Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 13 maja 2004 r. w sprawie warunków, w których uznaje się, że odpady nie są niebezpieczne

§ 1. Rozporzàdzenie okreÊla

1) warunki, w których uznaje si´, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊciwoÊci lub sk∏adników i w∏aÊciwoÊci

powodujàcych, ˝e odpady te stanowià odpady

niebezpieczne;

2) sposób ustalenia spe∏nienia warunków, o których

mowa w pkt 1.

§ 2. 1. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione

na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊciwoÊci wybuchowych (H1), sà negatywne wyniki badaƒ wra˝liwoÊci termicznej, wra˝liwoÊci na uderzenie

oraz wra˝liwoÊci na tarcie, przeprowadzonych w warunkach testowych.

2. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na

liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊciwoÊci szkodliwych (H5) albo toksycznych (H6), jest brak

efektów szkodliwych lub toksycznych w warunkach

prowadzonych testów przesiewowych z u˝yciem odpadów lub standardowego wyciàgu wodnego z odpadów.

3. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na

liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊciwoÊci rakotwórczych (H7), jest brak wystàpienia nowotworów u badanych zwierzàt nara˝onych na oddzia∏ywanie tych odpadów w warunkach testowych.

4. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà szkodliwego dzia∏ania na rozrodczoÊç (H10), jest brak ich wp∏ywu

na rozwój rozwielitek w warunkach testowych lub brak

oddzia∏ywania na rozrodczoÊç zwierzàt doÊwiadczalnych w warunkach testu jedno- lub dwupokoleniowego.

5. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na

liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊciwoÊci mutagennych (H11), jest brak zmian mutagennych u organizmów nara˝onych na oddzia∏ywanie odpadów w warunkach testowych.

6. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na

liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊciwoÊci ekotoksycznych (H14), jest brak efektów toksycznych w warunkach prowadzonych testów przesiewowych z u˝yciem standardowego wyciàgu wodnego

z odpadów.

———————

1) Minister Ârodowiska kieruje dzia∏em administracji rzàdo-

wej — Êrodowisko, na podstawie § 1 ust. 1 pkt 2 rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 4 maja 2004 r.

w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Ârodowiska (Dz. U. Nr 106, poz. 1130).

2) Zmiany wymienionej ustawy zosta∏y og∏oszone w Dz. U.

z 2002 r. Nr 41, poz. 365, Nr 113, poz. 984 i Nr 199,

poz. 1671, z 2003 r. Nr 7, poz. 78 oraz z 2004 r. Nr 96,

poz. 959 i Nr 116, poz. 1208.

7. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione na

liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà w∏aÊciwoÊci, z powodu których odpady te zosta∏y umieszczone na tej liÊcie, jest brak w∏aÊciwoÊci wymienionych

w ust. 1—6 oraz brak przekroczeƒ parametrów granicznych, okreÊlonych w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia.

§ 3. Ustalenie spe∏nienia warunków, o których mowa w § 2, nast´puje na podstawie przeprowadzonych

badaƒ, które prowadzà laboratoria akredytowane lub

laboratoria posiadajàce wdro˝ony system jakoÊci

w zakresie badania w∏aÊciwoÊci i sk∏adników odpadów niebezpiecznych, okreÊlonych w za∏àczniku nr 2

do rozporzàdzenia.

§ 4. Warunkiem uznania, ˝e odpady wymienione

na liÊcie odpadów niebezpiecznych nie posiadajà

sk∏adników i w∏aÊciwoÊci, z powodu których odpady

te zosta∏y umieszczone na tej liÊcie, jest

1) brak przekroczeƒ st´˝eƒ sk∏adników okreÊlonych

w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia lub

2) brak przekroczeƒ parametrów granicznych okreÊlonych w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia oraz

brak cech okreÊlonych w § 2 ust. 1—6.

§ 5. Je˝eli wystàpi chocia˝ jedna z cech, o których

mowa w § 2 ust. 1—6, i przekroczenie parametrów,

o których mowa w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia,

odpad jest odpadem niebezpiecznym.

§ 6. Spe∏nienie warunku, o którym mowa w § 4

pkt 1, ustala si´ w nast´pujàcych etapach

1) etap pierwszy — ustalenie listy substancji, których

wyst´powanie w odpadzie jest spodziewane;

2) etap drugi — przeprowadzenie wst´pnych badaƒ,

których celem jest ustalenie, czy faktycznie wyst´pujà substancje, o których mowa w pkt 1;

3) etap trzeci — przeprowadzenie szczegó∏owych badaƒ w celu okreÊlenia st´˝eƒ substancji ustalonych w etapie drugim.

§ 7. Je˝eli wyniki badaƒ, o których mowa w § 6

pkt 3, wykazujà, ˝e st´˝enia substancji sà ni˝sze ni˝

wymienione w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia, odpad uznaje si´ za nieposiadajàcy sk∏adników i w∏aÊciwoÊci powodujàcych, ˝e odpady te stanowià odpady

niebezpieczne.

§ 8. Je˝eli w wyniku ustaleƒ, o których mowa

w § 6, zostanie ustalone wyst´powanie sk∏adników

wymienionych w za∏àczniku nr 3 do ustawy z dnia

27 kwietnia 2001 r. o odpadach innych ni˝ wymienione w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia, to w celu

stwierdzenia, czy odpad nie stanowi odpadu niebezpiecznego, przeprowadza si´ badania w∏aÊciwoÊci,

o których mowa w § 2.

§ 9. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie po up∏ywie

14 dni od dnia og∏oszenia.

Minister Ârodowiska: J. Swatoƒ

Za∏àczniki do rozporzàdzenia Ministra Ârodowiska

z dnia 13 maja 2004 r. (poz. 1347)

Za∏àcznik nr 1

PARAMETRY GRANICZNE

Parametr graniczny

Lp.

Oznaczenia

w∏aÊciwoÊci

Nazwa

w∏aÊciwoÊci

nazwa parametru

jednostka

1

H2

utleniajàce

maksymalna pr´dkoÊç spalania

mm/s

maksymalna pr´dkoÊç spalania

mniejsza od maksymalnej

pr´dkoÊci spalania mieszanki

kontrolnej celulozy

i azotanu baru

2

H3-A

wysoce

∏atwopalne

temperatura zap∏onu

°C

powy˝ej 21 dla odpadów

ciek∏ych

3

4

H3-B

H4

5

H8

6

H9

7

H12

8

H13

wartoÊci, dla których

uznaje si´, ˝e odpad

nie posiada w∏aÊciwoÊci

czas spalania substancji sta∏ej

s

powy˝ej 45

temperatura zap∏onu

°C

powy˝ej 55

odczyn odpadu ciek∏ego lub wyciàgu wodnego odpadu sta∏ego

pH

powy˝ej 3,0 oraz poni˝ej 11,5

dzia∏anie na skór´ — rumieƒ skóry

—

01)

dzia∏anie na skór´ — obrz´k skóry

—

01)

dzia∏anie na oczy

—

02)

uczulenie skóry

—

03)

˝ràce

odczyn odpadu ciek∏ego lub wyciàgu wodnego odpadu sta∏ego

pH

powy˝ej 2,0 oraz poni˝ej 12,5

opór elektryczny przez skór´

szczura

om

>5

g´stoÊç optyczna w teÊcie z modelowà skórà ludzkà

%

1004)

zakaêne5)

Clostridium perfringens

>0,0001

Salmonella sp.

obecnoÊç

brak

Grupa coli, Eschericia coli

miano

>0,001

Pseudomonas aeruginosa

obecnoÊç

brak

inne organizmy

—

stosowanie do rodzaju

organizmów

3

uwalniajàce pr´dkoÊç wydzielania gazu

dm /kg

<1

toksyczne

na goi wysoko

dzin´

toksyczne gazy

ca∏kowita iloÊç wydzielonej

% masy

<3,0

substancji toksycznej

odpadu

ca∏kowita iloÊç wydzielonej

% masy

<0,1

substancji wysoce toksycznej

odpadu

toksyczne oddzia∏ywanie

—

brak

wydzielonego gazu na organizmy

testowe

wydzielajàce parametry stosowane dla postosowanie do badanych

substancje

szczególnych w∏aÊciwoÊci od H1

parametrów stosowanych

o w∏aÊcido H12

do oceny poszczególnych

woÊciach

w∏aÊciwoÊci

od H1 do H12

∏atwopalne

dra˝niàce

ObjaÊnienia

1) Brak zaczerwienienia oraz brak obrz´ku (ocena „0” w skali od 0 do 4).

2) Brak zm´tnienia rogówki, spojówki i t´czówki oraz brak obrz´ku powieki, oceny „0” (w skali: zm´tnienie rogówki: 0—4;

uszkodzenie t´czówki: 0—2, przekrwienie spojówki: 0—3, obrz´k powieki: 0—4).

3) Brak reakcji skórnych (ocena „0” w klasyfikacji Magnussona/Kligmana w skali od 0 do 3).

4) Odsetkowa wartoÊç graniczna musi jednak zostaç zdefiniowana w modelu prognostycznym, zanim metoda zostanie

uznana za odpowiednià.

5) Odpady zawierajàce ˝ywe mikroorganizmy lub ich toksyny, o których wiadomo lub co do których istniejà wiarygodne

podstawy do przyj´cia, ˝e powodujà choroby cz∏owieka lub innych ˝ywych organizmów.

Za∏àcznik nr 2

BADANIA W¸AÂCIWOÂCI

Lp.

Nazwa w∏aÊciwoÊci

Nazwa metody1)

1

2

3

1

wybuchowe H2)

1.1. Badanie wra˝liwoÊci termicznej wg PN-92/C-86006 (Materia∏y

wybuchowe — Oznaczenie deflagracyjnoÊci — Metoda ogrzewania w ∏usce stalowej) lub wg pkt 1.6.1 cz´Êci A.14 za∏àcznika3)

1.2. Badanie wra˝liwoÊci na uderzenie wg PN-EN 13631-4:2004

(Materia∏y wybuchowe do u˝ytku cywilnego. Materia∏y wybuchowe kruszàce. Cz´Êç 4: Oznaczanie wra˝liwoÊci na uderzenie)

lub wg pkt 1.6.2 cz´Êci A.14 za∏àcznika3)

1.3. Badanie wra˝liwoÊci na tarcie wg PN-C-86019:1994 (Materia∏y wybuchowe — Oznaczanie wra˝liwoÊci na tarcie) lub wg

pkt 1.6.3 cz´Êci A.14 za∏àcznika3)

2

utleniajàce H2

2.1. Badanie w∏aÊciwoÊci utleniajàcych (substancji sta∏ych/preparatów chemicznych) wg cz´Êci A.17 za∏àcznika3)

3

wysoce ∏atwopalne H3A

4

∏atwopalne H3B4)

4.1. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla zamkni´tego

wg Abela jak w pkt 3.1.1

4.2. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà zamkni´tego tygla

Pensky‘ego—Martensa jak w pkt 3.1.2

4.3. Oznaczanie temperatury zap∏onu w tyglu zamkni´tym TAG

jak w pkt 3.1.3

4.4. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla zamkni´tego

Abla—Pensky‘ego jak w pkt 3.1.4

5

dra˝niàce H4

5A. Testy przesiewowe — Badanie pH odpadu ciek∏ego lub wyciàgu wodnego z odpadu sta∏ego wg PN-90/C-04540.01 (Woda

i Êcieki. Badania pH, kwasowoÊci i zasadowoÊci. Oznaczanie

pH wód i Êcieków o przewodnoÊci elektrolitycznej w∏aÊciwoÊci

10 mikrosekund/cm i powy˝ej metodà elektrometrycznà)

3.1. Metody badania odpadów ciek∏ych4)

3.1.1. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla zamkni´tego wg Abela wg PN-EN ISO 13736:2002 (U)

(Przetwory naftowe i inne ciecze — Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla zamkni´tego wed∏ug

Abela) lub wg pkt 1.6.3.2 cz´Êci A.9 za∏àcznika3)

3.1.2. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà zamkni´tego tygla Pensky‘ego—Martensa wg PN-EN ISO

2719:2003 (Oznaczanie temperatury zap∏onu. Pomiar

metodà zamkni´tego tygla Pensky‘ego—Martensa)

lub wg pkt 1.6.3.2 cz´Êci A.9 za∏àcznika3)

3.1.3. Oznaczanie temperatury zap∏onu w tyglu zamkni´tym TAG wg PN-V-04043:2002 (Przetwory naftowe —

Oznaczanie temperatury zap∏onu w tyglu zamkni´tym

TAG) lub wg pkt 1.6.3.2 cz´Êci A.9 za∏àcznika3)

3.1.4. Oznaczanie temperatury zap∏onu metodà tygla zamkni´tego Abla—Pensky‘ego wg PN-EN 57:1999 (Produkty naftowe — Oznaczanie temperatury zap∏onu —

Pomiar metodà zamkni´tego tygla Abla—Pensky‘ego)

lub wg pkt 1.6.3.2 cz´Êci A.9 za∏àcznika3)

3.2. Metody badania odpadów sta∏ych — Oznaczanie palnoÊci

(substancji i parametrów chemicznych sta∏ych)

wg PN-EN 61300-2-36:2002 (Âwiat∏owodowe z∏àcza i elementy bierne — Podstawowe procedury badaƒ i pomiarów

— Cz´Êç 2-36: Badania — PalnoÊç (niebezpieczeƒstwo

zap∏onu)) lub wg cz´Êci A.10 za∏àcznika3)

2

Poz. 1347

3

5B. Badanie dzia∏ania dra˝niàcego: wykonywane wy∏àcznie

w przypadkach szczególnie uprawnionych5)

5B.1. ToksycznoÊç ostra (dzia∏anie dra˝niàce na skór´)

wg cz´Êci B.4 za∏àcznika3)

5B.2. ToksycznoÊç ostra (dzia∏anie dra˝niàce na oczy)

wg cz´Êci B.5 za∏àcznika3)

5B.3. ToksycznoÊç ostra (uczulenie skóry) wg cz´Êci

B.6 za∏àcznika3)

6

szkodliwe H56)

6A. Testy przesiewowe

6A.1. Test toksycznoÊci na bakteriach Vibrio fischeri wg instrukcji zawartych w dost´pnych testach komercyjnych

6A.2. Oznaczanie aktywnoÊci cytotoksycznej na rze˝usze

ogrodowej Lepidium sativum L.7)

6A.3. ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.)

wg cz´Êci C.2 za∏àcznika3)

6A.4. ToksycznoÊç — Hamowanie wzrostu glonów

wg cz´Êci C.3 za∏àcznika3)

6A.5. ToksycznoÊç ostra (dla ryb) wg cz´Êci C.1 za∏àcznika3)

6A.6. ToksycznoÊç dla d˝d˝ownic. Badania w sztucznej glebie

wg cz´Êci C.8 za∏àcznika3)

6B. Badania na ssakach: wykonywane wy∏àcznie w przypadkach

szczególnie uprawnionych

6B.1. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà).

Metoda ustalonej dawki wg cz´Êci B.1.BIS za∏àcznika3)

6B.2. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà).

Metoda klas ostrej toksycznoÊci wg cz´Êci B.1.TRIS za∏àcznika3)

6B.3. ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna) wg cz´Êci B.2 za∏àcznika3)

6B.4. ToksycznoÊç ostra (nara˝enie przez skór´) wg cz´Êci B.3

za∏àcznika3)

6B.5. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga pokarmowa) wg cz´Êci B.7 za∏àcznika3)

6B.6. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga inhalacyjna) wg cz´Êci B.8 za∏àcznika3)

6B.7. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, po podaniu

na skór´) wg cz´Êci B.9 za∏àcznika3)

7

toksyczne H66)

7A. Testy przesiewowe

7A.1. Test toksycznoÊci na bakteriach Vibrio fischeri wg instrukcji zawartych w dost´pnych testach komercyjnych

7A.2. Oznaczanie aktywnoÊci cytotoksycznej na rze˝usze

ogrodowej Lepidium sativum L.7)

7A.3. ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.)

wg cz´Êci C.2 za∏àcznika3)

7A.4. Hamowanie wzrostu glonów wg cz´Êci C.3 za∏àcznika3)

7A.5. ToksycznoÊç ostra (dla ryb) wg cz´Êci C.1 za∏àcznika3)

7A.6. ToksycznoÊç dla d˝d˝ownic. Badania w sztucznej glebie

wg cz´Êci C.8 za∏àcznika3)

7B. Badania na ssakach: wykonywane wy∏àcznie w przypadkach

szczególnie uprawnionych

7B.1. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà). Metoda

sta∏ej dawki wg cz´Êci B.1.BIS za∏àcznika3)

7B.2. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà). Metoda

klas ostrej toksycznoÊci wg cz´Êci B.1.TRIS za∏àcznika3)

7B.3. ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna) wg cz´Êci B.2 za∏àcznika3)

7B.4. ToksycznoÊç ostra (nara˝enie przez skór´) wg cz´Êci B.3

za∏àcznika3)

7B.5. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga pokarmowa) wg cz´Êci B.7 za∏àcznika3)

2

Poz. 1347

3

7B.6. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga inhalacyjna) wg cz´Êci B.8 za∏àcznika3)

7B.7. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, po podaniu na

skór´) zgodnie z cz´Êcià B.9 za∏àcznika3)

8

rakotwórcze H7

8.1. Obserwacja dzia∏ania rakotwórczego na zwierz´tach testowych wg cz´Êci B.32 za∏àcznika3)

8.2. Obserwacja toksycznoÊci przewlek∏ej i dzia∏ania rakotwórczego na zwierz´tach testowych lub metoda równowa˝na wg

cz´Êci B.33 za∏àcznika3)

9

˝ràce H8

9A. Testy przesiewowe — Badanie pH odpadu ciek∏ego lub wyciàgu wodnego z odpadu wg PN-90/C-04540.01 (Woda i Êcieki —

Badania pH, kwasowoÊci i zasadowoÊci. Oznaczanie pH wód

i Êcieków o przewodnoÊci elektrolitycznej w∏aÊciwej 10 mikrosekund/cm i powy˝ej metodà elektrometrycznà)

9B. Badanie dzia∏ania ˝ràcego

9B.1. Dzia∏anie ˝ràce na skór´ (test TER z u˝yciem skóry

szczura) wg pkt 1.5 cz´Êci B.40 za∏àcznika3) lub

9B.2. Dzia∏anie ˝ràce na skór´ (test na modelu skóry ludzkiej)

wg pkt 1.7 cz´Êci B.40 za∏àcznika3)

10

zakaêne H98)

10.1. Oznaczanie bakterii z rodzaju Clostridium wg PN-EN 26461-1:2001 (JakoÊç wody. Wykrywanie i oznaczanie iloÊciowe

przetrwalników beztlenowców redukujàcych siarczyny (clostridia). Cz´Êç 1: Metoda namna˝ania w pod∏o˝u p∏ynnym)

10.2. Oznaczanie bakterii z rodzaju Pseudomonas aeruginosa

wg PN 81/C-04615.26 (Woda i Êcieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii Pseudomonas aeruginosa metodà

hodowli na po˝ywkach p∏ynnych)

10.3. Oznaczanie bakterii z rodzaju Salmonella wg PN-EN ISO

6579:2003 (Mikrobiologia ˝ywnoÊci i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp).

10.4. Oznaczanie bakterii z grupy coli, Escherichia coli wg

PN 75/C-04615.05 (Woda i Êcieki. Badania mikrobiologiczne.

Oznaczanie bakterii grupy coli metodà fermentacyjnà probówkowà), PN 77/C-04615.07 (Woda i Êcieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli typu ka∏owego

(fekalnego) metodà fermentacyjnà probówkowà),

PN-EN ISO 9308-1:2004 (JakoÊç wody. Wykrywanie i oznaczanie iloÊciowe Escherichia coli i bakterii z grupy coli.

Cz´Êç 1: Metoda filtracji membranowej)

10.5. Oznaczanie innych mikroorganizmów metodami specyficznymi dla ich rodzajów

11

dzia∏ajàce szkodliwie

na rozrodczoÊç H109)

11A. Test przesiewowy — Badanie wp∏ywu na rozwój rozwielitek10)

11B. Badania na zwierz´tach: wykonywane wy∏àcznie w przypadkach szczególnie uprawnionych

11B.1. Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu

jednopokoleniowego wg cz´Êci B.34. za∏àcznika3) lub

11B.2. Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu dwupokoleniowego wg cz´Êci B.35. za∏àcznika3)

12

mutagenne H1111)

12A. Testy na organizmach ni˝szych i komórkach ssaków

12A.1. MutagennoÊç (test rewersji mutacji na bakteriach)

wg cz´Êci B.13/14 za∏àcznika3)

12A.2. MutagennoÊç (test mutacji genowych na komórkach

Saccharomyces cerevisiae) wg cz´Êci B.15 za∏àcznika3)

12A.3. MutagennoÊç (test rekombinacji mitotycznych na komórkach Saccharomyces cerevisiae) wg cz´Êci B.16 za∏àcznika3

2

Poz. 1347

3

12A.4. Recesywne mutacje letalne zwiàzane z p∏cià u Drosophila melanogaster wg cz´Êci B.20 za∏àcznika3)

12A.5. MutagennoÊç — (test mutacji genowych na komórkach ssaków) wg cz´Êci B.17 za∏àcznika3) lub

12A.6. Test wymiany chromatyd siostrzanych in vitro

wg cz´Êci B.19 za∏àcznika3), lub

12A.7. MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych in vitro na komórkach ssaków) wg cz´Êci B.10 za∏àcznika3)

12A.8. MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych na komórkach szpiku kostnego ssaków) wg cz´Êci B.11 za∏àcznika3)

12A.9. MutagennoÊç (test mikrojàdrowy na erytrocytach ssaków in vivo) wg cz´Êci B.12 za∏àcznika3)

12B. Badania na ssakach: wykonywane wy∏àcznie w przypadkach

szczególnie uprawnionych

12B.1. Dominujàce mutacje letalne u gryzoni wg cz´Êci B.22

za∏àcznika3) lub

12B.2. Aberracje chromosomowe spermatogoniów ssaków

wg cz´Êci B.23 za∏àcznika3), lub

12B.3. Test plamkowy u myszy wg cz´Êci B.24 za∏àcznika3),

lub

12B.4. Test dziedzicznych translokacji u myszy wg cz´Êci B.25

za∏àcznika3)

13

uwalniajàce toksyczne

i wysoko toksyczne gazy H12

Metoda badania dwuetapowa

13.A. I etap — Badanie palnoÊci (w kontakcie z wodà) wg cz´Êci

A.12 za∏àcznika3)

13.B. II etap — tylko wówczas, gdy w etapie I nie jest mo˝liwe

ustalenie nazwy chemicznej wydzielajàcego si´

gazu

13.B.1. ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna) wg cz´Êci B.2 za∏àcznika3)

lub

13.B.2. ToksycznoÊç dawki powtarzalnej (28 dni, droga inhalacyjna) wg cz´Êci B.8 za∏àcznika3)

14

H13 — wydzielajàce substancje

o w∏aÊciwoÊciach od H1 do H12

Jak dla w∏aÊciwoÊci od H1 do H12

15

ekotoksyczne H1412)

15.1. Testy ekotoksycznoÊci wg instrukcji zawartych w poszczególnych testach komercyjnych z wykorzystaniem bakterii luminescencyjnych, glonów, pierwotniaków, wrotków i skorupiaków dost´pnych w handlu w formie Toxkitów

15.2. Hamowanie wzrostu glonów wg cz´Êci C.3 za∏àcznika3)

15.3. ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.) wg cz´Êci C.2 za∏àcznika3)

15.4. ToksycznoÊç ostra (dla rz´sy wodnej — Lemna minor)13)

15.5. ToksycznoÊç ostra (dla ryb) wg cz´Êci C.1 za∏àcznika3)

ObjaÊnienia

1) Wykonanie badania wed∏ug opisu metody okreÊlonej w

a) za∏àczniku do rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia 28 lipca 2003 r. w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych (Dz. U. Nr 232,

poz. 2343),

b) normach polskich (europejskich),

c) innych udokumentowanych procedurach (patrz: objaÊnienia w odnoÊnikach 7, 10 i 13).

W testach, w których metodyki opisane w za∏àczniku, o którym mowa w lit. a, lub innych procedurach przewidujà u˝ycie wodnych roztworów badanych substancji, w badaniach odpadów stosuje si´ standardowe wyciàgi wodne z odpadów, wykonane zgodnie z PN-Z-15009:1997 (Odpady sta∏e — Przygotowanie wyciàgu wodnego) lub PN-Z-15012:1997

(Odpady sta∏e — Przygotowanie wyciàgu wodnego z odpadów zaolejonych).

We wszystkich badaniach, a w szczególnoÊci w badaniach toksykologicznych, nale˝y stosowaç w pierwszej kolejnoÊci

metody przesiewowe, tj. analizy chemiczne oraz mikrobiologiczne z zastosowaniem mikroorganizmów oraz organizmów

ni˝szych, z uwzgl´dnieniem podanych ni˝ej zasad. Metody te oznaczone sà symbolem A w opisie metod badania poszczególnych w∏aÊciwoÊci.

2) Badania wykonuje si´ wszystkimi wymienionymi metodami.

3) Za∏àcznik do rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia 28 lipca 2003 r. w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊci-

woÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych.

4) Wykonuje si´ badanie przynajmniej jednà z wymienionych metod.

5) Wybór metody powinien byç dostosowany do przewidywanej drogi nara˝enia.

6) Do ustalenia, czy odpad posiada w∏aÊciwoÊci H5 lub H6, nale˝y w pierwszej kolejnoÊci wykonaç testy przesiewowe na

bakteriach oraz takich organizmach, jak Lepidium sativum L., Daphnia sp., Eisenia foetida, ryby. Model badawczy powinien sk∏adaç si´ minimum z dwóch testów, z których jednym powinien byç test na rybach. W przypadku gdy w testach

przesiewowych zostanie wykazana szkodliwoÊç lub toksycznoÊç badanego wyciàgu wodnego z odpadów, wyniki mogà

zostaç dalej potwierdzone, o ile istnieje taka koniecznoÊç, w badaniach na ssakach.

7) Wykonanie wg nast´pujàcego opisu metody — Oznaczenie aktywnoÊci cytotoksycznej na rze˝usze ogrodowej Lepidium

sativum L.

1. Wst´p

1.1. Cel

Celem badania jest okreÊlenie, czy odpad wykazuje aktywnoÊç cytotoksycznà na rze˝usze ogrodowej Lepidium sativum L.

1.2. Zakres stosowania metody

Metod´ nale˝y stosowaç do wst´pnej oceny majàcej za zadanie okreÊlenie, czy badany odpad wykazuje w∏aÊciwoÊci mitodepresyjne, objawiajàce si´ hamowaniem podzia∏ów komórkowych organizmu testowego.

1.3. OkreÊlenia

a) widoczna toksycznoÊç — ogólne okreÊlenie opisujàce wyraêne objawy toksycznoÊci wyst´pujàce po podaniu

badanej substancji. Powinny one byç wystarczajàce do oszacowania zagro˝enia i powinny byç takie, by mo˝na

by∏o oczekiwaç, ˝e wzrost podanej dawki spowoduje zmiany intensywnoÊci objawów toksycznoÊci i prawdopodobnie ÊmiertelnoÊç,

b) NER5 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 5 % w stosunku do kontroli,

c) NER50 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 50 %

w stosunku do kontroli,

d) NER90 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 90 %

w stosunku do kontroli,

e) LID (Lowest Ineffective Dilution) — najmniejsze nieefektywne rozcieƒczenie.

1.4. Wytyczne ogólne

Naczynia do hodowli i szk∏o laboratoryjne nale˝y myç wodnym roztworem detergentu, a nast´pnie dok∏adnie p∏ukaç i sterylizowaç.

1.5. Zasada metody

Oznaczenie aktywnoÊci cytotoksycznoÊci na rze˝usze ogrodowej Lepidium sativum L. polega na obserwacji reakcji organizmów testowych umieszczonych w badanych wyciàgach wodnych odpadów. W etapie pierwszym okreÊlanym jako test wst´pny ustalany jest rzàd toksycznoÊci wykorzystywany w etapie drugim zwanym testem w∏aÊciwym, na podstawie którego okreÊlane sà wartoÊci nast´pujàcych parametrów: NER5, NER50, NER90, LID.

1.6. Odczynniki i roztwory

a) woda destylowana lub zdemineralizowana,

b) wodny roztwór detergentu,

c) salicylan sodowy,

d) siarczan cynkowy,

e) fenol,

f) czerwieƒ rutenowa (lub czerwieƒ oboj´tna).

1.7. Aparatura i przyrzàdy

a) urzàdzenia laboratoryjne do mieszania i rozcieƒczania po˝ywki,

b) êród∏o wody demineralizowanej lub destylowanej,

c) autoklaw,

d) pH-metr,

e) lupa binokularowa z przyrzàdem mikrometrycznym o dok∏adnoÊci 0,1 mm,

f) termostat,

g) ezy lub inne narz´dzia u˝ywane do przenoszenia nasion rze˝uchy,

h) naczynia z czystego szk∏a lub plastiku (najlepsze naczynie to szalka Petriego o Êrednicy 10 cm).

2. Wybór i przygotowanie organizmów testowych

2.1. Charakterystyka organizmu testowego

RoÊlina o wysokoÊci 30—60 cm, naga, posiada bia∏e kwiaty. ¸uszczynki szeroko oskrzydlone, opatrzone bardzo

krótkà szyjkà, nieprzewy˝szajàcà wyci´cia szczytowego ∏uszczynki.

2.2. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego

Nasiona rze˝uchy ogrodowej Lepidium sativum L. lub roÊlina mogà byç uzyskane ze êróde∏ komercyjnych lub laboratoriów badawczych. Organizm testowy musi byç bezb∏´dnie zidentyfikowany i zatwierdzony taksonomicznie

przed u˝yciem.

2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych

2.3.1. Uzyskiwanie i przygotowanie organizmów do testów

Nasiona rze˝uchy nale˝y wysiaç na bibu∏´ zwil˝onà wodà destylowanà lub wodà zdemineralizowanà. Inkubowaç w cieplarce w temperaturze 25±0,5 °C przez 17—24 h.

2.3.2. Selekcja organizmów do testów

Do badaƒ stosowane sà tylko te organizmy w iloÊci 25 sztuk na jedno st´˝enie, u których wzrost korzeni po

17—24 h kie∏kowania wynosi oko∏o 1 mm.

2.3.3. Woda do przygotowania roztworów potrzebnych do analizy

Do przygotowania roztworów do analizy wykorzystywana jest woda destylowana (zdemineralizowana).

2.3.4. OÊwietlenie

Podczas inkubacji i w czasie trwania testu wskazany jest brak oÊwietlenia.

2.3.5. Temperatura

Podczas inkubacji i w czasie trwania testu wskazane jest utrzymywanie temperatury na poziomie 25±0,5 °C.

3. Metodyka wykonania testu

3.1. Wytyczne ogólne

W testach przesiewowych nale˝y u˝yç ustalonych z góry st´˝eƒ, by ustaliç, czy próbka jest toksyczna w porównaniu z roztworem kontrolnym; je˝eli próbka jest toksyczna, nale˝y wykonaç test wst´pny, który ma na celu ustalenie rz´du toksycznoÊci badanych wyciàgów wodnych odpadów.

Do testu nale˝y u˝ywaç naczyƒ z czystego szk∏a lub tworzywa sztucznego; najlepszym naczyniem jest szalka Petriego o Êrednicy 10 cm; przed u˝yciem ka˝de naczynie nale˝y dok∏adnie umyç wodnym roztworem detergentu,

a nast´pnie dok∏adnie 3 razy p∏ukaç wodà wodociàgowà, 1 raz wodà destylowanà; ezy lub inne narz´dzie u˝ywane do przenoszenia nasion rze˝uchy powinny zostaç usuni´te po u˝yciu lub starannie umyte i wysterylizowane

przed ponownym u˝yciem.

Parametry testu — warunki Êrodowiskowe powinny odpowiadaç tym, jakie panujà podczas przygotowania organizmów testowych (ust. 2).

Utrwalanie i wybarwianie strefy korzeniowej — po inkubacji w celu utrwalenia badanego materia∏u skie∏kowane

nasiona rze˝uchy nale˝y przenieÊç do utrwalacza o nast´pujàcym sk∏adzie

— salicylan sodowy

— 2,0 g

— siarczan cynkowy

— 2,0 g

— fenol

— 0,5 g

— woda destylowana

— 100,00 cm3

czas utrwalania wynosi 1/2 godziny lub d∏u˝ej; po tym czasie kie∏ki nale˝y przemyç w wodzie, a nast´pnie w∏o˝yç

do roztworu czerwieni rutenowej w stosunku 1:5 000 na szkie∏ku przedmiotowym, w celu wybarwienia strefy korzeniowej; do wybarwienia mo˝e byç równie˝ zastosowana czerwieƒ oboj´tna, ale daje gorsze rezultaty.

Pomiarów d∏ugoÊci korzeni dokonuje si´ pod lupà binokularowà przy u˝yciu przyrzàdu mikrometrycznego z dok∏adnoÊcià do 0,1 mm.

3.2. Test wst´pny

Test ten powinien byç przeprowadzany w celu ustalenia, czy test ostateczny jest potrzebny, i po to, aby okreÊliç

rozcieƒczenie roztworów dla testu ostatecznego. W testach ustalania rz´du toksycznoÊci wykonuje si´ próby

wst´pne, sporzàdzajàc szereg rozcieƒczeƒ badanych wyciàgów wodnych z zastosowaniem ilorazu post´pu geometrycznego równego 5.

3.3. Test w∏aÊciwy

Celem tego testu jest okreÊlenie NER5, NER50, NER90, LID dla wzrostu korzenia rze˝uchy.

3.3.1. Metodyka wykonania testu

a) do testu nale˝y przygotowaç, na bazie uzyskanych wyników z testu wst´pnego, 5 rozcieƒczeƒ próbki (nie

liczàc kontroli) o malejàcym rozcieƒczeniu, przy zastosowaniu ilorazu post´pu geometrycznego rozcieƒczeƒ od 0,5 do 2,0; w analizie uwzgl´dnia si´ te rozcieƒczenia wyciàgu wodnego, które w sposób statystycznie istotny (L = 0,05) hamujà wzrost (wyd∏u˝enie si´) korzeni w stosunku do prób kontrolnych; (najlepiej przygotowaç seri´ rozcieƒczeƒ, w których Êrodkowe powoduje oko∏o 50 % inhibicj´ wzrostu, a najni˝sze i najwy˝sze skutkujà oko∏o 90 i 10 % efektem inhibicji),

b) dla ka˝dego rozcieƒczenia i kontroli powinny byç wykonane co najmniej 3 powtórzenia, ka˝de zawierajàce 10 cm3 badanego roztworu,

c) wprowadziç kontrol´ negatywnà zawierajàcà jedynie wod´ lub 1 % metyloceluloz´.

3.3.2. Wyniki testu

Pod wp∏ywem zwiàzków cytotoksycznych wyst´puje inhibicja procesów podzia∏owych komórek merystomatycznych, co prowadzi do zahamowania wzrostu organów rze˝uchy ogrodowej Lepidium sativum L.

W teÊcie bierze si´ pod uwag´ d∏ugoÊç korzeni badanego organizmu. Je˝eli w wysokich rozcieƒczeniach

wyst´puje stymulacja, a nie inhibicja wzrostu rze˝uchy, nale˝y zanotowaç to zjawisko, je˝eli ma miejsce.

4. Obliczanie wyników oznaczenia

4.1. W testach przesiewowych kluczowym pytaniem jest, czy próbka jest toksyczna, czy stymulujàca w porównaniu

z próbà kontrolnà.

4.2. ToksycznoÊç (lub stymulacj´) nale˝y okreÊliç jako procent inhibicji (lub stymulacji) w odniesieniu do kontroli

% I = 100 · (Lk – Lt)/Lk, gdzie

Lk i Lt sà Êrednimi d∏ugoÊciami korzeni odpowiednio w kontroli i próbie testowej;

otrzymane wyniki s∏u˝à do obliczenia NER5, NER50, NER90, LID.

4.3. Mi´dzy logarytmami rozcieƒczeƒ zwiàzków i efektem dzia∏ania wyst´puje w przybli˝eniu rozk∏ad normalny, do obliczeƒ stosuje si´ przybli˝onà metodà statystycznà wg Kad∏ubowskiego; wyniki dzielone sà na dwie grupy o inhibicji mniejszej i wi´kszej od 50 %, po czym obliczane sà Êrednie dla tych grup.

4.4. Nale˝y okreÊliç NER5, NER50, NER90, LID oraz wartoÊç S20 za pomocà metody statystycznej lub graficznej; nachylenie zale˝noÊci rozcieƒczenie-reakcja jest specyficzne dla danego odpadu i dlatego mo˝e byç cennà informacjà.

5. Kontrola jakoÊci

Negatywna próbka kontrolna jest konieczna do kontroli jakoÊci. Test jest nie do zaakceptowania, je˝eli wi´cej ni˝

10 % kontrolnych osobników wykazuje zmiany patologiczne.

8) Dla odpadów, co do których istnieje podejrzenie, ˝e zawierajà czynniki zakaêne, nale˝y wytypowaç mikroorganizmy

wskaênikowe reprezentujàce grup´ organizmów odpowiedzialnych za t´ w∏aÊciwoÊç odpadów. W badaniach tych zaleca si´, zgodnie z wybranà grupà wskaênikowà, wykorzystanie testów dotyczàcych jakoÊciowej analizy bakterii. Decyzja

o wyborze grupy poszukiwanych drobnoustrojów powinna byç podejmowana z udzia∏em laboratorium rekomendujàcego si´ doÊwiadczeniem w mikrobiologicznych badaniach Êrodowiskowych.

9) Podstawowy jest test z rozwielitkami.

10) Wykonanie wg nast´pujàcego opisu metody — Badanie wp∏ywu na rozród rozwielitek (Daphnia magna)

1. Wst´p

1.1. Cel

Celem badania jest okreÊlenie wp∏ywu wyciàgu wodnego badanych odpadów na rozród rozwielitek (Daphnia magna).

1.2. Zasada metody

Rozwielitki umieszcza si´ w wyciàgu wodnym badanego odpadu w ró˝nych rozcieƒczeniach. Notowana jest liczba urodzonych osobników w przeliczeniu na jednà samic´, która prze˝y∏a kontakt z badanà próbkà. T´ liczb´ nast´pnie porównuje si´ z potencja∏em rozrodczym rozwielitek z próbek kontrolnych.

2. Charakterystyka organizmu testowego

Dafnie sp. sà ma∏ymi s∏odkowodnymi skorupiakami o ciele sp∏aszczonym bocznie, okrytym, z wyjàtkiem g∏owy,

przezroczystym pancerzem, zakoƒczonym kolcem. Na g∏owie znajdujà si´ ciemno pigmentowane, ruchliwe oko

oraz krótkie czu∏ki pe∏niàce funkcj´ lokomotorycznà. Dzi´ki przeêroczystoÊci pancerza widoczne sà niektóre narzàdy wewn´trzne.

2.1. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego

Daphnia sp. mo˝e byç uzyskana ze êróde∏ komercyjnych, laboratoriów badawczych lub z terenu naturalnego. Od

20 do 30 rozwielitek wystarczy do za∏o˝enia hodowli. Organizm musi byç bezb∏´dnie zidentyfikowany i zatwierdzony taksonomicznie przed u˝yciem.

2.2. OkreÊlenia

a) NER — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, które dzia∏a szkodliwie na rozrodczoÊç,

b) LID (Lowest Ineffective Dilution) — najmniejsze nieefektywne rozcieƒczenie.

2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych

Hodowle nale˝y prowadziç zgodnie z metodykà zawartà w rozdz. C.2 za∏àcznika (patrz: objaÊnienia w odnoÊniku 1

pkt a).

2.4. Pokarm i sposób karmienia organizmów testowych

Rozwielitki nale˝y karmiç mieszaninà zielonych glonów i dro˝d˝ami. Najlepiej, jeÊli w sk∏ad glonów wchodziç b´dà Selenastrum capricornutum, Scenedesmus subspicatus i ewentualnie Chlorella sp.

2.4.1. Mieszanina glonów z dro˝d˝ami; aby przygotowaç mieszanin´ glonów, nale˝y je odwirowaç, przep∏ukaç

w przefiltrowanej wodzie ze zbiornika naturalnego (wod´ przepuÊciç przez filtr 0,22 µ m) lub w przefiltrowanej po˝ywce, na której rosnà glony, i ponownie odwirowaç; nale˝y pami´taç, ˝e podawanie pokarmu

w nadmiarze mo˝e powodowaç wyczerpywanie si´ tlenu, a nast´pnie Êmierç organizmów;

rozwielitki nale˝y karmiç, u˝ywajàc sterylnej pipety Pasteura, dodajàc

— do organizmów ≤ 9 do 10 dni — 2 krople ka˝dych glonów i dro˝d˝y,

— do organizmów 9- ÷ 10-dniowych — 1 kropl´ ka˝dych glonów i dro˝d˝y,

na dwa doros∏e osobniki, zaokràglajàc, je˝eli jest nieparzysta iloÊç rozwielitek; na koniec tygodnia pracy

(np. w piàtek) dodaç 1 dodatkowà kropl´ ka˝dych glonów i dro˝d˝y na ka˝dà zlewk´ z hodowlà; je˝eli tylko 2 z 3 gatunków glonów sà wykorzystywane do karmienia, nale˝y dodaç proporcjonalnie wi´cej z tych

2 glonów.

2.4.2. Karmienie jednym gatunkiem glonów; 7-dniowa hodowla glonów np. Selenastrum capricornutum powinna zawieraç 4—5 mln komórek w 1 cm3; nale˝y zmieszaç 7-dniowà hodowl´ glonów z hodowlà 3-dniowà

w stosunku obj´toÊciowym 2:1; wirowaç komórki glonów, a nast´pnie zawiesiç je w wodzie wodociàgowej

Êrednio twardej lub twardej tak, aby w 1 cm3 by∏o w przybli˝eniu 10 mln komórek; dziennie nale˝y dostarczyç rozwielitkom w przybli˝eniu 300 000 komórek glonów na 1 cm3 hodowli, czyli dodaç ok. 30 cm3 zawiesiny komórek do 1 dm3 hodowli.

3. Metodyka wykonania testu

3.1. Test trwa 21 dni, czyli 5 wyl´gów.

3.2. Liczba zwierzàt u˝ywanych do badania wynosi 60 sztuk.

3.3. Osobniki umieszcza si´ pojedynczo w 100 cm3 zlewce z 60—80 cm3 testowanego roztworu; wykonuje si´ 10 powtórzeƒ dla pi´ciu testowanych st´˝eƒ oraz 10 prób kontrolnych; co 2 lub 3 dni nale˝y policzyç osobniki, które

prze˝y∏y, i nowo narodzone; potem doros∏e osobniki przenosi si´ do Êwie˝ego roztworu testowanej substancji,

a m∏ode usuwa si´.

4. Obliczanie wyników oznaczenia

Danych uzyskanych w wyniku badania reprodukcji u˝ywa si´ do okreÊlenia najwi´kszego rozcieƒczenia wyciàgu wodnego odpadu potrzebnego do wywo∏ania szkodliwego efektu (NER) oraz najmniejszego rozcieƒczenia niepowodujàcego mo˝liwego do zaobserwowania efektu (LID). Porównuje si´ liczb´ urodzonych osobników w przeliczeniu na samic´, która prze˝y∏a kontakt z testowanà substancjà, z potencja∏em rozrodczym osobników u˝ytych do badania kontrolnego.

11) Podstawowe testy przesiewowe nale˝y wykonaç na bakteriach, liniach komórkowych ssaków lub komórkach dro˝d˝y.

Model badawczy powinien sk∏adaç si´ z dwóch testów, tj. jednego na komórkach prokariotycznych i jednego na komórkach eukariotycznych.

12) Nale˝y wykonaç testy na bakteriach, na formach m∏odocianych bezkr´gowców i glonów (zestawy komercyjne), oraz na

˝ywych organizmach roÊlinnych Lemna minor i zwierz´cych, takich jak Daphnia sp., ryby. Model badawczy powinien

sk∏adaç si´ z testów dla organizmów na ró˝nych poziomach troficznych.

13) Wykonanie wg nast´pujàcego opisu metody — Oznaczenie toksycznoÊci ostrej na rz´sie wodnej Lemna minor.

1. Wst´p

1.1. Cel

Celem badania jest okreÊlenie wysokoÊci st´˝eƒ toksycznych wyciàgu wodnego badanych odpadów na rz´sie

wodnej Lemna minor.

1.2. Zakres stosowania metody

Metod´ nale˝y stosowaç do badania fitotoksycznoÊci badanych odpadów na rz´sie, która jest idealnym organizmem do tego typu badania. Poniewa˝ wi´kszoÊç wyciàgów wodnych jest barwnych i/lub m´tnych, przez co

sprawiajà trudnoÊci w badaniu toksycznoÊci z u˝yciem glonów bez uprzedniego przesàczenia, które obni˝a integralnoÊç próbki. W dodatku niektóre próbki zawierajà labilne sk∏adniki i wymagajà metod odnawialnych lub przep∏ywowych. Testy na glonach mogà byç nieodpowiednie do takich próbek, podczas gdy toksycznoÊç badana na

rz´sie mo˝e byç ∏atwo modyfikowana innymi metodami.

Test toksycznoÊci na rz´sie wodnej jest przydatny, szczególnie do okreÊlania fitotoksycznoÊci na powierzchni rozdzia∏u powietrze-woda, gdzie substancje powierzchniowo czynne, oleje i t∏uszcze oraz toksyczne organiczne

zwiàzki mogà si´ gromadziç. Test ten jest te˝ u˝yteczny do okreÊlania toksycznoÊci metali, zwiàzków organicznych, Êcieków przemys∏owych i miejskich. Ogólnie jest okreÊlany jako prosty, czu∏y i wydajny test.

1.3. OkreÊlenia

a) toksycznoÊç ostra — obejmuje szkodliwe skutki wyst´pujàce w okreÊlonym czasie po podaniu pojedynczej

dawki wyciàgu,

b) widoczna toksycznoÊç — ogólne okreÊlenie opisujàce wyraêne objawy toksycznoÊci; powinny one byç wystarczajàce do oszacowania zagro˝enia i powinny byç takie, by mo˝na by∏o oczekiwaç, ˝e obni˝enie rozcieƒczenia

spowoduje zmiany intensywnoÊci objawów toksycznoÊci i prawdopodobnie ÊmiertelnoÊç,

c) NER5 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 5 %

w stosunku do kontroli,

d) NER50 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 50 %

w stosunku do kontroli,

e) NER90 — najwy˝sze rozcieƒczenie wodnego wyciàgu z odpadu, który hamuje wyd∏u˝enie si´ korzeni o 90 %

w stosunku do kontroli,

f) LID (Lowest Ineffective Dilution) — najmniejsze nieefektywne rozcieƒczenie,

g) S20 — najwi´ksza wartoÊç czynnika rozcieƒczajàcego, dla którego stwierdza si´ 20 % efekt stymulacji.

1.4. Wytyczne ogólne

1.4.1. Naczynia do hodowli i szk∏o laboratoryjne nale˝y myç wodnym roztworem detergentu, a nast´pnie dok∏adnie p∏ukaç.

1.4.2. U˝ywaç statycznych, odnawialnych lub przep∏ywowych metod. Zwykle, jeÊli roztwór jest stabilny (np. roztwór z ma∏à iloÊcià mikroorganizmów, wysokim st´˝eniem toksycznych metali lub ma∏ej lotnoÊci), u˝ywa si´

testu statycznego. Je˝eli próbki sà niestabilne, u˝yç odnawialnej (codziennie) lub przep∏ywowej metody.

1.5. Zasada metody

Oznaczenie fitotoksycznoÊci na rz´sie wodnej Lemna minor polega na obserwacji reakcji organizmów testowych

umieszczonych w wyciàgu wodnym badanych odpadów. W etapie pierwszym okreÊlanym jako test wst´pny

ustalany jest rzàd toksycznoÊci wykorzystywany w etapie drugim zwanym testem w∏aÊciwym, na podstawie którego okreÊlane sà wartoÊci nast´pujàcych parametrów: NER5, NER50, NER90, LID oraz wartoÊç S20.

1.6. Odczynniki i roztwory

a) roztwór podstawowy A

— NaNO3

— NaHNO3

— K2HPO4,

b) roztwór podstawowy B

— CaCl2*2H2O

— MgCl2

— Na2EDTA*2H2O

— MnCl2,

c) roztwór podstawowy C

— MgSO4*7H2O

— H3BO3

— Na2MoO4*2H2O

— ZnCl2

— CoCl2

— CuCl2,

d) woda demineralizowana lub destylowana,

e) wodny roztwór detergentu.

1.7. Aparatura i przyrzàdy

a) urzàdzenia laboratoryjne do mieszania i rozcieƒczania po˝ywki,

b) êród∏o wody demineralizowanej lub destylowanej,

c) autoklaw,

d) pH-metr,

e) r´czny obiektyw lub mikroskop selektywny,

f) akwaria hodowlane — 15 l naczynia (np. akwarium) lub nierdzewna stalowa miska,

g) lodówka,

h) oÊwietlenie zapewniajàce sta∏e bia∏e jarzeniowe Êwiat∏o (2 150—4 300 luksów),

i) ezy lub inne narz´dzia u˝ywane do przenoszenia rz´sy,

j) 250 cm3 szklane zlewki lub kolbki Erlenmayera (doÊç du˝e, aby zmieÊciç 150 cm3 roztworu testowego i kolonie rz´sy); uwaga: wszystkie naczynia powinny byç tego samego typu i wielkoÊci;

k) aparatura do pomiarów fizykochemicznych testowanych substancji chemicznych lub ich mieszanin.

2. Wybór i przygotowanie organizmów testowych

2.1. Charakterystyka organizmu testowego

Drobna roÊlina wodna o p∏askich, bezlistnych kolistych p´dach lub odwrotnie jajowatych Êrednicy 2—3 mm z∏o˝onych z cz´Êci tzw. po∏ci z korzonkami. Rzadko spotykane — kwiaty jednop∏ciowe bez okwiatu; m´ski z jednego

pr´cika, ˝eƒski z jednego s∏upka.

2.2. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego

Rz´sa wodna Lemna minor mo˝e byç uzyskana ze êróde∏ komercyjnych, laboratoriów badawczych lub z terenu

naturalnego. Organizm musi byç bezb∏´dnie zidentyfikowany i zatwierdzony taksonomicznie przed u˝yciem. Innym, preferownym przez niektórych biologów gatunkiem rz´sy jest L. gibba, L. perpusilla, L. pencicostata, L. polyrrhiza, które mogà byç u˝ywane z sukcesem po modyfikacjach procedury.

2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych

2.3.1. Hodowla organizmów testowych

Ârodowisko wzrostu roÊlin w warunkach kontrolnych powinno byç prowadzone w odpowiednich pomieszczeniach lub na zamkni´tych obszarach umo˝liwiajàcych utrzymanie odpowiedniej iloÊci pojemników testowych.

Nale˝y aklimatyzowaç nowà hodowl´ rz´sy do otoczenia testowego co najmniej przez 2 tygodnie przed

rozpocz´ciem badaƒ. Ta hodowla roÊnie energicznie i zapewnia prawie niewyczerpany zapas dla testów

prowadzonych w odpowiednich warunkach. Hodowla uzyskana z jednej wyizolowanej roÊliny powinna pos∏u˝yç do zaszczepienia wszystkich kolb u˝ytych w opisywanym teÊcie.

Aby przygotowaç 10 dm3 roztworu do hodowli, nale˝y dodaç 100 cm3 ka˝dego roztworu podstawowego

sk∏adników pokarmowych A, B i C (tabela 1) do demineralizowanej lub innej odpowiedniej wody (np. wody destylowanej). Dodaç rozcieƒczony (1/4 mocy) roztwór do hodowli raz w tygodniu. G∏´bokoÊç wody powinna wynosiç co najmniej 40 mm.

Raz w miesiàcu przenieÊç zapasowà hodowl´ do Êwie˝o przygotowanego roztworu sk∏adników od˝ywczych.

2.3.2. Uzyskiwanie i przygotowanie organizmów do testów

Szczepy hodowlane powinny byç rozmna˝ane w akwariach przez okres dwóch tygodni (z koniecznym przerzedzaniem) przed u˝yciem w teÊcie. RoÊliny u˝yte w teÊcie powinny byç okresowo selekcjonowane

z akwariów hodowlanych. Zaszczepienie powinno byç wykonane roÊlinami pochodzàcymi z hodowli m∏odszych ni˝ dwutygodniowe.

2.3.3. Selekcja organizmów do testów

Wybraç okazy rz´sy z hodowli, które ros∏y w tych samych warunkach. Uciàç wszystkie korzenie, by zredukowaç ska˝enie glonami, jeÊli jest taka koniecznoÊç. Nale˝y posegregowaç roÊlinki o podobnej wielkoÊci,

a liczba roÊlinek i listków powinna byç taka sama lub mo˝liwie taka sama w ka˝dym naczyniu. U˝ywaç jedynie zdrowych roÊlin zawierajàcych dwa liÊcie o takich samych lub podobnych rozmiarach. Alternatywnie 4 roÊliny 3-listne lub 3 roÊliny 4-listne. Zalecane jest, by w ka˝dym naczyniu znalaz∏o si´ co najmniej

12, ale nie wi´cej ni˝ 16 listków. RoÊlinki sà eksponowane w zamkni´tych naczyniach na równe obj´toÊci

ka˝dego rozcieƒczenia badanej próbki na okres 7 dni.

2.3.4. Choroby i drapie˝niki

Choroby, roÊlino˝erne owady lub inne szkodniki zwykle nie sprawiajà problemów w hodowlach rz´sy. Je˝eli w hodowli wystàpià jakiekolwiek zmiany chorobowe, nale˝y jà zniszczyç i rozpoczàç nowà. Wskazane

jest utrzymywanie kilku hodowli izolowanych od siebie.

2.3.5. Woda do hodowli (po˝ywka) i do przygotowania roztworów potrzebnych do analizy

Woda do rozcieƒczeƒ i woda do prób kontrolnych jest identyczna z roztworem substancji od˝ywczych do

hodowli rz´sy. Ten roztwór nale˝y przygotowaç wed∏ug tabel nr 1 i nr 2.

Tabela nr 1

Odczynnik

St´˝enie

Roztwór A

NaNO3

25,5 g/dm3

NaHCO3

15,0 g/dm3

K2HPO4

1,04 g/dm3

Roztwór B

CaCl2*2H2O

4,41 g/dm3

MgCl2

5,7 g/dm3

FeCl3

0,096 g/dm3

Na2EDTA*2H2O

MnCl2

0,3 g/dm3

0,264 g/dm3

Odczynnik

Poz. 1347

St´˝enie

Roztwór C

MgSO4*7H2O

14,7 g/dm3

H3BO3

0,186 g/dm3

Na2MoO4*2H2O

7,26 mg/dm3

ZnCl2

3,27 mg/dm3

CoCl2

0,78 mg/dm3

CuCl2

0,009 mg/dm3

Tabela nr 2

Pierwiastek

St´˝enie koƒcowe

Roztwór A

N

42,0 mg/dm3

Na

110,0 mg/dm3

C

21,4 mg/dm3

K

4,69 mg/dm3

P

1,86 mg/dm3

Roztwór B

Ca

12,0 mg/dm3

Mg

29,0 mg/dm3

Fe

0,33 mg/dm3

Mn

1,15 mg/dm3

Roztwór C

S

19,1 mg/dm3

B

325 µg/dm3

Mo

28,8 µg/dm3

Zn

15,7 µg/dm3

Co

3,54 µg/dm3

Cu

0,04 µg/dm3

Uwagi

Do przygotowania po˝ywki dodaç 1 cm3 ka˝dego roztworu do 100 cm3 dejonizowanej wody. Ustaliç pH na

poziomie 7,5—8,0.

Aby przygotowaç 10 dm3 roztworu do hodowli, dodaç 100 cm3 ka˝dego roztworu podstawowego sk∏adników pokarmowych A, B i C (tabela nr 1) do demineralizowanej lub innej odpowiedniej wody (np. wody destylowanej).

Po˝ywka powinna zostaç zrobiona przed ka˝dym transferem kultur rz´sy i do przygotowania nowych roztworów podczas prowadzenia testów. Je˝eli jest przygotowywana z wyprzedzeniem, powinna byç trzymana w lodówce.

2.3.6. OÊwietlenie

Nale˝y zapewniç sta∏e ch∏odne, bia∏e jarzeniowe Êwiat∏o (2 150—4 300 luksów) na powierzchni wody. Nat´˝enie Êwiat∏a powinno byç mierzone w ca∏ym obszarze inkubacji i nie powinno si´ ró˝niç wi´cej ni˝ 15 %

od wybranego nat´˝enia Êwiat∏a.

2.3.7. Temperatura

Hodowl´ nale˝y prowadziç w pomieszczeniu o czystym powietrzu, w którym utrzymywana b´dzie temperatura 25±2 °C.

2.3.8. Naczynia do hodowli

Nale˝y hodowaç rz´s´ w 15 l naczyniu, np. akwarium lub nierdzewnej stalowej misce

a) po za∏o˝eniu hodowli nale˝y ka˝de naczynie czyÊciç czystà gàbkà w celu usuni´cia martwej rz´sy i p∏ukaç dsetylowanà lub demineralizowanà wodà,

b) raz w miesiàcu, podczas wymiany wody, nale˝y umyç ka˝de naczynie wodnym roztworem detergentu;

po umyciu dok∏adnie wyp∏ukaç 3 razy wodà wodociàgowà, a nast´pnie wodà do hodowli w celu usuni´cia resztek detergentu,

c) ezy lub inne narz´dzie u˝ywane do przenoszenia rz´sy powinny zostaç usuni´te po u˝yciu lub starannie umyte i wysterylizowane przed ponownym u˝yciem.

3. Metodyka wykonania testu

3.1. Wytyczne ogólne

W testach przesiewowych nale˝y u˝yç ustalonych z góry rozcieƒczeƒ do ustalenia, czy próbka jest toksyczna

w porównaniu z roztworem kontrolnym; je˝eli próbka jest toksyczna, nale˝y wykonaç test wst´pny, który ma na

celu ustalenie rz´du toksycznoÊci badanych wyciàgów wodnych odpadów.

Naczynia u˝ywane w testach to 250 cm3 szklane zlewki lub kolbki Erlenmeyera, doÊç du˝e, by zmieÊciç 150 cm3

roztworu testowego i kolonie rz´sy, bez st∏oczenia w czasie trwania testu; wszystkie naczynia powinny byç tego

samego typu i wielkoÊci; pomimo ˝e wykonuje si´ co najmniej 3 powtórzenia, czasami mogà byç konieczne wi´ksze naczynia, by pomieÊciç dodatkowe kolonie i obj´toÊci badanych roztworów; stosunek obj´toÊci badanego

roztworu do obj´toÊci naczynia nie powinien przekroczyç 2:5; dla ka˝dego badanego rozcieƒczenia i kontroli nale˝y wykonaç tyle samo powtórzeƒ.

Warunki Êrodowiskowe powinny odpowiadaç tym, jakie panujà podczas hodowli organizmów testowych (ust. 2).

3.2. Test wst´pny

Test ten powinien byç przeprowadzany w celu ustalenia, czy test ostateczny jest potrzebny, i po to, aby okreÊliç

rozcieƒczenie roztworów dla testu ostatecznego. W testach ustalania rz´du toksycznoÊci wykonuje si´ próby

wst´pne, sporzàdzajàc szereg rozcieƒczeƒ badanych wyciàgów wodnych z zastosowaniem ilorazu post´pu geometrycznego równego 10, np. 10 %, 1 %, 0,1 %.

Je˝eli test wst´pny pokaza∏, ˝e najni˝sze rozcieƒczenie wyciàgu wodnego z badanej próbki odpadu nie wp∏yn´∏o niekorzystnie na rz´s´, oznacza to, ˝e wyciàg wodny badanego odpadu nie jest fitotoksyczny.

3.3. Test w∏aÊciwy

Celem tego testu jest okreÊlenie NER5, NER50, NER90, LID, S20 dla wzrostu rz´sy, bazujàc na okreÊleniu ca∏kowitej liczby listków, tempie wzrostu i/lub ÊmiertelnoÊci listków.

3.3.1. Metodyka wykonania testu

a) do testu nale˝y przygotowaç, na bazie uzyskanych wyników z testu wst´pnego, 5 rozcieƒczeƒ próbki

wyciàgu wodnego (nie liczàc kontroli) o malejàcym rozcieƒczeniu, przy zastosowaniu ilorazu post´pu

geometrycznego rozcieƒczeƒ od 0,5 do 2,0, np. 10 %, 5 %, 2,5 %

— zakres rozcieƒczeƒ badanego wyciàgu powinien byç dobrany tak, aby w najmniejszym rozcieƒczeniu mia∏o to wp∏yw na co najmniej 90 % listków rz´sy wodnej, a w najwy˝szym na nie wi´cej ni˝ 5 %

listków, w porównaniu z kontrolami,

— zakres rozcieƒczeƒ powinien zostaç dobrany tak, aby mo˝na by∏o wykreÊliç krzywà odpowiedzi na

rozcieƒczenia, pomi´dzy NER5 a NER90,

b) dla ka˝dego rozcieƒczenia i kontroli powinny byç wykonane co najmniej 3 powtórzenia, ka˝de zawierajàce 150 cm3 badanego roztworu lub tyle, by wystarczy∏o do uzyskania wyniku przy stosunku wielkoÊci

naczyƒ 2:5; mo˝na zastosowaç mniej powtórzeƒ zawierajàcych wi´kszà liczb´ kolonii, ale pojemniki testowe i obj´toÊci roztworów muszà zostaç odpowiednio przystosowane,

c) wprowadziç kontrol´ negatywnà zawierajàcà jedynie roztwór substancji pokarmowych lub zmodyfikowany roztwór,

d) po˝ywka i badane roztwory czasem muszà byç wymieniane w 3. lub 5. dniu prowadzenia testu lub jeÊli zaistnieje taka potrzeba cz´Êciej, by zapobiec brakom substancji od˝ywczych lub wyczerpaniu badanej substancji chemicznej; okresowe odnowienie pomo˝e zachowaç sta∏e ekspozycyjne st´˝enia badanej substancji przez czas trwania testu dla sk∏adników, które sà niestabilne w wodzie.

3.3.2. Wyniki testu

a) najpowszechniej u˝ywanà i pozornie wiarygodnà metodà oceniania jest wzrost listków; aby zmierzyç

wzrost listków, nale˝y policzyç ka˝dy dostrzegalny sterczàcy pàczek, podczas oglàdania pod r´cznym

obiektywem lub sekcyjnym mikroskopem; ta nieniszczàca metoda zezwala na powtarzanie obserwacji

tego samego roztworu; obserwacje wyglàdu i liczby listków nale˝y wykonywaç w dniach 0., 3., 5. i 7.;

w dniu 7. okreÊlana jest ca∏kowita liczba ˝ywych i/lub martwych listków; mikroskop sekcyjny u∏atwi obserwacje; nale˝y wykreÊliç krzywe odpowiedzi na st´˝enia; krzywe odpowiedzi na st´˝enie sà kreÊlone

dla ca∏kowitej liczby listków, tempa wzrostu (jako liczba listków na dzieƒ) i ÊmiertelnoÊci (procent martwych listków); te krzywe mogà stanowiç podstaw´ do okreÊlania NER5, NER50, NER90, LID, S20; nale˝y

zapisaç jakiekolwiek zmiany w rozwoju lub wyglàdzie listków, takie jak

— wzrost ich iloÊci (listek jest liczony bez wzgl´du na rozmiar)

— zmniejszenie si´ rozmiaru

— chloroz´ (utrat´ pigmentu/˝ó∏kni´cie)

— nekrozy (martwe miejsca)

— zniszczenie korzenia

— utrat´ p∏ywalnoÊci

— wypuk∏oÊci (w kszta∏cie ∏uku lub opuchlizna)

— toni´cie listków

— rozpad kolonii

porównanie chorych listków z okazami w próbie kontrolnej pos∏u˝y do ustalenia LID (rozcieƒczenia niewywo∏ujàcego zauwa˝alnego efektu),

b) inne metody, które mogà byç oszacowane w tym teÊcie i które wskaza∏yby na inhibicj´ wzrostu

— pobór w´gla C14

— zawartoÊç chlorofilu a, b, c

— zawartoÊç biomasy

— powierzchnia listków

— liczba kolonii, liczba korzeni

— d∏ugoÊç korzeni,

c) powinny byç te˝ zapisane ka˝de dodatkowe obserwacje, takie jak sedymentacja roztworu testowego

lub inne anomalia,

d) niektóre substancje zawarte w wyciàgu wodnym raczej stymulujà, ni˝ inhibitujà wzrost rz´sy; zanotowaç taki efekt, je˝eli wyst´puje.

4. Obliczenie wyników oznaczenia

4.1. W testach przesiewowych kluczowym pytaniem jest, czy próbka jest toksyczna, czy stymulujàca w porównaniu

z próbà kontrolnà.

4.2. ToksycznoÊç (lub stymulacj´) nale˝y okreÊliç jako procent inhibicji (lub stymulacji) w odniesieniu do kontroli

% I = 100 · (Lk – Lt)/Lk, gdzie

Lk i Lt sà Êrednimi d∏ugoÊciami korzeni odpowiednio w kontroli i próbie testowej;

otrzymane wyniki s∏u˝à do obliczenia NER5, NER50, NER90, LID.

4.3. Wyniki badaƒ rozstrzygajàcych mogà byç zobrazowane przy u˝yciu liniowych, pó∏logarytmicznych lub logarytmicznych wykresów. Typowa relacja rozcieƒczenie-efekt jest esowata.

4.4. Nale˝y okreÊliç NER5, NER50, NER90, LID oraz wartoÊç S20 (rozcieƒczenie powodujàce 20 % efekt stymulacji) za

pomocà metody statystycznej lub graficznej; nachylenie zale˝noÊci rozcieƒczenie-reakcja jest specyficzne dla danego odpadu i dlatego mo˝e byç cennà informacjà.

5. Kontrola jakoÊci

Negatywna próbka kontrolna jest konieczna do kontroli jakoÊci. Test jest nie do zaakceptowania, je˝eli wi´cej ni˝ 10 %

kontrolnych osobników umrze lub oka˝e niekorzystne symptomy. W normalnych warunkach czas podwojenia si´ dla

rz´sy wynosi mniej ni˝ 2 doby. Je˝eli próbka kontrolna wykazuje mniej ni˝ dwukrotny wzrost listków w 96 godzin,

test jest nie do przyj´cia.

Za∏àcznik nr 3

ST¢˚ENIA SK¸ADNIKÓW

Lp.

Substancje

St´˝enie, dla którego uznaje si´

˝e odpad nie posiada sk∏adników

1

Jedna lub wi´cej substancji wysoce toksycznych1)

∏àczne st´˝enia — poni˝ej 0,1 %

2

Jedna lub wi´cej substancji toksycznych1)

∏àczne st´˝enia — poni˝ej 3 %

3

Jedna lub wi´cej substancji szkodliwych1)

∏àczne st´˝enia — poni˝ej 25 %

4

Jedna lub wi´cej substancji ˝ràcych okreÊlonych jako R351)

∏àczne st´˝enia — poni˝ej 1 %

5

Jedna lub wi´cej substancji ˝ràcych okreÊlonych jako R341)

∏àczne st´˝enia — poni˝ej 5 %

6

Jedna lub wi´cej substancji dra˝niàcych okreÊlonych jako R411)

∏àczne st´˝enia — poni˝ej 10 %

7

Jedna lub wi´cej substancji dra˝niàcych okreÊlonych jako R36,

R37 i R381)

∏àczne st´˝enia — poni˝ej 20 %

8

Jedna substancja rakotwórcza kategorii 1 lub 21)

st´˝enie — poni˝ej 0,1 %

9

Jedna substancja rakotwórcza kategorii 31)

st´˝enie — poni˝ej 1 %

10

Jedna substancja szkodliwa na rozrodczoÊç kategorii 1 lub 2

okreÊlona jako R60, R611)

st´˝enie — poni˝ej 0,5 %

Jedna substancja szkodliwa na rozrodczoÊç kategorii 3 okreÊlona

jako R62, R631)

st´˝enie — poni˝ej 5 %

12

Jedna substancja mutagenna kategorii 1 lub 2 okreÊlona jako R461)

st´˝enie — poni˝ej 0,1 %

13

Jedna substancja mutagenna kategorii 3 okreÊlona jako R401)

st´˝enie — poni˝ej 1 %

11

ObjaÊnienie

1) OkreÊlone na podstawie rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia 2 wrzeÊnia 2003 r. w sprawie wykazu substancji niebez-

piecznych wraz z ich klasyfikacjà i oznakowaniem (Dz. U. Nr 199, poz. 1948) oraz rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia

2 wrzeÊnia 2003 r. w sprawie kryteriów i sposobu klasyfikacji substancji i preparatów chemicznych (Dz. U. Nr 171,

poz. 1666).

1347

ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ÂRODOWISKA1)

z dnia 13 maja 2004 r.

w sprawie warunków, w których uznaje si´, ˝e odpady nie sà niebezpieczne

Na podstawie art. 4 ust. 1 pkt 2 ustawy z dnia

27 kwietnia 2001 r. o odpadach (Dz. U. Nr 62, poz. 628,

z póên. zm.2)) zarzàdza si´, co nast´puje