊlin ziemniaka lub pomidora,

o których mowa w pkt 8;

10) miejsca produkcji roÊlin ziemniaka lub pomidora,

w których do nawadniania i opryskiwania u˝ywana by∏a woda uznana za ska˝onà;

11) roÊliny ziemniaka lub pomidora produkowane na

polach zalewanych wodami powierzchniowymi

uznanymi za ska˝one.

§ 12. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu

mo˝liwego rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia

solanacearum obejmujà

1) w przypadkach gdy roÊliny ziemniaka lub pomidora zosta∏y uznane za pora˝one — miejsca produkcji, w których

a) sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka lub

pomidora, znajdujàce si´ w sàsiedztwie miejsc

produkcji uznanych za pora˝one,

Poz. 775

b) stosowana jest lub by∏a wspólna produkcja

i u˝ywany jest lub by∏ ten sam materia∏ wyjÊciowy sadzeniaka ziemniaka,

c) do nawadniania lub opryskiwania roÊlin ziemniaka lub pomidora u˝ywa si´ wód powierzchniowych, które pochodzi∏y z miejsca produkcji

uznanego za pora˝one, lub je˝eli istnieje ryzyko, ˝e wody te sp∏yn´∏y lub zalewa∏y te miejsca;

2) w przypadkach gdy wody powierzchniowe zosta∏y

uznane za ska˝one

a) miejsca produkcji roÊlin ziemniaka lub pomidora, znajdujàce si´ w sàsiedztwie zbiornika wód

powierzchniowych uznanych za ska˝one lub zagro˝one zalaniem przez takie wody,

b) jakikolwiek odosobniony zbiornik irygacyjny

po∏àczony z wodami powierzchniowymi uznanymi za ska˝one.

§ 13. 1. RoÊliny ziemniaka lub pomidora uznane za

pora˝one nie mogà byç sadzone.

2. RoÊliny, o których mowa w ust. 1, pod nadzorem

wojewódzkiego inspektora powinny byç

1) spalone lub

2) zu˝yte do skarmiania zwierzàt, po uprzednim przeprowadzeniu zabiegu termicznego, wykluczajàcego ryzyko prze˝ycia bakterii Ralstonia solanacearum, lub

3) g∏´boko zakopanie w miejscu, w którym nie istnieje ryzyko ich przenikania do obszarów rolniczych

lub ryzyko kontaktu ze êród∏em wody, która mo˝e

zostaç u˝yta do nawadniania obszarów rolniczych,

lub

4) przeznaczone do przerobu przemys∏owego, po

bezpoÊrednim i natychmiastowym dostarczeniu

ich do zak∏adu przetwórczego, spe∏niajàcego warunki okreÊlone w § 15, lub

5) poddane innym dzia∏aniom, ni˝ wymienione

w pkt 1—4, je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum.

§ 14. 1. RoÊliny ziemniaka lub pomidora uznane za

prawdopodobnie pora˝one lub roÊliny ziemniaka oraz

pomidora, dla których zosta∏o zidentyfikowane ryzyko

pora˝enia, oraz produkowane w miejscach produkcji

uznanych za prawdopodobnie pora˝one nie mogà byç

sadzone.

2. RoÊliny, o których mowa w ust. 1, pod nadzorem

wojewódzkiego inspektora powinny byç

1) w przypadku bulw ziemniaka

a) przeznaczone do konsumpcji, pakowane

w miejscach, w których istniejà odpowiednie

warunki usuwania resztek, gotowe i przeznaczone do bezpoÊredniego dostarczenia i u˝ycia

bez przepakowywania, lub

b) przeznaczone do przerobu przemys∏owego po

bezpoÊrednim i natychmiastowym dostarczeniu ich do zak∏adu przetwórczego, o którym

mowa w § 13 ust. 2 pkt 4, lub

c) zu˝yte lub usuni´te w sposób okreÊlony przez

wojewódzkiego inspektora, je˝eli nie istnieje

ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia

solanacearum;

2) w przypadku innych cz´Êci roÊlin ziemniaka lub

pomidora, wraz z resztkami ∏odyg i liÊci

a) zniszczone lub

b) zu˝yte lub usuni´te w sposób okreÊlony przez

wojewódzkiego inspektora, je˝eli nie istnieje

ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia

solanacearum.

§ 15. W zak∏adach przetwórczych i w miejscach pakowania roÊlin ziemniaka lub pomidora

1) resztki roÊlin ziemniaka lub pomidora oraz inne

sta∏e resztki niszczy si´ przez

a) g∏´bokie zakopanie w miejscu, w którym nie

istnieje ryzyko ich przenikania do obszarów rolniczych lub ryzyko kontaktu ze êród∏em wody,

która mo˝e zostaç u˝yta do nawadniania obszarów rolniczych; resztki powinny byç przewiezione bezpoÊrednio do tego miejsca w warunkach

wykluczajàcych ryzyko ich rozniesienia si´, lub

b) spalenie;

2) resztki p∏ynne, zawierajàce zawieszone czàstki sta∏e, poddaje si´ filtrowaniu lub procesowi osiadania w celu usuni´cia tych czàstek, a czàstki niszczy

si´ w sposób okreÊlony w pkt 1 lit. a; nast´pnie

resztki p∏ynne

a) podgrzewa si´ do temperatury minimum

70 °C przez co najmniej 30 minut lub

b) niszczy si´ w sposób zatwierdzony przez wojewódzkiego inspektora, tak aby nie istnia∏o ryzyko kontaktu tych resztek z obszarami rolniczymi

lub ryzyko kontaktu ze êród∏em wody, która

mo˝e zostaç u˝yta do nawadniania obszarów

rolniczych.

§ 16. Ârodki transportu, maszyny, urzàdzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich cz´Êci, materia∏y

u˝ywane do pakowania i inne przedmioty, które zosta∏y uznane za ska˝one albo za prawdopodobnie ska˝one, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora niszczy

si´ albo odka˝a przez oczyszczenie lub dezynfekcj´

w taki sposób, aby

1) uniemo˝liwiç rozprzestrzenienie si´ bakterii Ralstonia solanacearum;

2) po zabiegach mog∏y byç uznane za nieska˝one.

Poz. 775

a) przez okres co najmniej czterech lat uprawy nast´pujàcych po stwierdzeniu pora˝enia

— niszczy si´ samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii

Ralstonia solanacearum, z uwzgl´dnieniem

chwastów z rodziny psiankowatych,

— zakazuje si´ sadzenia: bulw lub roÊlin ziemniaka, roÊlin i nasion pomidora, innych roÊlin ˝ywicielskich, roÊlin rodzaju Brassica,

dla których stwierdzono ryzyko prze˝ywania

bakterii Ralstonia solanacearum, oraz innych roÊlin, w przypadku których stwierdzono ryzyko rozprzestrzeniania si´ tej bakterii,

b) dopuszcza si´ sadzenie urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, z przeznaczeniem

wy∏àcznie na ziemniaki inne ni˝ sadzeniaki,

w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, nast´pujàcym po okresie czteroletnim,

o którym mowa w lit. a, je˝eli przez co najmniej

dwa kolejne ostatnie lata uprawy przed posadzeniem stwierdzano, ˝e pole jest wolne od samosiewów ziemniaka i pomidora oraz innych

roÊlin ˝ywicielskich, z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych; uprawa podlega

kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego

inspektora, który po zbiorach, w ramach przeprowadzanej kontroli, pobiera równie˝ próby

bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych,

c) w sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora nast´pujàcym po sezonie, o którym mowa w lit. b,

i po odpowiednim cyklu zmianowania, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych ni˝ sadzeniaki, u˝ywa si´ urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa

podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach, w ramach przeprowadzanej kontroli, pobiera równie˝ próby bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych, albo

2) w miejscach produkcji uznanych za pora˝one, na

polu lub w miejscu uprawy pod os∏onami uznanym za pora˝one

a) przez okres pi´ciu lat uprawy nast´pujàcych po

stwierdzeniu pora˝enia niszczy si´ samosiewy

ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum,

z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych,

b) przez pierwsze trzy lata uprawy pole nale˝y

— pozostawiç od∏ogiem lub obsiaç zbo˝em albo

— przeznaczyç na sta∏e pastwisko z cz´stym niskim koszeniem lub pod intensywny wypas,

albo

— przeznaczyç na produkcj´ nasiennà traw,

§ 17. 1. W obr´bie wyznaczonej strefy zagro˝enia

podejmuje si´ nast´pujàce dzia∏ania

1) w miejscach produkcji okreÊlonych jako pora˝one,

na polu lub w miejscu uprawy pod os∏onami uznanym za pora˝one

a przez nast´pne dwa lata przeznaczyç na upraw´ roÊlin nieb´dàcych ˝ywicielami bakterii Ralstonia solanacearum, dla których nie stwierdzono ryzyka jej prze˝ywania lub rozprzestrzeniania

si´,

c) w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora nast´pujàcym po okresie pi´cioletnim,

o którym mowa w lit. b, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych ni˝ sadzeniaki, u˝ywa si´ urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa podlega kontroli

przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach pobiera równie˝ próby

bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych;

3) na innych polach

a) w roku uprawy nast´pujàcym po stwierdzeniu

pora˝enia

— nie sadzi si´ bulw lub roÊlin ziemniaka, jak

równie˝ innych roÊlin ˝ywicielskich,

— niszczy si´ samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich,

z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny

psiankowatych, lub

— dopuszcza si´ sadzenie urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka z przeznaczeniem na ziemniaki konsumpcyjne lub

przemys∏owe pod warunkiem, ˝e nie istnieje

ryzyko wyst´powania samosiewów ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum,

z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny

psiankowatych; uprawa podlega kontroli

przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który pobiera równie˝ próby bulw

ziemniaka i próby samosiewów ziemniaka

do badaƒ laboratoryjnych,

b) w pierwszym roku uprawy nast´pujàcym po

roku, o którym mowa w lit. a, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych ni˝

sadzeniaki, u˝ywa si´ urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka,

c) w co najmniej drugim roku uprawy nast´pujàcym po roku, o którym mowa w lit. a, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych ni˝ sadzeniaki, u˝ywa si´ urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka lub sadzeniaków ziemniaka wyprodukowanych pod nadzorem wojewódzkiego inspektora z urz´dowo

kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka,

d) w ka˝dym roku uprawy, o których mowa

w lit. a—c, niszczy si´ samosiewy ziemniaka

lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich

bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych; uprawa przeznaczona na sadzeniaki ziemniaka podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach pobiera

równie˝ próby bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych;

4) bezpoÊrednio po stwierdzeniu pora˝enia oraz

w ka˝dym nast´pnym roku uprawy, a˝ do pierwszego sezonu w∏àcznie, w którym na polach uznanych za pora˝one dopuszcza si´ upraw´ ziemniaków lub pomidorów

Poz. 775

a) maszyny i miejsca przechowywania roÊlin, produktów roÊlinnych lub przedmiotów w miejscu

produkcji, wykorzystywane do produkcji ziemniaka lub pomidora, czyÊci si´ i dezynfekuje

w sposób uniemo˝liwiajàcy rozprzestrzenianie

si´ bakterii Ralstonia solanacearum,

b) wojewódzki inspektor przeprowadza kontrol´

programów nawadniania i opryskiwania, je˝eli

istnieje ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii

Ralstonia solanacearum;

5) w miejscu uprawy pod os∏onami uznanym za pora˝one, w którym mo˝liwa jest ca∏kowita wymiana

gleby lub pod∏o˝a

a) nie uprawia si´ bulw i roÊlin ziemniaka, roÊlin

i nasion pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, do czasu

stwierdzenia przez wojewódzkiego inspektora,

˝e w wyniku przeprowadzonych zabiegów,

w tym co najmniej usuni´cia wszelkiego materia∏u roÊlin ˝ywicielskich, ca∏kowitej wymiany

pod∏o˝a oraz oczyszczenia lub zdezynfekowania

miejsca uprawy i ca∏ego wyposa˝enia, wyeliminowano t´ bakteri´,

b) dopuszcza si´ produkcj´ ziemniaka z urz´dowo

kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, minibulw lub mikroroÊlin, uzyskanych pod urz´dowym nadzorem,

c) wojewódzki inspektor prowadzi kontrol´ programów nawadniania i opryskiwania, w celu zapobie˝enia rozprzestrzenianiu si´ bakterii Ralstonia solanacearum.

2. W obr´bie strefy zagro˝enia, oprócz wymagaƒ

okreÊlonych w ust. 1

1) w przypadku gdy strefa zagro˝enia zosta∏a wyznaczona zgodnie z § 9 pkt 1 lit. g, bezpoÊrednio po

stwierdzeniu pora˝enia i przez okres co najmniej

trzech lat uprawy po stwierdzeniu pora˝enia

a) wojewódzki inspektor sprawuje nadzór nad

miejscami uprawy, przechowywania i miejscami majàcymi kontakt z bulwami ziemniaka lub

pomidorami, wraz z miejscami, w których

wspólnie u˝ytkowane sà maszyny do produkcji

ziemniaka lub pomidora,

b) prowadzi si´ czyszczenie lub dezynfekcj´ maszyn i miejsc przechowywania w sposób uniemo˝liwiajàcy rozprzestrzenianie si´ bakterii Ralstonia solanacearum,

c) w przypadku upraw ziemniaka, dopuszcza si´

sadzenie wy∏àcznie urz´dowo kwalifikowanych

sadzeniaków ziemniaka lub sadzeniaków ziemniaka wyprodukowanych pod nadzorem wojewódzkiego inspektora z urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa podlega

kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego

inspektora, który po zbiorach pobiera do badaƒ

laboratoryjnych próby bulw ziemniaka sadzeniaka z miejsc produkcji prawdopodobnie pora˝onych,

d) oddziela si´ czynnoÊci zwiàzane ze zbiorem,

przechowywaniem, przemieszczaniem i pakowaniem zebranych sadzeniaków ziemniaka od

takich czynnoÊci wykonywanych przy ziemniakach innych ni˝ sadzeniaki, na terenie wszystkich miejsc w obr´bie strefy zagro˝enia,

e) wojewódzki inspektor przeprowadza kontrole

urz´dowe;

2) w przypadku gdy wody powierzchniowe zosta∏y

uznane za ska˝one lub za drog´ mo˝liwego rozprzestrzenienia si´ bakterii Ralstonia solanacearum, wojewódzki inspektor, bezpoÊrednio po

stwierdzeniu ska˝enia i przez okres co najmniej

trzech lat uprawy po stwierdzeniu ska˝enia, przeprowadza

a) coroczne kontrole obejmujàce pobieranie do

badaƒ laboratoryjnych prób wód powierzchniowych i roÊlin ˝ywicielskich z rodziny psiankowatych, rosnàcych w sàsiedztwie tych wód,

w terminach umo˝liwiajàcych wykrycie bakterii

Ralstonia solanacearum,

b) kontrol´ programów nawadniania i opryskiwania, w tym w zakresie zakazu stosowania wody

uznanej za ska˝onà do nawadniania lub opryskiwania roÊlin ziemniaka lub pomidora oraz

innych roÊlin ˝ywicielskich,

c) kontrole usuwania resztek sta∏ych powstajàcych w czasie procesów przemys∏owych lub

w miejscach pakowania, w których wykorzystywane sà roÊliny ziemniaka lub pomidora —

w przypadku stwierdzenia ska˝enia resztek

p∏ynnych;

Poz. 775

3) wojewódzki inspektor podejmuje dzia∏ania zmierzajàce do wymiany sadzeniaków ziemniaka.

§ 18. 1. W przypadku stwierdzenia obecnoÊci bakterii Ralstonia solanacearum w ziemniakach wyprodukowanych na terytorium Rzeczypospolitej Polskiej,

wojewódzki inspektor przeprowadza badania

1) dotyczàce wczeÊniejszych rozmno˝eƒ ziemniaka

wraz z poczàtkowym rozmno˝eniem klonalnym

i rozmno˝eƒ klonalnych materia∏ów bazowych sadzeniaków ziemniaka lub

2) wszystkich rozmno˝eƒ klonalnych materia∏ów bazowych lub wczeÊniejszych rozmno˝eƒ wraz z poczàtkowym rozmno˝eniem klonalnym, je˝eli nie

stwierdzono ˝adnego pokrewieƒstwa klonów.

2. W przypadkach innych ni˝ okreÊlone w ust. 1,

wojewódzki inspektor przeprowadza badania na ka˝dej roÊlinie pochodzàcej z poczàtkowego rozmno˝enia

klonalnego wst´pnej selekcji lub na reprezentatywnej

próbie pobranej z materia∏ów bazowych sadzeniaków

ziemniaka lub z materia∏ów pochodzàcych z wczeÊniejszych rozmno˝eƒ.

§ 19. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie z dniem

og∏oszenia.

Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: W. Olejniczak

Za∏àcznik do rozporzàdzenia Ministra Rolnictwa

i Rozwoju Wsi z dnia 13 kwietnia 2004 r. (poz. 775)

METODYKA DIAGNOZOWANIA, WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI BAKTERII Ralstonia solanacearum

I. Zakres stosowania metodyki

Metodyka obejmuje

1) diagnozowanie Êluzaka w bulwach ziemniaka oraz

w roÊlinach ziemniaka i pomidora;

2) wykrywanie i identyfikacj´ bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka.

1. Diagnozowanie Êluzaka w bulwach ziemniaka oraz

w roÊlinach ziemniaka i pomidora

Metodyka ma zastosowanie do bulw ziemniaka oraz

roÊlin ziemniaka i pomidora z charakterystycznymi

objawami chorobowymi lub podejrzanych o pora˝enie przez bakteri´ Ralstonia solanacearum. Metodyka

obejmuje szybkie badania umo˝liwiajàce postawienie

wst´pnej diagnozy, zwane dalej „metodami wst´pnego badania”, izolacj´ patogena z pora˝onych wiàzek

przewodzàcych na pod∏o˝a diagnostyczne, a w przypadku uzyskania wyników pozytywnych — identyfikacj´ kultury jako bakteria Ralstonia solanacearum.

ObjaÊnienia do diagramu

1) opis objawów zamieszczono w cz´Êci II ust. 1.

2) metodami wst´pnego badania sà

— test na obecnoÊç wycieków z wiàzek przewodzàcych ∏odygi (cz´Êç II ust. 2),

— test na obecnoÊç granulek poly-β-hydroksymaÊlanu (cz´Êç II ust. 2),

— test IF (cz´Êç III ust. 2),

— test ELISA (cz´Êç III ust. 3),

— test PCR (cz´Êç III ust. 4),

3) izolacja bakterii z materia∏u roÊlinnego z typowymi objawami metodà rozcieƒczeƒ p∏ytkowych jest prosta, jednak˝e

w przypadku zaawansowanych stadiów infekcji hodowla mo˝e si´ nie udaç; bakterie saprofityczne wyst´pujàce w chorej tkance mogà przerastaç bakteri´ Ralstonia solanacearum lub hamowaç jej wzrost na pod∏o˝u hodowlanym; je˝eli wynik izolacji jest negatywny, a objawy chorobowe sà typowe, izolacj´ nale˝y powtórzyç; zalecanà jest metoda posiewu na

pod∏o˝a selektywne,

4) wiarygodnà identyfikacj´ czystej kultury bakterii Ralstonia solanacearum mo˝na przeprowadziç w oparciu o testy wymienione w cz´Êci II ust. 4 pkt 1 w po∏àczeniu z testem patogenicznoÊci (cz´Êci II ust. 4 pkt 3); oznaczanie szczepu nie jest

obowiàzkowe, lecz zalecane w ka˝dym nowym przypadku wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum.

2. Wykrywanie i identyfikacja bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka

Metodyka ma zastosowanie do wykrywania infekcji

latentnej w bulwach ziemniaka za pomocà jednej

lub kilku metod szybkiego badania. Pozytywne wy-

Poz. 775

niki badaƒ uzyskanych z zastosowaniem tych metod sà potwierdzane przez izolacj´ bakterii Ralstonia solanacearum, a nast´pnie, w przypadku izolacji typowych kolonii, identyfikacj´ czystej kultury

bakterii Ralstonia solanacearum.

ObjaÊnienia do diagramu

1) standardowa próba sk∏ada si´ z co najmniej 200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie 25 ton, jednak˝e bada-

nie mo˝na równie˝ wykonaç dla mniejszych prób,

2) je˝eli pojedynczy test jest niewystarczajàco czu∏y lub zbyt ma∏o wiarygodny do wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum

w próbie, zaleca si´ przeprowadzenie wi´cej ni˝ jednego testu. Testy powinny opieraç si´ na ró˝nych zasadach biologicznych,

3) test immunofluorescencji (IF) jest powszechnie przyj´tà metodà wst´pnego badania; w odniesieniu do parametrów okreÊlonych w tej metodzie jest to test czu∏y (zakres czu∏oÊci 103—104 komórek/ml osadu ekstraktu ziemniaka); czynnikiem

krytycznym decydujàcym o wiarygodnoÊci wyniku testu jest jakoÊç przeciwcia∏; nale˝y u˝ywaç wy∏àcznie przeciwcia∏

o wysokim mianie (minimum 2000 dla przeciwcia∏ wyjÊciowych), a wszystkie testy muszà byç wykonywane z przeciwcia∏ami w zakresie miana lub z zastosowaniem pierwszego rozcieƒczenia poni˝ej miana; zalecana jest metoda poÊrednia;

metod´ bezpoÊrednià mo˝na stosowaç, jeÊli poziom wykrywalnoÊci i specyficznoÊci tej metody jest równowa˝ny z poziomem metody poÊredniej; test IF umo˝liwia dokonanie oceny morfologii zabarwionych komórek i intensywnoÊci fluorescencji; na tej podstawie okreÊla si´ specyficznoÊç reakcji; w teÊcie IF doÊç powszechne sà reakcje krzy˝owe z serologicznie spokrewnionymi bakteriami glebowymi lub bakteriami obecnymi w tkankach ziemniaka o morfologii komórki

zbli˝onej do bakterii Ralstonia solanacearum; w przypadkach podejrzenia o wystàpienie reakcji krzy˝owych nale˝y przeprowadziç badanie dodatkowà metodà opartà na innej zasadzie biologicznej; w takich przypadkach zalecana jest izolacja

na pod∏o˝e selektywne,

4) metoda izolacji bakterii Ralstonia solanacearum na pod∏o˝e selektywne SMSA jest metodà wst´pnego badania o wysokiej czu∏oÊci i selektywnoÊci; wyniki izolacji uzyskuje si´ w ciàgu 3—6 dni od przygotowania próby; wyhodowane bakterie mo˝na ∏atwo zidentyfikowaç; nale˝y ostro˝nie pobieraç tkank´ z cz´Êci przystolonowej bulwy w celu unikni´cia zanieczyszczenia próby obecnymi w bulwach ziemniaka bakteriami wtórnymi, które „rywalizujà” z bakterià Ralstonia solanacearum na pod∏o˝u i mogà niekorzystnie wp∏ywaç na rozwój tej bakterii; ze wzgl´du na niekorzystny wp∏yw sk∏adników

pod∏o˝a na badany organizm niektóre szczepy mogà rosnàç s∏abo; metoda izolacji mo˝e byç stosowana jako pojedyncza

metoda wst´pnego badania w przypadku, gdy uzyskano negatywny wynik badania i nie ma podejrzeƒ o zahamowanie

wzrostu bakterii Ralstonia solanacearum przez inne bakterie; w przypadku negatywnego wyniku badania, ale gdy wyst´puje podejrzenie o zahamowanie wzrostu bakterii Ralstonia solanacearum przez inne bakterie, prób´ poddaje si´ dalszym badaniom z zastosowaniem innej metody, w celu potwierdzenia lub odrzucenia diagnozy; w takim przypadku zalecanà metodà jest test IF,

5) test ELISA ma zakres czu∏oÊci 104—105 komórek/ml osadu ekstraktu ziemniaka i cz´Êciej uzyskuje si´ w nim wyniki fa∏szywie pozytywne (reakcje krzy˝owe) i fa∏szywie negatywne (hamujàcy wp∏yw czàsteczek fenolowych pochodzàcych

z ekstraktu ziemniaka), dlatego test ELISA nie mo˝e byç stosowany jako test pojedynczy,

6) test PCR jest bardzo czu∏ym testem; reakcja mo˝e byç jednak zak∏ócana przez sk∏adniki roÊlinne obecne w ekstrakcie z roÊlin czy bulw (inhibitory), co wp∏ywa na uzyskanie fa∏szywie negatywnych wyników; negatywny wp∏yw inhibitorów mo˝na zmniejszyç przez rozcieƒczenie próbki, majàc na uwadze, ˝e jednoczeÊnie ulega rozcieƒczeniu populacja bakterii Ralstonia solanacearum; wszystkie etapy przygotowania próby i badania nale˝y przeprowadzaç z du˝à ostro˝noÊcià w celu

unikni´cia kontaminacji, która mo˝e przyczyniç si´ do uzyskania wyników fa∏szywie pozytywnych; wyniki fa∏szywie pozytywne mogà równie˝ wynikaç z homologii sekwencji innych organizmów; z tych powodów test PCR nie mo˝e byç stosowany jako test pojedynczy,

7) test wzbogacania polega na inkubacji prób ekstraktu ziemniaka w pó∏selektywnym bulionie od˝ywczym (np. zmodyfikowany bulion SMSA) i pozwala na namno˝enie bakterii Ralstonia solanacearum; obecnoÊç bakterii Ralstonia solanacearum mo˝na stwierdziç za pomocà testów: IF, ELISA i PCR; nie zaleca si´ wykonywania bezpoÊredniego posiewu z bulionu od˝ywczego; test ten nie mo˝e byç wykorzystywany jako pojedyncza metoda wst´pnego badania,

8) test biologiczny mo˝e byç stosowany do izolacji bakterii Ralstonia solanacearum z ekstraktu ziemniaka drogà selektywnego wzbogacania w roÊlinie ˝ywicielskiej i mo˝na go wykonaç na roÊlinach pomidora lub ober˝yny; niezb´dne jest zapewnienie korzystnych dla rozwoju bakterii Ralstonia solanacearum warunków Êrodowiska,

9) identyfikacji czystej kultury bakterii Ralstonia solanacearum dokonuje si´ za pomocà co najmniej jednego z testów wskazanych w cz´Êci II ust. 4 pkt 1, w po∏àczeniu z testem patogenicznoÊci wskazanym w cz´Êci II ust. 4 pkt 3; oznaczanie szczepu nie jest obowiàzkowe, lecz zalecane w ka˝dym nowym przypadku wykrycia bakterii.

II. Diagnozowanie Êluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roÊlinach ziemniaka i pomidora

1. Objawy Êluzaka

1.1. Objawy na ziemniaku

Na roÊlinach ziemniaka we wczesnym stadium

infekcji obserwuje si´ wi´dni´cie liÊci ku wierzcho∏kowi ∏odygi w ciàgu dnia, gdy panuje wysoka temperatura. Objawy te zanikajà nocà.

Wi´dni´cie szybko staje si´ nieodwracalne

i prowadzi do Êmierci roÊliny. Wiàzki przewodzàce wi´dnàcej roÊliny, widoczne na przekroju

poprzecznym przez ∏odyg´, mogà przebarwiaç

si´ na bràzowo, a z przeci´tej powierzchni wycieka samoistnie lub po ÊciÊni´ciu ∏odygi

mleczny Êluz. Po umieszczeniu przeci´tej ∏odygi w wodzie w pozycji pionowej, z wiàzek przewodzàcych wydostajà si´ smu˝ki Êluzu.

W bulwach ziemniaka, po poprzecznym ich

przekrojeniu w pobli˝u cz´Êci przystolonowej,

we wczesnym stadium infekcji wyst´pujà szklisto˝ó∏te do jasnobràzowych przebarwienia

pierÊcienia wiàzek przewodzàcych, z których po

kilku minutach wydostaje si´, samoistnie lub

po lekkim ÊciÊni´ciu palcami, jasnokremowy

Êluz widoczny na przeci´tej powierzchni. Na-

st´pnie, bràzowe przebarwienia wiàzek stajà

si´ wyraêniejsze, a nekroza mo˝e rozszerzaç si´

na tkank´ parenchymatycznà. W zaawansowanych stadiach infekcja rozprzestrzenia si´ z cz´Êci przystolonowej i oczek na zewnàtrz, wskutek czego na powierzchni bulwy mogà wyst´powaç czerwonobràzowe, lekko zapadni´te

ranki, a na nich mogà pojawiaç si´ wycieki bakteryjne, do których przylegajà grudki ziemi.

1.2. Objawy na roÊlinach pomidora

Pierwszym widocznym objawem jest zwiotcza∏y wyglàd najm∏odszych liÊci. W sprzyjajàcych

rozwojowi bakterii Ralstonia solanacearum warunkach Êrodowiska (temperatura gleby oko∏o

25 °C, du˝a wilgotnoÊç) w ciàgu kilku dni dochodzi do epinastii i jednostronnego lub ca∏kowitego wi´dni´cia roÊliny, a nast´pnie jej zamierania. W mniej sprzyjajàcych warunkach

(temperatura gleby poni˝ej 21 °C) na ∏odydze

mo˝e rozwijaç si´ wiele korzeni przybyszowych. Czasami widoczne sà t∏uste smugi przebiegajàce wzd∏u˝ ∏odygi, które wskazujà na

obecnoÊç nekroz w obr´bie wiàzek przewodzàcych. Po przekrojeniu ∏odygi w poprzek, ze

zbràzowia∏ych wiàzek przewodzàcych wyciekajà krople Êluzu bakteryjnego barwy bia∏ej lub

˝ó∏tawej.

2. Metody wst´pnego badania

W celu postawienia wst´pnej diagnozy stosuje si´

jeden lub kilka z ni˝ej wymienionych testów

1) test na obecnoÊç wycieków z ∏odygi

a) wi´dnàcà ∏odyg´ ziemniaka przecina si´ nieco

powy˝ej poziomu gleby,

b) odci´ty fragment ∏odygi umieszcza si´ przeci´tà powierzchnià w zlewce z wodà,

c) po chwili z wiàzek przewodzàcych samoistnie

wydostajà si´ smu˝ki Êluzu bakteryjnego;

2) test na wykrywanie granulek poly-β-hydroksymaÊlanu (PHB)

a) granulki PHB w komórkach bakterii Ralstonia

solanacearum stajà si´ widoczne po zabarwieniu b∏´kitem nilu A albo sudanem czarnym B,

b) wykonuje si´ rozmaz ze Êluzu lub zawiesiny

tkanki na szkie∏ku mikroskopowym albo przygotowuje si´ preparat z 48. godzinnej kultury

bakterii Ralstonia solanacearum na pod∏o˝u

YPGA lub SPA, o którym mowa w cz´Êci IV

ust. 1,

c) przygotowuje si´ kontrol´ pozytywnà w postaci rozmazu ze szczepu nale˝àcego do biowaru 2/rasa 3 oraz, w przypadku gdy to stosowne, kontrol´ negatywnà w postaci rozmazu z niespokrewnionego szczepu,

d) preparat suszy si´, a nast´pnie kilkakrotnie

szybko przesuwa spodnià powierzchnià nad

p∏omieniem palnika w celu utrwalenia rozmazu;

3) test z b∏´kitem nilu

a) utrwalony rozmaz zalewa si´ 1 % wodnym

roztworem b∏´kitu nilu A, a nast´pnie inkubuje si´ przez 10 minut w temperaturze 55 °C,

b) zlewa si´ roztwór barwnika, przep∏ukuje s∏abym strumieniem wody bie˝àcej, a nadmiar

wody usuwa za pomocà bibu∏y,

c) preparat zalewa si´ 8 % wodnym roztworem

kwasu octowego i inkubuje przez minut´

w temperaturze pokojowej,

d) preparat przep∏ukuje si´ s∏abym strumieniem

wody bie˝àcej i osusza bibu∏à,

e) preparat zwil˝a si´ kroplà wody i nak∏ada

szkie∏ko nakrywkowe;

f) zabarwiony rozmaz oglàda si´ w mikroskopie

epifluorescencyjnym (450 nm) pod imersjà,

stosujàc powi´kszenie 1000x; obserwacje preparatu prowadzi si´ w kierunku wykrycia jasnopomaraƒczowych, fluoryzujàcych granulek PHB,

g) preparat oglàda si´ równie˝ w Êwietle bia∏ym,

aby upewniç si´, ˝e granulki znajdujà si´ wewnàtrz komórek bakterii, a morfologia komórki jest typowa dla bakterii Ralstonia solanacearum;

Poz. 775

4) test z sudanem czarnym

a) utrwalony rozmaz zalewa si´ 0,3 % roztworem sudanu czarnego B w 70 % alkoholu oraz

inkubuje przez 10 minut w temperaturze pokojowej,

b) zlewa si´ roztwór barwnika i przep∏ukuje wodà bie˝àcà; nadmiar wody zlewa si´, a preparat osusza za pomocà bibu∏y,

c) preparat zanurza si´ na krótko w ksylolu i osusza bibu∏à; z uwagi na szkodliwoÊç ksylolu

prac´ wykonuje si´ pod digestorium,

d) preparat zalewa si´ 0,5 % wodnym roztworem safraniny i pozostawia na 10 sekund

w temperaturze pokojowej; z uwagi na szkodliwoÊç safraniny prac´ wykonuje si´ pod digestorium,

e) delikatnie przep∏ukuje si´ preparat s∏abym

strumieniem wody bie˝àcej, osusza bibu∏à

i nak∏ada szkie∏ko nakrywkowe,

f) zabarwiony preparat oglàda si´ w mikroskopie Êwietlnym, w Êwietle przechodzàcym pod

imersjà, stosujàc powi´kszenie 1000x, granulki PHB w komórkach bakterii Ralstonia solanacearum barwià si´ na niebieskoczarno, a Êciana komórkowa barwi si´ na ró˝owo;

5) inne testy

a) test IF — przeprowadzany zgodnie ze sposobem okreÊlonym w cz´Êci III ust. 2,

b) test ELISA — przeprowadzany zgodnie ze sposobem okreÊlonym w cz´Êci III ust. 3,

c) test PCR — przeprowadzany zgodnie ze sposobem okreÊlonym w cz´Êci III 4 ust. 4.

3. Metoda izolacji

1) pobiera si´ Êluz lub fragmenty przebarwionej

tkanki z pierÊcienia wiàzek przewodzàcych bulwy

ziemniaka lub z wiàzek przewodzàcych ∏odygi

ziemniaka lub pomidora; umieszcza si´ je w ma∏ej obj´toÊci sterylnej wody destylowanej lub

50 mM buforu fosforanowego i pozostawia si´

na 5—10 minut;

2) wykonuje si´ serie dziesi´ciokrotnych rozcieƒczeƒ zawiesiny (1:10 i 1:100 lub wi´cej, jeÊli uzna

si´ za stosowne);

3) przenosi si´ standardowà obj´toÊç zawiesiny

i jej rozcieƒczeƒ na podstawowe pod∏o˝a od˝ywcze NA, YPGA i SPA, o których mowa w cz´Êci IV

ust. 1, lub na pod∏o˝e Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 1, lub

na pod∏o˝e selektywne SMSA, o którym mowa

w cz´Êci IV ust. 7; wykonuje si´ posiew za pomocà ezy lub g∏aszczki, stosujàc odpowiednià technik´ rozcieƒczeƒ p∏ytkowych; je˝eli uzna si´ za

stosowne, wykonuje si´ kontrol´ pozytywnà

drogà posiewu rozcieƒczonej zawiesiny patogenicznej kultury bakterii Ralstonia solanacearum,

nale˝àcej do biowaru 2/rasy 3 bakterii Ralstonia

solanacearum na oddzielnych p∏ytkach z ka˝dym

z pod∏o˝y;

4) p∏ytki inkubuje si´ przez 3 dni w temperaturze

28 °C; je˝eli wzrost jest powolny, czas inkubacji

mo˝na wyd∏u˝yç do 6 dni, majàc na uwadze, ˝e

na pod∏o˝u SMSA kolonie bakterii cz´sto stajà

si´ nietypowe i zamierajà

a) na podstawowych pod∏o˝ach od˝ywczych patogeniczne izolaty bakterii Ralstonia solanacearum tworzà per∏owobia∏e, p∏askie, nieregularne i fluidalne kolonie, cz´sto z charakterystycznymi zag∏´bieniami,

b) na pod∏o˝u Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym typowe kolonie patogenicznych izolatów

bakterii Ralstonia solanacearum sà kremowe,

p∏askie, nieregularne i fluidalne z krwistoczerwonym, zag∏´bionym Êrodkiem; niepatogeniczne formy tej bakterii produkujà ciemnoczerwone kolonie o mas∏owatej konsystencji,

c) na pod∏o˝u SMSA typowe kolonie patogenicznych izolatów bakterii Ralstonia solanace-

Poz. 775

arum sà mlecznobia∏e, p∏askie, nieregularne

i fluidalne, z krwistoczerwonym Êrodkiem; niepatogeniczne formy tej bakterii produkujà

mniej fluidalne kolonie, ca∏kowicie ró˝owe do

czerwonych;

5) kolonie o charakterystycznej morfologii przeszczepia si´ na podstawowe pod∏o˝e od˝ywcze

w celu uzyskania czystej kultury; nale˝y unikaç

regularnego przeszczepiania, które mo˝e prowadziç do utraty patogenicznoÊci.

4. Testy potwierdzajàce

1) Czystà kultur´ bakterii Ralstonia solanacearum

identyfikuje si´, stosujàc co najmniej jeden z nast´pujàcych testów

a) testy biochemiczne i fizjologiczne przeprowadzane w celu okreÊlenia, czy wyizolowane

bakterie posiadajà w∏aÊciwoÊci biochemiczne

i fizjologiczne, typowe dla bakterii Ralstonia

solanacearum; do ka˝dego testu do∏àcza si´

odpowiedni szczep kontrolny

barwnik fluoryzujàcy

–

inkluzje PHB

+

test oksydacyjno-fermentacyjny (O/F)

O+/F–

katalaza

+

test Kovacsa

+

redukcja azotanów

+

wykorzystanie cytrynianu

+

wzrost w temperaturze 40 °C

–

wzrost w 1 % NaCl

+

wzrost w 2 % NaCl

–

dihydrolaza argininy

–

hydroliza ˝elatyny

–

hydroliza skrobi

–

hydroliza eskuliny

–

produkcja lewanu

–

b) test IF — przygotowuje si´ zawiesin´ 106 komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego

oraz wykonuje si´ seri´ dwukrotnych rozcieƒczeƒ przeciwcia∏; test IF przeprowadza si´ zgodnie ze sposobem, o którym mowa w cz´Êci III

ust. 2; miano dla badanej kultury musi byç równowa˝ne mianu dla kontroli pozytywnej,

c) test ELISA — przygotowuje si´ zawiesin´ >106

komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego; test ELISA przeprowadza si´ zgodnie ze

sposobem, o którym mowa w cz´Êci III ust. 3;

odczyty w teÊcie ELISA dla badanej kultury

muszà byç równowa˝ne wartoÊciom uzyskanym dla kontroli pozytywnej,

d) test PCR — przygotowuje si´ zawiesin´ 106

komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego; test PCR przeprowadza si´ zgodnie ze

sposobem, o którym mowa w cz´Êci III ust. 4;

uzyskany produkt PCR dla badanej kultury

musi mieç takà samà wielkoÊç i wzór uzyskany w analizie z u˝yciem enzymów restrykcyjnych (REA) jak kontrola pozytywna,

e) fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) —

przygotowuje si´ zawiesin´ 106 komórek/ml

badanej kultury i szczepu kontrolnego; stosuje si´ metod´ FISH z primerem PCR OLI-1; badana kultura musi wykazywaç takà samà reakcj´ jak kontrola pozytywna,

stosuje metod´ FAP; profil badanej kultury

musi byç identyczny z profilem kontroli pozytywnej; charakterystyka kwasów t∏uszczowych jest nast´pujàca: 14:0 3OH, 16:0 2OH,

16:1 2OH i 18:1 2OH;

f) profil bia∏kowy — zdenaturowane bia∏ka komórkowe sà rozdzielane drogà elektroforezy

na ˝elu poliakrylamidowym — PAGE,

2) oznaczanie szczepu jest zalecane w ka˝dym nowym przypadku wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum; stosuje si´ co najmniej jednà z nast´pujàcych metod

g) analiza kwasów t∏uszczowych (FAP) — hoduje

si´ badanà kultur´ i szczep bakterii kontroli

pozytywnej przez 48 godzin, w temperaturze

28 °C, na agarze sojowo-tryptonowym oraz

a) okreÊlanie biowaru na podstawie zdolnoÊci do

produkcji kwasu z trzech alkoholi szeÊciow´glowych i trzech cukrów

Biowar

wykorzystywanie

1

2

3

4

5

— maltozy

–

+

+

–

+

— laktozy

–

+

+

–

+

— celobiozy

–

+

+

–

+

— mannitolu

–

–

+

+

+

— sorbitolu

–

–

+

+

–

— dulcitolu

–

–

+

+

–

dodatkowe testy na rozró˝nienie w obr´bie biowaru 2 podfenotypów

biowar 2

biowar 2-A

biowar 2-T

wykorzystywanie trehalozy

–

+

+

wykorzystywanie inozytolu

+

–

+

wykorzystywanie D-rybozy

–

–

+

aktywnoÊç pektolityczna

niska

niska

wysoka

b) okreÊlanie rasy na podstawie testu patogenicznoÊci na roÊlinach pomidora lub ober˝yny i roÊlinach tytoniu oraz na podstawie reakcji nadwra˝liwoÊci (HR) na liÊciach tytoniu

Reakcja

Rasa*)

1

2

3

na roÊlinach pomidora/ober˝yny

wi´dni´cie

brak reakcji

wi´dni´cie

na roÊlinach tytoniu

wi´dni´cie

brak reakcji

brak reakcji

na liÊciach tytoniu

nekroza (48 h)

i wi´dni´cie

(7—8 dni)

HR (12—24 h)

chloroza (2—8 dni)

*) Nie uwzgl´dniono rasy 4 (patogeniczna dla imbiru i niektórych innych roÊlin ˝ywicielskich) i rasy 5 (patogeniczna wy∏àcz-

nie dla morwy).

OkreÊlenie rasy na podstawie testu patogenicznoÊci lub testu nadwra˝liwoÊci na roÊlinach tytoniu mo˝e byç niewystarczajàco wiarygodne;

o rasie mo˝na wnioskowaç na podstawie biowaru i naturalnej roÊliny ˝ywicielskiej.

Szczepy bakterii Ralstonia solanacearum mo˝na rozró˝niç na poziomie molekularnym za

pomocà

— analizy RFLP,

— powtarzalnej sekwencji PCR (REP-, ERIC- i

BOX-PCR);

3) test patogenicznoÊci stosuje si´ w celu potwierdzenia diagnozy oraz w celu okreÊlania patogenicznoÊci kultur zidentyfikowanych jako bakteria

Ralstonia solanacearum, wykonujàc nast´pujàce

czynnoÊci

a) przygotowuje si´ inokulum 106 komórek/ml

badanej kultury i szczepu kontroli pozytywnej,

b) inokuluje si´ 5—10 roÊlin pomidora lub ober˝yny, najlepiej w stadium trzeciego liÊcia w∏aÊciwego lub starszych, zgodnie z metodà

okreÊlonà w cz´Êci III ust. 6,

c) roÊliny inkubuje si´ do dwóch tygodni w temperaturze 22—28 °C i wzgl´dnie wysokiej wilgotnoÊci, codziennie podlewajàc,

d) prowadzi si´ obserwacje w celu stwierdzenia,

czy na roÊlinach wyst´pujà objawy wi´dni´cia, epinastii, chlorozy i kar∏owatoÊci,

e) bakterie izoluje si´ z roÊlin z objawami choroby w nast´pujàcy sposób

— wycina si´ fragment tkanki ∏odygi dwa

centymetry powy˝ej miejsca inokulacji,

— tkank´ ∏odygi rozdrabnia si´ i zawiesza

w niewielkiej obj´toÊci sterylnej wody destylowanej lub w 50 mM buforu fosforanowego, a nast´pnie posiewa si´ na pod∏o˝e,

inkubuje i sprawdza wyst´powanie typowych kolonii bakterii Ralstonia solanacearum.

III. Wykrywanie i identyfikacja bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw

ziemniaka

1. Przygotowanie próby do badania

Standardowa próba sk∏ada si´ z co najmniej

200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie 25 ton, jednak˝e badanie mo˝na równie˝ wykonaç dla mniejszych prób.

W celu stymulacji namna˝ania ma∏ych populacji

bakterii Ralstonia solanacearum mo˝na, je˝eli uzna

si´ to za stosowane, inkubowaç prób´ w temperaturze 25—30 °C do dwóch tygodni.

Przed przystàpieniem do w∏aÊciwego badania, bulwy mo˝na umyç pod bie˝àcà wodà z u˝yciem odpowiednich dezynfektantów i detergentów, a nast´pnie osuszyç na powietrzu.

Poz. 775

Sposób post´powania przy przygotowaniu ekstraktu

1) za pomocà czystego i zdezynfekowanego skalpela lub no˝a do obierania warzyw usuwa si´ skórk´ z cz´Êci przystolonowej bulwy w taki sposób,

aby uwidoczniç wiàzki przewodzàce; ostro˝nie

wycina si´ z cz´Êci przystolonowej tkank´ przewodzàcà w postaci ma∏ego sto˝ka o Êrednicy

3—5 mm; iloÊç tkanki innej ni˝ przewodzàca nale˝y ograniczyç do minimum; w ten sam sposób

post´puje si´ z ka˝dà bulwà wchodzàcà w sk∏ad

próby; na tym etapie mo˝na dokonaç wizualnej

oceny bulw; bulwy z objawami choroby lub gnijàce poddaje si´ odr´bnym badaniom okreÊlonym w cz´Êci II;

2) tkank´ pobranà z cz´Êci przystolonowej bulw

umieszcza si´ w zamkni´tym pojemniku; je˝eli

nie jest mo˝liwe bezpoÊrednie przeprowadzenie

badania, materia∏ mo˝na przechowaç do 24 godzin, a w temperaturze 4 °C — nie d∏u˝ej ni˝

72 godziny;

3) tkank´ pobranà z cz´Êci przystolonowej

a) przenosi si´ do odpowiedniego pojemnika,

a nast´pnie dodaje si´ odpowiednià obj´toÊç

buforu do maceracji, o którym mowa w cz´Êci

IV ust. 2, w taki sposób, aby pokryç tkank´;

rozdrabnia si´ w homogenizatorze, nie dopuszczajàc do nadmiernej homogenizacji; macerat pozostawia si´ na 15—30 minut lub

b) przenosi si´ do odpowiedniego pojemnika,

a nast´pnie dodaje si´ odpowiednià obj´toÊç

buforu do maceracji w taki sposób, aby pokryç tkank´; pojemnik z tkankà wytrzàsa si´ na

wstrzàsarce obrotowej przy 50—100 obrotów/min przez 4 godziny w temperaturze

20—22 °C lub przez 16—24 godzin w temperaturze 4 °C, lub

c) przenosi si´ do mocnej jednorazowej torebki

do maceracji, a nast´pnie mia˝d˝y si´ a˝ do

uzyskania homogenatu; dodaje si´ odpowiednià obj´toÊç buforu do maceracji w taki sposób, aby pokryç tkank´; macerat pozostawia

si´ na 15—30 minut;

4) bakterie ekstrahuje si´ ze zmacerowanej tkanki

pobranej z cz´Êci przystolonowej w nast´pujàcy

sposób

a) macerat delikatnie dekantuje si´ do probówki

wirówkowej, pozostawiajàc jego resztki w pojemniku lub torebce; je˝eli zdekantowany macerat jest m´tny, odwirowuje si´ go z zastosowaniem nast´pujàcych parametrów: 180 g/10 minut/<10 °C; zdekantowany macerat lub supernatant uzyskany podczas wirowania wst´pnego

odwirowuje si´ z zastosowaniem nast´pujàcych

parametrów: 7000 g/15 minut/<10 °C lub

10000 g/10 minut/<10 °C; supernatant zlewa si´

bez naruszania osadu lub

b) macerat przefiltrowuje si´ z u˝yciem filtra

o wielkoÊci oczek 40—100 µm; filtrowanie

mo˝na u∏atwiç, stosujàc pomp´ pró˝niowà;

filtrat zbiera si´ do probówki wirówkowej,

a filtr przep∏ukuje si´ buforem do maceracji;

filtrat odwirowuje si´ z zastosowaniem nast´pujàcych parametrów: 7000 g/15 minut/<10 °C lub 10000 g/10 minut/<10 °C; supernatant zlewa si´ bez naruszania osadu;

5) osad zawiesza si´ w 1 ml buforu do zawieszania

osadu, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 2, a nast´pnie dzieli na dwie równe porcje i przenosi do

mikroprobówek; ekstrakt z jednej mikroprobówki wykorzystuje si´ do badaƒ, a jego pozosta∏oÊç

przechowuje si´ na czas badania w temperaturze

4 °C; do drugiej probówki dodaje si´ kropl´ sterylnego glicerolu i miesza si´ na wstrzàsarce typu worteks, a nast´pnie przechowuje si´ w temperaturze –18 °C przez kilka tygodni lub w temperaturze –70 °C przez kilka miesi´cy.

2. Test IF

W teÊcie IF u˝ywa si´ przeciwcia∏ na bakteri´ Ralstonia solanacearum (najlepiej rasa 3/biowar 2). Miano

przeciwcia∏ okreÊla si´ z u˝yciem zawiesiny 106 komórek/ml homologicznego szczepu bakterii Ralstonia solanacearum i koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w odpowiednim rozcieƒczeniu, zgodnie z instrukcjà stosowania. Przeciwcia∏a wyjÊciowe

powinny posiadaç miano co najmniej 1:2000.

W teÊcie u˝ywa si´ szkie∏ek mikroskopowych wielopunktowych; zalecane sà szkie∏ka 10. punktowe

o Êrednicy 6 mm. Na ka˝dym szkie∏ku mikroskopowym umieszcza si´ kontrol´ negatywnà, w celu

sprawdzenia, czy koniugat (FITC) nie wià˝e si´ niespecyficznie z antygenem bakteryjnym. Badanie

powtarza si´, jeÊli w okienku z kontrolà negatywnà

obecne sà fluoryzujàce komórki bakterii.

Poz. 775

Preparaty z kontrolà pozytywnà wykonuje si´ oddzielne, z u˝yciem zawiesiny 106 komórek/ml

szczepu nale˝àcego do odpowiedniej rasy/biowaru bakterii Ralstonia solanacearum. Dla ka˝dego

zestawu testów wykonuje si´ jeden preparat kontrolny.

Sposób wykonania badania

1) preparaty z badanych prób wykonuje si´ w nast´pujàcy sposób

a) w przypadku osadu z niewielkà zawartoÊcià

skrobi — za pomocà pipety nanosi si´ na

okienka, w jednym rz´dzie, standardowà obj´toÊç zawieszonego w buforze osadu; standardowà obj´toÊcià dla okienek o Êrednicy 6 mm

jest 15 µl; dla okienek o wi´kszej Êrednicy nale˝y dokonaç proporcjonalnych przeliczeƒ;

drugi rzàd okienek mo˝e byç u˝yty jako powtórzenie próby lub dla kolejnej próby, zgodnie ze schematem 1,

b) w przypadku pozosta∏ych ekstraktów — wykonuje si´ dziesi´ciokrotne rozcieƒczenia ekstraktu (1:10, 1:100 i 1:1000) w buforze do zawieszania osadu; za pomocà pipety nanosi si´

na okienka, w jednym rz´dzie, standardowà

obj´toÊç zawieszonego w buforze osadu i jego rozcieƒczenia; standardowà obj´toÊcià dla

okienek o Êrednicy 6 mm jest 15 µl; dla okienek o wi´kszej Êrednicy nale˝y dokonaç proporcjonalnych przeliczeƒ; drugi rzàd okienek

mo˝e byç u˝yty jako powtórzenie próby lub

dla kolejnej próby, zgodnie ze schematem 2;

2) krople pozostawia si´ do wyschni´cia, a nast´pnie preparat utrwala si´ przez ogrzanie, opalenie

lub z u˝yciem 95 % etanolu;

3) w przypadku gdy preparaty wykonuje si´ zgodnie ze sposobem okreÊlonym w pkt 1 lit. a, sporzàdza si´ zestaw dwukrotnych rozcieƒczeƒ

[1/4 miana (M/4), 1/2 miana (M/2), miano (M) i podwojone miano (2M)] przeciwcia∏ w buforze IF,

o którym mowa w cz´Êci IV ust. 3; w przypadku

sposobu okreÊlonego w pkt 1 lit. b — sporzàdza

si´ rozcieƒczenie robocze (RR) przeciwcia∏ w buforze IF; rozcieƒczenie robocze jest rozcieƒczeniem przeciwcia∏ o optymalnej specyficznoÊci

i stanowi ono zwykle po∏ow´ miana

a) preparaty umieszcza si´ na wilgotnej bibule;

okienka z badanymi próbami pokrywa si´

przeciwcia∏ami, a w okienku z kontrolà negatywnà FITC umieszcza si´ bufor PBS; naniesiona na okienka obj´toÊç przeciwcia∏ musi

byç równowa˝na obj´toÊci naniesionego ekstraktu,

b) preparaty inkubuje si´ pod przykryciem przez

30 minut w temperaturze otoczenia,

c) krople przeciwcia∏ usuwa si´ z preparatów,

a nast´pnie preparaty ostro˝nie sp∏ukuje si´

buforem IF; moczy si´ przez pi´ç minut w buforze IF-Tween, a nast´pnie pi´ç minut w buforze IF i ostro˝nie usuwa si´ nadmiar wilgoci,

d) preparaty umieszcza si´ na wilgotnej bibule;

okienka z badanymi próbami oraz okienko

z kontrolà negatywnà FITC pokrywa si´ koniugatem FITC w rozcieƒczeniu u˝ytym przy

okreÊlaniu miana; naniesiona na okienka obj´toÊç koniugatu (FITC) musi byç identyczna

jak obj´toÊç naniesionych przeciwcia∏,

e) preparaty inkubuje si´ pod przykryciem przez

30 minut w temperaturze otoczenia,

Poz. 775

f) krople koniugatu usuwa si´ z preparatu, preparat p∏ucze si´, a nast´pnie moczy w sposób

okreÊlony w lit. c i ostro˝nie usuwa si´ nadmiar wilgoci,

g) na ka˝de okienko nanosi si´ za pomocà pipety 5—10 µl 0,1 M buforu fosforanowego z glicerolem, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 3,

lub podobnego utrwalacza i nak∏ada si´

szkie∏ko nakrywkowe;

4) odczyt testu IF — preparaty oglàda si´ w mikroskopie epifluorescencyjnym z filtrami odpowiednimi dla wzbudzenia FITC pod imersjà, stosujàc

powi´kszenie 500—1000x; okienka przeglàda si´

w poprzek dwóch Êrednic przeci´tych pod kàtem

prostym oraz wokó∏ obwodu okienka; najpierw

sprawdza si´ preparat z kontrolà pozytywnà; komórki muszà byç wyraênie zabarwione i wykazywaç jasnà fluorescencj´; test nale˝y powtórzyç,

jeÊli zabarwienie jest niew∏aÊciwe; przeglàdajàc

preparaty z badanà próbà, najpierw sprawdza

si´, czy w kontroli FITC nie wyst´pujà fluoryzujàce komórki; obecnoÊç fluoryzujàcych komórek

w kontroli FITC wskazuje na niespecyficzne wiàzanie koniugatu FITC, autofluorescencj´ lub kontaminacj´; test nale˝y powtórzyç, je˝eli takie zjawisko wyst´puje; okienka z badanymi próbami

przeglàda si´, poszukujàc jasno fluoryzujàcych

komórek o charakterystycznej dla bakterii Ralstonia solanacearum morfologii; intensywnoÊç

fluorescencji musi byç równowa˝na z intensywnoÊcià fluorescencji w preparacie z kontrolà pozytywnà z u˝yciem tego samego rozcieƒczenia

przeciwcia∏; komórki nieca∏kowicie zabarwione

lub s∏abo fluoryzujàce muszà byç pomini´te,

chyba ˝e wyst´puje wiele takich komórek.

Interpretacja wyników testu IF

1) je˝eli nie stwierdzono obecnoÊci jasno fluoryzujàcych komórek o charakterystycznej morfologii,

wynik testu jest negatywny;

2) je˝eli stwierdzono obecnoÊç jasno fluoryzujàcych komórek o charakterystycznej morfologii,

okreÊla si´ Êrednià iloÊç komórek w polu widzenia i oblicza si´ iloÊç komórek (N) w ml zawieszonego osadu wed∏ug wzoru okreÊlonego w cz´Êci

IV ust. 4; populacja stanowiàca oko∏o 103 komórek/ml zawieszonego osadu jest uznawana za

granic´ wykrywalnoÊci w teÊcie IF, a wi´c

w przypadku prób o

a) N > 103 komórek/ml zawieszonego osadu —

wynik testu jest uznawany za pozytywny,

b) N < 103 komórek/ml zawieszonego osadu —

wynik testu mo˝e byç uznawany za pozytywny;

3) je˝eli w zakresie miana przeciwcia∏ widoczna jest

du˝a iloÊç (>105 komórek/ml) cz´Êciowo lub s∏abo fluoryzujàcych komórek, wykonuje si´ drugi

test

a) oparty na innej zasadzie biologicznej lub

b) powtórny test IF z u˝yciem innych przeciwcia∏

albo z u˝yciem dziesi´ciokrotnie rozcieƒczonego osadu.

Poz. 775

5) sporzàdza si´ odpowiednie rozcieƒczenie przeciwcia∏ na bakteri´ Ralstonia solanacearum

w buforze blokujàcym, o którym mowa w cz´Êci

IV ust. 5; do studzienek nanosi si´ po 100 µl rozcieƒczonych przeciwcia∏ oraz inkubuje przez godzin´ w temperaturze 37 °C;

6) przeciwcia∏a usuwa si´ ze studzienek, a studzienki wyp∏ukuje si´ w sposób okreÊlony w pkt 4;

7) sporzàdza si´ odpowiednie rozcieƒczenie koniugatu z alkalicznà fosfatazà w buforze blokujàcym i nanosi si´ po 100 µl rozcieƒczonego koniugatu do studzienek; p∏ytki inkubuje si´ przez

1 godzin´ w temperaturze 37 °C;

8) koniugat, o którym mowa w pkt 7, usuwa si´ ze

studzienek, a studzienki wyp∏ukuje si´ w sposób okreÊlony w pkt 4;

9) sporzàdza si´ roztwór substratu alkalicznej fosfatazy, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 5, nanosi si´ po 100 µl do studzienek oraz inkubuje

przez 30 minut do jednej godziny w ciemnoÊci,

w temperaturze otoczenia;

10) absorbancj´ odczytuje si´ przy d∏ugoÊci fali

409 nm.

3. Test ELISA

W teÊcie ELISA u˝ywa si´ przeciwcia∏ na bakteri´

Ralstonia solanacearum (najlepiej ras´ 3/biowar 2).

Miano okreÊla si´ z u˝yciem zawiesiny 106 komórek/ml homologicznego szczepu bakterii Ralstonia

solanacearum. U˝ywa si´ p∏ytek titracyjnych. Sporzàdza si´ kontrol´ negatywnà z u˝yciem ekstraktu

ze zdrowych ziemniaków i kontrol´ buforu fosforanowego (PBS); jako kontroli pozytywnej u˝ywa si´

zawiesiny o st´˝eniu >106 komórek/ml szczepu nale˝àcego do odpowiedniej rasy/biowaru bakterii

Ralstonia solanacearum. Z kontrolà pozytywnà post´puje si´ w taki sam sposób jak z badanymi próbami, przy czym kontrol´ pozytywnà wyraênie oddziela si´ od badanej próby na p∏ytce titracyjnej.

Sposób wykonania badania

1) wprowadza si´ 100—200 µl zawieszonego osadu

za pomocà pipety do mikroprobówki, którà podgrzewa si´ przez 4 minuty w temperaturze 100 °C,

a nast´pnie pozostawia w lodzie;

2) dodaje si´ równowa˝nà obj´toÊç podwójnie

st´˝onego buforu op∏aszczajàcego, o którym

mowa w cz´Êci IV ust. 5, oraz miesza si´ na

wstrzàsarce typu worteks;

3) nanosi si´ po 100 µl ekstraktu do co najmniej

dwóch studzienek w p∏ytce titracyjnej, a nast´pnie inkubuje si´ przez jednà godzin´ w temperaturze 37 °C lub pozostawia do nast´pnego

dnia w temperaturze 4 °C;

4) ekstrakt usuwa si´ ze studzienek, a studzienki

wyp∏ukuje si´ trzykrotnie buforem PBS-Tween,

o którym mowa w cz´Êci IV ust. 5, pozostawiajàc bufor w studzienkach przy ostatnim p∏ukaniu na co najmniej 5 minut;

Interpretacja wyników testu ELISA

1) je˝eli g´stoÊç optyczna (GO) próby jest <2 x GO

kontroli negatywnej — wynik testu ELISA jest

negatywny;

2) je˝eli g´stoÊç optyczna (GO) próby jest >2 x GO

kontroli negatywnej — wynik testu ELISA jest

pozytywny.

4. Test PCR

Na wszystkich etapach przygotowania próby i podczas innych czynnoÊci zwiàzanych z przeprowadzaniem testu PCR u˝ywa si´ koƒcówek do pipet z filtrem. Sporzàdza si´ zawiesin´ 106 komórek/ml

szczepu nale˝àcego do rasy 3/biowaru bakterii Ralstonia solanacearum jako kontrol´ pozytywnà.

Z kontrolà pozytywnà post´puje si´ w taki sam sposób jak z badanymi próbami.

Sposób wykonania badania

1) wprowadza si´ 100 µl zawieszonego osadu za

pomocà pipety do mikroprobówki albo przenosi

si´ 90 µl zawieszonego osadu do mikroprobówki zawierajàcej 10 µl 0,5M NaOH; miesza si´

przez kilkakrotne odwrócenie probówki;

2) probówk´ ogrzewa si´ przez 4 minuty w temperaturze 100 °C, a nast´pnie pozostawia w lodzie;

3) sporzàdza si´ co najmniej dwa dziesi´ciokrotne

rozcieƒczenia (1:10 i 1:100) lub wi´cej, je˝eli uzna

si´ za stosowne, w sterylnej wodzie destylowanej lub w wodzie ultraczystej (UPW);

4) przygotowuje si´ mieszanin´ reakcyjnà do testu

PCR, o której mowa w cz´Êci IV ust. 6, w sterylnej mikroprobówce i dodaje si´ sk∏adniki w nast´pujàcej kolejnoÊci

a) dla obj´toÊci 50 µl

sk∏adnik

woda sterylna destylowana lub UPW

10 x bufor PCR

d-ATP

d-CTP

d-GTP

d-TTP

primer OLI-1 (20 µM)

primer Y-2 (20 µM)

Tag polimeraza (5 U/µl)

iloÊç

st´˝enie koƒcowe

30,8 µl—33,8 µl

5,0 µl

1,0 µl

1,0 µl

1,0 µl

1,0 µl

2,5 µl

2,5 µl

0,2 µl

obj´toÊç ca∏kowita 45 µl—48 µl

1x

0,2 mM

0,2 mM

0,2 mM

0,2 mM

1 mM

1 mM

1,0 U

b) dla wi´kszej liczby reakcji — przelicza si´ iloÊç

ka˝dego sk∏adnika na wymaganà liczb´ reakcji, a nast´pnie miesza si´ sk∏adniki i przenosi

45 µl—48 µl mieszaniny do sterylnych probówek PCR; probówki z mieszaninà reakcyjnà do

PCR przetrzymuje si´ w lodzie,

c) dla obj´toÊci 25 µl — sk∏adniki przelicza si´

proporcjonalnie;

5) amplifikacja PCR

a) probówki z zagotowanà próbà i kontrolà pozytywnà mo˝na odwirowaç; do poszczególnych

probówek z mieszaninà reakcyjnà PCR dodaje

si´ w nast´pujàcej kolejnoÊci: 2—5 µl próby

albo kontrol´ negatywnà (woda), albo kontrol´ pozytywnà; probówki umieszcza si´ w bloku grzejnym amplifikatora DNA,

b) przeprowadza si´ program, obejmujàcy nast´pujàce etapy:1)

— jeden cykl: 2 minuty w temperaturze

96 °C (denaturacja),

— 50 cykli: 20 sekund w temperaturze

94 °C (denaturacja), 20 sekund w temperaturze 68 °C (przy∏àczanie primerów),

30 sekund w temperaturze 72 °C (wyd∏u˝anie kopii),

— jeden cykl: 10 minut w temperaturze

72 °C (dalsze wyd∏u˝anie),

— jeden cykl: utrzymywanie w temperaturze

4 °C,

c) probówki wyjmuje si´ z amplifikatora i analizuje produkt PCR; je˝eli analiza nie b´dzie wykonywana bezpoÊrednio, probówki przechowuje si´ w temperaturze 4 °C w celu u˝ycia

jeszcze tego samego dnia, lub w temperaturze

–18 °C, je˝eli analiza b´dzie przeprowadzana

w póêniejszym terminie;

6) analiza produktu PCR drogà elektroforezy agarozowej i barwienia bromkiem etydyny

————————

1) Podane parametry przewidziane sà dla amplifikatora Perkin Elmer 9600; w przypadku innych amplifikatorów konieczne mo˝e byç dodanie do probówki reakcyjnej PCR

oleju mineralnego lub modyfikacja czasu w etapie obejmujàcym 50 cykli.

a) sporzàdza si´ odpowiedni ˝el agarozowy, doprowadzajàc stopniowo do wrzenia agaroz´

w buforze do elektroforezy (TAE),

b) p∏ynnà agaroz´ sch∏adza si´ do temperatury

50—60 °C, a nast´pnie wlewa pomi´dzy dwie

p∏yty w celu uformowania ˝elu i montuje grzebieƒ; pozostawia si´ do zestalenia,

c) usuwa si´ grzebieƒ; ˝el zanurza si´ w buforze

TAE w taki sposób, aby by∏ pokryty 2—3 mm

warstwà buforu,

d) na parafilmie umieszcza si´ 3 µl kropl´ buforu

obcià˝ajàcego; dodaje si´ 12 µl produktu PCR

z próby, z kontroli pozytywnej lub z kontroli negatywnej (woda), po czym miesza si´ kilkakrotnie nabierajàc i wypuszczajàc mieszanin´

z koƒcówki pipety; podane obj´toÊci mogà byç

modyfikowane w taki sposób, aby odpowiada∏y rozmiarowi kieszonki w ˝elu agarozowym,

e) ostro˝nie nape∏nia si´ kieszonki w ˝elu; w co

najmniej jednej kieszonce umieszcza si´ odpowiedni wzorzec DNA jako odniesienie,

f) prowadzi si´ elektroforez´ przy parametrach

5—8 V/cm do chwili, a˝ wskaênik osiàgnie poziom 1 cm od koƒcowego brzegu ˝elu,

g) po wy∏àczeniu aparatu do elektroforezy,

ostro˝nie wyjmuje si´ ˝el i zanurza si´ w roztworze bromku etydyny na 30—45 minut, u˝ywajàc r´kawic jednorazowych,

h) ˝el odbarwia si´ w wodzie destylowanej przez

10—15 minut,

i) zamplifikowany fragment oglàda si´ w transiluminatorze UV; produkt PCR dla bakterii Ralstonia solanacearum z zestawem primerów

OLI-1 i Y-2 ma wielkoÊç 288 bp; porównuje si´

go z markerem DNA i kontrolà pozytywnà;

kontrola negatywna (woda) w ka˝dym przypadku musi byç negatywna, w przeciwnym

przypadku test nale˝y powtórzyç,

j) wykonuje si´ fotografi´ ˝elu w celu udokumentowania wyników, je˝eli jest to wymagane,

k) potwierdza si´ autentycznoÊç zamplifikownego fragmentu drogà analizy z u˝yciem enzymów restrykcyjnych (REA);

7) analiza z u˝yciem enzymów restrykcyjnych (REA)

a) przenosi si´ 8,5 µl produktu PCR do nowej mikroprobówki i dodaje si´ 1 µl st´˝onego 10 x buforu do enzymu i 0,5 µl enzymu restrykcyjnego

Ava II,

b) zawartoÊç probówki miesza si´ kilkakrotnie

nabierajàc i wypuszczajàc mieszanin´ z koƒcówki pipety; je˝eli na Êciankach mikroprobówki pozostanà krople, krótko wiruje si´

w mikrowirówce oraz inkubuje si´ przez godzin´ w temperaturze 37 °C,

c) analizuje si´ strawiony przez enzymy restrykcyjne fragment PCR drogà elektroforezy agarozowej w sposób okreÊlony ust. 4 pkt 6.

Interpretacja wyników testu PCR

1) je˝eli nie wykryto charakterystycznego fragmentu 288 bp, a fragment ten zosta∏ wykryty w kontroli pozytywnej Ralstonia solanacearum — wynik testu PCR jest negatywny;

2) je˝eli wykryto charakterystyczny fragment 288 bp,

a analiza REA zamplifikowanego fragmentu jest

identyczna jak w przypadku kontroli pozytywnej

bakterii Ralstonia solanacearum — wynik testu

PCR jest pozytywny.

5. Izolacja na pod∏o˝a selektywne

1) izolacj´ przeprowadza si´ z zastosowaniem techniki rozcieƒczeƒ p∏ytkowych, np.

a) sporzàdza si´ co najmniej dwa 10. rozcieƒczenia osadu zawieszonego w buforze do osadu

(1:10 i 1:100) lub wi´cej, jeÊli uzna si´ za stosowne; nanosi si´ za pomocà pipety odmierzonà standardowà obj´toÊç (50—100 µl) zawieszonego w buforze osadu i ka˝de jego rozcieƒczenie na zmodyfikowane pod∏o˝e selektywne SMSA, o którym mowa w cz´Êci IV

ust. 7, po czym rozprowadza si´ na powierzchni pod∏o˝a za pomocà szklanej

g∏aszczki; je˝eli uzna si´ za stosowne, wykonuje si´ posiew zawieszonego osadu za pomocà ezy z oczkiem o obj´toÊci 10 µl; po ka˝dym etapie ez´ opala si´ lub

b) przenosi si´ odmierzonà standardowà obj´toÊç (50—100 µl) zawieszonego w buforze

osadu na zmodyfikowane pod∏o˝e selektywne SMSA i rozprowadza na ca∏ej powierzchni

pod∏o˝a za pomocà szklanej g∏aszczki; wykonuje si´ posiew bez opalania g∏aszczki, na co

najmniej dwóch innych szalkach ze zmodyfikowanym pod∏o˝em SMSA;

2) przygotowuje si´ kontrol´ pozytywnà, stosujàc

t´ samà metod´ rozcieƒczeƒ p∏ytkowych w odniesieniu do zawiesiny 106 komórek/ml patogenicznej rasy 3/biowaru 2 bakterii Ralstonia solanacearum na oddzielnym zestawie p∏ytek ze

zmodyfikowanym pod∏o˝em SMSA;

Poz. 775

3) p∏ytki inkubuje si´ w temperaturze 28 °C, a odczyt wyniku rozpoczyna si´ po trzech dniach;

w przypadku wyniku negatywnego p∏ytk´ inkubuje si´ dalej, do szeÊciu dni; kolonie patogenicznych izolatów bakterii Ralstonia solanacearum sà mlecznobia∏e, p∏askie, nieregularne

i fluidalne, z krwistoczerwonym zag∏´bionym

Êrodkiem, wykazujàce wewn´trzne bruzdki;

4) kolonie bakterii o charakterystycznej morfologii,

w celu uzyskania czystej kultury, przeszczepienia

si´ na podstawowe pod∏o˝e od˝ywcze, o którym

mowa w cz´Êci IV ust. 1;

5) identyfikuje si´ czystà kultur´ w sposób okreÊlony w cz´Êci II ust. 4 pkt 1 i potwierdza identyfikacj´ bakterii Ralstonia solanacearum na podstawie testu patogenicznoÊci, o którym mowa

w cz´Êci II ust. 4 pkt 3.

Interpretacja wyników uzyskanych w metodzie izolacji na pod∏o˝a selektywne

1) je˝eli w ciàgu szeÊciu dni nie wyrosnà ˝adne kolonie lub nie zostanà wyizolowane kolonie charakterystyczne dla bakterii Ralstonia solanacearum, pod warunkiem ˝e nie podejrzewa si´ hamujàcego wp∏ywu innych kolonii bakterii, oraz

je˝eli w kontroli pozytywnej obecne sà kolonie

charakterystyczne dla bakterii Ralstonia solanacearum — wynik izolacji na pod∏o˝a selektywne

uznaje si´ za negatywny;

2) je˝eli obecne sà kolonie charakterystyczne dla

bakterii Ralstonia solanacearum — wynik izolacji

na pod∏o˝a selektywne uznaje si´ za pozytywny.

6. Test biologiczny

1) dla ka˝dej badanej próby u˝ywa si´ 10 sadzonek

roÊlin testowych podatnej odmiany pomidora

lub ober˝yny w stadium trzeciego liÊcia w∏aÊciwego; nie podlewa si´ roÊlin 24 godziny przed

inokulacjà;

2) 100. µl zawieszonego osadu inokuluje si´ roÊliny

testowe, wk∏uwajàc ig∏´ w ∏odyg´ pomi´dzy liÊcieniami oraz w jedno lub kilka innych miejsc;

3) przygotowuje si´ kontrol´ pozytywnà; stosujàc

t´ samà technik´ inokuluje si´ 10 sadzonek zawiesinà 106 komórek/ml patogenicznego szczepu bakterii Ralstonia solanacearum biowar 2/rasa 3 jako kontrol´ pozytywnà oraz kontrol´ negatywnà, inokulujàc roÊliny buforem do zawieszenia osadu; roÊliny stanowiàce kontrol´ pozytywnà oddziela si´ od pozosta∏ych roÊlin w celu

unikni´cia kontaminacji;

4) roÊliny testowe hoduje si´ dalej, do czterech tygodni, w temperaturze 22—28 °C i w warunkach

wysokiej wilgotnoÊci wzgl´dnej, codziennie podlewajàc; prowadzi si´ obserwacje w celu stwierdzenia, czy na roÊlinach wystàpià objawy wi´dni´cia, epinastii, chlorozy lub kar∏owatoÊci;

5) izoluje si´ bakterie z zainokulowanych roÊlin

i dokonuje si´ identyfikacji czystej kultury o cha-

rakterystycznej morfologii w sposób okreÊlony

w cz´Êci II ust. 4 pkt 1 oraz potwierdza si´ identyfikacj´ kultury jako bakteri´ Ralstonia solanacearum na podstawie testu patogenicznoÊci,

o którym mowa w cz´Êci II ust. 4 pkt 3;

6) w przypadku zestawu roÊlin z badanej próby niewykazujàcych objawów choroby, je˝eli uzna si´

za stosowne, sprawdza si´, czy nie wyst´puje infekcja latentna: z ka˝dej roÊliny testowej wycina

si´ 1. cm fragment ∏odygi w odleg∏oÊci 2 cm od

miejsca inokulacji; pobranà tkank´ homogenizuje si´ w buforze do maceracji, a nast´pnie wykonuje si´ posiew metodà rozcieƒczeƒ, o której

mowa w cz´Êci III ust. 5 pkt 1; je˝eli wynik jest

pozytywny, dokonuje si´ identyfikacji czystych

kultur o charakterystycznej morfologii w sposób

okreÊlony w cz´Êci II ust. 4 pkt 1 oraz potwierdza

si´ identyfikacj´ kultury jako bakteria Ralstonia

solanacearum na podstawie testu patogenicznoÊci, o którym mowa w cz´Êci II ust. 4 pkt 3.

Interpretacja wyniku testu biologicznego

1) je˝eli roÊliny testowe nie sà pora˝one przez bakteri´ Ralstonia solanacearum, a bakteria Ralstonia solanacearum zosta∏a wykryta w kontroli pozytywnej — wynik testu biologicznego uznaje si´

za negatywny;

2) je˝eli roÊliny testowe sà pora˝one przez bakteri´

Ralstonia solanacearum — wynik testu biologicznego uznaje si´ za pozytywny.

7. Testy wzbogacania

1) przenosi si´ 100 µl zawieszonego osadu do

3 ml zmodyfikowanego bulionu SMSA, o którym

mowa w cz´Êci IV ust. 7;

2) mieszanin´ inkubuje si´ 48 godzin, ale nie d∏u˝ej

ni˝ 72 godziny, w temperaturze 28 °C, z luêno

umocowanym korkiem probówki w celu zapewnienia dost´pu powietrza;

3) wciska si´ korek i miesza si´ na wstrzàsarce typu

worteks; rozdziela si´ go do celów testu IF, testu

ELISA lub testu PCR.

8. Test patogenicznoÊci

Test patogenicznoÊci przeprowadza si´ w sposób

okreÊlony w cz´Êci II ust. 4 pkt 3.

IV. Odczynniki, pod∏o˝a i testy stosowane

przy diagnozowaniu, wykrywaniu i identyfikacji bakterii Ralstonia solanacearum

1. Pod∏o˝a do izolacji i hodowli Ralstonia solanacearum

1) Nutrient Agar (NA) — agar od˝ywczy

Nutrient Agar (Difco)

23 g

Woda destylowana

1 litr

przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki

w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki i sterylizuje w autoklawie w temperaturze

121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do temperatury 50 °C, a nast´pnie rozlewa na p∏ytki;

Poz. 775

2) Yeast-Peptone-Glucose-Agar (YPGA) — agar

dro˝d˝owo-peptonowo-glukozowy

Yeast Extract (Difco)

5g

Bacto Peptone (Difco)

5g

D(+) glukoza (jednowodna)

10 g

Bacto Agar (Difco)

15 g

Woda destylowana

1 litr

przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki

w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki i sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze

121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do temperatury 50 °C, a nast´pnie rozlewa si´ na p∏ytki;

3) Sucrose Peptone Agar (SPA) — agar z sacharozà i peptonem

Sacharoza

20 g

Pepton

5g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4 x 7 H2O

0,25 g

Bacto Agar (Difco)

15 g

Woda destylowana

1 litr

przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki

w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki; ustala si´ pH 7,2—7,4, je˝eli jest to konieczne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze

121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do temperatury 50 °C, a nast´pnie rozlewa si´ na p∏ytki;

4) Pod∏o˝e Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym

Casamino acids (Difco)

1g

Bacto Peptone (Difco)

10 g

Glukoza

5g

Bacto Agar (Difco)

15 g

Woda destylowana

1 litr

przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki

w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze

121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do temperatury 50 °C; dodaje si´ wodny roztwór triphenylu

tetrazolium chloride (Sigma) sterylizowany drogà filtrowania tak, aby uzyskaç ostateczne st´˝enie 50 mg na litr; rozlewa si´ na p∏ytki.

2. Materia∏y do przygotowania próby

1) bufor do maceracji: 50 mM bufor fosforanowy,

pH 7,0

Na2HPO4

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Woda destylowana

1 litr

bufor ten jest stosowany do maceracji tkanek; rozpuszcza si´ sk∏adniki i ustala si´ pH; dzieli si´ na

mniejsze porcje, je˝eli uzna si´ za stosowne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez

15 minut; w przypadku wykonywania testu PCR zaleca si´ dodanie 5 % polyvinylpyrrolidone-40000

MWT (PVP-40) w celu zmniejszenia inhibicji amplifikacji przez czàsteczki zwiàzków aromatycznych

obecnych w ekstrakcie; w przypadku przeprowadzenia homogenizowania tkanek ziemniaka zaleca si´

dodanie Êrodka zapobiegajàcego powstawaniu

k∏aczkowatoÊci, Êrodka przeciwpieniàcego lub Êrodka antyoksydacyjnego, w iloÊciach niezb´dnych do

uzyskania wymaganego st´˝enia;

Lubrol w p∏atkach

0,5 g /litr

DC Silicone antifoam

1,0 ml/litr

tetrasodium pyrophosphate

1,0 g/litr.

autoklawuje si´ oddzielnie; dodaje si´ do uzyskania wymaganego st´˝enia;

2) bufor do zawieszania osadu: 10 mM bufor fosforanowy, pH 7,2

Na2HPO4 x 12 H2O

2,7 g

NaH2PO4 x 2 H2O

0,4 g

Woda destylowana

1 litr

bufor ten jest stosowany do zawieszania tkanki

przystolonowej bulwy i osadu; rozpuszcza si´

sk∏adniki i ustala pH; dzieli na mniejsze porcje,

je˝eli uzna si´ za stosowne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.

Poz. 775

4. OkreÊlanie poziomu infekcji w teÊcie IF

Powierzchnia (S) okienka na szkie∏ku wielopunktowym

wzór (1)

gdzie

D = Êrednica okienka.

Powierzchnia (s) pola widzenia obiektywu

wzór (2)

gdzie

d = Êrednica pola widzenia.

OkreÊla si´ d na podstawie bezpoÊredniego pomiaru lub wed∏ug nast´pujàcego wzoru

wzór (3)

gdzie

i = wspó∏czynnik pola (zale˝y od typu okularu i zawiera si´ w granicach od 8 do 24),

K = wspó∏czynnik tubusa (1 lub 1,25),

G = powi´kszenie 100x, 40x itp. obiektywu,

3. Materia∏y do testu IF

1) bufor IF: 10 mM bufor fosforanowy (PBS), pH 7,2

Na2HPO4 x 12 H2O

2,7 g

NaH2PO4 x 2 H2O

0,4 g

NaCl

8,0 g

Woda destylowana

1 litr

bufor ten jest stosowany do sporzàdzania rozcieƒczeƒ przeciwcia∏; rozpuszcza si´ sk∏adniki

i ustala pH; dzieli si´ na mniejsze porcje, je˝eli

uzna si´ za stosowne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut;

na podstawie wzoru (2)

wzór (4)

na podstawie wzoru (3)

Liczy si´ typowe fluoryzujàce komórki w polu widzenia (c).

OkreÊla si´ liczb´ typowych fluoryzujàcych komórek w okienku (C)

2) bufor IF — Tween

bufor ten jest stosowany do p∏ukania preparatów; dodaje si´ 0,1 % Tween 20 do buforu IF;

3) 0,1 M bufor fosforanowy z glicerolem, pH 7,6

Na2HPO4 x 12 H2O

3,2 g

NaH2PO4 x 2 H2O

0,15 g

Glicerol

50 ml

Woda destylowana

100 ml

bufor ten jest stosowany w celu zapobiegania

szybkiemu wygasaniu fluorescencji.

OkreÊla si´ liczb´ typowych fluoryzujàcych komórek w ml osadu (N)

gdzie

y = obj´toÊç osadu naniesionego na okienko,

F = wspó∏czynnik rozcieƒczenia osadu.

5. Materia∏y do testu ELISA

1) podwójnie st´˝ony op∏aszczajàcy bufor w´glanowy, pH 9,6

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Woda destylowana

1 litr

rozpuszcza si´ sk∏adniki i ustala pH; dzieli si´ na

mniejsze porcje, je˝eli uzna si´ za stosowne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez

15 minut; je˝eli ekstrakt zawiera wysokie frakcje czàsteczek zwiàzków aromatycznych, dodaje si´ siarczynu sodowego o st´˝eniu koƒcowym 0,2 % jako

Êrodka antyoksydacyjnego;

80 g

KH2PO4

2g

Na2HPO4 x 12 H2O

29 g

KCl

2g

Woda destylowana

1 litr

3) bufor fosforanowy (PBS-T)

10 % Tween 20

Woda destylowana

Fiolet krystaliczny

5) roztwór substratu alkalicznej fosfatazy, pH 9,8

Diethanolamine

97 ml

Woda destylowana

800 ml

miesza si´ i ustala pH 9,8 za pomocà st´˝onego

HCl; uzupe∏nia si´ do 1 litra wodà destylowanà;

dodaje si´ 0,2 g MgCl2; rozpuszcza si´ dwie

5 mg tabletki substratu fosfatazy (Sigma)

w 15 ml roztworu.

7. Materia∏y do izolacji na pod∏o˝a selektywne i testów wzbogacania

rozpuszcza si´ sk∏adniki i sprawdza pH; dzieli si´ na

mniejsze porcje, je˝eli uzna si´ za stosowne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez

15 minut;

10 x PBS

4) bufor blokujàcy (przeciwcia∏a) (musi byç Êwie˝o

przygotowany)

10 x PBS

10 ml

Polyvinylpyrrolidone-44000 MWT

(PVP-44)

2,0 g

10 % Tween 20

0,5 g

Mleko w proszku

0,5 g

Woda destylowana

do 100 ml

6. Materia∏y do testu PCR

sekwencja oligonukleotydowa primera

Primer OLI-1 5’-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3’

Primer Y-2 5’-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’

2) 10 x bufor fosforanowy (PBS), pH 7,4

NaCl

Poz. 775

100 ml

5 ml

895 ml

1) pod∏o˝e selektywne SMSA

pod∏o˝e podstawowe

Casamino acids (Difco)

1g

Bacto Peptone (Difco)

10 g

Glicerol

5 ml

Agar (Difco)

15 g

Woda destylowana

1 litr

przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki

w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki i ustala pH; ustala si´ pH 6,5 przed autoklawowaniem, je˝eli jest to konieczne. Ralstonia solanacearum nie roÊnie zbyt dobrze na pod∏o˝u

o pH > 7,0; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do

temperatury 50 °C; dodaje si´ nast´pujàce

sk∏adniki (wszystkie z Sigmy), tak aby uzyskaç

podane ostateczne st´˝enie

5 mg/ litr

Polymixin B sulphate

100 mg/litr

(Êrednio 600 000 jednostek)

Sigma P-1004

Bacitracin*)

25 mg/litr

(Êrednio 1250 jednostek)

Sigma B-0125

Chloramphenicol

5 mg/litr

Penicilin-G

0,5 mg/litr

Tetrazolium salts

50 mg/litr

Sigma C-3175

(Êrednio 825 jednostek)

Sigma P-3032

*) zwi´kszenie st´˝enia Bacitracin do 300 ppm mo˝e zmniejszyç stopieƒ kontaminacji przez bakterie saprofitycz-

ne bez redukcji wzrostu Ralstonia solanacearum;

sk∏adniki rozpuszcza si´ w 70 % etanolu, tak aby

uzyskaç dane st´˝enia dla obj´toÊci przygotowanego pod∏o˝a; niektóre sk∏adniki, mianowicie polymixin B i chloramphenicol wymagajà lekkiego

podgrzania i wstrzàsania;

2) bulion SMSA

przygotowuje si´ w podobny sposób jak selektywne pod∏o˝e SMSA, lecz nie dodaje si´ agaru;

rozdziela si´ po 3 ml do 30 ml uniwersalnych

probówek.

775

ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI1)

z dnia 13 kwietnia 2004 r.

w sprawie szczegó∏owych sposobów post´powania przy zwalczaniu

i zapobieganiu rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum2)

Na podstawie art. 10 ust. 1 ustawy z dnia 18 grudnia 2003 r. o ochronie roÊlin (Dz. U. z 2004 r. Nr 11,

poz. 94) zarzàdza si´, co nast´puje