Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 kwietnia 2004 r. w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzenianiu się bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

§ 1. Rozporzàdzenie okreÊla

1) szczegó∏owe sposoby post´powania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania si´ bakterii

Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, powodujàcej chorob´ zwanà bakteriozà pierÊcieniowà ziemniaka, w celu zlokalizowania i okreÊlenia

rozprzestrzenienia, niedopuszczenia do wystàpienia i rozprzestrzenienia oraz zwalczenia i zniszczenia tej bakterii, w tym

a) metody zwalczania bakterii i zapobiegania jej

rozprzestrzenianiu si´,

b) metody wykrywania i identyfikacji bakterii,

c) sposób wyznaczania stref, w których powinny

byç stosowane Êrodki w celu zwalczania lub zapobiegania rozprzestrzenianiu si´ bakterii,

d) warunki prowadzenia produkcji, obrotu, przemieszczania, przechowania, nabywania lub zbywania roÊlin;

2) dokument potwierdzajàcy, ˝e w partii bulw ziemniaka wyprowadzanych z terytorium Rzeczypospolitej Polskiej nie stwierdzono wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

b) roÊliny nieposadzone w chwili wprowadzania

do obrotu lub przemieszczania, lecz przeznaczone do póêniejszego sadzenia;

3) urz´dowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka —

sadzeniaki ziemniaka uznane w urz´dowej ocenie

za elitarne lub kwalifikowane;

4) miejsce produkcji — wszelkie obiekty, w szczególnoÊci magazyny, przechowalnie, szklarnie, tunele

foliowe lub pola znajdujàce si´ w obr´bie jednego gospodarstwa lub jego cz´Êci lub kilku gospodarstw, stanowiàce jednà zorganizowanà ca∏oÊç.

§ 3. 1. Kontrol´ w celu sprawdzenia wyst´powania

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,

zwanà dalej „urz´dowà kontrolà”, przeprowadza wojewódzki inspektor ochrony roÊlin i nasiennictwa, zwany dalej „wojewódzkim inspektorem”, na roÊlinach

ziemniaka (Solanum tuberosum L.) znajdujàcych si´

w uprawie oraz na bulwach ziemniaka po zbiorach,

w zakresach i terminach uwzgl´dniajàcych systemy

produkcji roÊlin ziemniaka oraz biologi´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, a tak˝e wiedz´ naukowà w tym zakresie.

2. Wojewódzki inspektor w ka˝dym przypadku podejrzenia wystàpienia pora˝enia, w celu potwierdzenia lub wykluczenia podejrzeƒ

§ 2. U˝yte w rozporzàdzeniu okreÊlenia oznaczajà

1) pobiera próby bulw z partii ziemniaków, w szczególnoÊci bulw pochodzàcych z przechowalni,

i poddaje je badaniom laboratoryjnym;

1) sadzenie — ka˝dà czynnoÊç majàcà na celu

umieszczenie roÊlin w sposób umo˝liwiajàcy ich

wzrost, reprodukcj´ lub rozmno˝enie;

2) przeprowadza dodatkowo ocen´ wizualnà krojonych bulw ziemniaka.

2) roÊliny przeznaczone do sadzenia

a) roÊliny ju˝ posadzone, które majà pozostaç

w pod∏o˝u uprawowym lub byç przesadzone,

lub

———————

1) Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje dzia∏em admini-

stracji rzàdowej — rolnictwo, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 1

rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca

2002 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305).

2) Przepisy niniejszego rozporzàdzenia wdra˝ajà postanowienia

— Dyrektywy Rady 93/85/EEC z dnia 4 paêdziernika 1993 r.

w sprawie zwalczania bakteriozy pierÊcieniowej ziemniaka (Dz. Urz. WE, L 259 z 18.10.1993 r.).

Dane dotyczàce og∏oszenia aktu prawa Unii Europejskiej,

zamieszczone w niniejszym rozporzàdzeniu, z dniem uzyskania przez Rzeczpospolità Polskà cz∏onkostwa w Unii

Europejskiej, dotyczà og∏oszenia tego aktu w Dzienniku

Urz´dowym Unii Europejskiej — wydanie specjalne.

3. Badania laboratoryjne, o których mowa w ust. 2

pkt 1, przeprowadza si´ z zastosowaniem metod diagnozowania, wykrywania i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, okreÊlonych

w za∏àczniku do rozporzàdzenia.

§ 4. W przypadku podejrzenia wystàpienia bakterii

Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus na podstawie pozytywnego wyniku testu immunofluorescencyjnego (IF), wskazujàcego na mo˝liwoÊç wystàpienia

tej bakterii, do czasu zakoƒczenia nast´pnych etapów

badania i uzyskania ostatecznego jego wyniku, zabezpiecza si´ i przechowuje

1) wszystkie bulwy lub próby roÊlin ziemniaka, je˝eli

jest to mo˝liwe;

2) pozosta∏y ekstrakt i preparaty IF.

§ 5. 1. W przypadku podejrzenia wystàpienia lub

w przypadku potwierdzenia w czasie badaƒ laboratoryjnych wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis

ssp. sepedonicus, G∏ówny Inspektor Ochrony RoÊlin

i Nasiennictwa powiadamia o tym Komisj´ Europejskà

lub inne paƒstwa cz∏onkowskie Unii Europejskiej.

2. W przypadku potwierdzenia w czasie badaƒ laboratoryjnych wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, przez co najmniej miesiàc od dnia powiadomienia, o którym mowa w ust. 1,

zabezpiecza si´ i przechowuje

1) materia∏ wyszczególniony w § 4;

2) prób´ pora˝onego materia∏u roÊlinnego ober˝yny,

zainokulowanego ekstraktem z pora˝onych bulw

lub roÊlin ziemniaka;

3) wyizolowanà kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

§ 6. W przypadku pobrania prób bulw ziemniaka

do badaƒ laboratoryjnych w celu wykluczenia infekcji

latentnej lub gdy wzrokowo widoczne sà podejrzane

objawy chorobowe, lub gdy uzyskano pozytywne wyniki testu IF lub innych testów, a˝ do zakoƒczenia badaƒ laboratoryjnych potwierdzajàcych lub wykluczajàcych wyst´powanie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

1) nie przemieszcza si´ roÊlin ziemniaka lub bulw pochodzàcych z upraw, partii lub przesy∏ek, z których

pobrano próby, chyba ˝e przemieszczenie to odbywa si´ pod nadzorem wojewódzkiego inspektora

i je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus;

2) bulwy ziemniaka pochodzàce z partii, z których pobrano próby, nie mogà byç przeznaczone do sadzenia i nie mogà byç w czasie zbioru, transportu

lub przechowywania mieszane z innymi partiami

bulw ziemniaka;

3) wojewódzki inspektor

a) podejmuje czynnoÊci majàce na celu wykrycie

êród∏a pochodzenia prawdopodobnego pora˝enia, w przypadku gdy wzrokowo widoczne sà

podejrzane objawy chorobowe lub gdy uzyskano pozytywne wyniki testu IF,

b) mo˝e wprowadziç inne ni˝ okreÊlone w pkt 1 i 2

dzia∏ania zapobiegajàce rozprzestrzenianiu si´

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w szczególnoÊci mo˝e przeprowadzaç

urz´dowe kontrole przemieszczania roÊlin lub

bulw ziemniaka w obr´bie lub poza obiekty gospodarstwa lub miejsca produkcji, zwiàzane

z podejrzeniem wystàpienia tej bakterii.

§ 7. Je˝eli w badaniach laboratoryjnych, przeprowadzonych z zastosowaniem metod diagnozowania,

wykrywania i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, okreÊlonych w za∏àczniku

do rozporzàdzenia, zostanie potwierdzona obecnoÊç

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

w próbie, wojewódzki inspektor

1) uznaje za pora˝one bulwy lub roÊliny ziemniaka,

parti´ roÊlin lub przesy∏k´, z której zosta∏y pobrane

próby do badania, oraz okreÊla jako ska˝one maszyny, urzàdzenia, Êrodki transportu, opakowania,

przechowalnie lub ich cz´Êci oraz wszelkie inne

Poz. 709

przedmioty, które mia∏y kontakt z pora˝onymi bulwami lub roÊlinami ziemniaka, a tak˝e, je˝eli jest to

mo˝liwe, wskazuje ska˝one obiekty, szklarnie, tunele foliowe, pola lub miejsca produkcji, z których

pochodzà pora˝one bulwy lub roÊliny;

2) ustala zasi´g prawdopodobnego pora˝enia, zgodnie z § 8, bioràc pod uwag´: kontakt przed lub po

zbiorze z pora˝onymi roÊlinami ziemniaka, kontakt

ze ska˝onymi maszynami, urzàdzeniami, Êrodkami

transportu, opakowaniami, przechowalniami lub

ich cz´Êciami oraz kontakt ze ska˝onymi obiektami, szklarniami, tunelami foliowymi, polami lub

miejscami produkcji, o których mowa w pkt 1,

a tak˝e powiàzania produkcyjne ze ska˝onymi

miejscami lub przedmiotami oraz okreÊla prawdopodobnie pora˝one roÊliny lub bulwy ziemniaka;

3) wyznacza stref´ na podstawie: stwierdzonego pora˝enia i ska˝enia okreÊlonego w pkt 1, okreÊlonego zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia, zgodnie

z pkt 2, oraz zasi´gu mo˝liwego rozprzestrzenienia

si´ bakterii zgodnie z § 9, zwanà dalej „strefà zagro˝enia”, w której podejmowane b´dà dzia∏ania

w celu zwalczania i zapobiegania rozprzestrzenianiu si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

§ 8. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu

prawdopodobnego pora˝enia bakterià Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus obejmujà

1) inne bulwy lub roÊliny ziemniaka znajdujàce si´

w miejscu produkcji okreÊlonym jako pora˝one;

2) miejsca produkcji, gospodarstwa lub obiekty, które mia∏y jakikolwiek kontakt z bulwami lub roÊlinami ziemniaka okreÊlonymi jako pora˝one, wraz

z miejscami produkcji, w których wspólnie u˝ytkowany jest lub by∏ sprz´t i urzàdzenia u˝ywane

w cyklu produkcyjnym;

3) bulwy lub roÊliny produkowane w miejscach wymienionych w pkt 2 lub wyst´pujàce w tych miejscach produkcji w okresie, w którym bulwy lub roÊliny ziemniaka uznane za pora˝one znajdowa∏y

si´ w tych miejscach;

4) miejsca przechowywania roÊlin lub bulw ziemniaka pochodzàcych z miejsc wymienionych w pkt 2;

5) maszyny, urzàdzenia, Êrodki transportu, opakowania, przechowalnie lub ich cz´Êci oraz inne przedmioty, które mog∏y mieç kontakt z bulwami lub roÊlinami ziemniaka okreÊlonymi jako pora˝one

podczas ostatnich 12 miesi´cy przed stwierdzeniem pora˝enia;

6) bulwy lub roÊliny ziemniaka majàce kontakt

z przedmiotami, o których mowa w pkt 5, przed

czyszczeniem i dezynfekcjà tych przedmiotów oraz

7) bulwy lub roÊliny ziemniaka pochodzàce z tego

samego rozmno˝enia klonalnego co bulwy lub roÊliny uznane za pora˝one, je˝eli badania laboratoryjne wskazujà na mo˝liwoÊç pora˝enia.

§ 9. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu

mo˝liwego rozprzestrzeniania si´ bakterii Clavibacter

michiganensis ssp. sepedonicus obejmujà

1) inne miejsca produkcji, gdzie uprawia si´ ziemniaki

lub inne roÊliny ˝ywicielskie, sàsiadujàce z miejscami produkcji uznanymi za pora˝one lub znajdujàcymi si´ w zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia;

mo˝liwiajàcy rozprzestrzenianie si´ bakterii, tak aby

mog∏y zostaç uznane za niepora˝one.

2) wspólne miejsce wytwarzania rodów sadzeniaków

ziemniaka.

1) na pora˝onym polu

§ 10. 1. W przypadku pora˝enia bulw lub roÊlin

ziemniaka, wojewódzki inspektor przeprowadza badania laboratoryjne wegetatywnych (klonalnych) rozmno˝eƒ rodów ziemniaka, w których wykryto pora˝enie, w sposób umo˝liwiajàcy okreÊlenie pierwotnego

êród∏a infekcji i zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia.

2. Na podstawie badaƒ, o których mowa w ust. 1,

wojewódzki inspektor okreÊla pora˝enie oraz, je˝eli

ma to zastosowanie, wyznacza stref´ zagro˝enia.

3. Dla celów doÊwiadczalnych lub naukowych oraz

dla prac nad selekcjà odmian ziemniaka wojewódzki

inspektor mo˝e odstàpiç od dzia∏aƒ okreÊlonych w § 7

pod warunkiem, ˝e odst´pstwo to nie zak∏óci zwalczania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i nie stworzy ryzyka jej rozprzestrzeniania si´.

§ 11. 1. Pora˝onych bulw lub roÊlin ziemniaka nie

przeznacza si´ do sadzenia i niszczy si´ je pod nadzorem wojewódzkiego inspektora.

2. Je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,

pora˝one bulwy ziemniaka, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, mogà zostaç przeznaczone

1) do przerobu przemys∏owego w zak∏adzie przetwórczym, posiadajàcym mo˝liwoÊci unieszkodliwiania resztek powsta∏ych w procesie przetwarzania

pora˝onych bulw ziemniaka i dezynfekcji miejsc

oraz przedmiotów majàcych kontakt z pora˝onymi

bulwami ziemniaka, pod warunkiem ich bezpoÊredniego i natychmiastowego dostarczenia do tego zak∏adu przetwórczego;

2) na konsumpcj´ lub pasz´, po ich uprzednim ugotowaniu lub uparowaniu w gospodarstwie, z którego pochodzà.

§ 12. 1. Bulw lub roÊlin ziemniaków prawdopodobnie pora˝onych nie przeznacza si´ do sadzenia.

2. Je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,

pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, bulwy i roÊliny ziemniaka prawdopodobnie pora˝one mogà zostaç przeznaczone na cele, o których mowa w § 11

ust. 2, lub do konsumpcji poza gospodarstwem, po ich

uprzednim zapakowaniu i bezpoÊrednim dostarczeniu

do odbiorcy, bez koniecznoÊci przepakowywania.

3. Je˝eli istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, bulwy lub roÊliny ziemniaka prawdopodobnie pora˝one

niszczy si´ pod nadzorem wojewódzkiego inspektora.

§ 13. Ârodki transportu, maszyny, urzàdzenia, opakowania, przechowalnie lub ich cz´Êci oraz inne przedmioty, okreÊlone jako pora˝one lub prawdopodobnie

pora˝one, niszczy si´ lub oczyszcza i dezynfekuje, pod

nadzorem wojewódzkiego inspektora, w sposób unie-

§ 14. 1. W pora˝onych miejscach produkcji

a) przez co najmniej trzy lata uprawy nast´pujàce

po roku, w którym stwierdzono pora˝enie

— niszczy si´ samosiewy ziemniaka i inne naturalnie wyst´pujàce roÊliny ˝ywicielskie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,

— nie sadzi si´ bulw, roÊlin lub nasion ziemniaka ani innych naturalnie wyst´pujàcych roÊlin ˝ywicielskich tej bakterii, a˝ do uznania

pola za wolne od samosiewów ziemniaka

przez co najmniej 2 kolejne lata uprawy,

b) w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka nast´pujàcym po okresie, o którym mowa w lit. a, dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka

urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem bulw pochodzàcych z tej uprawy do konsumpcji lub przerobu przemys∏owego; uprawa i bulwy ziemniaka

podlegajà obowiàzkowej kontroli wojewódzkiego inspektora, w tym tak˝e badaniom laboratoryjnym na obecnoÊç bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,

c) w kolejnym sezonie uprawy ziemniaka, po zastosowaniu cyklu w∏aÊciwego p∏odozmianu,

dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka

urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem na sadzeniaki

ziemniaka, ziemniaki do konsumpcji lub do

przerobu przemys∏owego; uprawa i bulwy

ziemniaka podlegajà obowiàzkowej kontroli

wojewódzkiego inspektora, w tym tak˝e badaniom laboratoryjnym na obecnoÊç bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, albo

2) na pora˝onym polu

a) podczas czterech lat uprawy nast´pujàcych po

roku, w którym stwierdzono pora˝enie

— niszczy si´ samosiewy ziemniaka i inne naturalnie wyst´pujàce roÊliny ˝ywicielskie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,

— nie u˝ytkuje si´ pola do celów rolniczych lub

leÊnych i przeznacza si´ to pole na u˝ytkowanie pastwiskowe, stosujàc cz´ste niskie koszenie lub intensywny wypas,

b) w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka nast´pujàcym po okresie, o którym mowa w lit. a, dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka

urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem bulw na sadzeniaki ziemniaka, ziemniaki do konsumpcji lub

do przerobu przemys∏owego; uprawa i bulwy

ziemniaka podlegajà obowiàzkowej kontroli

wojewódzkiego inspektora, w tym tak˝e badaniom laboratoryjnym na obecnoÊç bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus;

3) na polach innych ni˝ pora˝one

a) w roku uprawy nast´pujàcym po roku, w którym stwierdzono pora˝enie

— nie sadzi si´ bulw, roÊlin i nasion ziemniaka

ani innych naturalnie wyst´pujàcych roÊlin

˝ywicielskich bakterii oraz niszczy si´ samosiewy ziemniaka lub

— dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem

bulw pochodzàcych z tej uprawy na ziemniaki do konsumpcji lub do przerobu przemys∏owego; pod warunkiem, ˝e wojewódzki inspektor stwierdzi, ˝e nie istnieje ryzyko wyst´powania samosiewów ziemniaka i innych

naturalnie wyst´pujàcych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Clavibacter michiganensis ssp.

sepedonicus,

b) przez co najmniej dwa lata uprawy nast´pujàce

po okresie, o którym mowa w lit. a, dopuszcza si´

sadzenie sadzeniaków ziemniaka urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora,

z przeznaczeniem bulw pochodzàcych z tej uprawy na sadzeniaki ziemniaka lub ziemniaki do konsumpcji, lub do przerobu przemys∏owego,

c) w ka˝dym roku uprawy, o których mowa

w lit. a i b, niszczy si´ samosiewy ziemniaka i inne naturalnie wyst´pujàce roÊliny ˝ywicielskie

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, a uprawy podlegajà obowiàzkowej kontroli wojewódzkiego inspektora,

d) je˝eli w roku uprawy nast´pujàcym po roku,

w którym stwierdzono pora˝enie, sadzone by∏y

urz´dowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka

z przeznaczeniem na ziemniaki do konsumpcji

lub do przerobu przemys∏owego, uprawa podlega obowiàzkowej kontroli wojewódzkiego inspektora w terminach pozwalajàcych na wykrycie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w ramach której, w szczególnoÊci,

przeprowadza si´ badania laboratoryjne samosiewów ziemniaka.

2. Pod nadzorem wojewódzkiego inspektora czyÊci

si´ i dezynfekuje wszystkie urzàdzenia, maszyny, Êrodki transportu i przechowalnie lub ich cz´Êci oraz inne

przedmioty w sposób uniemo˝liwiajàcy rozprzestrzenienie si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

1) bezpoÊrednio po stwierdzeniu pora˝enia oraz

2) w ka˝dym nast´pnym roku uprawy, w∏àcznie

z pierwszym sezonem, w którym uprawa ziemniaka jest dozwolona na pora˝onych polach.

3. W systemie produkcji, w którym mo˝liwa jest

ca∏kowita wymiana pod∏o˝a

1) nie sadzi si´ bulw, roÊlin i nasion ziemniaka, chyba

˝e obiekt zosta∏ poddany urz´dowo zatwierdzonym zabiegom w celu wyeliminowania bakterii

Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i usuni´cia wszelkich bulw lub innego materia∏u roÊlin

psiankowatych, ∏àcznie z ca∏kowità wymianà pod-

Poz. 709

∏o˝a oraz oczyszczeniem i dezynfekcjà tego obiektu i ca∏ego jego wyposa˝enia;

2) po dokonaniu zabiegów, o których mowa w pkt 1,

dopuszcza si´ produkcj´ ziemniaka z urz´dowo

kwalifikowanych sadzeniaków, minibulw lub mikroroÊlin ziemniaka wyprodukowanych pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, po uznaniu, ˝e

obiekt jest wolny od bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

§ 15. 1. W obr´bie strefy zagro˝enia, oprócz wymagaƒ okreÊlonych w § 14, bezpoÊrednio po stwierdzeniu pora˝enia i przez nast´pne co najmniej trzy sezony uprawy

1) miejsca produkcji lub gospodarstwa, w których

uprawia si´, przechowuje lub przemieszcza bulwy

ziemniaka oraz wykorzystuje maszyny, urzàdzenia,

narz´dzia i Êrodki transportu zwiàzane z produkcjà

ziemniaka, podlegajà kontroli wojewódzkiego inspektora;

2) w razie potrzeby czyÊci si´ i dezynfekuje maszyny,

urzàdzenia, narz´dzia, Êrodki transportu, opakowania i przechowalnie w gospodarstwach, o których mowa w pkt 1, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, w sposób uniemo˝liwiajàcy rozprzestrzenienie si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus;

3) dopuszcza si´ sadzenie wy∏àcznie urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka;

4) oddzielnie zbiera si´, przemieszcza i przechowuje

sadzeniaki ziemniaka oraz ziemniaki do konsumpcji lub przerobu przemys∏owego na terenie gospodarstw w obr´bie wyznaczonej strefy zagro˝enia;

5) wojewódzki inspektor przeprowadza urz´dowe

kontrole.

2. W obr´bie wyznaczonej strefy zagro˝enia w razie potrzeby, wojewódzki inspektor podejmuje dzia∏ania zmierzajàce do wymiany wszelkiego materia∏u sadzeniakowego ziemniaka.

§ 16. 1. Sadzeniaki ziemniaka powinny spe∏niaç

wymagania specjalne okreÊlone w przepisach wydanych na podstawie art. 20 ust. 1 ustawy z dnia

18 grudnia 2003 r. o ochronie roÊlin oraz pochodziç

w prostej linii z materia∏u poddanego urz´dowej ocenie i uznanego za wolny od bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus na podstawie badaƒ laboratoryjnych przeprowadzonych przez wojewódzkiego

inspektora.

2. Badania, o których mowa w ust. 1, przeprowadza si´

1) w przypadkach gdy pora˝enie dotyczy produkcji

ziemniaka sadzeniaka — na roÊlinach poczàtkowego rozmno˝enia klonalnego;

2) w innych przypadkach — na roÊlinach z poczàtkowego rozmno˝enia klonalnego albo na reprezentatywnych próbach materia∏u bazowego ziemniaka sadzeniaka lub wczeÊniejszych rozmno˝eƒ.

§ 17. 1. Bulwy ziemniaków wyprodukowanych na

terytorium Rzeczypospolitej Polskiej mogà byç prze-

mieszczane z przeznaczeniem do paƒstw cz∏onkowskich, je˝eli zosta∏y zaopatrzone w zaÊwiadczenie

wydane przez wojewódzkiego inspektora po przeprowadzeniu badaƒ laboratoryjnych stwierdzajàcych, ˝e w partii tych bulw nie stwierdzono wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Poz. 709

2. ZaÊwiadczenie jest wystawiane nie wczeÊniej

ni˝ 14 dni przed dniem wyprowadzenia ziemniaków

z terytorium Rzeczypospolitej Polskiej.

§ 18. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie z dniem

og∏oszenia.

Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: W. Olejniczak

Za∏àcznik do rozporzàdzenia Ministra

Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia

13 kwietnia 2004 r. (poz. 709)

I. Metody diagnozowania, wykrywania i identyfikacji

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

1. Pobieranie tkanki z cz´Êci przystolonowych bulwy

Standardowa próba sk∏ada si´ z co najmniej

200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie

25 ton, jednak˝e badanie mo˝na równie˝ wykonaç dla

mniejszych prób

1) myje si´ 200 bulw pod bie˝àcà wodà; za pomocà

regularnie dezynfekowanego skalpela lub skrobaczki do ziemniaków usuwa si´ skórk´ wokó∏

pi´tki ka˝dej bulwy; dezynfekcj´ narz´dzi przeprowadza si´ przez ich zanurzenie w 70 % alkoholu

i ich opalenie;

2) z cz´Êci przystolonowej ka˝dej bulwy pobiera si´

niewielki fragment tkanki, obejmujàcy wiàzki przewodzàce, ograniczajàc iloÊç tkanki innej ni˝ przewodzàca do minimum, nast´pnie tkank´ poddaje si´

badaniom w ciàgu 24 godzin, okreÊlonych w ust. 3

lub przechowuje si´ w temperaturze minus 20 °C do

dwóch tygodni w sposób okreÊlony w ust. 3.

2. Badanie makroskopowe na obecnoÊç objawów

chorobowych

Po pobraniu tkanki z cz´Êci przystolonowej ka˝dà

bulw´ kroi si´ w poprzek i bada na obecnoÊç objawów

———————

1) Objawami obserwowanymi najwczeÊniej, g∏ównie w po-

bli˝u cz´Êci przystolonowej, jest lekka szklistoÊç lub przejrzystoÊç tkanek, bez rozmi´kczenia tkanki otaczajàcej wiàzki przewodzàce. PierÊcieƒ wiàzek przewodzàcych w cz´Êci

przystolonowej mo˝e byç nieznacznie ciemniejszy ni˝ normalnie. Pierwszym, ∏atwym do rozpoznania objawem jest

przebarwienie pierÊcienia wiàzek przewodzàcych na ˝ó∏tawo oraz wydostawanie si´ z nich serowatej masy po lekkim ÊciÊni´ciu bulwy. Wyciek ten zawiera miliony bakterii.

W tym stadium wiàzki przewodzàce mogà ulec przebarwieniu na bràzowo. Poczàtkowo objawy te mogà byç

ograniczone do cz´Êci pierÊcienia, niekoniecznie w pobli˝u cz´Êci przystolonowej, i mogà rozszerzaç si´ stopniowo

na ca∏y pierÊcieƒ. W miar´ rozwoju infekcji dochodzi do

zniszczenia wiàzek przewodzàcych; tkanki bulwy kory pierwotnej mogà oddzielaç si´ od mi´kiszu rdzeniowego.

W zaawansowanym stadium infekcji na powierzchni bulwy pojawiajà si´ sp´kania, które cz´sto majà czerwonawobràzowe brzegi. Objawy mogà byç maskowane przez

wtórne patogeny bakteryjne czy grzybowe, stàd odró˝nienie zaawansowanego stadium bakteriozy pierÊcieniowej

od gnicia powodowanego przez inne czynniki mo˝e byç

trudne, a nawet niemo˝liwe.

bakteriozy pierÊcieniowej1). W tym celu Êciska si´ bulw´ i sprawdza, czy z wiàzek przewodzàcych nie wydostajà si´ zmacerowane tkanki.

3. Przygotowanie prób do testu Grama, testu immunofluorescencji (IF) oraz testu ober˝ynowego

1) tkank´ pobranà z cz´Êci przystolonowej bulw homogenizuje si´ w Êrodku nietoksycznym dla bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

(na przyk∏ad 0,05 M bufor fosforanowy /PBS/ o pH

7,0), w temperaturze poni˝ej 30 °C; zaleca si´ dodanie nietoksycznego Êrodka rozdrabniajàcego;

mo˝e byç równie˝ niezb´dne dodanie nietoksycznego Êrodka zapobiegajàcego powstawaniu piany, o którym mowa w cz´Êci II ust. 1; nie mo˝na

dopuÊciç do nadmiernej maceracji;

2) zmacerowanà tkank´

a) odwirowuje si´ z zastosowaniem parametru

180 g/10 minut; uzyskany supernatant odwirowuje si´ z zastosowaniem parametru: 4000 g/10 minut, nast´pnie zlewa si´ i usuwa supernatant albo

b) odstawia si´ na 30 minut w celu osadzenia si´

resztek roÊlinnych; zlewa si´ supernatant bez

naruszania osadu, a nast´pnie przefiltrowuje

przez bibu∏´ filtracyjnà (Whatman nr 1) umieszczonà na filtrze szklanym (nr 2 = 40–100 µm),

z zastosowaniem wodnej pompy pró˝niowej;

filtrat zbiera si´ do probówki wirówkowej, a nast´pnie przep∏ukuje sterylnym buforem PBS,

tak aby uzyskaç maksymalnie 35 ml filtratu, który odwirowuje si´ z zastosowaniem parametru

4000 g/20 minut;

3) osad zawiesza si´ w sterylnym buforze fosforanowym 0,01 M o pH 7,2, o którym mowa w cz´Êci II

ust. 2, w taki sposób, aby uzyskaç ca∏kowità obj´toÊç oko∏o 1 ml, a nast´pnie dzieli si´ na dwie równe cz´Êci, jednà z nich pozostawia jako materia∏ referencyjny, zamra˝ajàc w temperaturze –20 °C lub

liofilizujàc; pozosta∏à cz´Êç dzieli si´ na po∏ow´;

jednà u˝ywa si´ do testu IF i barwienia Grama,

drugà do testu ober˝ynowego;

4) wszystkie pozytywne kontrole bakterii Clavibacter

michiganensis ssp. sepedonicus i próby traktuje

si´ oddzielnie w celu unikni´cia kontaminacji; ma

to zastosowanie w odniesieniu do preparatów IF

i testu ober˝ynowego; w czasie wykonywania te-

stu IF i testu ober˝ynowego nale˝y oddzielaç od

siebie kontrole pozytywne i badane próby w celu

unikni´cia kontaminacji.

4. Test Grama

1) przygotowuje si´ preparaty Grama ze wszystkich

rozcieƒczeƒ osadu, o których mowa w ust. 5 pkt 2,

i ze wszystkich przeci´tych bulw, o których mowa

w ust. 2, które na przekroju wykazujà szklistoÊç,

zgnilizn´ czy inne podejrzane objawy; materia∏ do

analiz pobiera si´ z brzegu pora˝onych tkanek;

2) przygotowuje si´ preparaty Grama ze znanych kultur bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus oraz, w miar´ mo˝liwoÊci, z naturalnie pora˝onych tkanek, o których mowa w ust. 5 pkt 1;

3) okreÊla si´, które próby zawierajà typowe, Gram dodatnie, maczugowate komórki; komórki bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus majà na

ogó∏ d∏ugoÊç 0,8 do 1,2 µm i szerokoÊç 0,4—0,6 µm2);

procedura barwienia jest okreÊlona w cz´Êci 2 ust. 3.

———————

2) W

preparatach z naturalnie zainfekowanych tkanek lub

Êwie˝o wyizolowanych kultur cz´sto dominujà zaokràglone pa∏eczki, zwykle nieznacznie mniejsze ni˝ komórki ze

starszych kultur wyhodowanych na agarze. Na wi´kszoÊci

pod∏o˝y hodowlanych komórki bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus sà pleomorficznymi, maczugowatymi pa∏eczkami i mogà wykazywaç zmiennoÊç w reakcji Grama. Komórki wyst´pujà pojedynczo, uk∏adajà si´

w pary z charakterystycznym wygi´ciem, co ma zwiàzek

z ich podzia∏em, czasami tworzà nieregularne grupy przypominajàce palisady lub chiƒskie litery.

Poz. 709

5. Test IF

1) w teÊcie IF u˝ywa si´ przeciwcia∏ na znany szczep

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus — ATCC 33113 (NCPPB 2137) lub NCPPB 2140,

o mianie powy˝ej 1:600; w preparacie z badanà próbà uwzgl´dnia si´ kontrol´ PBS w celu sprawdzenia, czy koniugat izotiocyjanianu fluoresceiny przeciw immunoglobulinom króliczym (FITC) nie ∏àczy

si´ niespecyficznie z komórkami bakterii; jako kontrol´ pozytywnà na oddzielnym szkie∏ku stosuje si´

kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (ATCC 33113 /NCPPB 2137/NCPPB 2140)

oraz w miar´ mo˝liwoÊci umieszcza si´ naturalnie

zainfekowanà tkank´ (zachowanà w formie zliofilizowanej lub zamro˝onà w temperaturze –20 °C),

zgodnie ze schematem 2;

2) sposób wykonania badania

a) przygotowuje si´ trzy seryjne dziesi´ciokrotne

rozcieƒczenia (1:10, 1:100 i 1:1000) osadu w wodzie destylowanej (schemat 1),

b) na okienka wielopunktowego szkie∏ka mikroskopowego nanosi si´ za pomocà pipety odmierzonà standardowà obj´toÊç ka˝dego rozcieƒczenia osadu lub zawiesiny bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Êrednio 106 komórek/ml), wystarczajàcà do pokrycia

okienka (Êrednio 25 µl),

Schemat 1

Preparaty z próby i kontrola PBS

Schemat 2

Preparat z kontrolà pozytywnà

c) preparat suszy si´ w temperaturze oko∏o 37 °C,

a nast´pnie utrwala z u˝yciem etanolu lub przez

opalenie,

d) okienka pokrywa si´ przeciwcia∏ami na bakteri´

Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

rozcieƒczonymi w 0,01 M buforze PBS o pH 7,2,

o którym mowa w cz´Êci II ust. 2, jak pokazano

na schemacie 1; u˝ywa si´ PBS jako kontrol´

FITC; rozcieƒczenie robocze przeciwcia∏ stanowi

zwykle po∏ow´ miana; w przypadku u˝ycia innych rozcieƒczeƒ przeciwcia∏, dla ka˝dego rozcieƒczenia przygotowuje si´ oddzielne preparaty,

e) preparat inkubuje si´ w wilgotnej komorze

w temperaturze pokojowej przez 30 minut,

f) po inkubacji preparat ostro˝nie sp∏ukuje si´

0,01 M buforem PBS o pH 7,2, a nast´pnie moczy si´ trzy razy po 5 minut w 0,01 M buforze

PBS o pH 7,2,

g) ostro˝nie usuwa si´ nadmiar wilgoci,

h) ka˝de okienko preparatu pokrywa si´ koniugatem FITC w takim rozcieƒczeniu, jakie by∏o stosowane do okreÊlania miana, i inkubuje si´

w ciemnej, wilgotnej komorze przez 30 minut

w temperaturze pokojowej,

i) preparat sp∏ukuje si´ i moczy, tak jak w lit. f,

j) na ka˝de okienko nanosi si´ Êrednio od 5 do 10

µl 0,1 M buforu fosforanowego z glicerynà o pH

7,6, o którym mowa w cz´Êci II ust 2 (lub podobnego utrwalacza o pH nie ni˝szym ni˝ 7,6) i przykrywa szkie∏kiem nakrywkowym,

k) przygotowany preparat przeglàda si´ w mikroskopie zaopatrzonym w êród∏o Êwiat∏a epifluorescencyjnego i filtry przeznaczone do pracy

z FITC; stosuje si´ powi´kszenie 400 do 1000;

okienka w powtórzeniach przeglàda si´ w poprzek dwóch Êrednic pod kàtem prostym oraz

wokó∏ obwodu okienka.

Poszukuje si´ fluoryzujàcych komórek w kontrolach pozytywnych i okreÊla si´ miano przeciwcia∏. Na-

st´pnie poszukuje si´ fluoryzujàcych komórek

w okienku kontrolnym FITC/PBS i, je˝eli si´ ich nie

stwierdzi, przechodzi si´ do przeglàdania okienek z badanà próbà. W minimum 10 polach mikroskopu okreÊla si´ Êrednià liczb´ morfologicznie typowych, fluoryzujàcych komórek w polu widzenia i oblicza si´ ich

liczb´ w mililitrze nierozcieƒczonego osadu wed∏ug

wzoru okreÊlonego w cz´Êci II ust. 4.

Przy ocenie preparatów bierze si´ pod uwag´ mo˝liwoÊç wystàpienia reakcji krzy˝owych. W osadzie

ziemniaka mogà wyst´powaç populacje fluoryzujàcych komórek o nietypowej dla bakterii Clavibacter

michiganensis ssp. sepedonicus morfologii oraz bakterie saprofityczne dajàce reakcje krzy˝owe, o wymiarach i morfologii podobnych do bakterii Clavibacter

michiganensis ssp. sepedonicus, dlatego te˝ bierze

si´ pod uwag´ tylko fluoryzujàce komórki o typowych

wymiarach i morfologii. Ze wzgl´du na mo˝liwoÊç wyst´powania reakcji krzy˝owych, próby, w przypadku

których uzyskano pozytywne wyniki testu IF, poddaje

si´ powtórnym badaniom z zastosowaniem innych

przeciwcia∏.

Techniczna granica wykrywalnoÊci okreÊlona dla

tego testu zawiera si´ w przedziale 103-104 komórek/ml nierozcieƒczonego osadu. Próby, w których

stwierdza si´ iloÊç typowych fluorescencyjnych komórek na granicy wykrywalnoÊci, sà zwykle wolne od

Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, ale mogà byç poddane testowi ober˝ynowemu.

Wynik testu IF traktuje si´ jako negatywny w przypadku prób, w których nie stwierdza si´ morfologicznie typowych fluoryzujàcych komórek. Próby takie

uznaje si´ za „niepora˝one” przez bakterie Clavibacter

michiganensis ssp. sepedonicus. Test ober˝ynowy nie

jest wymagany.

Wynik testu IF traktuje si´ jako pozytywny w przypadku prób, w których obecne sà morfologicznie typowe, fluoryzujàce komórki.

Próby, w przypadku których uzyskuje si´ pozytywny wynik testu IF z zastosowaniem obydwu rodzajów

przeciwcia∏, uznaje si´ za „potencjalnie pora˝one”

przez bakterie Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

W przypadku wszystkich prób uznanych za „potencjalnie pora˝one” wykonuje si´ test ober˝ynowy.

6. Test ober˝ynowy

Sposób uprawy ober˝yny okreÊlony jest w cz´Êci II

ust. 5.

Test ober˝ynowy przeprowadza si´ w nast´pujàcy

sposób

1) osadem, który otrzymano w sposób okreÊlony

w ust 3 pkt 3, inokuluje si´ co najmniej 25 roÊlin

ober˝yny w stadium trzeciego liÊcia uzyskanych

Poz. 709

w sposób okreÊlony w cz´Êci II ust. 5, za pomocà jednej z metod, o których mowa w ust. 6

pkt 2, 3 i 4;

2) inokulacji przez naci´cie na ∏odydze — pierwszy

sposób

a) ka˝dà doniczk´ umieszcza si´ poziomo w bloczku z polistyrenu (w przypadku doniczki o Êrednicy 10 cm odpowiedni jest bloczek z polistyrenu

z wydrà˝onym z jednej strony miejscem o g∏´bokoÊci 5 cm, szerokoÊci 10 cm i d∏ugoÊci

15 cm), w sposób przedstawiony na schemacie

3; pomi´dzy ∏odygà a bloczkiem, dla ka˝dej próby, umieszcza si´ pasek sterylnej folii aluminiowej; roÊlin´ mo˝na zabezpieczyç za pomocà gumowej opaski na∏o˝onej wokó∏ bloczka,

Schemat 3

b) pomi´dzy liÊcieniami i pierwszym liÊciem, wykonuje si´ za pomocà skalpela pod∏u˝ne lub lekko ukoÊne naci´cie o d∏ugoÊci 0,5—1,0 cm i g∏´bokoÊci Êrednio 3/4 Êrednicy ∏odygi,

c) naci´cie rozchyla si´ za pomocà skalpela

i wprowadza do niego inokulum cienkim p´dzelkiem zanurzonym w osadzie. Pozosta∏y

osad rozdziela si´ pomi´dzy roÊliny ober˝yny,

d) powsta∏à ran´ zabezpiecza si´ 2 ml sterylnej

wazeliny naniesionej za pomocà strzykawki;

3) inokulacja przez naci´cie na ∏odydze — drugi sposób

a) trzymajàc roÊlin´ pomi´dzy dwoma palcami,

w miejscu pomi´dzy liÊcieniami i pierwszym liÊciem nanosi si´ kropl´ (Êrednio od 5 do 10 µl)

zawiesiny osadu,

b) za pomocà sterylnego skalpela wykonuje si´

pod∏u˝ne (pod kàtem oko∏o 5 °) naci´cie, o d∏ugoÊci 1,0 cm i g∏´bokoÊci Êrednio 2/3 gruboÊci

∏odygi, rozpoczynajàc od miejsca naniesienia

kropli osadu,

c) powsta∏à ran´ zabezpiecza si´ sterylnà wazelinà

ze strzykawki;

4) inokulacja za pomocà strzykawki — trzeci sposób

a) nie podlewa si´ roÊlin ober˝yny przez jeden

dzieƒ przed inokulacjà w celu obni˝enia ciÊnienia turgorowego,

b) ∏odygi ober˝yny powy˝ej liÊcieni inokuluje si´

za pomocà strzykawki z ig∏à do iniekcji podskórnej (nie mniejszej ni˝ 23 G); osad rozdziela si´

pomi´dzy roÊliny ober˝yny;

5) inokuluje si´ 25 roÊlin ober˝yny kulturà bakterii zidentyfikowanà wczeÊniej jako kultura bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i, w miar´ mo˝liwoÊci, naturalnie zainfekowanà tkankà

ziemniaka, o której mowa w ust. 5 pkt 1, za pomocà tej samej metody inokulacji;

6) inokuluje si´ 25 roÊlin sterylnym 0,05 M buforem

PBS za pomocà tej samej metody inokulacji;

7) roÊliny inkubuje si´ w odpowiednich warunkach,

o których mowa w cz´Êci II ust. 5, przez 40 dni; po

8 dniach obserwuje si´ roÊliny w celu stwierdze-

nia, czy nie wyst´pujà na nich objawy choroby3)

oraz notuje si´ liczb´ roÊlin wykazujàcà objawy;

je˝eli w kolejnych testach nie sà obserwowane

objawy, prób´ uznaje si´ jako negatywnà.

8) przygotowuje si´ preparaty Grama, o których mowa w ust. 4, dla wszystkich partii ober˝yny wykazujàcych objawy, wykonujàc przekroje przez tkank´ zwi´d∏ego liÊcia lub ∏odygi roÊliny, oraz dokonuje si´ izolacji na odpowiednie pod∏o˝e od˝ywcze, o którym mowa w ust. 7; liÊcie i ∏odygi ober˝yny dezynfekuje si´ powierzchniowo przez zwil˝enie ich 70 % etanolem;

7. Izolacja bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

9) przy ocenie roÊlin testowych bierze si´ pod uwag´

mo˝liwoÊç wystàpienia infekcji latentnej, szczególnie gdy uprawa nie jest prowadzona w optymalnych warunkach, nawet po 40-dniowej inkubacji.

Infekcje takie mogà prowadziç do zahamowania

wzrostu i braku wigoru inokulowanych roÊlin; je˝eli wynik testu IF uznany jest za pozytywny, koniecznym mo˝e byç przeprowadzenie dodatkowych badaƒ, dlatego te˝ nale˝y dokonaç porównania tempa wzrostu wszystkich badanych roÊlin

ober˝yny z roÊlinami kontrolnymi inokulowanymi

sterylnym 0,05 M PBS oraz monitorowanie warunków Êrodowiska szklarni; dalszà ocen´ prowadzi

si´ w nast´pujàcy sposób

a) odcina si´ ∏odygi powy˝ej miejsca inokulacji

i usuwa si´ liÊcie,

b) ∏odygi maceruje si´ w 0,05 M buforze PBS o pH

7,0 w sposób okreÊlony w ust. 3 pkt 1 i 2,

c) po∏ow´ osadu u˝ywa si´ do wykonania testu

Grama i testu IF,

d) drugà po∏ow´ osadu u˝ywa si´ do przeprowadzenia dodatkowego testu ober˝ynowego,

zgodnie z ust. 6, je˝eli uzyskano wyniki pozytywne testu Grama lub testu IF; stosuje si´ kontrol´ pozytywnà, którà stanowi zidentyfikowanà

wczeÊniej kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, oraz kontrol´ negatywnà w postaci sterylnego 0,05 M buforu PBS;

———————

3) Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus po-

woduje wi´dni´cie liÊci ober˝yny, które mo˝e rozpoczynaç

si´ wiotczeniem brzegów lub przestrzeni mi´dzy nerwami.

Zwi´d∏e tkanki mogà byç poczàtkowo ciemnozielone lub

plamiste, lecz jaÊniejà, zanim ulegnà nekrozie. Wi´dnàce

tkanki mi´dzy nerwami cz´sto sprawiajà wra˝enie nat∏uszczonych i uwodnionych. Tkanki nekrotyczne majà cz´sto

jasno˝ó∏ty brzeg. RoÊliny nie zawsze zamierajà; im d∏u˝szy

okres poprzedzajàcy wystàpienie objawów, tym wi´ksza

szansa na prze˝ycie. RoÊliny mogà pokonaç infekcj´. Podatne, m∏ode roÊliny ober˝yny sà bardziej wra˝liwe na ni˝sze koncentracje bakterii Clavibacter michiganensis ssp.

sepedonicus ni˝ roÊliny starsze, stàd koniecznoÊç stosowania do badaƒ roÊlin w stadium trzeciego liÊcia lub nieco m∏odszych. Sprawcà wi´dni´cia mogà byç równie˝ populacje innych bakterii lub grzybów zasiedlajàcych tkanki

bulwy. Do nich nale˝à Erwinia carotovora subsp. carotovora i E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var

foveata, jak równie˝ du˝e populacje bakterii saprofitycznych. Tego typu wi´dni´cie mo˝na odró˝niç od wi´dni´cia

powodowanego przez bakteri´ Clavibacter michiganensis

ssp. sepedonicus, poniewa˝ w pierwszym przypadku

gwa∏townie wi´dnà ca∏e liÊcie lub ca∏e roÊliny.

Ostatecznà diagnoz´ stawia si´ wy∏àcznie po przeprowadzeniu identyfikacji wyizolowanych kultur bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,

o której mowa w ust. 8. Bakteri´ Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus mo˝na wyizolowaç z tkanek

wykazujàcych objawy chorobowe. BezpoÊrednia izolacja bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus z osadu uzyskanego z tkanki ziemniaka, o którym

mowa w ust. 3 pkt 3, nie jest zalecana.

RoÊliny ober˝yny stanowià swoiste pod∏o˝e umo˝liwiajàce namno˝enie si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, jak równie˝ sà najlepszà testowà roÊlinà ˝ywicielskà. Bakteri´ izoluje si´ ze

wszystkich bulw ziemniaka i roÊlin ober˝yny wykazujàcych objawy, o których mowa w ust. 4 i 6. Maceracj´

∏odyg ober˝yny, o ile jest to konieczne, wykonuje si´

zgodnie z ust. 3 i 6 pkt 9

1) zawiesin´ posiewa si´ na jedno z nast´pujàcych

pod∏o˝y, okreÊlonych w cz´Êci II ust. 6

— Nutrient dextrose agar (agar od˝ywczy z glukozà) (tylko do przeszczepiania),

— Yeast peptone glucose agar (agar dro˝d˝owo-peptonowo-glukozowy),

— Nutrient yeast dextrose agar (agar od˝ywczy

dro˝d˝owo-glukozowy),

— Yeast extract mineral salts agar (agar z wyciàgiem dro˝d˝owym wzbogacony solami mineralnymi).

Szalki inkubuje si´ w temperaturze 21 °C do 20 dni,

a nast´pnie obserwuje si´, czy na pod∏o˝u obecne sà

kolonie bakterii o morfologii typowej dla bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.4) Nast´pnie

bakteri´ Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

przeszczepia si´ w celu uzyskania czystej kultury.

8. Identyfikacja wyizolowanych kultur bakterii

Ze zdrowych lub pora˝onych ziemniaków i ober˝yny mo˝na wyizolowaç wiele Gram dodatnich, maczugowatych bakterii, wytwarzajàcych kolonie podobne

do tych produkowanych przez bakterie Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Z tego wzgl´du dokonuje si´ identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w oparciu o nast´pujàce testy

1) test IF;

2) test ober˝ynowy;

———————

4) Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus jest

organizmem wolnorosnàcym. Typowe kolonie sà kremowobia∏e lub barwy koÊci s∏oniowej, okràg∏e, g∏adkie,

wzniesione, Êluzowato-p∏ynne, ca∏obrzegie i zwykle majà

Êrednic´ 1 do 3 mm.

3) testy biochemiczne i fizjologiczne, o których mowa

w cz´Êci II ust. 7

a) test oksydacyjno-fermentacyjny (O/F),

b) test na obecnoÊç oksydazy,

Poz. 709

W ka˝dym teÊcie uwzgl´dnia si´ zidentyfikowanà wczeÊniej kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. W testach biochemicznych i fizjologicznych

wykorzystuje si´ kultury wyhodowane na agarze od˝ywczym. Cechy morfologiczne bakterii ocenia si´ na

podstawie kultur wyros∏ych na agarze z glukozà.

c) wzrost w temperaturze 37 °C,

Test IF wykonuje si´ z wykorzystaniem zawiesiny

bakterii o st´˝eniu 106 komórek/ml. WartoÊç miana

przeciwcia∏ powinna byç zbli˝one do miana okreÊlonego w badaniu i u˝yciem zidentyfikowanej kultury

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Test ober˝ynowy wykonuje si´ z wykorzystaniem zawiesiny bakterii o st´˝eniu 107 komórek/ml. Do testu

u˝ywa si´ 10 roÊlin dla ka˝dej próby, stosujàc znanà

kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus oraz wod´ sterylnà jako kontrole pozytywnà

i negatywnà.

d) produkcja ureazy,

e) hydroliza eskuliny,

f) hydroliza skrobi,

g) tolerancja w stosunku do 7 % NaCl,

h) produkcja indolu,

i) test na obecnoÊç katalazy,

j) produkcja H2S,

k) wykorzystanie cytrynianu,

l) hydroliza ˝elatyny,

m) wytwarzanie kwasu z: glicerolu, laktozy, ramnozy i salicyny,

n) barwienie Grama.

W przypadku czystych kultur typowe objawy wi´dni´cia uzyskuje si´ w ciàgu 20 dni, lecz roÊliny niewykazujàce objawów po up∏ywie tego czasu inkubuje

si´ do koƒca 30-dniowego okresu w temperaturze

optymalnej dla uprawy ober˝yny, lecz nieprzekraczajàcej 30 °C. Je˝eli po 30 dniach objawy nie wystàpià,

kultura nie mo˝e byç uznana za patogenicznà form´

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

Test

O/F

oksydaza

katalaza

redukcja azotanów

aktywnoÊç ureazy

produkcja H2S

produkcja indolu

wykorzystanie cytrynianu

hydroliza skrobi

wzrost w temperaturze 37 °C

wzrost w obecnoÊci 7 % NaCl

hydroliza ˝elatyny

hydroliza eskuliny

produkcja kwasu z

— glicerolu

— laktozy

— ramnozy

— salicyny

oboj´tna lub s∏abo utleniajàca

—

+

—

—

—

—

—

— lub s∏aba

—

—

—

+

—

— lub s∏aba

—

—

II. Odczynniki, pod∏o˝a i testy stosowane przy diagnozowaniu, wykrywaniu i identyfikacji bakterii

Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

1. Sk∏ad p∏ynu do maceracji

D C silicone antifoam MS A compound

(Hopkins & Williams Ltd, nr kat. 9964 — 25,

Chadwell Heath, Essex, England) — Êrodek

przeciwpieniàcy

Lubrol W w p∏atkach (ICI Ltd)

pirofosforan czterosodowy

0,05 M bufor fosforanowy, pH 7,0

10 ml

0,5 g

1g

1 litr

2. Bufory

1) 0,05 M bufor fosforanowy o pH 7,0 stosowany do

maceracji tkanek ziemniaka, o której mowa w cz´Êci I ust. 3 pkt 1

Na2HPO4

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

NaCl

8,00 g

woda destylowana

— uzupe∏nia si´ do 1 litra

2) 0,01 M bufor fosforanowy o pH 7,2 stosowany do

rozcieƒczania przeciwcia∏ i p∏ukania preparatów

w metodzie IF

Poz. 709

przestanie uwalniaç barwnik, lub zanurza si´

w alkoholu na 30 sekund lekko poruszajàc preparatem,

Na2HPO4 x 12 H2O

2,70 g

g) przep∏ukuje si´ wodà z kranu i osusza bibu∏à,

NaH2PO4 x 2 H2O

0,40 g

h) zalewa si´ roztworem safraniny na 10 sekund,

NaCl

8,00 g

woda destylowana

uzupe∏nia si´ do 1 litra

i) preparat przep∏ukuje si´ wodà z kranu i osusza

bibu∏à.

3) 0,1 M bufor fosforanowy z glicerynà o pH 7,6 stosowany do zamykania preparatów, utrwala efekt

fluorescencji

Na2HPO4 x 12 H2O

3,20 g

NaH2PO4 x 2 H2O

0,15 g

glicerol

50 ml

woda destylowana

100 ml

Bakterie Gram dodatnie barwià si´ na kolor niebieskofioletowy, bakterie Gram ujemne na ró˝owoczerwony.

4. OkreÊlanie populacji komórek pozytywnych w teÊcie immunofluorescencji

Powierzchnia (S) okienka na szkie∏ku wielopunktowym

πD2

S = ——

4

3. Test Grama (modyfikacja Huckera)

1) Roztwór fioletu krystalicznego

2 g fioletu krystalicznego rozpuszcza si´ w 20 ml

95 % etanolu

gdzie

D = Êrednica okienka.

Powierzchnia (s) pola widzenia obiektywu

0,8 g kwaÊnego w´glanu sodu rozpuszcza si´ w 80

ml wody destylowanej

πd2

S = ——

4

Miesza si´ obydwa roztwory.

2) P∏yn Lugola

(1)

(2)

gdzie

jod

1g

d = Êrednica pola widzenia.

jodek potasu

2g

woda destylowana

300 ml

d okreÊla si´ na podstawie bezpoÊredniego pomiaru lub wed∏ug nast´pujàcego wzoru

πi2

s = —————

(3)

G2 · K2 · 4

Substancje sta∏e rozdrabnia si´ razem w moêdzierzu. Dodaje si´ wod´ i miesza w zamkni´tym naczyniu do rozpuszczenia.

3) Roztwór barwnika kontrastowego — safraniny

Roztwór podstawowy

gdzie

i = wspó∏czynnik pola (zale˝y od typu okularu

i zawiera si´ w granicach od 8 do 24),

K = wspó∏czynnik tubusa (1 lub 1,25)

safranina O

2,5 g

95 % etanol

100 ml

Miesza si´ oba roztwory i przechowuje. W celu

uzyskania roztworu roboczego, mieszanin´ rozcieƒcza si´ w stosunku 1:10.

G = powi´kszenie 100x, 40x obiektywu,

na podstawie (2)

4) Procedura barwienia

a) przygotowuje si´ rozmaz, suszy si´ go powietrznie i utrwala termicznie,

b) preparat zalewa si´ fioletem krystalicznym na 1

minut´,

c) krótko przep∏ukuje si´ wodà z kranu,

d) zalewa si´ p∏ynem Lugola na 1 minut´,

e) przep∏ukuje si´ wodà z kranu i osusza bibu∏à,

f) preparat odbarwia si´ 95 % etanolem dodawanym kroplami a˝ do momentu, gdy rozmaz

na podstawie (3)

(4)

Liczy si´ typowe fluoryzujàce komórki w polu widzenia (c).

OkreÊla si´ liczb´ typowych fluoryzujàcych komórek w okienku (C).

S

C=c—

s

OkreÊla si´ liczb´ typowych fluoryzujàcych komórek w ml osadu (N)

1000

N = C · –—— · F

y

gdzie

y = obj´toÊç osadu naniesionego na okienko,

F = wspó∏czynnik rozcieƒczenia osadu.

5. Uprawa ober˝yny

Nasiona ober˝yny (Solanum melongena odmiana

Black Beauty) wysiewa si´ do pasteryzowanego kompostu. Siewki z w pe∏ni rozwini´tymi liÊcieniami

(10—14-dniowe) przesadza si´ do pasteryzowanego

kompostu w doniczkach. Do badaƒ u˝ywa si´ ober˝yn´ w stadium trzeciego liÊcia, gdy dwa, lecz nie wi´cej ni˝ trzy liÊcie, sà w pe∏ni rozwini´te. Ober˝yn´ hoduje si´ w szklarni w nast´pujàcych warunkach Êrodowiska

— d∏ugoÊç dnia: 14 godzin lub naturalna d∏ugoÊç

dnia w przypadku dnia d∏u˝szego;

— temperatura: dzieƒ: 21—24 °C, noc: 15 °C.

Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

nie roÊnie w temperaturze powy˝ej 30 °C. Je˝eli temperatura nocà nie spada do 15 °C, mo˝e wystàpiç

uszkodzenie chromatoforów, co uwidoczni si´ w postaci srebrzystej nekrozy. Uszkodzeniom korzeni

przez larwy ziemiórek zapobiega si´ przez zastosowanie odpowiedniego insektycydu.

6. Pod∏o˝a do hodowli i izolacji bakterii Clavibacter

michiganensis ssp. sepedonicus

1) Nutrient agar (NA) — agar od˝ywczy

Difco Bacto Nutrient Agar rozpuszcza si´ w wodzie

destylowanej wed∏ug proporcji podanych przez

producenta, a nast´pnie sterylizuje w autoklawie

w temperaturze 121 °C przez 15 minut.

2) Nutrient dextrose agar (NDA) — agar od˝ywczy

z glukozà

Po˝ywk´ agarowà Difco Bacto Nutrient Agar zawierajàcà 1 % D(+) glukozy (jednowodna), po przygotowaniu wed∏ug zaleceƒ producenta, sterylizuje si´

w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut.

3) Yeast peptone glucose agar (YPGA) — agar dro˝d˝owo-peptonowo-glukozowy

Difco Bacto Yeast Extract (nr 0127)

(wyciàg dro˝d˝owy)

5g

Difco Bacto Peptone (nr 0118)

5g

D(+)-glukoza (jednowodna)

10 g

Difco Bacto Purified Agar (nr 0560)

(agar oczyszczony)

15 g

woda destylowana

1 litr

Po˝ywk´ w porcjach pó∏litrowych sterylizuje si´

w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut.

Poz. 709

4) Yeast extract mineral salts medium (YGM) — po˝ywka z wyciàgiem dro˝d˝owym wzbogacona solami mineralnymi

Difco Bacto Yeast Extract

(wyciàg dro˝d˝owy)

2,00 g

D(+)-glukoza (jednowodna)

2,50 g

0,25 g

K2HPO4

KH2PO4

0,25 g

0,10 g

MgSO4 x 7H2O

MnSO4 x H2O

0,015 g

NaCl

0,05 g

FeSO4 x 7H2O

0,005 g

Difco Bacto Purified Agar

(agar oczyszczony)

18,0 g

woda destylowana

1 litr

Po˝ywk´ w porcjach pó∏litrowych sterylizuje si´

w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut.

7. Testy biochemiczne i fizjologiczne do identyfikacji

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

Wszystkie pod∏o˝a inkubuje si´ w temperaturze

21 °C i przeglàda si´ po 6 dniach. Je˝eli nie obserwuje si´ wzrostu bakterii, inkubuje si´ pod∏o˝a dalej do

20 dni.

1) Test oksydacyjno-fermentacyjny test O/F

Po˝ywka podstawowa

KCl

MgSO4 x 7H2O

NH4H2PO4

Difco bacto pepton

Difco Bacto Purified Agar

(agar oczyszczony)

D(+) glukoza (jednowodna)

b∏´kit bromotymolowy

woda destylowana

0,2 g

0,2 g

1,0 g

1,0 g

3,0 g

10,0 g

0,03 g

1 litr

Miesza si´ sk∏adniki i ustala pH na poziomie

7,0—7,2 za pomocà 1N KOH. Rozdziela si´ po 5 ml

i 10 ml do probówek bakteryjnych o wymiarach

16 mm x 100 mm (obj´toÊç 12 ml). Probówki z po˝ywkà sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze

115 °C przez 10 minut. Ka˝dà kulturà inokuluje si´

pod∏o˝e w 5 ml i 10 ml probówkach metodà nak∏ucia. Do probówki 10 ml dodaje si´ aseptycznie

1—2 ml sterylnej, ciek∏ej parafiny, a nast´pnie inkubuje si´.

Odczyt wyniku

Probówka

Kolor

Interpretacja

otwarta

zamkni´ta

˝ó∏ty

˝ó∏ty

metabolizm

fermentacyjny

otwarta

zamkni´ta

˝ó∏ty

metabolizm

niebieskozielony oksydacyjny

otwarta

zamkni´ta

zielonkawy

metabolizm

niebieskozielony oksydacyjny lub

oboj´tny

4) Test na obecnoÊç katalazy

2) Test na obecnoÊç oksydazy

Odczynnik Kovacsa stanowi 1 % roztwór wodny

dwuhydrochlorku

tetrametylparafenylenodwuaminy (BDH nr 30386) w wodzie destylowanej.

Kropl´ nadtlenku wodoru (30 obj´toÊci) umieszcza

si´ na czystym szkie∏ku przedmiotowym i miesza

z kulturà bakterii za pomocà platynowej ezy.

Odczynnik ten sporzàdza si´ na bie˝àce potrzeby

w obj´toÊciach 1 ml lub przechowuje si´ go

w ciemnej, szklanej butelce w temperaturze

5 °C przez 1—4 tygodni. Kropl´ odczynnika nanosi

si´ na bibu∏´ filtracyjnà w czystej p∏ytce Petriego.

JednoczeÊnie pobiera si´ badanà kultur´ z agaru

od˝ywczego za pomocà platynowej ezy.

Reakcj´ pozytywnà stwierdza si´ na podstawie

wydzielanych p´cherzyków gazu, wskazujàcych na

obecnoÊç katalazy.

Reakcj´ pozytywnà stwierdza si´ na podstawie

wystàpienia purpurowego zabarwienia w ciàgu 10

sekund. Reakcja taka uzyskana w ciàgu 10—30 sekund daje wynik s∏abo dodatni.

Przy przeprowadzaniu testu nale˝y stosowaç platynowà ez´ i kultur´ z agaru od˝ywczego, gdy˝ Êladowe iloÊci ˝elaza lub du˝a zawartoÊç cukru

w pod∏o˝u wzrostowym mo˝e wp∏ywaç na fa∏szywie pozytywne wyniki.

3) Produkcja kwasu z laktozy, ramnozy, salicyny, glicerolu

Przygotowuje si´ pod∏o˝e O/F Hugh i Leifsona bez

glukozy, a nast´pnie rozlewa do probówek po

5 ml. Probówki wraz z pod∏o˝em sterylizuje si´

w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 10 minut. Do p∏ynnego pod∏o˝a podstawowego o temperaturze 45 °C dodaje si´, aseptycznie przez filtr,

0,5 ml 10 % roztworu wodnego glicerolu lub laktozy lub ramnozy lub salicyny. Ostro˝nie miesza si´.

Reakcj´ pozytywnà stwierdza si´ na podstawie

zmiany zabarwienia z niebieskozielonego na ˝ó∏te,

wskazujàcego na produkcj´ kwasu.

5) AktywnoÊç reduktazy azotanowej i denitryfikacja

Pod∏o˝e hodowlane

1g

KNO3 (bez azotynu)

Difco bacto yeast extract

1g

5g

K2HPO4

woda destylowana

1 litr

Rozlewa si´ po 10 ml do butelek o pojemnoÊci

20 ml, a nast´pnie sterylizuje w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.

Odczynnik A

H2SO4

8g

5 N kwas octowy

1 litr

Odczynnik B

naftyloamina

5g

5 N kwas octowy

1 litr

Pod∏o˝e azotanowe inokuluje si´ w dwóch powtórzeniach, a nast´pnie bada po 10 i 20 dniach przez

dodanie 1 kropli p∏ynu Lugola, 0,5 ml odczynnika

A i 0,5 ml odczynnika B. Je˝eli pod∏o˝e nie zmieni

barwy na czerwonawà, dodaje si´ oko∏o 50 mg

sproszkowanego cynku i obserwuje reakcj´ barwnà.

Reakcja barwna

Reakcja pozytywna

stadium 1

stadium 2

brak redukcji azotanów

bezbarwna

czerwona

redukcja azotanów do azotynów (tylko reduktaza

azotanowa)

czerwona

—

redukcja azotanów poni˝ej azotynów (denitryfikacja

— reduktaza azotanowa i azotynowa)

bezbarwna

bezbarwna

6) Produkcja ureazy

Pod∏o˝e podstawowe

Oxoid urea agar base (CM53)

woda destylowana

pod∏o˝a z ˝ó∏topomaraƒczowej na barw´ wiÊniowoczerwonà lub karmazynoworó˝owà.

2,4 g

95 ml

Pod∏o˝e podstawowe sterylizuje si´ w autoklawie

w temperaturze 115 °C przez 20 minut, nast´pnie

sch∏adza do temperatury 50 °C, dodaje si´, aseptycznie przez filtr, 5 ml 40 % roztworu wodnego

mocznika (Oxoid SR20) i dok∏adnie miesza si´.

Po˝ywk´ rozlewa si´ po 6 ml do sterylnych probówek (16 x 100 mm) i pozostawia do zastygni´cia

w postaci skosów.

Reakcj´ pozytywnà, w przypadku aktywnoÊci ureazy, stwierdza si´ na podstawie zmiany barwy

7) Wykorzystanie cytrynianu

Citrate agar base (Merck 2503)

23 g

woda destylowana

1 litr

Wymienione sk∏adniki miesza si´ i rozpuszcza przez

podgrzanie, a nast´pnie rozlewa po 6 ml, tak jak

w przypadku pod∏o˝a z mocznikiem. Po˝ywk´ sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez

15 minut i pozostawia do zastygni´cia w postaci

skosów.

Reakcj´ pozytywnà stwierdza si´ na podstawie

zmiany zabarwienia pod∏o˝a z pomaraƒczowego

na czerwone.

8) Wytwarzanie siarkowodoru

Poz. 709

12) Hydroliza ˝elatyny

Pod∏o˝e

Pod∏o˝e

Difco bacto tryptone (nr 0123)

10 g

K2HPO4

1g

NaCl

woda destylowana

Difco bacto gelatine (nr 0143)

120 g

5g

woda destylowana

1 litr

1 litr

Sk∏adniki miesza si´, rozpuszcza przez podgrzanie

i rozlewa do probówek po 6 ml. Nast´pnie sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez

15 minut.

Sk∏adniki rozpuszcza si´ i rozlewa po 6 ml do probówek o wymiarach 16 x 100 ml, a nast´pnie sterylizuje w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 10 minut. Pod∏o˝e zaszczepia si´ badanà kulturà bakterii,

a z brzegu probówki zawiesza si´ aseptycznie papierek nasycony octanem o∏owiowym i mocuje si´ za

pomocà korka. Inkubuje si´ do 20 dni.

Reakcj´ pozytywnà, b´dàcà dowodem na produkcj´ H2S z tryptonu, stwierdza si´ na podstawie

przebarwienia papierka testowego na kolor czarnobràzowy.

9) Wytwarzanie indolu

Pod∏o˝e przygotowuje si´ tak, jak w teÊcie na wytwarzanie H2S.

Usuwa si´ papierek nasycony octanem o∏owiu, dodaje 1—2 ml eteru dwuetylowego i delikatnie

wstrzàsa. Odstawia si´ probówk´ w celu rozdzielenia warstw (5 minut), a nast´pnie dodaje 0,5 ml odczynnika Kovacsa, wprowadzajàc do wn´trza przechylonej probówki.

Reakcjà pozytywnà, Êwiadczàcà o obecnoÊci indolu, jest pojawienie si´ czerwonej barwy w ˝ó∏tej

warstwie pomi´dzy eterem i frakcjami wodnymi.

10) Wzrost w temperaturze 37 °C

Pod∏o˝e

Difco bacto nutrient broth (nr 0003)

8g

woda destylowana

1 litr

Miesza si´ sk∏adniki, rozpuszcza i rozlewa do probówek po 6 ml, a nast´pnie sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Probówk´ wraz z pod∏o˝em inokuluje si´ badanà kultur´ bakterii i inkubuje w temperaturze 37 °C.

Reakcj´ pozytywnà stwierdza si´ na podstawie

wzrostu bakterii.

11) Wzrost w obecnoÊci 7 % chlorku sodu

Pod∏o˝e

Difco bacto nutrient broth

8g

NaCl

70 g

woda destylowana

1 litr

Sk∏adniki miesza si´, rozpuszcza i rozlewa do probówek po 6 ml. Nast´pnie sterylizuje w autoklawie

w temperaturze 121 °C przez 15 minut.

Reakcj´ pozytywnà stwierdza si´ na podstawie

wzrostu bakterii.

Reakcj´ pozytywnà stwierdza si´ na podstawie

rozpuszczonej ˝elatyny, nawet w przypadku utrzymywania jej w temperaturze 5 °C przez 30 minut.

13) Hydroliza skrobi

Pod∏o˝e

Difco Bacto Nutrient Agar

(p∏ynny agar od˝ywczy)

1 litr

Difco bacto soluble starch (nr 0178)

(skrobia rozpuszczalna)

2g

Sk∏adniki miesza si´, sterylizuje w autoklawie

w temperaturze 115 °C przez 10 minut, a nast´pnie

rozlewa do p∏ytek. P∏ytki inokuluje si´ punktowo

badanà kulturà bakterii. Po uzyskaniu obfitego

wzrostu bakterii (inkubuje 10 do 20 dni), usuwa si´

cz´Êciowo bakterie z po˝ywki i p∏ytk´ zalewa si´

p∏ynem Lugola.

Reakcj´ pozytywnà stwierdza si´ na podstawie

wystàpienia strefy przejaÊnienia wokó∏ kolonii

bakterii i zabarwieniu pozosta∏ej cz´Êci po˝ywki na

purpurowo.

14) AktywnoÊç hydrolazy eskuliny

Pod∏o˝e

Difco Bacto Peptone

10 g

Eskulina

1g

cytrynian ˝elazowy (Merck 3862)

0,05 g

cytrynian sodowy

1g

woda destylowana

1 litr

Sk∏adniki miesza si´ i rozlewa do probówek po

6 ml, a nast´pnie sterylizuje w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 10 minut. Po˝ywka jest

przezroczysta, wykazuje jednak niebieskawà fluorescencj´.

Reakcj´ pozytywnà, b´dàcà dowodem na hydroliz´ eskuliny, stwierdza si´ na podstawie bràzowego

zabarwienia po∏àczonego z zanikiem fluorescencji.

Zjawisko to mo˝na sprawdziç stosujàc lamp´ ultrafioletowà.

709

ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI1)

z dnia 13 kwietnia 2004 r.

w sprawie szczegó∏owych sposobów post´powania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania si´

bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus2)

Na podstawie art. 10 ust. 1 i art. 15 ust. 3 ustawy

z dnia 18 grudnia 2003 r. o ochronie roÊlin (Dz. U.

z 2004 r. Nr 11, poz. 94) zarzàdza si´, co nast´puje