PL
Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 12 maja 2003 r. w sprawie metod analiz wyrobów winiarskich do celów urzędowej kontroli pod względem jakości handlowej
Table of Provisions (6)
Statutory Text (6 Articles)
§ 1. Analiz´ aromatyzowanych napojów winiarskich i wyrobów winiarskich gronowych pod wzgl´dem jakoÊci handlowej przeprowadza si´, stosujàc nie
mniej ni˝ jednà z nast´pujàcych metod do
1) oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C — okreÊlonà w za∏àczniku nr 1 do
rozporzàdzenia;
2) refraktometrycznego oznaczania zawartoÊci cukrów w moszczach gronowych i zag´szczonych
moszczach gronowych — okreÊlonà w za∏àczniku
nr 2 do rozporzàdzenia;
———————
1) Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje dzia∏em admini-
stracji rzàdowej — rynki rolne, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 3
rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca
2002 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305).
3) oznaczania zawartoÊci alkoholu w procentach obj´toÊciowych — okreÊlonà w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia;
4) oznaczania zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego (suchej masy ogó∏em) — okreÊlonà w za∏àczniku nr 4
do rozporzàdzenia;
5) oznaczania zawartoÊci cukrów redukujàcych —
okreÊlonà w za∏àczniku nr 5 do rozporzàdzenia;
6) oznaczania zawartoÊci sacharozy — okreÊlonà
w za∏àczniku nr 6 do rozporzàdzenia;
7) oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy — okreÊlonà w za∏àczniku nr 7 do rozporzàdzenia;
8) wykrywania wzbogacania moszczy gronowych, zag´szczonych moszczy gronowych i win metodà
magnetycznego rezonansu jàdrowego deuteru
(SNIF-NMR/RMN-FINS) — okreÊlonà w za∏àczniku
nr 8 do rozporzàdzenia;
9) oznaczania zawartoÊci popio∏u — okreÊlonà w za∏àczniku nr 9 do rozporzàdzenia;
10) oznaczania alkalicznoÊci popio∏u — okreÊlonà
w za∏àczniku nr 10 do rozporzàdzenia;
37) oznaczania zawartoÊci dwutlenku w´gla — okreÊlonà w za∏àczniku nr 37 do rozporzàdzenia;
11) oznaczania zawartoÊci chlorków — okreÊlonà w za∏àczniku nr 11 do rozporzàdzenia;
38) oznaczania zawartoÊci pochodnych cyjankowych
— okreÊlonà w za∏àczniku nr 38 do rozporzàdzenia;
12) oznaczania zawartoÊci siarczanów — okreÊlonà
w za∏àczniku nr 12 do rozporzàdzenia;
39) wykrywania obecnoÊci izotiocyjanianu allilowego
— okreÊlonà w za∏àczniku nr 39 do rozporzàdzenia;
13) oznaczania kwasowoÊci ogólnej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 13 do rozporzàdzenia;
40) oznaczania wskaênika Folin-Ciocalteu — okreÊlonà
w za∏àczniku nr 40 do rozporzàdzenia;
14) oznaczania kwasowoÊci lotnej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 14 do rozporzàdzenia;
41) oznaczania stosunku izotopów tlenu o masie atomowej 18 i 16 (18O/16O) w wodzie zawartej w winie — okreÊlonà w za∏àczniku nr 41 do rozporzàdzenia.
15) oznaczania kwasowoÊci zwiàzanej — okreÊlonà
w za∏àczniku nr 15 do rozporzàdzenia;
16) oznaczania zawartoÊci kwasu winowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 16 do rozporzàdzenia;
17) oznaczania zawartoÊci kwasu cytrynowego —
okreÊlonà w za∏àczniku nr 17 do rozporzàdzenia;
18) oznaczania zawartoÊci kwasu mlekowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 18 do rozporzàdzenia;
19) oznaczania zawartoÊci kwasu L-jab∏kowego —
okreÊlonà w za∏àczniku nr 19 do rozporzàdzenia;
20) oznaczania zawartoÊci kwasu D-jab∏kowego —
okreÊlonà w za∏àczniku nr 20 do rozporzàdzenia;
§ 2. Analiz´ fermentowanych napojów winiarskich
pod wzgl´dem jakoÊci handlowej przeprowadza si´,
stosujàc co najmniej jednà z nast´pujàcych metod
1) oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C — okreÊlonà w za∏àczniku nr 1 do
rozporzàdzenia;
2) oznaczania zawartoÊci alkoholu w procentach obj´toÊciowych — okreÊlonà w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia;
21) oznaczania zawartoÊci kwasu jab∏kowego ogó∏em
— okreÊlonà w za∏àczniku nr 21 do rozporzàdzenia;
3) oznaczania zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego (suchej masy ogó∏em) — okreÊlonà w za∏àczniku nr 4
do rozporzàdzenia;
22) oznaczania zawartoÊci kwasu sorbowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 22 do rozporzàdzenia;
4) oznaczania zawartoÊci cukrów redukujàcych —
okreÊlonà w za∏àczniku nr 5 do rozporzàdzenia;
23) oznaczania zawartoÊci kwasu L-askorbinowego —
okreÊlonà w za∏àczniku nr 23 do rozporzàdzenia;
5) oznaczania zawartoÊci popio∏u — okreÊlonà w za∏àczniku nr 9 do rozporzàdzenia;
24) oznaczania wartoÊci pH — okreÊlonà w za∏àczniku
nr 24 do rozporzàdzenia;
6) oznaczania alkalicznoÊci popio∏u — okreÊlonà
w za∏àczniku nr 10 do rozporzàdzenia;
25) oznaczania zawartoÊci dwutlenku siarki — okreÊlonà w za∏àczniku nr 25 do rozporzàdzenia;
7) oznaczania zawartoÊci chlorków — okreÊlonà w za∏àczniku nr 11 do rozporzàdzenia;
26) oznaczania zawartoÊci sodu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 26 do rozporzàdzenia;
8) oznaczania zawartoÊci siarczanów — okreÊlonà
w za∏àczniku nr 12 do rozporzàdzenia;
27) oznaczania zawartoÊci potasu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 27 do rozporzàdzenia;
9) oznaczania kwasowoÊci ogólnej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 13 do rozporzàdzenia;
28) oznaczania zawartoÊci magnezu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 28 do rozporzàdzenia;
10) oznaczania kwasowoÊci lotnej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 14 do rozporzàdzenia.
29) oznaczania zawartoÊci wapnia — okreÊlonà w za∏àczniku nr 29 do rozporzàdzenia;
30) oznaczania zawartoÊci ˝elaza — okreÊlonà w za∏àczniku nr 30 do rozporzàdzenia;
31) oznaczania zawartoÊci miedzi — okreÊlonà w za∏àczniku nr 31 do rozporzàdzenia;
32) oznaczania zawartoÊci kadmu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 32 do rozporzàdzenia;
33) oznaczania zawartoÊci srebra — okreÊlonà w za∏àczniku nr 33 do rozporzàdzenia;
34) oznaczania zawartoÊci cynku — okreÊlonà w za∏àczniku nr 34 do rozporzàdzenia;
35) oznaczania zawartoÊci o∏owiu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 35 do rozporzàdzenia;
36) oznaczania zawartoÊci fluorków — okreÊlonà w za∏àczniku nr 36 do rozporzàdzenia;
§ 3. Analiz´ wyrobów winiarskich pod wzgl´dem
jakoÊci handlowej mo˝na przeprowadzaç metodami
innymi ni˝ okreÊlone w rozporzàdzeniu, je˝eli stosowanie innych metod zapewnia porównywalnà powtarzalnoÊç i odtwarzalnoÊç wyników, z tym ˝e uznaje si´ za
ostateczny wynik analizy przeprowadzonej metodà
okreÊlonà w rozporzàdzeniu.
§ 4. Przepisy § 1 tracà moc z dniem uzyskania przez
Rzeczpospolità Polskà cz∏onkostwa w Unii Europejskiej.
§ 5. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie po up∏ywie
14 dni od dnia og∏oszenia.
Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: A. Taƒski
Za∏àczniki do rozporzàdzenia Ministra Rolnictwa
i Rozwoju Wsi z dnia 12 maja 2003 r. (poz. 1173)
Za∏àcznik nr 1
OZNACZANIE G¢STOÂCI I CI¢˚ARU W¸AÂCIWEGO W TEMPERATURZE 20 °C
G´stoÊç jest stosunkiem masy okreÊlonej obj´toÊci
wina lub moszczu w temperaturze 20 °C do tej obj´toÊci, wyra˝anym w g/ml, oznaczanym symbolem ρ 20.
Ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze 20 °C (lub g´stoÊç
wzgl´dna) jest stosunkiem, wyra˝onym liczbà dziesi´tnà, g´stoÊci wina lub moszczu w temperaturze 20 °C do
g´stoÊci wody w tej samej temperaturze, oznaczanym
symbolem d2020.
Do analiz stosuje si´ piknometr, który posiada
bocznà rurk´ o d∏ugoÊci 25 mm o Êrednicy nieprzekraczajàcej 1 mm, zakoƒczonà sto˝kowym szlifem lub zamkni´tà korkiem zbiornikowym, który sk∏ada si´ z rurki ze sto˝kowym szlifem, wyd∏u˝onej cz´Êci na koƒcu
i komory w Êrodkowej cz´Êci.
3. KALIBRACJA PIKNOMETRU
Kalibracja piknometru polega na oznaczeniu
G´stoÊç i ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze
20 °C w badanej próbce oznaczane sà metodà piknometrycznà.
1) tary pustego piknometru;
1. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY
3) masy piknometru po nape∏nieniu go wodà o temperaturze 20 °C.
JeÊli próbka zawiera znaczne iloÊci dwutlenku w´gla, usuwa si´ nadmiar tego dwutlenku w´gla przez
mieszanie 250 ml wina w litrowej kolbie lub przez wykonanie filtracji pod zmniejszonym ciÊnieniem.
2. APARATURA I SPRZ¢T
Do oznaczenia g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego
w temperaturze 20 °C stosuje si´ typowy sprz´t laboratoryjny, w szczególnoÊci
1) piknometr przedstawiony na schemacie, wykonany ze szk∏a typu Pyrex, o pojemnoÊci oko∏o 100 ml,
z wyjmowanym skalibrowanym termometrem,
z doszlifowanym korkiem, o skali o dzia∏ce elementarnej 1/10 stopnia w zakresie od 10 do 30 °C;
2) butelk´ tarowà przedstawionà na schemacie, o obj´toÊci takiej jak piknometr, z dopuszczalnà tolerancjà do 1 ml, o masie równej masie piknometru nape∏nionego cieczà o g´stoÊci w∏aÊciwej 1,01,
np. 2,0 % m/v roztworem chlorku sodowego;
3) termicznie izolowanà os∏on´ (pojemnik) o kszta∏cie
dok∏adnie dopasowanym do kszta∏tu piknometru;
4) wag´ dwuszalkowà o noÊnoÊci nie mniejszej ni˝
300 g oraz czu∏oÊci 0,1 mg albo wag´ jednoszalkowà o noÊnoÊci nie mniejszej ni˝ 200 g oraz czu∏oÊci
0,1 mg.
Schemat piknometru i butelki tarowej
2) obj´toÊci piknometru w temperaturze 20 °C;
Metoda oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego
w temperaturze 20 °C z zastosowaniem wagi dwuszalkowej
Butelk´ tarowà stawia si´ na lewej szalce wagi, natomiast czysty i suchy piknometr, zamkni´ty „korkiem
zbiornikowym”, stawia si´ na prawej szalce wagi. Na
szalce z piknometrem umieszcza si´ odwa˝niki w liczbie potrzebnej do uzyskania równowagi. Nast´pnie zapisuje si´ ∏àcznà mas´ odwa˝ników w gramach, oznaczanà dalej literà „ρ”.
Piknometr nape∏nia si´ wodà destylowanà o temperaturze pokojowej, wk∏ada si´ do niego termometr.
Ostro˝nie wyciera si´ piknometr, a nast´pnie umieszcza go w termicznie izolowanym pojemniku. Pojemnik
z piknometrem odwraca si´ parokrotnie w celu wyrównania temperatury. Po osiàgni´ciu wyrównanej
sta∏ej temperatury uzupe∏nia si´ poziom wody w piknometrze do poziomu górnej kraw´dzi bocznej rurki.
Wyciera si´ do sucha Êcianki rurki, wk∏ada „korek
zbiornikowy” i dok∏adnie odczytuje wskazanie temperatury t °C.
Nape∏niony wodà piknometr umieszcza si´ na prawej szalce wagi, a butelk´ tarowà na lewej. Na szalk´
z piknometrem nape∏nionym wodà dok∏ada si´ odwa˝niki w liczbie potrzebnej do uzyskania równowagi, nast´pnie zapisuje si´ ich ∏àcznà mas´ ρ’ w gramach.
Obliczanie wyniku oznaczania
1) tara pustego piknometru = ρ + m,
gdzie m oznacza mas´ powietrza wype∏niajàcego
piknometr, m = 0,0012 (ρ — ρ’);
2) obj´toÊç piknometru (V20) w temperaturze
20 °C ustala si´ z dok∏adnoÊcià ± 0,001 ml wed∏ug
wzoru
V20 = (ρ + m — ρ’) x F,
butelka tarowa
piknometr
gdzie F jest wspó∏czynnikiem odczytanym z tabeli
nr I za∏àcznika, dla temperatury t °C;
3) masa wody (M20) w temperaturze 20 °C
Poz. 1173
gdzie liczba 0,998203 jest g´stoÊcià wody w temperaturze 20 °C.
w dalszej cz´Êci dokumentu, zgodnie z rodzajem
badanej cieczy: wino o zawartoÊci cukrów mniejszej ni˝ 33 g/l (tabela nr II), naturalny lub zag´szczony moszcz (tabela nr III), wino o zawartoÊci cukrów
powy˝ej 33 g/l (tabela nr IV);
Metoda oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego
w temperaturze 20 °C z zastosowaniem wagi jednoszalkowej
4) ci´˝ar w∏aÊciwy d2020 badanego wina oblicza si´
przez podzielenie jego g´stoÊci w temperaturze
20 °C przez g´stoÊç wody w temperaturze 20 °C,
która wynosi 0,998203.
M20 = 0,998203 V20,
W metodzie z zastosowaniem wagi jednoszalkowej
oznacza si´
1) tar´ pustego piknometru, oznaczanà symbolem P;
2) mas´ piknometru nape∏nionego wodà o temperaturze t °C, oznaczanà symbolem P1;
3) mas´ butelki tarowej, oznaczanà symbolem T0.
W metodzie z wykorzystaniem wagi jednoszalkowej oznacza si´
1) tar´ pustego piknometru, oznaczanà symbolem P;
2) mas´ piknometru nape∏nionego badanà próbkà
o temperaturze t °C, oznaczanà symbolem P2;
3) mas´ butelki tarowej oznaczanej symbolem Tt.
Obliczanie wyniku oznaczania
1) tara pustego piknometru = P — m,
Obliczanie wyniku oznaczania
gdzie m oznacza mas´ powietrza wype∏niajàcego
piknometr, m = 0,0012 (P1— P);
2) obj´toÊç piknometru (V20) w
20 °C oblicza si´ wed∏ug wzoru
Metoda z wykorzystaniem wagi jednoszalkowej
temperaturze
V20 = [P — (P — m)] x F,
gdzie F = wspó∏czynnik odczytany z tabeli nr I za∏àcznika dla temperatury t °C.
Obj´toÊç piknometru podaje si´ z dok∏adnoÊcià
do ±0,001 ml;
3) mas´ wody (M20) w temperaturze 20 °C oblicza si´
wed∏ug wzoru
M20 = 0,998203 V20,
gdzie 0,998203 jest g´stoÊcià wody w temperaturze 20 °C.
1) masa pustego piknometru w czasie pomiaru =
P — m + dT, gdzie dT = Tt — T0;
2) masa próbki zawartej w piknometrze w temperaturze t °C = P2 — (P — m + dT);
3) g´stoÊç pozornà (ρ t) w temperaturze t °C oblicza si´
wed∏ug wzoru
P2 — (P — m + dT)
ρt = —————————— ;
V20
4) g´stoÊç w temperaturze 20 °C oblicza si´, wykorzystujàc jednà z tabel poprawek zamieszczonych
w dalszej cz´Êci dokumentu, zgodnie z rodzajem
badanej cieczy: wino o zawartoÊci cukrów poni˝ej
33 g/l i wino pozbawione alkoholu (tabela nr II), naturalny lub zag´szczony moszcz (tabela nr III), wino
o zawartoÊci cukrów powy˝ej 33 g/l (tabela nr IV);
Metoda z wykorzystaniem wagi dwuszalkowej
5) ci´˝ar w∏aÊciwy d2020 wina jest obliczany przez podzielenie jego g´stoÊci w temperaturze 20 °C przez
g´stoÊç wody w temperaturze 20 °C równà
0,998203.
Piknometr nape∏nia si´ przygotowanà próbkà
i przeprowadza post´powanie analogicznie jak w przypadku nape∏nienia wodà destylowanà.
Dla uzyskania bardzo dok∏adnych oznaczeƒ wynik
pomiaru g´stoÊci koryguje si´, uwzgl´dniajàc wp∏yw
dwutlenku siarki, zgodnie z wzorem
4. WYKONANIE OZNACZANIA
Obliczanie wyniku oznaczenia
1) masa próbki zawartej w piknometrze = ρ + m — ρ”,
gdzie ρ” oznacza mas´ odwa˝ników w gramach potrzebnà do uzyskania równowagi podczas wa˝enia
pomi´dzy butelkà tarowà znajdujàcà si´ na lewej
szalce i piknometrem nape∏nionym badanà próbkà
znajdujàcym si´ na prawej szalce wagi;
2) pozornà g´stoÊç (ρt) w temperaturze t °C oblicza
si´ wed∏ug wzoru
ρ + m — ρ„
ρt = —————— ;
V20
3) g´stoÊç w temperaturze 20 °C oblicza si´, wykorzystujàc jednà z tabel poprawek zamieszczonych
ρ20 = ρ‘20 — 0,0006 x S,
gdzie ρ20 — oznacza g´stoÊç skorygowanà,
ρ’20 — oznacza g´stoÊç zmierzonà,
S
— oznacza ca∏kowità zawartoÊç dwutlenku
siarki w g/l.
5. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C powtarzalnoÊç (r) wynosi
1) dla win o zawartoÊci cukrów ni˝szej od 33 g/l
r = 0,00010;
Poz. 1173
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
2) dla win o zawartoÊci cukrów powy˝ej 33 g/l
r = 0,00018.
W przypadku oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C odtwarzalnoÊç (R) wynosi
6. ODTWARZALNOÂå METODY
1) dla win o zawartoÊci cukrów ni˝szej od 33 g/l
R = 0,00037;
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
2) dla win o zawartoÊci cukrów powy˝ej 33 g/l
R = 0,00045.
TABELA nr I
WartoÊci wspó∏czynnika F do obliczenia obj´toÊci piknometru w temperaturze 20 °C
ObjaÊnienie
Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika F pomno˝one przez mas´ wody o temperaturze t °C zawartej w piknometrze ze szk∏a typu Pyrex stosuje si´ do obliczenia obj´toÊci piknometru w temperaturze 20 °C.
TABELA nr II
WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci win
o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l, pozbawionych alkoholu, mierzonej przy u˝yciu piknometru
ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C
ObjaÊnienie
Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” stosuje si´ do obliczania g´stoÊci win o zawartoÊci cukrów ni˝szej od 33 g/l, pozbawionych alkoholu, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C wed∏ug nast´pujàcego wzoru
c
ρ20 = ρt ± ———
1000
— je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C
+ je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C
WartoÊci podane w tabeli majà tak˝e zastosowanie do przeliczania ci´˝aru w∏aÊciwego d t20 na ci´˝ar w∏aÊciwy d 2020.
TABELA nr III
WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci naturalnych
i zag´szczonych moszczy, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C
w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C
ObjaÊnienie
WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” podane w tabeli stosuje si´ obliczania g´stoÊci naturalnych
i zag´szczonych moszczy, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C wed∏ug nast´pujàcego wzoru
c
ρ20 = ρt ± ———
1000
— je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C
+ je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C
WartoÊci podane w tabeli majà tak˝e zastosowanie do przeliczania ci´˝aru w∏aÊciwego d t20 na ci´˝ar w∏aÊciwy d 2020.
TABELA nr IV
WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci win
o st´˝eniu alkoholu nie mniejszym ni˝ 13 % obj., zawierajàcych pozosta∏oÊci cukrów, mierzonej przy u˝yciu
piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C
ObjaÊnienie
Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” stosuje si´ do obliczania g´stoÊci win o st´˝eniu alkoholu nie mniejszym ni˝ 13 % obj., zawierajàcych pozosta∏oÊci cukrów, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C, wed∏ug nast´pujàcego wzoru
c
ρ20 = ρt ± ———
— je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C
+ je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C
Za∏àcznik nr 2
REFRAKTOMETRYCZNE OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CUKRÓW W MOSZCZACH GRONOWYCH
I ZAG¢SZCZONYCH MOSZCZACH GRONOWYCH
Oznaczanie zawartoÊci cukrów w moszczach gronowych, zag´szczonych moszczach gronowych polega na
obliczeniu ich zawartoÊci w g/l lub w g/kg na podstawie
1) wspó∏czynnika refrakcji wyra˝onego w wartoÊciach bezwzgl´dnych i zawartego w tabelach lub
z dok∏adnoÊcià do 0,1 %, a wspó∏czynnik refrakcji z dok∏adnoÊcià do czwartego miejsca po przecinku.
Dodatkowo ustala si´ wartoÊç temperatury t °C.
Oznaczanie wykonuje si´ w dwóch powtórzeniach.
2) zawartoÊci sacharozy wyra˝onej w % wagowych.
4. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
1. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Poprawka uwzgl´dniajàca wp∏yw temperatury jest
stosowana w przypadku u˝ycia refraktometru wyskalowanego w % wagowych sacharozy. Do odczytania wartoÊci poprawki korzysta si´ z tabeli nr I za∏àcznika.
Przygotowanie moszczu lub moszczu zag´szczonego wykonuje si´, przesàczajàc go przez suchà gaz´ z∏o˝onà czterokrotnie, przy czym pierwsze krople przesàczu odrzuca si´.
2. APARATURA I SPRZ¢T
Refraktometr Abbego ze skalà podajàcà
1) % wagowe sacharozy z dok∏adnoÊcià do 0,1 % lub
2) wspó∏czynnik refrakcji do czwartego miejsca po
przecinku.
Do oznaczania zawartoÊci cukrów stosuje si´ refraktometr wyposa˝ony w termometr ze skalà o zakresie co najmniej od +15 °C do +25 °C oraz w urzàdzenie
do cyrkulacji wody umo˝liwiajàce dokonywanie pomiarów w temperaturze 20±5 °C.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Próbk´ doprowadza si´ do temperatury bliskiej
20 °C. Nast´pnie niewielkà iloÊç tej próbki umieszcza
si´ na dolnym pryzmacie refraktometru tak, aby próbka równomiernie pokrywa∏a szklanà powierzchni´.
ZawartoÊç sacharozy odczytuje si´ w % wagowych
W przypadku zastosowania refraktometru wyskalowanego w wartoÊciach wspó∏czynnika refrakcji do odczytania odpowiedniej wartoÊci zawartoÊci sacharozy
w % wagowych w temperaturze t °C w tabeli nr II za∏àcznika odczytuje si´ zawartoÊç sacharozy odpowiadajàcà
zmierzonej wartoÊci wspó∏czynnika refrakcji. Ustalanà
w ten sposób zawartoÊç sacharozy koryguje si´ za pomocà danych podanych w tabeli nr I za∏àcznika.
ZawartoÊç sacharozy w moszczach i moszczach zag´szczonych w % wagowych w temperaturze 20 °C odnajduje si´ w tabeli nr II za∏àcznika i odczytuje odpowiednià zawartoÊç sacharozy w g/l i g/kg. ZawartoÊç
cukrów jest wyra˝ana w przeliczeniu na cukier inwertowany z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.
Przy ustalaniu wspó∏czynnika refrakcji moszczu lub
moszczu zag´szczonego zawartoÊç sacharozy w temperaturze 20 °C odnajduje si´ w tabeli nr II i odczytuje
odpowiednià wartoÊç wspó∏czynnika refrakcji w temperaturze 20 °C. Wspó∏czynnik ten podany jest z dok∏adnoÊcià do czwartego miejsca po przecinku.
TABELA nr I
WartoÊci poprawek majàce zastosowanie, gdy oznaczanie zawartoÊci sacharozy w procentach masowych
zosta∏o wykonane w temperaturze ró˝nej od 20 °C
ObjaÊnienie
Podane w tabeli poprawki majà zastosowanie w przypadku dokonania oznaczania zawartoÊci sacharozy w procentach masowych przy temperaturze ró˝nej od 20 °C.
TABELA nr II
ZawartoÊç cukrów w moszczu gronowym i zag´szczonym moszczu gronowym w g/l i g/kg,
oznaczona za pomocà refraktometru wyskalowanego w % wag. sacharozy w temperaturze 20 °C
lub w wartoÊci wspó∏czynnika refrakcji w temperaturze 20 °C, przeliczona na cukier inwertowany
Za∏àcznik nr 3
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI ALKOHOLU W PROCENTACH OBJ¢TOÂCIOWYCH
1. APARATURA I SPRZ¢T
Destylat zbiera si´ w tej samej 200 ml kolbie miarowej u˝ywanej do odmierzania wina. Destylat zbiera si´
w iloÊci oko∏o 3/4 wyjÊciowej obj´toÊci wina w przypadku destylacji bez pary wodnej i 198 do 199 ml destylatu w przypadku destylacji z parà wodnà. Nast´pnie destylat uzupe∏nia si´ wodà destylowanà do
200 ml, przy czym temperatura destylatu nie mo˝e odbiegaç od temperatury poczàtkowej o wi´cej ni˝ ±2 °C.
Do oznaczania zawartoÊci alkoholu stosuje si´
sprz´t laboratoryjny, w szczególnoÊci
Bardzo ostro˝nie miesza si´ destylat w kolbie kolistymi ruchami.
1) zestaw do destylacji sk∏adajàcy si´ z litrowej kolby
okràg∏odennej ze szlifem, kolumny rektyfikacyjnej
o wysokoÊci oko∏o 20 cm lub innego urzàdzenia zapobiegajàcego rozpryskiwaniu cieczy, êród∏a ciep∏a, ch∏odnicy zakoƒczonej przed∏u˝aczem doprowadzajàcym destylat na dno kolby miarowej lub
Dla win zawierajàcych szczególnie du˝e iloÊci jonów amonowych destylat poddaje si´ powtórnej destylacji, zast´pujàc zawiesin´ wodorotlenku wapnia
1-molowym roztworem kwasu siarkowego, rozcieƒczonego w stosunku 10:100 (v/v).
Oznaczanie zawartoÊci alkoholu w procentach obj´toÊciowych (% obj.) polega na wykonaniu destylacji
wina, uprzednio zalkalizowanego za pomocà zawiesiny
wodorotlenku wapnia, i piknometrycznym oznaczeniu
g´stoÊci destylatu. ZawartoÊci alkoholu odczytuje si´
z tabel alkoholometrycznych.
2) zestaw do destylacji z parà wodnà, sk∏adajàcy si´
z wytwornicy pary, przewodu pary, kolumny rektyfikacyjnej i ch∏odnicy;
3) piknometr.
Dopuszcza si´ u˝ycie dowolnego typu aparatu do
destylacji bez pary wodnej lub z parà wodnà, o ile spe∏ni wymagania testu, w którym przeprowadza si´ pi´ç
kolejnych destylacji mieszaniny alkoholowo-wodnej
o zawartoÊci alkoholu 10 % obj., przy czym zawartoÊç
alkoholu w destylacie po pi´ciu destylacjach powinna
wynosiç co najmniej 9,9 % obj., a straty alkoholu w ka˝dej destylacji nie mogà przekraczaç 0,02 % obj.
2. ODCZYNNIKI
Dwumolowa zawiesina wodorotlenku wapnia,
otrzymana przez stopniowe dodawanie do 120 g wapna niegaszonego (CaO) litra wody o temperaturze od
60 do 70 °C.
3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Z wina usuwa si´ wi´kszoÊç dwutlenku w´gla przez
mieszanie próbki wina o obj´toÊci 250 do 300 ml w kolbie o pojemnoÊci 500 ml.
Nast´pnie za pomocà kolby miarowej odmierza si´
200 ml wina, które przenosi si´ nast´pnie do kolby destylacyjnej. Kolb´ miarowà przemywa si´ czterokrotnie 5 ml porcjami wody, zlewajàc jà do kolby destylacyjnej lub do przewodu pary. Do kolby destylacyjnej
wprowadza si´ przewód pary zestawu do destylacji
z parà wodnà. Nast´pnie dodaje si´ 10 ml zawiesiny
wodorotlenku wapnia i kilka od∏amków oboj´tnego
materia∏u porowatego takiego jak pumeks.
4. WYKONANIE OZNACZANIA
G´stoÊç (ρt) destylatu w temperaturze t °C oznacza
si´ w sposób okreÊlony w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia.
5. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
ZawartoÊç alkoholu w temperaturze 20 °C odczytuje si´ przy u˝yciu tabel alkoholometrycznych.
6. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania zawartoÊci alkoholu powtarzalnoÊç (r) wynosi
r = 0,10 % obj.
7. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania zawartoÊci alkoholu odtwarzalnoÊç (R) wynosi
R = 0,19 % obj.
Za∏àcznik nr 4
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI EKSTRAKTU CA¸KOWITEGO
(suchej masy ogó∏em)
Ekstrakt ca∏kowity (sucha masa ogó∏em) jest to zawartoÊç wszystkich substancji nielotnych.
Ekstrakt bezcukrowy jest to ró˝nica pomi´dzy ekstraktem ca∏kowitym a zawartoÊcià cukrów ogó∏em.
2. OBLICZANIE WYNIKU
Ci´˝ar w∏aÊciwy (d1) wina pozbawionego alkoholu
oblicza si´ wed∏ug wzoru
gdzie
Ekstrakt zredukowany jest to ró˝nica mi´dzy ekstraktem ca∏kowitym a zawartoÊcià cukrów ogó∏em
w iloÊci powy˝ej 1 g/l, zawartoÊcià siarczanu potasowego w iloÊci powy˝ej 1 g/l, zawartoÊcià mannitolu
i zawartoÊcià innych substancji chemicznych, które
mogà byç dodawane do wina.
Ekstrakt resztkowy jest to ekstrakt bezcukrowy pomniejszony o kwasowoÊç zwiàzanà w przeliczeniu na
kwas winowy.
ZawartoÊç ekstraktu wyra˝a si´ w g/l z dok∏adnoÊcià do ±0,5 g.
1. WYKONANIE OZNACZANIA
ZawartoÊç ekstraktu ca∏kowitego oblicza si´ poÊrednio na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego moszczu,
a dla wina na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego wina pozbawionego alkoholu.
ZawartoÊç ekstraktu ca∏kowitego wyra˝ana jest
przez iloÊç sacharozy, która rozpuszczona w wodzie
i sprowadzona do obj´toÊci 1 litra da roztwór o ci´˝arze w∏aÊciwym takim jak moszcz lub wino pozbawione
alkoholu. IloÊci te sà podane w tabeli za∏àcznika.
dv
d1 = dv – da + 1,000,
— oznacza ci´˝ar w∏aÊciwy wina w temperaturze 20 °C (z poprawkà na kwasowoÊç
lotnà),
dv = d2020 — 0,0000086 kwasowoÊci lotnej wyra˝onej
w miligramorównowa˝nikach na litr,
da
— oznacza ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze
20 °C mieszaniny wodno-alkoholowej
o tej samej zawartoÊci alkoholu co wino.
dv obliczaç mo˝na równie˝ na podstawie g´stoÊci
w temperaturze 20 °C wina (ρv) i mieszaniny wodno-alkoholowej (ρa) o tej samej zawartoÊci alkoholu wed∏ug
wzoru
dv = 1,0018 (ρv – ρa) + 1,000,
gdzie wspó∏czynnik 1,0018 zaokràgla si´ do jednoÊci,
gdy wartoÊç ρv jest mniejsza od 1,05, co ma miejsce
w wi´kszoÊci przypadków.
Do obliczenia zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego
w g/l na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego d1 wina pozbawionego alkoholu lub na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego d2020 moszczu stosuje si´ wartoÊci z tabeli za∏àcznika.
ZawartoÊç ekstraktu ca∏kowitego ustala si´
w g/l z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.
TABELA
Obliczanie zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego w g/l
Za∏àcznik nr 5
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CUKRÓW REDUKUJÑCYCH
Cukry redukujàce sà to wszystkie cukry zawierajàce wolne grupy karbonylowe, które mogà redukowaç
sole miedziowe w roztworach alkalicznych.
Metoda oznaczania cukrów redukujàcych polega
na przesàczeniu zoboj´tnionego oraz pozbawionego
alkoholu wina lub moszczu przez kolumn´ jonowymiennà, w której aniony analizowanej próbki sà wymieniane na jony octanowe. Przesàczonà próbk´ klaruje si´ oboj´tnym octanem o∏owiawym i tak sklarowane wino lub moszcz reaguje z okreÊlonà iloÊcià zasadowego roztworu soli miedziowej, a pozosta∏e w roztworze jony miedziowe sà oznaczane jodometrycznie.
1. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY
— KLAROWANIE
Przy oznaczaniu cukrów redukujàcych próbk´
rozcieƒcza si´ tak, aby zawartoÊç cukrów w badanym roztworze mieÊci∏a si´ w granicach od 0,5
do 5 g/l.
Win o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l nie rozcieƒcza si´ w trakcie klarowania, natomiast wina
s∏odkie rozcieƒcza si´ w trakcie klarowania tak, aby
zawartoÊç cukrów mieÊci∏a si´ w nast´pujàcych granicach
Próbka
ZawartoÊç cukrów (g/l)
G´stoÊç
Rozcieƒczenie (%)
Moszcze i mistele
Wina s∏odkie o zawartoÊci cukrów
znacznie powy˝ej 33 g/l, wzmocnione lub niewzmocnione
Wina o zawartoÊci cukrów nieco
powy˝ej 33 g/l
Wina o zawartoÊci cukrów poni˝ej
33 g/l
>125
>1,038
1
25 do 125
1,005 do 1,038
4
5 do 25
0,997 do 1,005
20
<5
<0,997
nierozcieƒczane
Odczynniki
1) jednomolowy roztwór kwasu solnego (HCl);
2) jednomolowy roztwór wodorotlenku sodowego
(NaOH);
3) czteromolowy
(CH3COOH);
roztwór
kwasu
octowego
4) dwumolowy roztwór wodorotlenku sodowego
(NaOH);
5) ˝ywica anionowymienna (Dowex 3 20—50 mesh)
lub inna ˝ywica o podobnych w∏asnoÊciach;
6) oboj´tny roztwór octanu o∏owiawego, sporzàdzony z 250 g oboj´tnego octanu o∏owiawego
[Pb(CH3COOH)2 • 3 H2O)] rozpuszczonego w goràcej wodzie, w takiej iloÊci, aby mo˝na by∏o uzyskaç
500 ml gotowego roztworu;
7) w´glan wapniowy (CaCO3).
Klarowanie win o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l
Do zlewki o Êrednicy od 10 do 12 cm wlewa si´
50 ml wina, a nast´pnie dodaje si´ 1/2 (n – 0,5) ml roztworu wodorotlenku sodowego (gdzie n oznacza obj´toÊç roztworu wodorotlenku sodowego zu˝ytego do
oznaczania kwasowoÊci ogólnej w 10 ml wina). Próbk´
odparowywuje si´ na wrzàcej ∏aêni wodnej w strumieniu goràcego powietrza do otrzymania obj´toÊci oko∏o
20 ml. Nast´pnie próbk´ przesàcza si´ przez kolumn´
z ˝ywicà anionowymiennà w formie octanowej, z szybkoÊcià 3 ml na dwie minuty. Eluat zbiera si´ w kolbie
miarowej na 100 ml. Naczynie i kolumn´ przemywa si´
szeÊciokrotnie porcjami wody o obj´toÊci 10 ml ka˝da.
Nast´pnie, mieszajàc ca∏y czas, do eluatu dodaje si´
2,5 ml nasyconego roztworu octanu o∏owianego oraz
0,5 g w´glanu wapniowego. Ca∏oÊç cieczy wstrzàsa si´
kilkakrotnie i pozostawia na co najmniej 15 minut. Nast´pnie uzupe∏nia si´ wodà i przesàcza si´. 1 ml przesàczu odpowiada 0,5 ml wina.
Klarowanie moszczy, misteli, win s∏odkich i pó∏s∏odkich
1) dla moszczy i misteli — przygotowuje si´ 10 % roztwór badanej próbki, a do analizy bierze si´ 10 ml
rozcieƒczonej próbki;
2) dla win s∏odkich o g´stoÊci w temperaturze
20 °C pomi´dzy 1,005 i 1,038 — przygotowuje si´
20 % roztwór badanej próbki, a do analizy bierze
si´ 20 ml rozcieƒczonej próbki;
3) dla win pó∏s∏odkich o g´stoÊci w temperaturze
20 °C pomi´dzy 0,997 i 1,005 — do analizy pobiera
si´ 20 ml nierozcieƒczonego wina.
Próbki przesàcza si´ przez kolumn´ anionowymiennà w formie octanowej z szybkoÊcià 3 ml na dwie
minuty. Eluat zbiera si´ w kolbie miarowej na 100 ml.
Nast´pnie kolumn´ przemywa si´ wodà a˝ do uzyskania oko∏o 90 ml eluatu. Do eluatu dodaje si´ 0,5 g w´glanu wapniowego i 1 ml nasyconego roztworu octanu o∏owiawego. Ca∏oÊç miesza si´ i pozostawia na
15 minut, mieszajàc od czasu do czasu, po czym uzupe∏nia wodà do 100 ml i przesàcza.
2. WYKONANIE OZNACZANIA
Odczynniki
1) zasadowy roztwór soli miedziowej — 25 g siarczanu
miedziowego (CuSO4 • 5 H2O) rozpuszcza si´ w 100 ml
wody, 50 g kwasu cytrynowego (C6H8O7 • H2O)
rozpuszcza si´ w 300 ml wody, 388 g krystalicznego
w´glanu sodu (Na2CO3 • 10 H2O) rozpuszcza si´
w 300 ÷ 400 ml goràcej wody, nast´pnie miesza si´
roztwory kwasu cytrynowego i w´glanu sodu, dodaje roztwór siarczanu miedzi i dope∏nia wodà do 1 litra;
2) 30 % roztwór jodku potasowego;
3) 25 % kwas siarkowy;
4) roztwór skrobi o st´˝eniu 5 g/l
wod´ w iloÊci oko∏o 500 ml z dodatkiem 5 g skrobi doprowadza si´ do wrzenia, stale mieszajàc, a nast´pnie
gotuje przez 10 minut, po czym dodaje si´ 200 g chlorku sodu, ch∏odzi i uzupe∏nia wodà do 1 litra;
5) 0,1-molowy roztwór tiosiarczanu(VI)sodu;
6) roztwór cukru inwertowanego o st´˝eniu 5 g/l
roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy sposób
w kolbie miarowej o pojemnoÊci 200 ml umieszcza
si´ 4,75 g czystej i suchej sacharozy, dodaje 100 ml
wody oraz 5 ml st´˝onego kwasu solnego (o g´stoÊci ρ20 = 1,16—1,19 g/ml); kolb´ ogrzewa si´ w ∏aêni wodnej o temperaturze 60 °C do uzyskania temperatury roztworu 50 °C. Temperatur´ t´ utrzymuje si´ przez oko∏o 15 minut, a nast´pnie kolb´ pozostawia si´ do ostygni´cia na oko∏o 30 minut; roztwór z kolby przenosi si´ do kolby miarowej o pojemnoÊci 1 litra i dope∏nia wodà do 1 litra.
Tak sporzàdzony roztwór mo˝e byç stosowany nie
d∏u˝ej ni˝ miesiàc od dnia sporzàdzenia. Przed u˝yciem roztwór zoboj´tnia si´ roztworem wodorotlenku sodu.
Poz. 1173
3. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
IloÊç cukrów zawarta w próbce w przeliczeniu na
cukier inwertowany podana w tabeli jest funkcjà iloÊci
(n’ — n) ml zu˝ytego tiosiarczanu sodu,
gdzie n — oznacza iloÊç ml zu˝ytego tiosiarczanu sodu,
n’ — oznacza iloÊç ml tiosiarczanu sodu zu˝ytego w próbie Êlepej.
ZawartoÊç cukrów w winie, w przeliczeniu na cukier
inwertowany, podaje si´ w g/l z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku. Uwzgl´dnia si´ rozcieƒczenie
próbki powsta∏e w trakcie klarowania oraz obj´toÊç badanej próbki.
4. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania zawartoÊci cukrów redukujàcych powtarzalnoÊç (r) wynosi
r = 0,015 xi,
gdzie xi oznacza zawartoÊç
w g/l próbki.
cukru
inwertowanego
Oznaczanie
5. ODTWARZALNOÂå METODY
W kolbie sto˝kowej o pojemnoÊci 300 ml sporzàdza
si´ mieszanin´ 25 ml zasadowego roztworu siarczanu
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejmiedzi z 15 ml wody i 10 ml sklarowanego roztworu ba- sza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
danej próbki. Do tej mieszaniny wrzuca si´ kilka ma∏ych ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami baod∏amków pumeksu. Nast´pnie na kolb´ zak∏ada si´ daƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
ch∏odnic´ zwrotnà. Roztwór podgrzewa si´ i doprowa- dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
dza do wrzenia w ciàgu 2 minut. Roztwór gotuje si´ przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
10 minut, po czym kolb´ szybko och∏adza si´ w strumieW przypadku oznaczania zawartoÊci cukrów reduniu zimnej wody. Do och∏odzonego roztworu dodaje si´
10 ml roztworu jodku potasu, 25 ml kwasu siarkowego kujàcych odtwarzalnoÊç (R) wynosi
oraz 2 ml roztworu skrobi. Roztwór ten miareczkuje si´
R = 0,058 xi,
roztworem tiosiarczanu(VI)sodu. Dla porównania wykonuje si´ prób´ Êlepà, w której 10 ml roztworu cukru za- gdzie xi oznacza zawartoÊç cukru inwertowanego
st´puje si´ 10 ml wody destylowanej.
w g/l próbki.
TABELA
Zale˝noÊç mi´dzy obj´toÊcià 0,1-molowego roztworu tiosiarczanu sodu (n’ — n)
a iloÊcià cukrów redukujàcych w mg
Na2S2O3 (ml)
Cukry redukujàce
(mg)
Ró˝nica
Na2S2O3 (ml)
Cukry redukujàce
(mg)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2,4
4,8
7,2
9,7
12,2
14,7
17,2
19,8
22,4
25,0
27,6
30,3
2,4
2,4
2,5
2,5
2,5
2,6
2,6
2,6
2,6
2,6
2,7
2,7
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
33,0
35,7
38,5
41,3
44,2
47,2
50,0
53,0
56,0
59,1
62,2
Ró˝nica
2,7
2,8
2,8
2,9
2,9
2,9
3,0
3,0
3,1
3,1
Za∏àcznik nr 6
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SACHAROZY
Oznaczanie zawartoÊci sacharozy wykonuje si´ metodà chromatografii cienkowarstwowej, chromatografii cieczowej lub chromatografii gazowej.
ko fazà zwiàzanà oraz z detekcjà refraktometrycznà.
Oznaczanie iloÊciowe jest wykonywane z u˝yciem
wzorca zewn´trznego analizowanego w identycznych
warunkach.
METODA CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ
W chromatografii cienkowarstwowej sacharoz´
oddziela si´ od innych cukrów na p∏ytce pokrytej celulozà. Wywo∏ywanie chromatogramu wykonuje si´ z zastosowaniem mieszaniny mocznika i kwasu solnego,
w temperaturze 105 °C.
Aparatura i sprz´t
1) p∏ytki chromatograficzne pokryte warstwà celulozy o odpowiedniej gruboÊci (20 x 20);
2) komora chromatograficzna;
3) mikrostrzykawka lub mikropipeta;
4) suszarka umo˝liwiajàca uzyskanie temperatury
105 °C, z dok∏adnoÊcià do 2 °C.
Odczynniki
1) w´giel aktywowany do odbarwiania;
2) faza ruchoma: dwuchlorometan : kwas octowy
100 % (lodowaty o g´stoÊci ρ20 = 1,05 g/ml) : etanol
: metanol : woda, w nast´pujàcych proporcjach
50:25:9:6:10;
3) roztwór wywo∏ujàcy sporzàdzony z: 5 g mocznika,
20 ml dwumolowego kwasu solnego i 100 ml etanolu;
4) roztwór wzorcowy zawierajàcy: 35 g glukozy,
35 g fruktozy i 0,5 g sacharozy w 1000 ml wody.
Przygotowanie próbki do analizy
Silnie zabarwiony moszcz lub wino przed wykonaniem oznaczania odbarwia si´ za pomocà w´gla aktywnego.
Otrzymywanie chromatogramu
Na linii równoleg∏ej do dolnej kraw´dzi p∏ytki i oddalonej od niej o 2,5 cm nanosi si´
1) 10 µl próbki;
2) 10 µl roztworu wzorcowego.
P∏ytk´ umieszcza si´ w komorze uprzednio nasyconej parami fazy ruchomej. Chromatogram rozwija si´
do momentu, gdy faza ruchoma znajdzie si´ 1 cm od
górnej kraw´dzi p∏ytki. P∏ytk´ wyjmuje si´ i suszy
w strumieniu ciep∏ego powietrza. Rozwijanie chromatogramu powtarza si´ dwukrotnie. Po rozwini´ciu
chromatogramu p∏ytk´ spryskuje si´ równomiernie
15 ml odczynnika barwiàcego i umieszcza w suszarce
o temperaturze 105 °C na oko∏o 5 minut.
Aparatura i sprz´t
1) wysokosprawny chromatograf cieczowy wyposa˝ony w
a) injektor typu zaworu z 10 µl loop injector,
b) detektor, refraktometr ró˝nicowy lub refraktometr interferometryczny,
c) kolumn´ z wype∏nieniem na bazie krzemionki
z alkiloaminà jako fazà zwiàzanà (d∏ugoÊç 25 cm,
Êrednica wewn´trzna 4 mm),
d) kolumn´ wst´pnà wype∏nionà tà samà fazà,
e) izolacj´ prekolumny i kolumny analitycznej,
umo˝liwiajàcà utrzymanie ich w odpowiedniej
temperaturze (30 °C),
f) regulacj´ przep∏ywu fazy ruchomej na 1 ml/minut´,
g) rejestrator oraz ewentualnie integrator;
2) urzàdzenie do filtracji membranowej (0,45 µm).
Odczynniki
1) woda redestylowana;
2) acetonitryl (CH3CN) do HPLC;
3) faza ruchoma: acetonitryl : woda w proporcji 80:20,
poddane uprzednio filtracji membranowej (filtr
0,45 µm). Faz´ ruchomà odgazowuje si´ przed u˝yciem;
4) roztwór wzorcowy: wodny roztwór sacharozy
o st´˝eniu 1,2 g/l, przesàczony przez filtr membranowy 0,45 µm.
Wykonanie oznaczania
W celu przygotowania próbki wina i moszcze przesàcza si´ przez filtr membranowy 0,45 µm.
Oznaczanie chromatograficzne wykonuje si´, nastrzykujàc na kolumn´ chromatografu kolejno
10 µl roztworu wzorcowego i 10 µl próbki. Zabieg ten
powtarza si´ i rejestruje si´ chromatogram. Czas retencji sacharozy wynosi oko∏o 10 minut.
Obliczanie wyniku oznaczania
Sacharoza i fruktoza sà widoczne w postaci ciemnoniebieskiej plamy na bia∏ym tle, a glukoza — w postaci
plamy zielonej o mniej intensywnym zabarwieniu.
Do obliczeƒ stosuje si´ Êrednià obliczonà z dwóch
oznaczeƒ wykonanych dla roztworu wzorcowego i dla
próbki. W przypadku win i moszczy wynik oznaczania
jest zarazem zawartoÊcià sacharozy.
METODA WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII
CIECZOWEJ
Wyra˝anie wyniku
Sacharoz´ rozdziela si´ w kolumnie z zastosowaniem wype∏nienia na bazie krzemionki z alkiloaminà ja-
ZawartoÊç sacharozy w winach, moszczach podaje
si´ w g/l wina lub moszczu z dok∏adnoÊcià do jednego
miejsca po przecinku.
Za∏àcznik nr 7
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI GLUKOZY I FRUKTOZY
Glukoza i fruktoza sà oznaczane indywidualnie metodà enzymatycznà, jedynie w celu obliczenia stosunku glukozy do fruktozy.
Oznaczanie to polega na poddaniu tych cukrów fosforylacji za pomocà adenozynotrójfosforanu (ATP)
w wyniku reakcji enzymatycznej katalizowanej przez
heksokinaz´ (HK), podczas której powstajà glukozo-6-fosforan (G6P) i fruktozo-6-fosforan (F6P).
HK
glukoza + ATP <————> G6P + ADP
HK
fruktoza + ATP <————> F6P + ADP
Glukozo-6-fosforan jest poczàtkowo utleniany do
6-fosforanu glukonianu za pomocà fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w obecnoÊci enzymu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (G6PDH).
IloÊç powstajàcego zredukowanego fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH) odpowiada iloÊci glukozo-6-fosforanu, a przez to iloÊci glukozy.
G6PDH
G6P + NADP+ <————> glukozo-6-fosforan +
+ NADPH + H+
Zredukowany fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego jest oznaczany przez pomiar absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm.
Na koniec reakcji fruktozo-6-fosforan przeprowadzany jest w glukozo-6-fosforan za pomocà izomerazy
glukofosforanowej (PGI)
PGI
F6P <————> G6P
Glukozo-6-fosforan reaguje z kolei z fosforanem
dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego, dajàc
6-fosforan glukonianu i zredukowany fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego; ten ostatni zwiàzek jest oznaczany iloÊciowo.
1. APARATURA I SPRZ¢T
Do oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy stosuje si´ nast´pujàcy sprz´t laboratoryjny
1) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 340 nm. Je˝eli opisany aparat nie jest dost´pny, mo˝na równie˝ wykorzystaç spektrofotometr ze êród∏em Êwiat∏a o nieciàg∏ym widmie,
umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 334 lub
365 nm;
2) kuwety szklane o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm lub
kuwety jednorazowego u˝ytku;
3) pipety do odmierzania roztworów do testów enzymatycznych o pojemnoÊci 0,02; 0,05; 0,1 i 0,2 ml.
2. ODCZYNNIKI
1) Roztwór 1: roztwór buforowy (0,3-molowa trójetanoloamina, pH 7,6, 4 x 10-3 M w Mg2+), który otrzymuje si´ przez rozpuszczenie 11,2 g chlorowodorku trójetanoloaminy [(C2H5)3N • HCl]
i 0,2 g siarczanu magnezu MgSO4 • 7H2O w 150 ml
wody redestylowanej i dodanie oko∏o 4 ml 5-molowego roztworu wodorotlenku sodu (NaOH) do uzyskania wartoÊci pH 7,6 oraz uzupe∏nienie wodà do
200 ml. Roztwór buforowy mo˝na przechowywaç
w temperaturze 4 °C przez cztery tygodnie;
2) Roztwór 2: roztwór fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (oko∏o 11,5 x 10-3 M), który
uzyskuje si´ przez rozpuszczenie 50 mg fosforanu
dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w 5 ml
wody redestylowanej. Roztwór ten mo˝e byç przechowywany w temperaturze 4 °C przez cztery tygodnie;
3) Roztwór 3: trójfosforanu dwusodowego adenozyny (oko∏o 81 x 10-3 M), który uzyskuje si´ przez rozpuszczenie 250 mg 5’-trójfosforanu dwusodowego
adenozyny i 250 mg wodorow´glanu sodu
(NaHCO3) w 5 ml wody redestylowanej. Roztwór
ten mo˝e byç przechowywany w temperaturze
4 °C przez cztery tygodnie;
4) Roztwór 4: heksokinaza/dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu, który uzyskuje si´ przez zmieszanie
0,5 ml roztworu heksokinazy (2 mg bia∏ka/ml lub
280 U/ml) z 0,5 ml roztworu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (1 mg bia∏ka/ml). Roztwór ten mo˝e
byç przechowywany w temperaturze oko∏o
+4 °C przez rok;
5) Roztwór 5: izomeraza fosforoglukozowa (2 mg
bia∏ka/ml lub 700 U/ml), który stosuje si´ bez rozcieƒczania. Roztwór ten mo˝e byç przechowywany
w temperaturze oko∏o 4 °C przez rok.
Roztwory przed przystàpieniem do wykonania
oznaczania sprowadza si´ do temperatury 20 °C.
3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY
Zale˝nie od spodziewanej ∏àcznej iloÊci glukozy i fruktozy w 1 litrze próbk´ rozcieƒcza si´, stosujàc
Pomiar przy 340
lub 334 nm
Pomiar przy 365 nm
Rozcieƒczanie wodà
Wspó∏czynnik
rozcieƒczenia F
do 0,4 g/l
0,8 g/l
—
—
do 4,0 g/l
8,0 g/l
1+
9
10
do 10,0 g/l
20,0 g/l
1 + 24
25
do 20,0 g/l
40,0 g/l
1 + 49
50
do 40,0 g/l
80,0 g/l
1 + 99
100
Powy˝ej 40,0 g/l
80,0 g/l
1 + 999
1000
4. WYKONANIE OZNACZANIA
1) glukozy: ∆AG = (A2 — A1)S – (A3 — A2)R;
D∏ugoÊç fali w spektrofotometrze ustawia si´ na
340 nm i przeprowadza pomiar w stosunku do powietrza (bez kuwety na drodze optycznej) lub w stosunku
do wody jako odnoÊnika.
2) fruktozy: ∆AF = (A2 — A1)S – (A3 — A2)R.
Pomiaru dokonuje si´ w temperaturze od 20 do 25 °C.
Do kuwet o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm nalewa si´
Kuweta
Kuweta
odniesienia
z próbkà
Roztwór 1
2,50 ml
2,50 ml
Roztwór 2
0,10 ml
0,10 ml
Roztwór 3
0,10 ml
0,10 ml
Badana próbka
0,20 ml
Woda redestylowana
0,20 ml
Przygotowuje si´ tak˝e
Roztwór 4
Roztwór 5
0,02 ml
0,02 ml
0,02 ml
0,02 ml
Roztwory 1, 2 i 3 miesza si´. Po oko∏o 3 minutach
odczytuje ich absorbancj´ (A1) i zapoczàtkowuje si´ reakcj´ enzymatycznà przez dodanie Roztworu 4. Ca∏oÊç
miesza si´, a nast´pnie po up∏ywie 15 minut odczytuje
si´ absorbancj´ (A2). Po nast´pnych 2 minutach sprawdza si´, czy reakcja ju˝ ca∏kowicie usta∏a. Wówczas dodaje si´ Roztwór 5. Ponownie ca∏oÊç miesza si´ i po
up∏ywie 10 minut odczytuje si´ absorbancj´ (A3). Po
kolejnych 2 minutach sprawdza si´, czy reakcja usta∏a.
Z uwagi na to, ˝e czas trwania reakcji enzymatycznej
mo˝e byç ró˝ny dla poszczególnych serii oznaczeƒ, podany czas nale˝y traktowaç jako czas przyk∏adowy
trwania reakcji dla ka˝dej z serii.
Obliczanie zawartoÊci glukozy i fruktozy (C) wykonuje si´ wed∏ug wzoru
V·M
C (g/l) = ——————— ∆A,
ε · d · v · 1000
gdzie
V — oznacza obj´toÊç roztworu wzorcowego (ml),
v — oznacza obj´toÊç badanej próbki (ml),
M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji,
d — oznacza gruboÊç warstwy kuwety o d∏ugoÊci
drogi optycznej 1 cm,
ε — jest wspó∏czynnikiem absorbancji NADPH
(przy 340 nm = 6,3 mmol–1 x 1 cm–1).
Dla oznaczania glukozy V = 2,92, a dla oznaczania fruktozy V = 2,94
v = 0,20 ml
M = 180
d=1
Wykorzystujàc dane, otrzymuje si´ dla
1) glukozy C(g/l) = 0,417 ∆AG;
2) fruktozy C(g/l) = 0,420 ∆AF.
Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
5. OBLICZANIE WYNIKÓW OZNACZANIA
Je˝eli pomiar by∏ wykonywany przy d∏ugoÊci fali
334 lub 365 nm, uzyskuje si´ nast´pujàce pomiary
Po zakoƒczeniu analizy oblicza si´ ró˝nice absorbancji dla kuwet z próbkà odniesienia i próbkà badanà
1) przy d∏ugoÊci fali 334 nm ε = 6,2 (mmola–1 x 1 cm–1)
1) odpowiadajàcà zawartoÊci glukozy A2 — A1;
2) odpowiadajàcà zawartoÊci fruktozy A3 — A2.
Oblicza si´ ró˝nic´ absorbancji dla kuwety z próbkà odniesienia (∆AR) i kuwety z badanà próbkà (∆AS),
otrzymujàc wartoÊci dla
dla glukozy — C(g/l) = 0,425 ∆ΑG,
dla fruktozy — C(g/l) = 0,428 ∆AF;
2) przy d∏ugoÊci fali 365 nm ε = 3,4 (mmola–1 x 1 cm–1)
dla glukozy — C(g/l) = 0,773 ∆AG,
dla fruktozy — C(g/l) = 0,778 ∆AF.
6. POWTARZALNOÂå METODY
7. ODTWARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest
mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej
metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego
sprz´tu.
W przypadku oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy powtarzalnoÊç (r) wynosi
W przypadku oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy odtwarzalnoÊç (R) wynosi
r = 0,056 xi,
R = 0,12 + 0,076 xi,
gdzie xi = zawartoÊç glukozy lub fruktozy w g/l.
gdzie xi = zawartoÊç glukozy lub fruktozy w g/l.
Za∏àcznik nr 8
WYKRYWANIE WZBOGACANIA MOSZCZY GRONOWYCH, ZAG¢SZCZONYCH MOSZCZY GRONOWYCH I WIN
METODÑ MAGNETYCZNEGO REZONANSU JÑDROWEGO DEUTERU
(SNIF-NMR/RMN-FINS)
Deuter wyst´pujàcy w cukrach i w wodzie moszczy
gronowych po fermentacji znajduje si´ w winie w czàsteczkach zwiàzków oznaczonych jako zwiàzki chemiczne
I. CH2D CH2OH
II. CH3 CHD OH
III. CH3 CH2 OD
IV. HOD
Dodatek egzogennego cukru podczas dos∏adzania
na sucho przed fermentacjà moszczu wp∏ywa na rozk∏ad deuteru w czàsteczkach tych zwiàzków.
gdzie
D
H
R
(D/H)I
R = 2(D/H)II/(D/H)I wyra˝a wzgl´dny rozk∏ad deuteru
w czàsteczkach zwiàzku chemicznego I i II i jest bezpoÊrednio mierzony na podstawie nat´˝enia (h) sygna∏u,
stàd R wynosi 3hII/hI.
— oznacza deuter,
— oznacza wodór,
— oznacza wzgl´dny rozk∏ad deuteru,
— oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach
zwiàzku chemicznego I,
(D/H)II — oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach
zwiàzku chemicznego II,
o
(D/H) w — oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach
wody w winie.
W porównaniu z wartoÊcià parametrów dla naturalnego wina kontrolnego z tego samego regionu
wzbogacanie egzogennym cukrem b´dzie powodowa∏o nast´pujàce zmiany
Parametr (D/H)I charakteryzuje g∏ównie roÊliny,
które syntetyzujà cukier, w mniejszym stopniu po∏o˝enie geograficzne miejsca uprawy (rodzaj wody wykorzystywanej w fotosyntezie).
Parametr (D/H)II charakteryzuje warunki klimatyczne miejsca uprawy winogron (rodzaj wody deszczowej
i warunki pogodowe) oraz, w mniejszym stopniu, zawartoÊç cukru w wyjÊciowym moszczu.
Parametr (D/H)ow charakteryzuje warunki klimatyczne miejsca uprawy i zawartoÊç cukru w moszczu.
Poz. 1173
Odczynniki
Stosuje si´ odczynniki do oznaczania zawartoÊci
wody metodà Karla-Fischera.
Wykonanie oznaczania
Zdefiniowane parametry [R, (D/H)I oraz (D/H)II] sà
oznaczane metodà magnetycznego rezonansu jàdrowego deuteru w etanolu wydzielonym z wina lub z produktów fermentacji moszczu, moszczu zag´szczonego
uzyskanego w okreÊlonych warunkach; parametry te
mogà byç uzupe∏nione przez oznaczanie stosunku izotopów w wodzie wydzielonej z wina, (D/H)ow oraz przez
oznaczanie stosunku izotopów 13C/12C w etanolu.
1. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY
Wydzielanie etanolu i wody z wina
Do wydzielania etanolu i wody z wina dopuszcza
si´ zastosowanie dowolnej metody wydzielania etanolu, pod warunkiem ˝e metoda taka zapewnia w destylacie, zawierajàcym 92 do 93 % % wagowo etanolu
(95 % obj.), uzyskanie odzysku od 98 do 98,5 % ca∏kowitej zawartoÊci etanolu w winie.
Aparatura i sprz´t
Aparat destylacyjny do wydzielania etanolu, przedstawiony na schemacie, sk∏ada si´ z
1) elektrycznego p∏aszcza grzejnego z transformatorem;
2) kolby okràg∏odennej o pojemnoÊci 1 litra, ze szlifem;
3) kolumny Cadiota z obracajàcym si´ pierÊcieniem
(cz´Êci ruchome wykonane z teflonu);
W badanej próbce wina oznacza si´ zawartoÊç etanolu (p) z dok∏adnoÊcià co najmniej 0,05 % obj. zgodnie z metodà opisanà w za∏àczniku nr 3.
Nast´pnie 500 ml jednorodnej próbki wina o zawartoÊci alkoholu (p) wprowadza si´ do kolby aparatu destylacyjnego o sta∏ej wartoÊci stopnia deflegmacji równej 0,9. Jako odbieralnik destylatu umieszcza si´ kolb´
sto˝kowà na 125 ml. Destylat zbiera si´ w iloÊci oko∏o
40 do 60 ml, przy temperaturze wrzenia mi´dzy 78,0
a 78,2 °C. Je˝eli temperatura przekroczy 78,5 °C przerywa si´ zbieranie destylatu na 5 minut.
Gdy temperatura ponownie osiàgnie 78 °C, zbiera
si´ ponownie destylat do osiàgni´cia temperatury
78,5 °C. CzynnoÊç t´ powtarza si´ do chwili, gdy temperatura, po przerywaniu destylacji i pracy w obiegu
zamkni´tym, utrzyma si´ na sta∏ym poziomie. Ca∏kowita destylacja trwa oko∏o 5 godzin. Metoda ta pozwala
na odzyskanie w destylacie od 98 do 98,5 % ca∏oÊci
zawartego w winie alkoholu, przy czym zawartoÊç
alkoholu w destylacie wynosi od 92 do 93 % wagowo
(95 % obj.) i jest to st´˝enie, dla którego ustalono warunki NMR.
Nast´pnie wa˝y si´ zebrany destylat, po czym
60 ml jednorodnej próbki pozosta∏oÊci po destylacji,
odpowiadajàcej wodzie zawartej w winie, przenosi si´
do kolby na 60 ml.
W próbce tej mo˝na oznaczyç stosunek izotopów.
4) kolby sto˝kowej na 125 ml, ze szlifem;
Je˝eli do oznaczania stosuje si´ spektrometr wyposa˝ony w próbnik o Êrednicy 10 mm, do oznaczenia
wystarczy jednorodna próbka wina o obj´toÊci 300 ml.
5) butelek o pojemnoÊci 125 i 60 ml, z korkami z tworzywa sztucznego.
ZawartoÊç wody (p’) w gramach oznacza si´ metodà Karla-Fischera.
Schemat aparatu destylacyjnego do wydzielania etanolu
ZawartoÊç alkoholu (tDm) w % wagowych oblicza
si´ wed∏ug wzoru
p—p’
tDm = ——— x 100.
p
Fermentacja moszczy i moszczy zag´szczonych
Odczynniki
1) kwas winowy;
2) DIFCO — dro˝d˝e bez aminokwasów (Bacto Yeast
Nitrogen Base);
3) aktywne suszone dro˝d˝e (Saccharomyces cerevisiae), przy czym je˝eli znany jest stosunek izotopów w moszczu, dro˝d˝e suszone przed u˝yciem
mogà byç uaktywniane przez 15 minut w minimalnej iloÊci letniej niedestylowanej wody, aby stosunek izotopów by∏ podobny do stosunku izotopów
w moszczu. Je˝eli stosunek izotopów w moszczu
nie jest znany, lepiej u˝yç Êwie˝ych dro˝d˝y.
Aparatura
Naczynie fermentacyjne o pojemnoÊci 1,5 l wyposa˝one w urzàdzenie zapewniajàce hermetyczne zamkni´cie i skraplanie par alkoholu, poniewa˝ w trakcie
fermentacji nie mogà wystàpiç ˝adne straty etanolu.
WydajnoÊç przemiany cukrów fermentujàcych w etanol powinna wynosiç ponad 98 %.
2) w przypadku zastosowania próbnika do NMR
o Êrednicy 10 mm pobiera si´ 3,2 ml alkoholu
i 1,3 ml TMU.
Wykonanie oznaczania
Zale˝nie od rodzaju spektrometru i próbnika dodaje si´ odpowiednie iloÊci heksafluorobenzenu jako
substancji stabilizujàcej cz´stotliwoÊç pola zgodnie
z zamieszczonà tabelà
1) moszcze Êwie˝e, w których uprzednio oznaczono
zawartoÊç cukrów fermentujàcych — 1 litr moszczu
umieszcza si´ w naczyniu fermentacyjnym. Do naczynia dodaje si´ jeden gram suchych, wczeÊniej
uaktywnionych dro˝d˝y, po czym zamyka si´
szczelnie naczynie. Fermentacj´ prowadzi si´
w temperaturze oko∏o 20 °C do czasu zu˝ycia cukrów. Po oznaczeniu mocy alkoholowej w produkcie fermentacji i obliczeniu wydajnoÊci przemiany
cukrów w etanol odwirowuje si´ przefermentowanà ciecz i oddestylowuje etanol;
2) moszcze z fermentacjà zatrzymanà przez dodanie
dwutlenku siarki; wykonuje si´ desulfitacj´ oko∏o
1,2 litra tego moszczu przez przepuszczenie azotu
przez moszcz umieszczony w ∏aêni wodnej o temperaturze 70 do 80 °C pod ch∏odnicà zwrotnà, do
uzyskania zawartoÊci dwutlenku siarki mniej ni˝
200 mg/l. Zwraca si´ uwag´, aby moszcz nie uleg∏
zag´szczeniu w wyniku odparowania wody; w tym
celu stosuje si´ wydajne ch∏odzenie. Nast´pnie
1 litr desulfitowanego moszczu umieszcza si´
w naczyniu fermentacyjnym i post´puje dalej tak
jak w przypadku moszczu Êwie˝ego. Je˝eli do sulfitacji moszczu u˝yto pirosiarczynu sodowego,
przed desulfitacjà do moszczu dodaje si´ 0,25 ml
kwasu siarkowego (o g´stoÊci ρ20 = 1,84 g/ml) na
1 g pirosiarczynu dodanego na 1 litr moszczu;
3) moszcze zag´szczone o znanej zawartoÊci cukrów
w iloÊci odpowiadajàcej masie oko∏o 170 g umieszcza si´ w naczyniu fermentacyjnym. Nast´pnie
uzupe∏nia si´ do 1 litra wodà o tym samym stosunku izotopów co próbki naturalnego moszczu, dodaje 1 g suchych dro˝d˝y i 3 g DIFCO, po czym dok∏adnie miesza si´ i post´puje dalej tak jak w przypadku moszczu Êwie˝ego.
Przygotowanie próbki alkoholu do oznaczania metodà
NMR
Odczynniki
1) N,N-czterometylomocznik (TMU) — u˝ywa si´
próbki wzorcowego TMU o podanym, kontrolowanym stosunku izotopów D/H;
2) heksafluorobenzen.
Wykonanie oznaczania
1) w przypadku zastosowania próbnika do NMR
o Êrednicy 15 mm post´puje si´ w nast´pujàcy
sposób — do uprzednio zwa˝onej butelki szklanej
zbiera si´ 7 ml alkoholu uzyskanego podczas wydzielania etanolu z wina i wa˝y ca∏oÊç z dok∏adnoÊcià do 0,1 mg (mA); nast´pnie bierze si´ 3 ml próbk´ wzorca wewn´trznego (TMU) i wa˝y z dok∏adnoÊcià do 0,1 mg (mst). Ca∏oÊç miesza si´, dok∏adnie
wstrzàsajàc;
Spektrometr
Próbnik 10 mm
Próbnik 15 mm
7,05 T
9,4 T
150 µl
35 µl
200 µl
50 µl
Przygotowanie próbki wody do pomiarów metodà
NMR, w celu ewentualnego oznaczania w niej stosunku
izotopów
Odczynniki
N,N-czterometylomocznik (TMU)
Wykonanie oznaczania
3 ml wody uzyskanej podczas wydzielania etanolu
i wody z wina lub podczas fermentacji moszczy
umieszcza si´ w wytarowanej kolbie i wa˝y z dok∏adnoÊcià do 0,1 mg (m’E). Nast´pnie wprowadza si´ 4 ml
wzorca wewn´trznego (TMU) i wa˝y z dok∏adnoÊcià do
0,1 m (m’ST), po czym ca∏oÊç miesza si´ dok∏adnie
przez wstrzàsanie.
2. WYKONANIE OZNACZANIA — REJESTROWANIE
WIDM 2HNMR ALKOHOLU I WODY
Oznaczanie parametrów izotopowych
Aparatura i sprz´t
1) spektrometr NMR wyposa˝ony w specyficzny
próbnik deuterowy dostrojony do charakterystycznej cz´stotliwoÊci V0 pola B0, posiadajàcy kana∏ odsprz´gania protonów (B2) i kana∏ stabilizacji cz´stotliwoÊci pola na cz´stotliwoÊci fluorowej. RozdzielczoÊç mierzona w widmie, transformowana
bez mno˝enia wyk∏adniczego (to jest LB = 0) i wyra˝ana przez szerokoÊç po∏ówkowà sygna∏u metylowego i metylenowego etanolu oraz sygna∏u metylowego TMU, mo˝e byç wi´ksza lub równa
0,5 Hz. Czu∏oÊç mierzona ze wspó∏czynnikiem
mno˝enia wyk∏adniczego LB = 2 nie mo˝e byç
mniejsza od 150 dla sygna∏u metylowego etanolu
w roztworze o mocy alkoholowej 95 % obj./(93,5 %
wagowo). W tych warunkach przedzia∏ ufnoÊci dla
pomiaru wysokoÊci sygna∏u, obliczany z prawdopodobieƒstwem 97,5 % (test jednostronny) i dla
10 powtórzeƒ widm, wynosi 0,35 %;
2) urzàdzenie do automatycznej zmiany próbek;
3) komputerowy program do obróbki danych;
4) próbówki na próbki o Êrednicy 15 lub 10 mm, zale˝ne od konstrukcji spektrometru.
Kalibracja i sprawdzanie prawid∏owoÊci kalibracji
spektrofotometru
1) przeprowadza si´ zwyk∏à kalibracj´ odnoÊnie do
jednorodnoÊci i czu∏oÊci zgodnie z zaleceniami
producenta;
2) sprawdza si´ prawid∏owoÊç kalibracji.
U˝ywa si´ wzorcowych etanoli, oznaczonych literami C, V i B, o ró˝nym st´˝eniu izotopów, ale dok∏adnie
standaryzowanych, gdzie
C — oznacza alkohol uzyskany z cukru trzcinowego
lub glukozy kukurydzianej,
V — oznacza alkohol uzyskany z winogron,
B — oznacza alkohol uzyskany z buraków.
Post´pujàc zgodnie z metodà opisanà dalej, oznacza si´ stosunek izotopów w alkoholu uzyskanym z cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej (Cmeas), alkoholu uzyskanym z winogron (Vmeas) i alkoholu uzyskanym z buraków (Bmeas).
WartoÊci uzyskane z oznaczania porównuje si´
z wartoÊciami podanymi dla odpowiednich wzorców
— alkoholu uzyskanego z cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej (CST), alkoholu uzyskanego z winogron (VST) i alkoholu uzyskanego z buraków (BST).
Poz. 1173
Dla ka˝dego widma prowadzi si´ pewnà liczb´ akumulacji NS, wystarczajàcà do uzyskania stosunku sygna∏u do szumu. Powtarza si´ te akumulacje NE = 10 razy.
WartoÊci NS zale˝à od rodzaju spektrometru i u˝ywanego próbnika.
3. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
Etanol
Dla ka˝dego z 10 uzyskanych widm wyznacza si´
3hII
wysokoÊç sygna∏u II (CH3CHD OH)
1) R = ——
= 3 x —————————————————;
hI
wysokoÊç sygna∏u I (CH2D CH2OH)
mst
(D/H)st
2) (D/H)I = 1,5866 x TI x ——
x ————
;
mA
tDm
mst
(D/H)st
3) (D/H)II = 2,3799 x TII ——
x ————
mA
t Dm
przy czym
wysokoÊç sygna∏u I (CH2DCH2OH)
a) TI = —————————————————————— ,
wysokoÊç sygna∏u wzorca wewn´trznego (TMU)
Odchylenie standardowe powtarzalnoÊci uzyskanej na Êredniej z 10 powtórzeƒ ka˝dego widma nie mo˝e przekroczyç 0,01 dla wspó∏czynnika (R) i 0,3 ppm dla
stosunku (D/H)I oraz (D/H)II.
wysokoÊç sygna∏u II (CH3CHDOH)
b) TII = —————————————————–––——— ,
wysokoÊç sygna∏u wzorca wewn´trznego (TMU)
Warunki uzyskiwania widm NMR
c) (D/H)st oznacza stosunek izotopów we wzorcu wewn´trznym (TMU).
Przygotowanà próbk´ alkoholu lub próbk´ wody
umieszcza si´ w próbówce szklanej o Êrednicy 15 lub
10 mm i wprowadza do próbnika.
Warunki uzyskiwania widm NMR sà nast´pujàce
1) sta∏a temperatura w próbniku;
2) czas akwizycji co najmniej 6,8 s dla szerokoÊci widma 1200 Hz (16 K pami´ci); (oko∏o 20 ppm przy
61,4 MHz lub 27 ppm przy 46,1 MHz);
Wykorzystujàc do obliczeƒ wysokoÊç piku uzyskanego na chromatogramie, zamiast jego powierzchni,
co jest metodà mniej dok∏adnà, zak∏ada si´, ˝e szerokoÊç piku w po∏owie jego wysokoÊci jest identyczna
i pozwala uzyskaç mo˝liwe do przyj´cia przybli˝enie.
Woda
Je˝eli stosunek izotopów w wodzie jest oznaczany
metodà NMR w mieszaninie woda — TMU, wykorzystuje si´ nast´pujàcy wzór
3) impuls 90°;
4) ustawienie czasu akwizycji — wartoÊç ta powinna
byç tego samego rz´du co czas relaksacji;
5) detekcja paraboliczna — przesuni´cie offsetu 01
ustawiç pomi´dzy wzorcowym sygna∏em OD
i CHD dla etanolu i pomi´dzy wzorcowym sygna∏em HOD i TMU dla wody;
6) wartoÊç przesuni´cia odsprz´gania oznacza si´ na
podstawie widma protonowego mierzonego za pomocà cewki odsprz´gajàcej w tej samej próbówce.
Dobre odsprz´ganie osiàga si´, gdy 02 znajduje si´
w Êrodku przedzia∏u cz´stotliwoÊci wyst´pujàcego
mi´dzy grupami CH3– i CH2. Stosuje si´ szerokie
pasmo odsprz´gania.
m’st
(D/H)ow = 0,9306 x TIV x ———
x (D/H)st
m’E
przy czym
powierzchnia sygna∏u (HOD) wody wydzielonej z wina
1)TIV = —————————————–——————————–;
powierzchnia sygna∏u wzorca wewn´trznego (TMU)
2)(D/H)st oznacza stosunek izotopów we wzorcu wewn´trznym (TMU).
Dla ka˝dego z parametrów izotopów oblicza si´
Êrednià z 10 oznaczeƒ oraz przedzia∏ ufnoÊci.
4. INTERPRETACJA WYNIKU
Poz. 1173
nuje si´ te wartoÊci z alkoholem wydzielonym z produktu fermentacji moszczy.
Porównuje si´ wartoÊci wzgl´dnego rozk∏adu deuteru w badanej próbce (RX) z wartoÊcià wzgl´dnego
rozk∏adu deuteru we wzorcu (RTI) lub (RTII). Je˝eli RX
ró˝ni si´ od Êredniej wartoÊci RTI lub RTII uzyskanej dla
wina kontrolnego o wi´cej ni˝ dwukrotnà wartoÊç odchylenia standardowego, mo˝na przypuszczaç, ˝e
próbka zosta∏a zafa∏szowana.
Wykrywanie dodatku cukru buraczanego, cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej
1) Dla wina
gdy Rx jest wi´ksze od RTI — przypuszczalnie zosta∏
dodany cukier buraczany,
gdy Rx jest mniejsze od RTII — przypuszczalnie zosta∏ dodany cukier trzcinowy lub glukoza kukurydziana;
WielkoÊç wzbogacenia E w % obj. wyra˝a obj´toÊç
alkoholu dodanego do fermentowanego produktu.
Znajàc rozcieƒczenia, które mog∏y byç dokonane przed
fermentacjà (w przypadku moszczy zag´szczonych),
i zak∏adajàc, ˝e z 16,83 g cukru otrzymuje si´ 1 % obj.
alkoholu, nale˝y obliczyç iloÊç (mas´) cukru dodanego
na litr moszczu, moszczu zag´szczonego.
Wykrywanie dodatku mieszaniny cukru buraczanego,
cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej
Stosunek izotopów (D/H)I i R zmienia si´ w mniejszym stopniu w przypadku dodania mieszaniny cukrów ni˝ w przypadku dodania tylko jednego rodzaju
cukru.
2) Moszcze, moszcze zag´szczone
WartoÊç (D/H)II jest wi´ksza, jak równie˝ wartoÊç
(D/H)wo.
Oznacza si´ wartoÊci parametrów izotopów w alkoholu wydzielonym z fermentowanego produktu otrzymanego podczas fermentacji moszczu lub moszczu zag´szczonego, post´pujàc zgodnie z instrukcjà, i porów-
Dodanie mieszaniny cukrów mo˝na potwierdziç
przez wyznaczenie stosunku 13C/12C w etanolu metodà
spektrometrii masowej, gdy˝ w przypadku zafa∏szowania stosunek ten jest wy˝szy.
Za∏àcznik nr 9
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI POPIO¸U
Popió∏ stanowià wszystkie substancje pozostajàce
po spaleniu pozosta∏oÊci po odparowaniu wina. Spalanie przeprowadza si´ w taki sposób, aby wszystkie kationy (z wyjàtkiem kationów amonowych) przesz∏y
w form´ w´glanów lub innych bezwodnych soli nieorganicznych.
si´ tygiel w elektrycznym piecu muflowym o temperaturze 525 ± 25 °C. Po 15 minutach zw´glania tygiel wyjmuje si´ z pieca, dodaje 5 ml wody destylowanej i odparowuje wod´ na ∏aêni wodnej lub w promienniku
w podczerwieni, a nast´pnie ponownie ogrzewa
w temperaturze 525 °C przez 10 minut.
Pozosta∏oÊç po odparowaniu wina jest spalana
w temperaturze od 500 do 550 °C a˝ do ca∏kowitego
spalenia (utlenienia) substancji organicznych.
W sytuacji gdy nie nastàpi∏o ca∏kowite spalenie
zw´glonych czàsteczek, powtarza si´ przemywanie,
odparowywanie wody i pra˝enie.
1. APARATURA I SPRZ¢T
W przypadku win o wysokiej zawartoÊci cukrów korzystne jest dodanie do wyciàgu, przed pierwszym
spopielaniem, kilku kropli czystego oleju roÊlinnego
w celu zapobie˝enia nadmiernemu pienieniu próbki.
1) ∏aênia z wrzàcà wodà;
2) waga o czu∏oÊci do 0,1 mg;
3) p∏yta grzejna lub promiennik w podczerwieni;
4) elektryczny piec muflowy o kontrolowanej temperaturze;
Po zakoƒczeniu spalania próbki przenosi si´ do eksykatora. Po och∏odzeniu w eksykatorze wa˝y si´ tygiel.
3. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
5) eksykator;
6) tygiel platynowy o Êrednicy 70 mm i wysokoÊci
25 mm.
ZawartoÊç popio∏u (P) w badanej próbce, w g/l, oblicza si´ wed∏ug wzoru
P = 50 x (P1 – P0),
2. WYKONANIE OZNACZANIA
Po uprzednim zwa˝eniu tygla z platyny odmierza
si´ 20 ml wina. Próbk´ odparowuje si´ na wrzàcej ∏aêni wodnej, a nast´pnie ogrzewa pozosta∏oÊç na p∏ycie
grzejnej o temperaturze 200 °C lub w promienniku
w podczerwieni a˝ do rozpocz´cia zw´glania próbki.
Gdy z próbki przestanie wydzielaç si´ dym, umieszcza
gdzie
P0 — oznacza mas´ pustego tygla,
P1 — oznacza mas´ tygla ze spopielonà próbkà (popio∏em),
50 — oznacza przelicznik 20 ml na litr.
Za∏àcznik nr 10
OZNACZANIE ALKALICZNOÂCI POPIO¸U
AlkalicznoÊç popio∏u stanowi suma kationów, innych ni˝ kationy amonowe, zwiàzanych z kwasami organicznymi w winie.
Metoda oznaczania alkalicznoÊci popio∏u polega na
rozpuszczeniu popio∏u w goràcym roztworze kwasu,
a nast´pnie dokonaniu oznaczania nadmiaru kwasu
metodà miareczkowà z u˝yciem oran˝u metylowego
jako wskaênika.
1. ODCZYNNIKI I APARATURA
2. WYKONANIE OZNACZANIA
Do tygla platynowego, w którym zosta∏ umieszczony popió∏ otrzymany z 20 ml wina, odmierza si´ 10 ml
roztworu kwasu siarkowego. Tygiel umieszcza si´ we
wrzàcej ∏aêni wodnej na oko∏o 15 minut, rozbijajàc i mieszajàc zawartoÊç tygla za pomocà szklanej bagietki w celu przyspieszenia rozpuszczania. Nast´pnie dodaje si´
dwie krople roztworu oran˝u metylowego i odmiareczkowuje nadmiar kwasu siarkowego roztworem wodorotlenku sodu do zmiany barwy wskaênika na ˝ó∏tà.
3. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
1) 0,05-molowy roztwór kwasu siarkowego (H2SO4);
2) 0,1-molowy roztwór wodorotlenku sodu (NaOH);
AlkalicznoÊç popio∏u (A) w miligramorównowa˝nikach na litr, z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po
przecinku, oblicza si´ wed∏ug wzoru
A = 5 (10 – n),
3) 0,1 % wodny roztwór oran˝u metylowego;
gdzie n jest obj´toÊcià roztworu wodorotlenku sodu
zu˝ytego do oznaczania.
4) wrzàca ∏aênia wodna.
Za∏àcznik nr 11
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CHLORKÓW
ZawartoÊç chlorków oznacza si´ bezpoÊrednio
w winie metodà potencjometrycznà z zastosowaniem
elektrody Ag/AgCl.
1. APARATURA I SPRZ¢T
1) pehametr/miliwoltomierz o dzia∏ce elementarnej
co najwy˝ej 2 mV;
2) mieszad∏o magnetyczne;
3) elektroda Ag/AgCl z nasyconym roztworem azotanu sodowego jako elektrolitem;
4) mikrobiureta o dzia∏ce elementarnej 1/100 ml;
5) stoper.
2. ODCZYNNIKI
1) wzorcowy roztwór chlorku sporzàdzony przez rozpuszczenie w wodzie destylowanej 2,1027 g chlorku potasu (KCl, maks. 0,005 % Br) wysuszonego
przed u˝yciem przez kilka dni w eksykatorze, a nast´pnie dodaje si´ wody destylowanej do uzyskania 1 litra roztworu. Sporzàdzony w ten sposób roztwór w 1 ml zawiera 1 mg Cl;
2) roztwór azotanu srebra do miareczkowania sporzàdzony przez rozpuszczenie w 10 % obj. roztworze alkoholu 4,7912 g azotanu srebra (AgNO3)
i uzupe∏nienie do 1 litra;
w sporzàdzonym w ten sposób roztworze: 1 ml odpowiada 1 mg Cl;
3) kwas azotowy o czystoÊci co najmniej 65 % (o g´stoÊci ρ20 = 1,40 g/ml).
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Do cylindrycznego naczynia na 150 ml umieszczonego na mieszadle magnetycznym odmierza si´ 5,0 ml
wzorcowego roztworu chlorku, a nast´pnie rozcieƒcza
si´ wodà do oko∏o 100 ml i zakwasza, dodajàc 1 ml
kwasu azotowego. Po zanurzeniu elektrody miareczkuje si´ roztworem azotanu srebra dozowanym z mikrobiurety, stosujàc umiarkowane mieszanie. Poczàtkowo dodaje si´ azotan w czterech porcjach po 1,0 ml
ka˝da, odczytujàc wartoÊç potencja∏u w miliwoltach
(mV). Nast´pnie dodaje si´ 2 ml azotanu w porcjach
po 0,2 ml i kolejnà porcj´ 1 ml azotanu a˝ do wprowadzenia ca∏oÊci 10 ml azotanu. Po dokonaniu ka˝dorazowego wkroplenia odczekuje si´ oko∏o 30 sekund i odczytuje wartoÊç potencja∏u. Na podstawie uzyskanych
wartoÊci potencja∏u sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie
P = f(c), gdzie P — oznacza wartoÊç potencja∏u, c —
oznacza iloÊç zu˝ytego roztworu azotanu srebra. Na
podstawie punktu przegi´cia krzywej odczytuje si´ potencja∏ punktu równowa˝nikowego.
Do cylindrycznego naczynia na 150 ml odmierza si´
5 ml wzorcowego roztworu chlorku, dodaje si´ 95 ml
wody destylowanej i 1 ml kwasu azotowego i zanurza
elektrod´. Nast´pnie miareczkuje si´ roztworem azotanu srebra dozowanym z mikrobiurety, ciàgle mieszajàc, do uzyskania potencja∏u punktu równowa˝nikowego. Oznaczenie powtarza si´ do uzyskania zbli˝onych
wyników. Test ten nale˝y przeprowadziç przed ka˝dà
serià oznaczeƒ chlorków w próbkach win.
Do cylindrycznego naczynia na 150 ml odmierza si´
50 ml wina, nast´pnie dodaje si´ 50 ml wody destylowanej i 1 ml kwasu azotowego i miareczkuje roztworem azotanu srebra dozowanym z mikrobiurety, ciàgle mieszajàc,
do uzyskania potencja∏u punktu równowa˝nikowego.
Dla dok∏adnego oznaczania
1) miareczkuje si´ roztworem azotanu srebra, dodajàc po 0,5 ml i rejestrujàc odczytanà wartoÊç potencja∏u w mV. Na podstawie pierwszego miareczkowania okreÊla si´ przybli˝onà obj´toÊç azotanu
srebra potrzebnà do zmiareczkowania próbki;
2) powtarza si´ miareczkowanie w tych samych warunkach. Na poczàtku dodaje si´ po 0,5 ml roztworu miareczkujàcego do momentu, w którym dodana iloÊç jest mniejsza od obj´toÊci wyznaczonej w
pkt 1 i wynosi od 1,5 do 2,0 ml. Nast´pnie dodaje
si´ po 0,2 ml roztworu miareczkujàcego, po czym
kontynuuje si´ miareczkowanie a˝ poza wyznaczony w przybli˝eniu punkt równowa˝nikowy w sposób symetryczny, dodajàc po 0,2 ml, a nast´pnie
po 0,5 ml roztworu azotanu srebra.
4. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
ZawartoÊç chlorków w badanej próbce wynosi
20 x V
— wynik wyra˝ony w mg/l w przeliczeniu
na chlor (Cl),
0,5633 x V — wynik wyra˝ony w miligramorównowa˝nikach na litr,
32,9 x V
— wynik wyra˝ony w mg/l w przeliczeniu
na chlorek sodu (NaCl),
gdzie V — oznacza iloÊç ml azotanu srebra zu˝ytego
w oznaczaniu.
Punkt koƒcowy miareczkowania oraz dok∏adnà obj´toÊç zu˝ytego roztworu azotanu srebra okreÊla si´
1) przez wykreÊlenie krzywej i wyznaczenie punktu
równowa˝nikowego lub
Poz. 1173
2) wed∏ug wzoru
∆∆E1
V = V’ + ∆V1 ——————
,
∆∆E1 + ∆∆E2
gdzie
V
— oznacza iloÊç ml zu˝ytego roztworu azotanu srebra do uzyskania punktu równowa˝nikowego,
V’
— oznacza iloÊç ml zu˝ytego roztworu azotanu
srebra przed najwi´kszym skokiem potencja∏u,
∆V1 — oznacza sta∏à obj´toÊç, w jakiej wprowadzano
roztwór azotanu srebra, równà 0,2 ml,
∆∆E1 — oznacza drugà ró˝nic´ potencja∏u przed najwi´kszym skokiem potencja∏u,
∆∆E2 — oznacza drugà ró˝nic´ potencja∏u po najwi´kszym skoku potencja∏u.
5. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania zawartoÊci chlorków powtarzalnoÊç (r) wynosi
1) r = 1,2 mg/l w przeliczeniu na Cl;
2) r = 0,03 miligramorównowa˝nika na litr;
3) r = 2,0 mg/l w przeliczeniu na NaCl.
6. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania zawartoÊci chlorków odtwarzalnoÊç (R) wynosi
1) R = 4,1 mg/l w przeliczeniu na Cl;
2) R = 0,12 miligramorównowa˝nika na litr;
3) R = 6,8 mg/l w przeliczeniu na NaCl.
Za∏àcznik nr 12
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SIARCZANÓW
Metoda oznaczania zawartoÊci siarczanów polega
na wytràceniu jonów siarczanowych za pomocà chlorku baru. RównoczeÊnie wytràcajàcy si´ fosforan baru
jest usuwany przez przemywanie osadu kwasem chlorowodorowym. Uzyskany osad po spopieleniu wa˝y
si´. W przypadku moszczy i win bogatych w dwutlenek
siarki przed oznaczaniem zalecana jest desulfitacja
przez gotowanie w szczelnie zamkni´tym naczyniu.
1. ODCZYNNIKI
1) dwumolowy roztwór kwasu solnego;
2) roztwór chlorku baru BaCl2 • 2 H2O, o st´˝eniu 200 g/l.
2. WYKONANIE OZNACZANIA
solnego i 2 ml roztworu chlorku baru. Ca∏oÊç miesza
si´ mieszad∏em szklanym, nast´pnie mieszad∏o przemywa si´ niewielkà iloÊcià wody destylowanej i odstawia na 5 minut, po czym wiruje 5 minut. Po zakoƒczeniu wirowania ostro˝nie zlewa si´ ciecz znad osadu.
Uzyskany osad siarczanu baru przemywa si´ 10 ml
kwasu solnego, nast´pnie wytwarza si´ zawiesin´ i wiruje przez 5 minut, po czym ostro˝nie zlewa si´ ciecz
znad osadu. Przemywanie wykonuje si´ dwukrotnie
w tych samych warunkach, za ka˝dym razem u˝ywajàc
15 ml wody destylowanej. Po zakoƒczeniu przemywania osad przenosi si´ do zwa˝onego naczynka platynowego, wyp∏ukujàc osad wodà destylowanà. Naczynko
wraz z osadem umieszcza si´ w ∏aêni wodnej o temperaturze 100 °C a˝ do ca∏kowitego odparowania. Suchy
osad pra˝y si´ kilkakrotnie w p∏omieniu do uzyskania
bia∏ej pozosta∏oÊci, nast´pnie och∏adza w eksykatorze
i wa˝y.
Ogólny sposób wykonania oznaczania
Do próbówki do wirowania o pojemnoÊci 50 ml odmierza si´ 40 ml badanej próbki i dodaje 2 ml kwasu
solnego i 2 ml roztworu chlorku baru. Ca∏oÊç miesza
si´ mieszad∏em szklanym, nast´pnie mieszad∏o przemywa si´ niewielkà iloÊcià wody destylowanej i odstawia na 5 minut, po czym wiruje 5 minut. Po zakoƒczeniu wirowania ostro˝nie zlewa si´ ciecz znad osadu.
Uzyskany osad siarczanu baru przemywa si´ 10 ml
kwasu solnego, nast´pnie wytwarza si´ zawiesin´ i wiruje przez 5 minut, po czym ostro˝nie zlewa si´ ciecz
znad osadu. Przemywanie wykonuje si´ dwukrotnie
w tych samych warunkach, za ka˝dym razem u˝ywajàc
15 ml wody destylowanej. Po zakoƒczeniu przemywania osad przenosi si´ do zwa˝onego naczynka platynowego, wyp∏ukujàc osad wodà destylowanà. Naczynko
wraz z osadem umieszcza si´ w ∏aêni wodnej o temperaturze 100 °C a˝ do ca∏kowitego odparowania. Suchy
osad pra˝y si´ kilkakrotnie w p∏omieniu do uzyskania
bia∏ej pozosta∏oÊci, nast´pnie och∏adza w eksykatorze
i wa˝y.
3. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
ZawartoÊç siarczanów w mg/l w przeliczeniu na
siarczan potasu (K2SO4) oblicza si´, mno˝àc 18,67
przez iloÊç mg otrzymanego siarczanu baru.
ZawartoÊç siarczanów w moszczach i winie oznacza
si´ w mg chlorku potasu/litr, z dok∏adnoÊcià do 1 mg.
4. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania zawartoÊci siarczanów
powtarzalnoÊç (r) wynosi
Specjalny sposób wykonania oznaczania
1) do 1000 mg/l: r = 27 mg/l;
Specjalny sposób wykonania oznaczania dotyczy
moszczy i win o wysokiej zawartoÊci dwutlenku siarki.
2) oko∏o 1500 mg/l: r = 41 mg/l.
Do kolby sto˝kowej na 500 ml wyposa˝onej we
wkraplacz i rurk´ odprowadzajàcà odmierza si´ 25 ml
wody i 1 ml czystego kwasu solnego o g´stoÊci (ρ20)
wynoszàcej od 1,15 do 1,18 g/ml. Roztwór zagotowuje
si´ w celu odpowietrzenia. Nast´pnie przez lejek wprowadza si´ 100 ml wina. Próbk´ gotuje si´ dalej a˝ do
momentu, gdy obj´toÊç cieczy w kolbie zmniejszy si´
do oko∏o 75 ml. Po och∏odzeniu roztwór przenosi si´
iloÊciowo do kolby miarowej na 100 ml i uzupe∏nia wodà do 100 ml. Uzyskuje si´ w ten sposób próbk´ do
badaƒ.
5. ODTWARZALNOÂå METODY
Do próbówki do wirowania o pojemnoÊci 50 ml odmierza si´ 40 ml próbki do badaƒ i dodaje 2 ml kwasu
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania zawartoÊci siarczanów
odtwarzalnoÊç (R) wynosi
1) do 1000 mg/l: R = 51 mg/l;
2) oko∏o 1500 mg/l: R = 81 mg/l.
Za∏àcznik nr 13
OZNACZANIE KWASOWOÂCI OGÓLNEJ
KwasowoÊç ogólna jest sumà kwasowoÊci miareczkowych próbki, gdy miareczkowanie odbywa si´
do pH 7 przy u˝yciu mianowanego roztworu zasady.
Dwutlenek w´gla nie wchodzi w sk∏ad kwasowoÊci
ogólnej.
Metoda oznaczania kwasowoÊci ogólnej polega na
miareczkowaniu potencjometrycznym lub miareczkowaniu z b∏´kitem bromotymolowym jako wskaênikiem
i porównaniu z wzorcem o barwie odpowiadajàcej
punktowi koƒcowemu miareczkowania.
1. ODCZYNNIKI
1) roztwór buforowy o pH 7,0 sporzàdzony
z 107,3 g dwuwodorofosforanu potasowego
(KH2PO4), 500 ml jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu (NaOH) i wody w iloÊci potrzebnej
do uzyskania 1000 ml roztworu;
2) 0,1-molowy roztwór wodorotlenku sodu (NaOH);
3) roztwór wskaênika b∏´kitu bromotymolowego o st´˝eniu 4 g/l, sporzàdzony z: 4 g b∏´kitu bromotymolowego (C27H28Br2O8S) rozpuszczonego w 200 ml
oboj´tnego etanolu 96 % obj., 200 ml wody pozbawionej CO2, jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu w iloÊci potrzebnej do uzyskania barwy niebieskozielonej (pH 7) — oko∏o 7,5 ml i wody w iloÊci
potrzebnej do uzyskania 1000 ml roztworu.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) pompka wodna;
2) kolba pró˝niowa na 500 ml;
Do cylindra miarowego wprowadza si´ przygotowanà próbk´ o obj´toÊci 10 ml. Nast´pnie dodaje si´
oko∏o 10 ml wody destylowanej i roztwór wodorotlenku sodu w iloÊci potrzebnej do uzyskania pH 7 w temperaturze 20 °C. Wodorotlenek sodu dodaje si´ powoli, stale mieszajàc.
Miareczkowanie ze wskaênikiem (b∏´kit bromotymolowy)
1) próba wst´pna — do cylindra miarowego odmierza si´ 25 ml przegotowanej wody destylowanej,
1 ml roztworu b∏´kitu bromotymolowego oraz
próbk´ wina o obj´toÊci 10 ml. Dodaje si´ roztwór
wodorotlenku sodu w iloÊci potrzebnej do zmiany
barwy na niebieskozielonà. Nast´pnie dodaje si´
5 ml roztworu buforowego o pH 7;
2) próba w∏aÊciwa — do cylindra miarowego odmierza si´ 30 ml przegotowanej wody destylowanej,
1 ml roztworu b∏´kitu bromotymolowego oraz
próbk´ wina o obj´toÊci 10 ml. Nast´pnie dodaje
si´ roztwór wodorotlenku sodowego w iloÊci potrzebnej do uzyskania barwy identycznej z barwà
uzyskanà w próbie wst´pnej.
5. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
1) KwasowoÊç ogólnà (A) w miligramorównowa˝nikach na litr oblicza si´ wed∏ug wzoru
A = 10 x n,
gdzie n — oznacza obj´toÊç zu˝ytego roztworu wodorotlenku sodu.
WartoÊç t´ podaje si´ z dok∏adnoÊcià do jednego
miejsca po przecinku;
3) potencjometr skalowany w wartoÊciach pH;
4) elektrody szklana i kalomelowa lub kombinowana;
5) cylindry miarowe na 50 ml i 100 ml.
Elektrod´ szklanà przechowuje si´ w wodzie destylowanej. Elektrod´ kalomelowà nasyconà chlorkiem
potasu przechowuje si´ w nasyconym roztworze chlorku potasu. Najcz´Êciej jest u˝ywana elektroda kombinowana, która powinna byç przechowywana w wodzie
destylowanej.
3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY
Przygotowanie próbki
2) KwasowoÊç ogólnà (A’) w g/l kwasu winowego oblicza si´ wed∏ug wzoru: A’ = 0,075 x A.
WartoÊç t´ podaje si´ z dok∏adnoÊcià do jednego
miejsca po przecinku.
6. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
Do kolby pró˝niowej odmierza si´ oko∏o 50 ml wina. Nast´pnie kolb´ pod∏àcza si´ do pompki wodnej
na jednà do dwóch minut, stale wstrzàsajàc.
W przypadku oznaczania kwasowoÊci ogólnej powtarzalnoÊç (r) wynosi
4. WYKONANIE OZNACZANIA
2) r = 0,07 g kwasu winowego/litr.
Miareczkowanie potencjometryczne
7. ODTWARZALNOÂå METODY
Przed przystàpieniem do miareczkowania wzorcuje
si´ pehametr za pomocà buforu o pH 7.
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest
mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bez-
1) r = 0,9 miligramorównowa˝nika/litr;
wzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej
metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego
sprz´tu.
W przypadku oznaczania kwasowoÊci ogólnej odtwarzalnoÊç (R) wynosi
Poz. 1173
1) dla win bia∏ych i ró˝owych
a) R = 3,6 miligramorównowa˝nika/litr,
b) R = 0,3 g kwasu winowego/litr;
2) dla win czerwonych
a) R = 5,1 miligramorównowa˝nika/litr,
b) R = 0,4 g kwasu winowego/litr.
Za∏àcznik nr 14
OZNACZANIE KWASOWOÂCI LOTNEJ
KwasowoÊç lotna jest sumà kwasów lotnych w stanie
wolnym lub zwiàzanym, wyra˝onà liczbà gramów kwasu
octowego na litr. ZawartoÊci kwasu w´glowego i kwasu
siarkowego nie zalicza si´ do kwasowoÊci lotnej wina.
Metoda oznaczania kwasowoÊci lotnej polega na
zmiareczkowaniu oddestylowanych kwasów lotnych
mianowanym roztworem wodorotlenku sodu. Z wina
usuwa si´ uprzednio dwutlenek w´gla, natomiast kwasowoÊç tworzonà przez wolny i zwiàzany dwutlenek
siarki odejmuje si´ od kwasowoÊci destylatu. Odejmuje si´ równie˝ kwasowoÊç tworzonà przez kwas sorbowy, który móg∏ byç dodany do wina.
W destylacie jest obecna cz´Êç kwasu salicylowego, który w niektórych krajach jest stosowany do
utrwalania wina. ZawartoÊç kwasu salicylowego równie˝ odejmuje si´ od kwasowoÊci lotnej.
1. ODCZYNNIKI
1) krystaliczny kwas winowy (C4H6O6);
2) 0,1-molowy roztwór wodorotlenku sodu (NaOH);
3) 1 % roztwór fenoloftaleiny w 96 % obj. alkoholu;
4) kwas chlorowodorowy (o g´stoÊci ρ20 = 1,18 do
1,19 g/ml) rozcieƒczony w stosunku1:4 obj.;
5) 0,005-molowy roztwór jodu (I2);
6) krystaliczny jodek potasu (KI);
7) roztwór skrobi o st´˝eniu 5 g/l, sporzàdzony przez
zmieszanie 5 g skrobi z oko∏o 500 ml wody, doprowadzony do wrzenia przy ciàg∏ym mieszaniu i gotowany przez 10 minut, a nast´pnie dodanie
200 g chlorku sodu, och∏odzenie i uzupe∏nienie do
1 litra;
b) kolby z przewodem pary,
c) kolumny destylacyjnej,
d) ch∏odnicy;
2) pompki wodnej;
3) kolby pró˝niowej.
3. PRZYGOTOWANIE APARATURY
W celu przygotowanie zestawu do destylacji z parà
wodnà wykonuje si´ nast´pujàce testy
1) do kolby zestawu do destylacji odmierza si´ 20 ml
przegotowanej wody; zbiera si´ 250 ml destylatu
i dodaje do niego 0,1 ml roztworu wodorotlenku
sodu i dwie krople roztworu fenoloftaleiny; barwa
ró˝owa powinna utrzymywaç si´ przez co najmniej
10 sekund, co oznacza, ˝e para wodna nie zawiera
dwutlenku w´gla;
2) do kolby odmierza si´ 20 ml 0,1-molowego roztworu kwasu octowego; zbiera si´ 250 ml destylatu,
który miareczkuje si´ roztworem wodorotlenku
sodu, przy czym obj´toÊç roztworu zu˝ytego do
miareczkowania nie mo˝e byç mniejsza ni˝
19,9 ml, co oznacza, ˝e co najmniej 99,5 % kwasu
octowego zosta∏o oddestylowane z parà wodnà;
3) do kolby miarowej odmierza si´ 20 ml 1-molowego roztworu kwasu mlekowego; zbiera si´ 250 ml
destylatu i miareczkuje roztworem wodorotlenku
sodowego; obj´toÊç zu˝ytego do miareczkowania
roztworu wodorotlenku sodowego nie mo˝e byç
wi´ksza ni˝ 1 ml, co oznacza, ˝e nie wi´cej ni˝
0,5 % kwasu mlekowego zosta∏o oddestylowane.
8) nasycony roztwór heptaoksotetraboranu sodu
(Na2B4O7) • H2O, o st´˝eniu 55 g/l w temperaturze
20 °C.
4. WYKONANIE OZNACZANIA
2. APARATURA I SPRZ¢T
Przed przystàpieniem do oznaczenia z próbki usuwa si´ dwutlenek w´gla w nast´pujàcy sposób: do kolby pró˝niowej odmierza si´ oko∏o 50 ml wina i w∏àcza
pompk´ wodnà na jednà do dwóch minut, stale wstrzàsajàc.
1) zestaw do destylacji z parà wodnà, sk∏adajàcy si´ z
a) wytwornicy pary wodnej niezawierajàcej dwutlenku w´gla,
Usuwanie dwutlenku w´gla
Destylacja z u˝yciem pary wodnej
1) r = 0,7 miligramorównowa˝nika/litr;
20 ml wina pozbawionego dwutlenku w´gla odmierza si´ do kolby zestawu destylacyjnego, dodaje
oko∏o 0,5 g kwasu winowego i przeprowadza destylacj´. Zbiera si´ co najmniej 250 ml destylatu.
2) r = 0,04 g kwasu octowego/litr.
Miareczkowanie
Destylat miareczkuje si´ roztworem wodorotlenku
sodu, wobec dwóch kropli fenoloftaleiny jako wskaênika. Miareczkowanie koƒczy si´ w chwili pojawienia si´
ró˝owej barwy roztworu niezanikajàcej w ciàgu 30 sekund.
Wprowadzenie poprawki na dwutlenek siarki
Destylat bezpoÊrednio po zmiareczkowaniu zakwasza si´ czterema kroplami kwasu solnego. Nast´pnie
dodaje si´ 2 ml roztworu skrobi i kilka kryszta∏ów jodku potasu. Roztwór miareczkuje si´ za pomocà roztworu jodu do niebieskiego zabarwienia. Zu˝yta iloÊç jodu
odpowiada zawartoÊci wolnego dwutlenku siarki w destylacie. Nast´pnie dodaje si´ nasycony roztwór heptaoksotetraboranu sodu do uzyskania barwy ró˝owej
i miareczkuje zwiàzany dwutlenek siarki za pomocà
roztworu jodu.
5. OBLICZANIE WYNIKU
1) kwasowoÊç lotna (A), wyra˝ana w miligramorównowa˝nikach na litr z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku, wynosi: A = 5 (n – 0,1 n’ – 0,05 n’’);
2) kwasowoÊç lotna (AI), wyra˝ana w g kwasu octowego na litr z dok∏adnoÊcià do dwóch miejsc po
przecinku, wynosi: AI = 0,300 (n – 0,1 n’ – 0,05 n’’),
gdzie
Poz. 1173
7. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest
mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy pomi´dzy dwoma wynikami pojedynczego oznaczania, uzyskanymi na tej samej próbce, w ró˝nych warunkach — ró˝ne osoby wykonujàce,
ró˝ne aparaty lub ró˝ne laboratoria, lub w ró˝nym czasie.
W przypadku oznaczania kwasowoÊci lotnej odtwarzalnoÊç (R) wynosi
1) R = 1,3 miligramorównowa˝nika/litr;
2) R = 0,08 g kwasu octowego/litr.
8. OZNACZANIE KWASU SALICYLOWEGO PRZECHODZÑCEGO DO DESTYLATU OTRZYMYWANEGO
PRZY OZNACZANIU KWASOWOÂCI LOTNEJ
Po oznaczeniu kwasowoÊci lotnej i wprowadzeniu
poprawki na zawartoÊç dwutlenku siarki nale˝y stwierdziç obecnoÊç kwasu salicylowego, po zakwaszeniu,
przez fioletowe zabarwienie pojawiajàce si´ po dodaniu soli ˝elaza (III).
Oznaczanie kwasu salicylowego przechodzàcego
do destylatu wraz z kwasami lotnymi wykonuje si´ w
drugim destylacie, przy czym u˝ywa si´ tej samej obj´toÊci destylatu, jakà wykorzystano do oznaczania
kwasowoÊci lotnej. Kwas salicylowy oznacza si´ kolorymetrycznà metodà porównawczà. Oznaczonà zawartoÊç kwasu salicylowego odejmuje si´ od kwasowoÊci
lotnej oznaczonej w destylacie uzyskanym w wyniku
pierwszej destylacji.
n — oznacza obj´toÊç zu˝ytego wodorotlenku sodu,
Odczynniki
n’ — oznacza obj´toÊç jodu zu˝ytego do miareczkowania wolnego dwutlenku siarki,
1) kwas chlorowodorowy (HCl) (o g´stoÊci ρ20 = 1,18
do 1,19 g/l);
n’’— oznacza obj´toÊç jodu zu˝ytego do miareczkowania zwiàzanego dwutlenku siarki.
2) 0,1-molowy roztwór tiosiarczanu sodu (Na2S2O3 ⋅ 5H2O);
JeÊli wino zawiera kwas sorbowy, kwasowoÊç pochodzàcà z kwasu sorbowego odejmuje si´ od oznaczonej kwasowoÊci lotnej, przy za∏o˝eniu, ˝e 100 mg
kwasu sorbowego odpowiada kwasowoÊci 0,89 milirównowa˝nika/l lub 0,053 g/l kwasu octowego oraz gdy
jest znana zawartoÊç kwasu sorbowego w mg/ml.
3) 10 % (m/v) roztwór siarczanu ˝elazo-amonowego
(Fe2(SO4)3 ⋅ (NH4)2SO4 ⋅ 24H2O);
4) 0,01-molowy roztwór salicylanu sodowego;
5) roztwór salicylanu sodowego (NaC7H5O3) o st´˝eniu 1,60 g/l.
Wykonanie oznaczania
6. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy pomi´dzy dwoma wynikami pojedynczego
oznaczania, uzyskanymi na tej samej próbce, w tych
samych warunkach — ta sama osoba wykonujàca, ten
sam aparat, to samo laboratorium i w krótkim odst´pie
czasowym.
1) wykrywanie obecnoÊci kwasu salicylowego w destylacie wykorzystanym przy oznaczaniu kwasowoÊci
lotnej. Natychmiast po oznaczeniu kwasowoÊci lotnej i wprowadzeniu poprawki na zawartoÊç wolnego
i zwiàzanego dwutlenku siarki do kolby sto˝kowej odmierza si´ 0,5 ml kwasu solnego, 3 ml roztworu tiosiarczanu sodu i 1 ml roztworu siarczanu ˝elazo-amonowego. Uzyskanie barwy fioletowej Êwiadczy
o obecnoÊci w próbce kwasu salicylowego;
W przypadku oznaczania kwasowoÊci lotnej powtarzalnoÊç (r) wynosi
2) oznaczanie zawartoÊci kwasu salicylowego. Na
kolbie sto˝kowej, wykorzystanej przy wykrywaniu
obecnoÊci kwasu salicylowego, zaznacza si´ kreskà obj´toÊç destylatu, nast´pnie kolb´ opró˝nia
si´ i przep∏ukuje. Przeprowadza si´ destylacj´ z parà wodnà drugiej próbki wina o obj´toÊci 20 ml,
zbierajàc destylat do kolby sto˝kowej. Nast´pnie
dodaje si´ 0,3 ml czystego kwasu solnego i 1 ml
roztworu siarczanu ˝elazowo-amonowego. ZawartoÊç kolby zabarwi si´ na fioletowo. Do kolby sto˝kowej, identycznej jak ww. kolba z zaznaczonà kreskà, nalewa si´ wody destylowanej w iloÊci równej
iloÊci destylatu, a nast´pnie dodaje 0,3 ml czyste-
Poz. 1173
go kwasu solnego i 1 ml roztworu siarczanu ˝elazo-amonowego. Za pomocà biurety wprowadza
si´ roztwór salicylanu sodowego do uzyskania barwy fioletowej o nat´˝eniu odpowiadajàcym barwie
roztworu w kolbie zawierajàcej destylat wina;
3) wprowadzanie poprawki do kwasowoÊci lotnej. Od
obj´toÊci n ml roztworu wodorotlenku sodu, zu˝ytego do miareczkowania kwasów w destylacie
podczas oznaczania kwasowoÊci lotnej, odjàç obj´toÊç 0,1 x n’’’, gdzie n’’’ oznacza obj´toÊç w ml
roztworu dodanego z biurety.
Za∏àcznik nr 15
OZNACZANIE KWASOWOÂCI ZWIÑZANEJ
KwasowoÊç zwiàzanà oblicza si´ z ró˝nicy mi´dzy
kwasowoÊcià ca∏kowità a kwasowoÊcià lotnà.
KwasowoÊç zwiàzanà wyra˝a si´ w miligramorównowa˝nikach na litr lub w g kwasu winowego na litr.
Za∏àcznik nr 16
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU WINOWEGO
Kwas winowy wytràcany w postaci (±)winianu
wapnia oznacza si´ grawimetrycznie. Dopuszczalne
jest uzupe∏nienie tego oznaczania przy u˝yciu dodatkowo metody miareczkowej. Podczas wytràcania nale˝y
zapewniç, aby takie warunki, jak: pH, ca∏kowita obj´toÊç roztworu zu˝ytego do wytràcania, st´˝enie jonów
wytràcajàcych by∏y takie same i aby nastàpi∏o ca∏kowite wytràcenie (±)winianu wapnia oraz pozostanie
w roztworze D(-)winianu wapnia. Je˝eli do wina dodano kwas mezowinowy, który powoduje nieca∏kowite
wytràcanie (±)winianu wapnia, przed oznaczaniem
przeprowadza si´ hydroliz´ kwasu.
1. METODA GRAWIMETRYCZNA
Odczynniki
1) roztwór octanu wapnia o st´˝eniu 10 g wapnia w litrze, który sporzàdza si´ z: 25 g w´glanu wapnia
(CaCO3), 40 ml lodowatego kwasu octowego
(CH3COOH) o g´stoÊci ρ20 = 1,05 g/ml i wody w iloÊci potrzebnej do sporzàdzenia 1 litra roztworu;
(±)winian wapnia, krystaliczny: CaC4O6H4 x 4H2O.
Roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy sposób: do
zlewki na 400 ml odmierza si´ 20 ml roztworu kwasu L(+)winowego (5 g/l), dodaje si´ 20 ml roztworu
D(–)winianu amonu (6,126 g/l) i 6 ml roztworu octanu wapnia zawierajàcego 10 g wapnia w litrze. Ca∏oÊç pozostawia si´ na dwie godziny w celu wytràcenia winianu wapnia. Osad zbiera si´ na tyglu ze
spiekiem szklanym nr 4 i przemywa trzy razy oko∏o
30 ml wody destylowanej. Nast´pnie osad suszy
si´ do sta∏ej masy w suszarce w temperaturze
70 °C. U˝ywajàc wy˝ej wskazanych iloÊci odczynników, uzyskuje si´ oko∏o 340 mg krystalicznego
(±)winianu wapnia. Tak przygotowany winian wapnia przechowuje si´ w zakorkowanej butelce;
2) roztwór wytràcajàcy o pH 4,75 sporzàdzony w nast´pujàcy sposób: 122 mg kwasu D(-)winowego
rozpuszcza si´ w wodzie w iloÊci niezb´dnej do
otrzymania oko∏o 900 ml roztworu, dodajàc 0,3 ml
25 % obj. roztworu wodorotlenku amonu (o g´stoÊci ρ20 = 0,97 g/ml). Nast´pnie dodaje si´ 8,8 ml
roztworu octanu wapnia, uzupe∏nia wodà do 1 litra
i sprowadza pH do 4,75 za pomocà kwasu octowego. Z uwagi na to, ˝e (±)winian wapnia jest trudno
rozpuszczalny w takim roztworze, nale˝y dodaç
5 ml (±)winianu wapnia na litr, a nast´pnie po
12-godzinnym mieszaniu uzyskany roztwór przesàcza si´.
Wykonanie oznaczania
1) wino bez dodatku kwasu mezowinowego — do
zlewki na 600 ml odmierza si´ 500 ml roztworu
stràcajàcego i 10 ml wina. Ca∏oÊç miesza si´ i zapoczàtkowuje wytràcanie winianu wapnia przez
pocieranie Êcianek naczynia koƒcem szklanej bagietki. Ciecz pozostawia si´ w zlewce do wytràcenia na okres 12 godzin. Nast´pnie ciecz wraz z osadem przesàcza si´ przez zwa˝ony tygiel ze spiekiem szklanym nr 4, umieszczony na czystej kolbie
pró˝niowej. W celu przeniesienia ca∏oÊci osadu tygiel pop∏ukuje si´ uzyskanym przesàczem, czyli
tym, w którym zachodzi∏o wytràcanie winianu.
Uzyskany osad suszy si´ do sta∏ej masy w suszarce w temperaturze 70 °C i nast´pnie wa˝y;
2) wino, do którego dodano kwas mezowinowy lub
istnieje przypuszczenie, ˝e dodano do niego kwas
mezowinowy — wymaga si´, na wst´pie, przeprowadzenia hydrolizy tego kwasu. Hydroliz´ wykonuje si´, odmierzajàc do kolby sto˝kowej o pojemnoÊci 50 ml — 10 ml wina i 0,4 ml lodowatego kwasu octowego. Na kolbie zamocowuje si´ ch∏odnic´
zwrotnà, a zawartoÊç kolby gotuje si´ przez 30 minut. Po ostygni´ciu przenosi si´ roztwór do zlewki
o pojemnoÊci 600 ml. Kolb´ przemywa si´ dwukrotnie za pomocà 5 ml wody.
Obliczonà zawartoÊç kwasu mezowinowego
uwzgl´dnia si´ w koƒcowym wyniku oznaczenia jako kwas winowy.
Obliczanie wyniku oznaczania
Jedna czàsteczka (±)winianu wapnia odpowiada
po∏owie czàsteczki kwasu L(+)-winowego w winie.
1) iloÊç kwasu winowego na litr wina, wyra˝ana w miligramorównowa˝nikach kwasu winowego, wynosi: 384,5 x p,
gdzie p oznacza mas´ otrzymanego krystalicznego
(±)winianu wapnia.
WartoÊç ta podawana jest z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku;
2) iloÊç kwasu winowego na litr wina, wyra˝ana
w gramach kwasu winowego, wynosi: 28,84 x p,
gdzie p oznacza mas´ otrzymanego krystalicznego
(±)winianu wapnia.
WartoÊç ta podawana jest z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku;
3) iloÊç kwasu winowego na litr wina, wyra˝ana
w gramach soli potasowej kwasu winowego, wynosi: 36,15 x p,
gdzie p oznacza mas´ otrzymanego krystalicznego
(±)winianu wapnia.
WartoÊç ta podawana jest z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.
2. PORÓWNAWCZA ANALIZA MIARECZKOWA
Odczynniki
1) kwas chlorowodorowy (HCl) (1:5 v/v) (o g´stoÊci
ρ20 = 1,18 do 1,19 g/ml);
Poz. 1173
2) 0,05-molowy roztwór EDTA, sporzàdzony z 18,61 g
EDTA [sól dwusodowa kwasu etylenodwuaminoczterooctowego (C10H14N2O8Na2 · 2H2O)] i wody
destylowanej w iloÊci potrzebnej do otrzymania
1000 ml roztworu;
3) 40 % (m/v) roztwór wodorotlenku sodu, sporzàdzony z: 40 g wodorotlenku sodu (NaOH) i wody destylowanej w iloÊci potrzebnej do otrzymania
1000 ml roztworu;
4) wskaênik kompleksometryczny 1 % wagowo sporzàdzony z 1 g kwasu 2-hydroksy-1-(2-hydroksy-4-sulfo-1-naftylazo)-3-naftoesowego
(C21H14N14O7S · 3H2O) i 100 g bezwodnego siarczanu sodu (Na2SO4).
Wykonanie oznaczania
Uprzednio zwa˝ony tygiel ze spiekiem szklanym zawierajàcy osad (±)winianu wapnia umieszcza si´ na
kolbie pró˝niowej. Osad rozpuszcza si´ w 10 ml rozcieƒczonego kwasu solnego. Nast´pnie tygiel przemywa si´ 50 ml wody destylowanej. Po przemyciu osadu
dodaje si´ do tygla 5 ml roztworu wodorotlenku sodu
i oko∏o 30 mg wskaênika. Ca∏oÊç miareczkuje si´ roztworem EDTA.
Obliczanie wyniku oznaczania
1) zawartoÊç kwasu winowego w litrze wina, wyra˝anà w miligramorównowa˝nikach/l z dok∏adnoÊcià
do jednego miejsca po przecinku, oblicza si´ przez
pomno˝enie przez 5 iloÊci ml EDTA zu˝ytych do
miareczkowania;
2) iloÊç kwasu winowego na litr wina, wyra˝ana
w g kwasu winowego, równa si´: 0,375 x n, gdzie
n oznacza iloÊç ml EDTA zu˝ytych do miareczkowania.
WartoÊç ta jest podawana z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku;
3) iloÊç kwasu winowego na litr wina, wyra˝ana
w g winianu potasowego, równa si´: 0,470 x n,
gdzie n oznacza iloÊç ml EDTA zu˝ytych do miareczkowania.
WartoÊç ta jest podawana z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.
Za∏àcznik nr 17
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU CYTRYNOWEGO
Metoda jest oparta na enzymatycznej przemianie
kwasu cytrynowego (cytrynianu) w oksalooctan i octan
w reakcji katalizowanej przez liaz´ cytrynianowà (CL)
CL
cytrynian <——> szczawiooctan + octan
Oksalooctan ulega samorzutnej dekarboksylacji do
pirogronianu.
W obecnoÊci dehydrogenazy jab∏czanowej (MDH)
i dehydrogenazy mleczanowej (LDH) szczawiooctan
i pirogronian sà redukowane do L-jab∏czanu i L-mleczanu przez zredukowany dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH).
MDH
szczawiooctan + NADH + H+ <———> L-jab∏czan + NAD+
LDH
pirogronian + NADH + H+ <———> L-mleczan + NAD+
IloÊç NADH utlenionego do NAD+ w powy˝szej reakcji jest proporcjonalna do iloÊci cytrynianu w próbce. IloÊç utlenionego NADH jest oznaczana przez pomiar spadku absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm.
1. ODCZYNNIKI
1) Roztwór 1 — roztwór buforowy o pH 7,8 (0,51-molowy roztwór glicyloglicyny; pH 7,8; Zn2+) (oko∏o
6 x 10–3 M). Roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy
sposób: 7,13 g glicyloglicyny rozpuszcza si´ w oko∏o 70 ml wody redestylowanej, nast´pnie sprowadza pH do 7,8 za pomocà oko∏o 13 ml 5-molowego
roztworu wodorotlenku sodu, dodaje 10 ml roztworu chlorku cynku (ZnCl2, 80 mg w 100 ml H2O)
i uzupe∏nia do 100 ml wodà redestylowanà;
2) Roztwór 2 — roztwór zredukowanego dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) (oko∏o
6 x 10–3 M). Roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy
sposób: 30 mg NADH i 60 mg NaHCO3 rozpuszcza
si´ w 6 ml wody redestylowanej;
3) Roztwór 3 — roztwór dehydrogenazy jab∏czanowej
i dehydrogenazy mleczanowej (MDH/LDH 0,5 mg
MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml). Roztwór sporzàdza si´
w nast´pujàcy sposób: 0,1 ml roztworu MDH (5 mg
MDH/ml) miesza si´ z 0,4 ml roztworu siarczanu
amonu (3,2-molowego) i 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Zawiesina ta jest trwa∏a w temperaturze 4 °C przez co
najmniej rok od dnia sporzàdzenia;
4) Roztwór 4 — liaza cytrynianowa (CL, 5 mg bia∏ka/ml) sporzàdzona w nast´pujàcy sposób: 168 mg
liofilizatu rozpuszcza si´ w 1 ml wody lodowej.
Roztwór ten jest trwa∏y w temperaturze 4 °C przez
co najmniej tydzieƒ i przez co najmniej cztery tygodnie w stanie zamro˝enia od dnia sporzàdzenia.
Przed wykonaniem oznaczania sprawdza si´ aktywnoÊç enzymów;
5) poliwinylopolipirolidyna (PVPP).
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 340 nm, przy której NADH wykazuje maksimum absorpcji. Je˝eli spektrofotometr taki nie jest
dost´pny, mo˝na u˝yç spektrofotometru o êródle
widma nieciàg∏ego, umo˝liwiajàcego pomiar przy
334 lub 365 nm. Poniewa˝ w oznaczeniu wykorzystuje si´ wartoÊç bezwzgl´dnà absorbancji (nie wykorzystuje si´ krzywych wzorcowych, natomiast
przeprowadza si´ kalibracj´, uwzgl´dniajàc wspó∏czynnik ekstynkcji NADH), nale˝y sprawdziç skale
d∏ugoÊci fali i absorbancj´ widmowà aparatu;
2) kuwety szklane o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm lub
kuwety jednorazowego u˝ytku;
3) mikropipety do odmierzania obj´toÊci w zakresie
od 0,02 do 2 ml.
3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
1) o ile zawartoÊç kwasu cytrynowego wynosi poni˝ej 400 mg/l — oznaczanie cytrynianu przeprowadza si´ zwykle bezpoÊrednio, bez uprzedniego usuwania zwiàzków dajàcych zabarwienie i bez rozcieƒczania;
2) jeÊli zawartoÊç kwasu cytrynowego jest równa lub
wy˝sza ni˝ 400 mg/l, wino rozcieƒcza si´ do uzyskania zawartoÊci cytrynianu od 20 do 400 mg/l (zawartoÊç cytrynianu w badanej próbce wynosi od
5 do 80 µg);
3) w przypadku win czerwonych bogatych w zwiàzki
fenolowe wytràca si´ je za pomocà PVPP, post´pujàc w nast´pujàcy sposób: z oko∏o 0,2 g PVPP wytwarza si´ zawiesin´ w wodzie, którà nast´pnie odstawia si´ na 15 minut, po czym przesàcza przez sàczek karbowany. Wilgotnà PVPP wybranà z sàczka
za pomocà ∏opatki dodaje si´ do kolby sto˝kowej
na 50 ml zawierajàcej 10 ml wina. Ca∏oÊç wytrzàsa
si´ przez dwie do trzech minut i przesàcza.
4. WYKONANIE OZNACZANIA
Za pomocà spektrofotometru z d∏ugoÊcià fali ustawionà na 340 nm oznacza si´ absorbancj´ przy u˝yciu
1 cm kuwet i w stosunku do powietrza jako wzorca o zerowej absorbancji (próbka odniesienia), czyli bez kuwety w drodze optycznej. W 1 cm kuwetach umieszcza si´
Kuweta
odniesienia
(próba Êlepa)
(ml)
Roztwór 1
— 1,00
Roztwór 2
— 0,10
Badana próbka
— —
Woda redestylowana — 2,00
Roztwór 3
— 0,02
Kuweta
z badanà próbkà
(ml)
1,00
0,10
0,20
1,80
0,02
Ca∏oÊç miesza si´ i po oko∏o 5 minutach odczytuje
absorbancj´ roztworu odniesienia i roztworu badanej
próbki (A1).
Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia
Po odczytaniu absorbancji dodaje si´ Roztworu 4
w iloÊci 0,02 ml do kuwety odniesienia oraz 0,02 ml do
kuwety z badanà próbkà.
1) przy 334 nm — C = 488 × ∆A
(= 6,2 mmol–1 × 1 × cm–1);
Nast´pnie miesza si´, pozostawia do zakoƒczenia
reakcji (oko∏o 5 minut) i odczytuje absorbancj´ roztworu odniesienia i roztworu badanej próbki (A2).
Z uwagi na to, ˝e czas niezb´dny do ca∏kowitego
przebiegu reakcji enzymatycznej mo˝e byç ró˝ny dla
kolejnych serii oznaczeƒ, podany czas nale˝y traktowaç
jedynie jako orientacyjny czas trwania reakcji. W zwiàzku z tym oznacza si´ czas dla ka˝dej z serii.
5. WYRA˚ANIE WYNIKU
ZawartoÊç kwasu cytrynowego podaje
w mg/l w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej.
si´
Ogólny wzór obliczania zawartoÊci kwasu cytrynowego w mg/l jest nast´pujàcy
V×M
C = ————— × ∆A,
ε×d×v
gdzie
V
— oznacza obj´toÊç badanego roztworu w ml,
v
— oznacza obj´toÊç badanej próbki w ml,
M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji,
d
— oznacza d∏ugoÊç drogi optycznej kuwety w cm,
ε
— oznacza wspó∏czynnik absorbancji NADH (przy
340 nm ε = 6,3–1 x 1 × cm–1),
∆A — oznacza ró˝nic´ (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej
Wykorzystujàc powy˝sze dane, otrzymuje si´
C = 479 x ∆A.
2) przy 365 nm — C = 887 × ∆A
(= 3,4 mmol–1 × 1 × cm–1).
6. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania kwasu cytrynowego powtarzalnoÊç (r) wynosi
1) przy zawartoÊci kwasu
400 mg/l: r = 14 mg/l;
cytrynowego
poni˝ej
2) przy zawartoÊci kwasu cytrynowego powy˝ej
400 mg/l: r = 28 mg/l.
7. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania kwasu cytrynowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi
1) przy zawartoÊci kwasu
400 mg/l: R = 39 mg/l;
cytrynowego
poni˝ej
2) przy zawartoÊci kwasu cytrynowego powy˝ej
400 mg/l: R = 65 mg/l.
Za∏àcznik nr 18
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU MLEKOWEGO
Ca∏a iloÊç kwasu mlekowego (L-mleczan i D-mleczan) jest utleniana przez dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) do pirogronianu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenaz´ L-mleczanowà (L-LDH)
i dehydrogenaz´ D-mleczanowà (D-LDH).
Równowaga tej reakcji jest zwykle przesuni´ta
w stron´ mleczanu. Usuwanie pirogronianu z miesza-
niny reakcyjnej przesuwa równowag´ reakcji w stron´
tworzenia pirogronianu.
W obecnoÊci L-glutominianu pirogronian przechodzi w L-alanin´ w reakcji katalizowanej przez transaminaz´ glutaminowo-pirogronianowà (GPT). Nast´puje
to wed∏ug reakcji
L-LDH
(1) L-mleczan + NAD <————> pirogronian + NADH+ H+ lub
D-LDH
(2) D-mleczan + NAD <————> pirogronian + NADH + H+, lub
GPT
(3) Pirogronian + L-glutaminian <————> L-alanina + α-ketoglutaran.
IloÊç powstajàcego NADH, mierzona przez wzrost absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm, jest proporcjonalna do iloÊci mleczanu obecnego w próbce.
Mo˝liwe jest wykonanie oznaczania kwasu L-mlekowego niezale˝nie przy wykorzystaniu reakcji (1) i (3),
a kwasu D-mlekowego analogicznie za pomocà reakcji (2) i (3).
1. ODCZYNNIKI
1) Roztwór 1 — roztwór buforowy, pH 10 (0,6 mola/l glicyloglicyny; 0,1 mola/l L-glutaminianu). Roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy sposób —
4,75 g glicyloglicyny i 0,88 g kwasu L-glutaminowego rozpuszcza si´ w oko∏o 50 ml wody redestylowanej, sprowadza si´ pH do 10 za pomocà kilku
mililitrów 10-molowego roztworu wodorotlenku
sodu i uzupe∏nia do 60 ml wodà redestylowanà.
Roztwór ten jest trwa∏y przez co najmniej 12 miesi´cy w temperaturze 4 °C;
2) Roztwór 2 — roztwór dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD), o st´˝eniu oko∏o 40 x 10–3 mola.
Roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy sposób —
900 mg NAD rozpuszcza si´ w 30 ml wody redestylowanej. Roztwór ten jest trwa∏y przez co najmniej
4 tygodnie w temperaturze 4 °C;
3) Roztwór 3 — zawiesina transaminazy glutaminowo-pirogronianowej (GPT), 20 mg/l. Zawiesina ta
jest trwa∏a przez co najmniej rok w temperaturze 4 °C;
4) Roztwór 4 — zawiesina dehydrogenazy L-mleczanowej (L-LDH), 5 mg/ml. Zawiesina ta jest trwa∏a
przez co najmniej rok w temperaturze 4 °C;
5) Roztwór 5 — zawiesina dehydrogenazy D-mleczanowej (D-LDH), 5 mg/ml. Zawiesina ta jest trwa∏a
przez co najmniej rok w temperaturze 4 °C.
Zaleca si´ sprawdzenie aktywnoÊci enzymów
przed wykonaniem oznaczania.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 340 nm, przy której NADH wykazuje maksimum absorpcji. Dopuszcza si´ tak˝e u˝ycie spektrofotometru o êródle widma nieciàg∏ego, umo˝liwiajàcego pomiar przy 334 lub 365 nm;
2) kuwety szklane o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm lub
kuwety jednorazowego u˝ytku;
3) mikropipety do odmierzania obj´toÊci w zakresie
od 0,02 do 2 ml.
3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Zasada przygotowania próbki jest nast´pujàca
1) gdy zawartoÊç kwasu mlekowego wynosi poni˝ej
100 mg/l. Oznaczanie kwasu mlekowego przeprowadza si´ dla wina, bez uprzedniego usuwania
zwiàzków barwnych oraz bez rozcieƒczania;
2) gdy zawartoÊç kwasu mlekowego jest zawarta pomi´dzy
a) 100 mg/l a 1 g/l — wino rozcieƒcza si´ wodà redestylowanà w stosunku 1:10,
b) 1 g/l a 2,5 g/l — wino rozcieƒcza si´ wodà redestylowanà w stosunku 1:25,
c) 2,5 g/l a 5 g/l — wino rozcieƒcza si´ wodà redestylowanà w stosunku 1:50.
Z uwagi na mo˝liwoÊç wprowadzenia kwasu L-mlekowego, którego obecnoÊç spowoduje uzyskanie b∏´dnego wyniku, jest zabronione dotykanie palcami jakiejkolwiek z tych cz´Êci u˝ywanego szk∏a, które mogà
mieç kontakt z mieszaninà reakcyjnà.
4. WYKONANIE OZNACZANIA
Oznaczanie kwasu mlekowego ogó∏em
Po sprawdzeniu, czy temperatura roztworu buforowego przed przystàpieniem do oznaczania mieÊci si´
w granicach od 20 do 25 °C, ustawia si´ d∏ugoÊç fali
w spektrofotometrze na 340 nm. Do oznaczania absorbancji stosuje si´ kuwety o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm.
W kuwetach umieszcza si´
Kuweta
odniesienia
(próba Êlepa)
(ml)
— 8352 —
Kuweta
z badanà próbkà
Roztwór 1
— 1,00
Roztwór 2
— 0,20
Woda redestylowana — 1,00
Roztwór 3
— 0,02
Badana próbka
— —
(ml)
1,00
0,20
0,80
0,02
0,20
ZawartoÊç kuwet miesza si´ mieszad∏em szklanym
lub pr´tem z materia∏u syntetycznego ze sp∏aszczonym
koƒcem. Nast´pnie po oko∏o 5 minutach mierzy si´ absorbancj´ roztworów w kuwecie z próbkà odniesienia
oraz w kuwecie z badanà próbkà (A1).
Po zmierzeniu absorbancji do kuwety odniesienia
oraz kuwety z badanà próbkà dodaje si´ 0,02 ml Roztworu 4 oraz 0,05 ml Roztworu 5. Nast´pnie dok∏adnie
miesza si´, pozostawia do zakoƒczenia reakcji (na oko∏o 30 minut) i mierzy absorbancj´ roztworów w kuwetach z próbkà odniesienia i z badanà próbkà (A2).
Oznaczanie kwasu L-mlekowego i D-mlekowego
Mo˝liwe jest niezale˝ne prowadzenie oznaczania
kwasu L-mlekowego i D-mlekowego przy zastosowaniu metody oznaczania kwasu mlekowego ogó∏em do
momentu wyznaczenia wartoÊci A1. Przy czym po
zmierzeniu absorbancji A1 dodaje si´ po 0,02 ml Roztworu 4, nast´pnie dok∏adnie miesza si´ i pozostawia
substancje do zakoƒczenia reakcji. Czas ten wynosi
oko∏o 20 minut. Nast´pnie mierzy si´ absorbancj´
w kuwetach zawierajàcych próbk´ odniesienia i próbk´ badanà (A2). Po dokonaniu pomiaru absorbancji A2
dodaje si´ 0,02 ml Roztworu 5, dok∏adnie miesza si´,
ponownie pozostawia si´ substancj´ do zakoƒczenia
reakcji. Czas ten wynosi oko∏o 30 minut. Nast´pnie
mierzy si´ absorbancj´ w kuwetach zawierajàcych
próbk´ odniesienia i próbk´ badanà (A3).
Z uwagi na to, ˝e czas trwania reakcji enzymatycznej mo˝e ró˝niç si´ dla kolejnych serii oznaczaƒ, podane czasy trwania reakcji sà przyk∏adowe. Zaleca si´
oznaczanie faktycznego czasu dla ka˝dej z serii. Przy
oznaczaniu wy∏àcznie kwasu L-mlekowego czas inkubacji mo˝na skróciç do 10 minut.
5. WYRA˚ANIE WYNIKU
ZawartoÊç kwasu mlekowego podaje si´ w g/l,
z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku. Obliczanie zawartoÊci kwasu mlekowego wykonuje si´ wed∏ug wzoru
VxM
C = ———————— x ∆A,
ε x d x v x 1000
gdzie
V — oznacza obj´toÊç badanego roztworu w ml
(V = 2,24 ml dla kwasu L-mlekowego,
V = 2,29 dla kwasu D-mlekowego i kwasu mlekowego ogó∏em),
v — oznacza obj´toÊç badanej próbki w ml,
M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji,
d — oznacza d∏ugoÊç drogi optycznej kuwety w cm,
Poz. 1173
ε — oznacza
wspó∏czynnik
absorpcji
NADH
(w 340 nm, ε = 6,3 mmol–1 x cm–1),
∆A = (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej w przypadku
kwasu mlekowego ogó∏em,
∆A = (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej w przypadku
kwasu L-mlekowego,
∆A = (A3 — A2)próbki — (A3 — A2)próby Êlepej w przypadku
kwasu D-mlekowego.
ZawartoÊç kwasu mlekowego ogó∏em i kwasu
D-mlekowego oblicza si´ wed∏ug wzoru
C = 0,164 x ∆A
Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowania do oznaczania, wynik nale˝y pomno˝yç przez
wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
Pomiar w 334 nm: C = 0,167 x ∆A (ε = 6,2 mmol–1 x 1
x cm–1)
Pomiar w 365 nm: C = 0,303 x ∆A (ε = 3,4 mmol–1 x 1
x cm–1)
ZawartoÊç kwasu mlekowego i kwasu L-mlekowego oblicza si´ wed∏ug wzoru
C = 0,160 x ∆A
Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowania do oznaczania, wynik nale˝y pomno˝yç
przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
Pomiar w 334 nm: C = 0,163 x ∆A (ε = 6,2 mmol–1 x 1
x cm–1)
Pomiar w 365 nm: C = 0,297 x ∆A (ε = 3,4 mmol–1 x 1
x cm–1)
6. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania kwasu mlekowego powtarzalnoÊç (r) wynosi
r = 0,02 + 0,07 xi g/l
xi — oznacza zawartoÊç kwasu mlekowego w próbce
w g/l.
7. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania kwasu mlekowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi
R = 0,05 + 0,125 xi g/l
xi — oznacza zawartoÊç kwasu mlekowego w próbce
w g/l.
Za∏àcznik nr 19
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU L-JAB¸KOWEGO
Kwas L-jab∏kowy (L-jab∏czan) jest utleniany przez
dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) do
szczawiooctanu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenaz´ L-jab∏czanowà (L-DH). Równowaga tej reakcji
jest zwykle wyraênie przesuni´ta w stron´ jab∏czanu.
Usuwanie szczawiooctanu z mieszaniny reakcyjnej
przesuwa równowag´ reakcji w stron´ tworzenia
szczawiooctanu. W obecnoÊci L-glutaminianu szczawiooctan przechodzi w L-asparaginian w reakcji katalizowanej przez transaminaz´ glutaminianowo-szczawiooctanowà (GOT)
L–MDH
(1) L-jab∏czan + NAD <————> szczawiooctan + NADH + H+ lub
GOT
(2) szczawiooctan + L-glutaminian <———> L-asparaginian + α-ketoglutaran.
GPT
IloÊç powstajàcego NADH, mierzona przez wzrost absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm, jest proporcjonalna do iloÊci L-jab∏czanu obecnego w próbce.
1. ODCZYNNIKI
1) Roztwór 1 — roztwór buforowy, pH 10 (glicylogilcyna 0,6 M; L-glutaminian 0,1-molowy) sporzàdza
si´ w nast´pujàcy sposób — 4,75 g glicyloglicyny
i 0,88 g kwasu L-glutaminowego rozpuszcza si´
w oko∏o 50 ml wody redestylowanej, nast´pnie
sprowadza si´ pH do 10 za pomocà oko∏o 4,6 ml
dziesi´ciomolowego wodorotlenku sodu i uzupe∏nia do 60 ml wodà redestylowanà. Roztwór ten jest
trwa∏y przez co najmniej 12 tygodni w temperaturze 4 °C;
2) Roztwór 2 — roztwór dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD), oko∏o 47 x 10- 3 mola, który
sporzàdza si´ w nast´pujàcy sposób — 420 mg
NAD rozpuszcza si´ w 12 ml wody redestylowanej.
Roztwór ten jest trwa∏y przez co najmniej 4 tygodnie w temperaturze 4 °C;
3) Roztwór 3 — zawiesina transaminazy glutaminianowo-szczawiooctanowej (GOT), 2 mg/ml;
4) Roztwór 4 — roztwór dehydrogenazy L-jab∏czanowej (L-MDH), 5 mg/ml.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 340 nm, w której NADH wykazuje maksimum absorpcji albo spektrofotometr o êródle widma nieciàg∏ego, umo˝liwiajàcy pomiar przy 334
lub 365 nm;
2) kuwety szklane o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm lub
kuwety jednorazowego u˝ytku;
2) je˝eli zawartoÊç kwasu L-jab∏kowego oznaczana
przy 365 nm jest wy˝sza ni˝ 350 mg/l (zawartoÊç
L-jab∏czanu w badanym roztworze wynosi od 3 do
35 µg), próbk´ rozcieƒcza si´ wodà redestylowanà
do uzyskania zawartoÊci L-jab∏czanu od 30 do
350 mg/l;
3) je˝eli zawartoÊç jab∏czanu w winie wynosi mniej
ni˝ 30 mg/l, obj´toÊç próbki testowej mo˝na zwi´kszyç do 1 ml, a iloÊç dodawanej wody zmniejsza si´
w ten sposób, aby ca∏kowita obj´toÊç roztworu
w obu kuwetach by∏a jednakowa.
4. WYKONANIE OZNACZANIA
Absorbancj´ oznacza si´ za pomocà spektrofotometru z d∏ugoÊcià fali ustawionà na 340 nm przy u˝yciu kuwet o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm w stosunku
do wzorca — powietrza o zerowej absorbancji (próbka
odniesienia) bez kuwety na drodze Êwiat∏a lub w stosunku do wody.
W kuwetach o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm
umieszcza si´
Kuweta
odniesienia
(próba Êlepa)
(ml)
Roztwór 1
— 1,00
Roztwór 2
— 0,10
Woda redestylowana — 1,00
Roztwór 3
— 0,01
Badana próbka
— —
Kuweta
z badanà próbkà
(ml)
1,00
0,10
0,90
0,01
0,20
3) mikropipety do odmierzania obj´toÊci w zakresie
0,02 do 2 ml.
ZawartoÊç kuwet miesza si´, pozostawia na oko∏o
3 minuty, odczytuje absorbancj´ roztworów w kuwecie
z próbkà odniesienia i w kuwecie z badanà próbkà (A1).
3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Po odczytaniu absorbancji dodaje si´ Roztwór 4
w iloÊci po 0,01 ml do kuwety odniesienia oraz kuwety
z badanà próbkà. Nast´pnie miesza si´, pozostawia do
zakoƒczenia reakcji (oko∏o 5 do 10 minut) i odczytuje
absorbancj´ roztworów w kuwecie z próbkà odniesienia i w kuwecie z badanà próbkà (A2).
1) je˝eli zawartoÊç kwasu L-jab∏kowego oznaczana
przy 365 nm wynosi poni˝ej 350 mg/l, oznaczanie
jab∏czanu przeprowadza si´ zwykle bezpoÊrednio,
bez uprzedniego usuwania zwiàzków barwnych
i bez rozcieƒczania;
Z uwagi na to, ˝e czas trwania reakcji enzymatycznej mo˝e ró˝niç si´ dla kolejnych serii oznaczeƒ, podane powy˝ej czasy trwania reakcji sà przyk∏adowe. Zaleca si´ oznaczanie faktycznego czasu dla ka˝dej z serii.
5. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
ZawartoÊç kwasu L-jab∏kowego podaje si´
w g/l z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.
ZawartoÊç kwasu cytrynowego (C) oblicza si´ wed∏ug
wzoru
V×M
C = ————————— × ∆A,
ε × d × v × 1000
Poz. 1173
6. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania kwasu L-jab∏kowego powtarzalnoÊç (r) wynosi
r = 0,03 + 0,034 xi
xi — oznacza st´˝enie kwasu jab∏kowego w próbce
w g/l.
gdzie
V — oznacza obj´toÊç badanego roztworu w ml,
v — oznacza obj´toÊç badanej próbki w ml,
M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji (dla kwasu L-jab∏kowego M = 134,09),
7. ODTWARZALNOÂå METODY
d — oznacza d∏ugoÊç drogi optycznej kuwety w cm,
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
ε — oznacza wspó∏czynnik absorbancji NADH (przy
340 nm ε = 6,3 mmola–1 x 1 x cm–1),
∆A = (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej
Wykorzystujàc powy˝sze dane, otrzymuje si´
C = 0,473 × ∆A g/l.
Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia
1) przy pomiarze w 334 nm — C = 0,482 × ∆A;
2) przy pomiarze w 365 nm — C = 0,876 × ∆A.
W przypadku oznaczania kwasu L-jab∏kowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi
R = 0,05 + 0,071 xi
xi — oznacza st´˝enie kwasu jab∏kowego w próbce
w g/l.
Za∏àcznik nr 20
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU D-JAB¸KOWEGO
Kwas D-jab∏kowy (D-jab∏czan) jest utleniany przez
dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) do
szczawiooctanu w obecnoÊci dehydrogenazy D-jab∏-
czanowej (D-MDH). Powstajàcy szczawiooctan ulega
rozpadowi do pirogronianu i dwutlenku w´gla.
D-MDH
D-jab∏czan + NAD+ <————> pirogronian + CO2 + NADH + H+
IloÊç powstajàcego NADH jest proporcjonalna do iloÊci kwasu D-jab∏kowego i jest mierzona przy d∏ugoÊci
fali 334, 340 lub 365 nm.
1. ODCZYNNIKI
3) Roztwór 3 — zliofilizowana D-MDH.
Zestaw testowy na oko∏o 30 oznaczeƒ sk∏adajàcy si´ z
Przygotowanie roztworów
1) Roztwór 1 — oko∏o 30 ml roztworu, sk∏adajàcego
si´ z buforu Hepesa [kwas 4-(2-hydroksylo)-1-piperazynoetanolosulfonowy] o pH = 9,0 i stabilizatorów;
1) Roztworu 1 u˝ywa si´ bez rozcieƒczania, przed u˝yciem nale˝y doprowadziç temperatur´ roztworu
do 20—25 °C;
2) Roztwór 2 — oko∏o 210 mg zliofilizowanego NAD;
2) Roztwór 2 rozpuszcza si´ w 4 ml wody redestylowanej;
3) Roztwór 3 rozpuszcza si´ w 0,6 ml wody redestylowanej, przed u˝yciem tego roztworu nale˝y doprowadziç jego temperatur´ od 20 do 25 °C.
Trwa∏oÊç roztworów
1) Roztwór 1 jest trwa∏y przez co najmniej rok, je˝eli
jest przechowywany w temperaturze 4 °C;
2) Roztwór 2 jest trwa∏y przez 3 tygodnie, je˝eli jest
przechowywany w temperaturze 4 °C, i przez dwa
miesiàce, je˝eli jest przechowywany w temperaturze minus 20 °C;
3) Roztwór 3 jest trwa∏y przez 5 dni, je˝eli jest przechowywany w temperaturze 4 °C.
2. APARATURA
1) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 340 nm, przy której NADH i NADPH wykazujà maksimum absorpcji, lub spektrofotometr
o êródle widma nieciàg∏ego, umo˝liwiajàcego pomiar przy 334 lub 365 nm;
Poz. 1173
2) kuwety szklane o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm lub
kuwety jednorazowe;
3) mikropipety dostosowane do odmierzania obj´toÊci od 0,01 do 2 ml.
3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Przygotowanie próbki do analizy wykonuje si´
zgodnie z nast´pujàcymi zasadami
1) oznaczanie kwasu D-jab∏kowego wykonywane jest
bezpoÊrednio w winie bez potrzeby wczeÊniejszego odbarwiania;
2) oznaczanie kwasu D-jab∏kowego przeprowadza si´
zwykle bezpoÊrednio w winie, bez uprzedniego rozcieƒczania, o ile iloÊç kwasu D-jab∏kowego w kuwetach ma wynosiç od 2 mg do 50 g. W tym celu wino
nale˝y rozcieƒczyç, uzyskujàc st´˝enie kwasu
D-jab∏kowego odpowiednio od 0,02 do 0,5 g/l lub od
0,02 do 0,3 g/l (w zale˝noÊci od u˝ytego aparatu).
Rozcieƒczanie wina wykonuje si´ zgodnie z danymi
w tabeli rozcieƒczeƒ
Spodziewana iloÊç kwasu D-jab∏kowego/litr
Pomiar wykonywany przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej
340 lub 334 nm
365 nm
< 0,3 g
0,3 — 3,0 g
< 0,5 g
0,5 — 5,0 g
4. WYKONANIE OZNACZANIA
Za pomocà spektrofotometru z d∏ugoÊcià fali ustawionà na 340 nm oznacza si´ absorbancj´ przy u˝yciu
1 cm kuwet i w stosunku do powietrza jako wzorca o zerowej absorbancji (próbka odniesienia), czyli bez kuwety w drodze optycznej.
Do kuwet odmierza si´
Kuweta
Kuweta
odniesienia z badanà próbkà
(próba Êlepa)
(ml)
(ml)
Roztwór 1
Roztwór 2
Woda redestylowana
Roztwór badanej próbki
— 1,00
— 0,10
— 1,80
— —
1,00
0,10
1,70
0,10
ZawartoÊç kuwet miesza si´ i odczytuje absorbancj´ próby Êlepej i próbki badanej (A1) po oko∏o 6 minutach. Nast´pnie dodaje si´ do kuwety odniesienia i kuwety z badanà próbkà 0,05 ml Roztworu 3. Po wymieszaniu pozostawia si´ do zakoƒczenia reakcji (oko∏o
20 minut) i odczytuje absorbancj´ próby Êlepej i próbki badanej (A2).
Czas niezb´dny do przeprowadzenia reakcji enzymatycznej mo˝e byç ró˝ny dla poszczególnych serii
Roztwór wodny
Roztwór czynnika F
—
1+9
1
10
oznaczeƒ. Podany wy˝ej czas reakcji jest przyk∏adowy.
Czas reakcji okreÊla si´ dla ka˝dej serii oznaczeƒ.
Kwas D-jab∏kowy reaguje bardzo gwa∏townie. Enzym przekszta∏ca równie˝ kwas L-winowy, ale o wiele
wolniej. To t∏umaczy wyst´powanie „reakcji pe∏zajàcych”, które mogà byç korygowane w drodze ekstrapolacji.
Zalecany sposób post´powania w przypadku „reakcji
pe∏zajàcych”
„Reakcje pe∏zajàce” sà spowodowane g∏ównie reakcjami ubocznymi enzymu, obecnoÊcià innych enzymów w matrycy próbki badanej lub interakcjà jednego
sk∏adnika lub wi´cej sk∏adników matrycy z czynnikami
towarzyszàcymi reakcji enzymatycznej.
Gdy reakcja przebiega normalnie, absorbancja
osiàga wartoÊç sta∏à po czasie zale˝nym od pr´dkoÊci
okreÊlonej reakcji enzymatycznej, zazwyczaj po 10 do
20 minutach.
W przypadku gdy zachodzà reakcje uboczne, absorbancja nie osiàga sta∏ej wartoÊci, lecz stale roÊnie
w czasie, co okreÊla si´ mianem „reakcji pe∏zajàcej”.
Je˝eli zjawisko to wyst´puje w czasie analizy, pomiar powinien byç wykonywany w regularnych odst´-
pach (co 2 do 5 minut), po czasie wymaganym dla osiàgni´cia ostatecznej absorbancji roztworu standardowego. Przeprowadza si´ 5 lub 6 odczytów, jeÊli absorbancja roÊnie ze sta∏à pr´dkoÊcià, a nast´pnie ekstra-
poluje graficznie lub matematycznie wartoÊç absorbancji, jakà mia∏by roztwór w momencie ostatniego
dodania enzymu (T 0). Ró˝nic´ absorbancji (Af—Ai)
wykorzystaç do obliczenia st´˝enia substratu.
5. OBLICZANIE WYNIKU
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
ZawartoÊç kwasu D-jab∏kowego (C) w mg/l oblicza
si´ wed∏ug wzoru
V × PM
C =—————— × ∆A
ε×d×v
W przypadku oznaczania kwasu D-jab∏kowego powtarzalnoÊç (r) wynosi
gdzie
r = 11 mg/l.
V
— oznacza obj´toÊç koƒcowà w ml (2,95 ml),
v
— oznacza obj´toÊç badanej próbki w ml (0,1 ml),
PM — oznacza ci´˝ar czàsteczkowy oznaczanej substancji (dla kwasu D-jab∏kowego PM = 134,09),
d
— oznacza d∏ugoÊç drogi optycznej kuwety w cm
∆A = (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej
ε
— oznacza wspó∏czynnik absorbancji NADH, który przy
a) 340 nm wynosi (6,3 milimola–1 x 1 x cm–1),
b) 365 nm wynosi (3,4 milimola–1 x 1 x cm–1),
c) 334 nm wynosi (6,18 milimola–1 x 1 x cm–1).
Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
ZawartoÊç kwasu D-jab∏kowego
w mg/l z dok∏adnoÊcià do jednoÊci.
podaje
si´
6. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
7. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania kwasu D-jab∏kowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi
R = 20 mg/l.
8. UWAGI
Z uwagi na stopieƒ dok∏adnoÊci metody, jeÊli uzyskana zawartoÊç kwasu D-jab∏kowego wyniesie poni˝ej
50 mg/l, uzyskany wynik powinien zostaç dodatkowo
potwierdzony przy u˝yciu innej metody analitycznej.
W celu unikni´cia mo˝liwoÊci zatrzymania aktywnoÊci enzymatycznej przez polifenole zawartoÊç próbki wina w kuwecie nie powinna przekraczaç 0,1 ml.
Za∏àcznik nr 21
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU JAB¸KOWEGO OGÓ¸EM
Kwas jab∏kowy, rozdzielony metodà chromatografii anionowymiennej, jest oznaczany kolorymetrycznie
w eluacie, przez pomiar barwy ˝ó∏tej, tworzàcej si´
w reakcji z kwasem chromotropowym w obecnoÊci
st´˝onego kwasu siarkowego. Poprawka na obecnoÊç
substancji przeszkadzajàcych jest dokonywana przez
odj´cie absorbancji uzyskanej w reakcji prowadzonej
z 86 % kwasem siarkowym i kwasem chromotropowym (kwas jab∏kowy nie reaguje przy takim st´˝eniu
kwasu) od absorbancji uzyskanej przy u˝yciu kwasu
siarkowego o st´˝eniu 96 %.
1. APARATURA I SPRZ¢T
1) kolumna szklana o d∏ugoÊci oko∏o 250 mm i Êrednicy wewn´trznej 35 mm, wyposa˝ona w kran spustowy;
2) kolumna szklana o d∏ugoÊci oko∏o 300 mm i Êrednicy wewn´trznej od 10 do 11 mm, wyposa˝ona
w kran spustowy;
miennej. Poziom cieczy powinien znajdowaç si´
50 mm ponad warstwà ˝ywicy. Nast´pnie kolumn´
przemywa si´ 1000 ml wody destylowanej i roztworem
wodorotlenku sodu, który sàczy si´ do chwili, gdy górny poziom cieczy w kolumnie znajdzie si´ 2 do 3 mm
nad warstwà ˝ywicy. Przemywanie roztworem wodorotlenku sodu powtarza si´ dwukrotnie. Nast´pnie kolumn´ pozostawia si´ na godzin´, po czym ponownie
przemywa si´ za pomocà 1000 ml wody destylowanej.
Tak przygotowanà kolumn´ zalewa si´ kwasem octowym o st´˝eniu 30 % wagowych, który sàczy si´ do
chwili, gdy górny poziom cieczy w kolumnie znajdzie
si´ 2 do 3 mm nad warstwà ˝ywicy. Przemywanie kwasem octowym wykonuje si´ dwukrotnie. Przed u˝yciem
kolumn´ pozostawia si´ na co najmniej 24 godziny. Do
rozpocz´cia nast´pnej analizy pozostawia si´ kolumn´
zalanà kwasem octowym o st´˝eniu 30 % wagowych.
Przygotowanie kolumny z ˝ywicà jonowymiennà
2. ODCZYNNIKI
Na dnie kolumny (o Êrednicy 11 mm i wysokoÊci
300 mm), nad kranem, umieszcza si´ zatyczk´ z waty
bawe∏nianej. Nast´pnie wlewa si´ zawiesin´ ˝ywicy jonowymiennej do wysokoÊci 10 cm. Po czym otwiera si´
kran i powoli spuszcza roztwór kwasu octowego do
chwili, gdy górny poziom cieczy w kolumnie znajdzie
si´ 2 do 3 mm nad warstwà ˝ywicy. Nast´pnie kolumn´
przemywa si´ 50 ml porcjami 0,5 % kwasu octowego.
1) silnie zasadowa ˝ywica jonowymienna;
Rozdzia∏ kwasu DL-jab∏kowego
3) ∏aênia wodna z termostatem, o temperaturze
100 °C;
4) spektrofotometr ustawiony na wykonywanie pomiaru przy 420 nm, z kuwetami o d∏ugoÊci drogi
optycznej 1 cm.
2) 5 % (m/v) roztwór wodorotlenku sodu;
3) 30 % (m/v) roztwór kwasu octowego;
4) 0,5 % (m/v) roztwór kwasu octowego;
5) 10 % (m/v) roztwór siarczanu sodu;
6) kwas siarkowy o st´˝eniu od 95 % do 97 % wagowo;
7) kwas siarkowy o st´˝eniu 86 % wagowo;
8) 5 % (m/v) roztwór kwasu chromotropowego.
Przed ka˝dym oznaczaniem przygotowuje si´ Êwie˝y roztwór przez rozpuszczenie 500 mg chromotropianu sodu (C10H6Na2O8 S2⋅2H20) w 10 ml wody
destylowanej;
9) roztwór kwasu DL-jab∏kowego, 0,5 g/l, sporzàdzony
przez rozpuszczenie 250 g kwasu jab∏kowego
(C4H6O5) w 10 % roztworze siarczanu sodu i uzupe∏nienie do 500 ml 10% roztworem siarczanu sodu.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Przygotowanie ˝ywicy jonowymiennej
Zatyczk´ z waty bawe∏nianej nasàczonej wodà destylowanà umieszcza si´ na dnie kolumny szklanej
(o Êrednicy 35 mm i wysokoÊci 250 mm) nad kranem.
Do tej kolumny wlewa si´ zawiesin´ ˝ywicy jonowy-
Do kolumny wlewa si´ 10 ml wina lub moszczu.
Próbk´ sàczy si´ przez kolumn´ z takà pr´dkoÊcià, aby
z kolumny wyp∏ywa∏y pojedyncze krople (Êrednia pr´dkoÊç: kropla na sekund´), i zamyka kran w chwili, gdy
górny poziom cieczy znajdzie si´ 2 do 3 mm nad warstwà ˝ywicy. Nast´pnie kolumn´ przemywa si´ za pomocà 50 ml 0,5 % kwasu octowego i 50 ml wody destylowanej, po czym ciecz sàczy si´ przez kolumn´ do
chwili, gdy górny poziom cieczy znajdzie si´ 2 do 3 mm
nad warstwà ˝ywicy.
Kwasy zaabsorbowane przez ˝ywic´ jonowymiennà eluuje si´ roztworem siarczanu sodu. Eluat zbiera
si´ w kolbie miarowej na 100 ml.
Po skoƒczonym rozdziale kolumn´ regeneruje si´.
Oznaczanie kwasu jab∏kowego
Dwie próbówki, z szyjkà szerokà, o pojemnoÊci
30 ml (i z doszlifowanym korkiem) oznacza si´ jako
A i B. Do ka˝dej z nich wprowadza si´ 1 ml eluatu
i 1 ml kwasu chromotropowego. Nast´pnie dodaje si´
1) do próbówki A (próbka odniesienia) — 10 ml kwasu siarkowego o st´˝eniu 86 % wagowo;
2) do próbówki B (próbka badana) — 10 ml kwasu
siarkowego o st´˝eniu 96 % wagowo.
Próbówki zamyka si´ korkiem i miesza przez wytrzàsanie, uwa˝ajàc, aby nie zamoczyç korka. Nast´pnie próbówki zanurza si´ we wrzàcej ∏aêni wodnej na
10 minut, po czym och∏adza si´ je w ciemnoÊci w temperaturze 20 °C przez 90 minut. Natychmiast mierzy si´
absorbancj´ badanej próbki w stosunku do próbki odniesienia przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 420 nm w kuwetach o d∏ugoÊci drogi optycznej wynoszàcej 1 cm.
Sporzàdzanie roboczych roztworów wzorcowych
Do czterech kolb miarowych o pojemnoÊci 50 ml
odmierza si´ pipetà odpowiednio 5; 10; 15 i 20 ml roztworu kwasu jab∏kowego. Kolby uzupe∏nia si´ do 50 ml
roztworem siarczanu sodowego. Uzyskane robocze
roztwory wzorcowe odpowiadajà eluatom otrzymanym z wina zawierajàcego odpowiednio 0,5; 1,0; 1,5
i 2,0 g/l kwasu jab∏kowego.
WykreÊlanie krzywej wzorcowej
Do próbówek, z szyjkà szerokà i z doszlifowanym
korkiem, o pojemnoÊci 30 ml, wprowadza si´ po 1 ml
roboczego roztworu wzorcowego i 1 ml kwasu chromotropowego. Nast´pnie dodaje si´ 10 ml kwasu siarkowego (96 %). Próbówki zamyka si´ korkiem i miesza
przez wytrzàsanie, uwa˝ajàc, aby nie zamoczyç korka.
Nast´pnie próbówki zanurza si´ we wrzàcej ∏aêni wodnej na 10 minut, po czym och∏adza si´ je w ciemnoÊci
w temperaturze 20 °C przez 90 minut. Natychmiast
mierzy si´ absorbancj´ badanej próbki w stosunku do
próbki odniesienia (1 ml eluatu, 1 ml kwasu chromotropowego i 10 ml kwasu siarkowego 86 %) przy d∏ugoÊci
fali Êwietlnej 420 nm w kuwetach o d∏ugoÊci drogi
optycznej wynoszàcej 1 cm.
Nast´pnie sporzàdza si´ krzywà wzorcowà w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza wartoÊç absorbancji,
c — oznacza st´˝enie kwasu jab∏kowego w roboczych
roztworach wzorcowych w g/l. Wykres absorbancji ma
Poz. 1173
postaç linii prostej przechodzàcej przez poczàtek uk∏adu wspó∏rz´dnych.
4. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA
ZawartoÊç kwasu jab∏kowego w eluacie w g/l odczytuje si´, wykorzystujàc krzywà wzorcowà dla zmierzonej wartoÊci absorbancji, a wynik podaje si´ z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.
5. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania kwasu jab∏kowego powtarzalnoÊç (r) wynosi
1) dla zawartoÊci kwasu jab∏kowego mniejszej ni˝
2 g/l: r = 0,1 g/l;
2) dla zawartoÊci kwasu jab∏kowego wi´kszej ni˝ 2 g/l
r = 0,2 g/l.
6. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania kwasu jab∏kowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi
R = 0,3 g/l.
Za∏àcznik nr 22
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU SORBOWEGO
Metoda spektrofotometrii absorpcyjnej
w nadfiolecie
1. ODCZYNNIKI
Kwas sorbowy (kwas trans, trans, 2,4-heksadienowy), wydzielony metodà destylacji z parà wodnà, oznacza si´ w destylacie wina metodà spektrofotometrii
w nadfiolecie. Substancje, które zak∏ócajà pomiar
w nadfiolecie, usuwa si´ przez odparowanie do sucha
z zastosowaniem lekko alkalicznego wodorotlenku
wapnia. Przy stwierdzeniu w badanej próbce zawartoÊci kwasu sorbowego w iloÊci poni˝ej 20 mg/l przeprowadza si´ dla potwierdzenia wyniku chromatografi´
cienkowarstwowà.
2) roztwór 0,02-molowy wodorotlenku wapnia [Ca(OH)2];
1) krystaliczny kwas winowy (C4H6O6);
3) wzorcowy roztwór kwasu sorbowego (20 mg/l) sporzàdza si´, odwa˝ajàc: 20 mg kwasu sorbowego
(C6H8O2), który rozpuszcza si´ w oko∏o 2 ml 0,1-molowego roztworu wodorotlenku sodu, nast´pnie rozwór przenosi si´ do kolby miarowej o pojemnoÊci
1000 ml i uzupe∏nia wodà do 1000 ml albo rozpuszcza
si´ 26,8 mg sorbinianu potasu (C6H7KO2) w wodzie
i uzupe∏nia si´ wodà do uzyskania obj´toÊci 1 litra.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) zestaw do destylacji z parà wodnà, sk∏adajàcy si´ z
Poz. 1173
bowego w roztworze, wyra˝onà w mg na litr, którego
u˝yto do pomiaru spektrofotometrycznego.
a) wytwornicy pary wodnej bez dwutlenku w´gla,
Metoda chromatografii gazowej
b) kolby z przewodem pary,
Kwas sorbowy, wyekstrahowany octanem etylu,
oznacza si´ metodà chromatografii gazowej z wzorcem
wewn´trznym.
c) kolumny destylacyjnej,
d) ch∏odnicy;
2) ∏aênia wodna o temperaturze 100 °C;
3) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar absorbancji przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 256 nm, wyposa˝ony w kuwety o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Destylacja
W kolbie aparatu do destylacji z parà wodnà
umieszcza si´ 10 ml wina i dodaje si´ od 1 do 2 g krystalicznego kwasu winowego, nast´pnie zbiera si´
250 ml destylatu.
Przygotowanie krzywej wzorcowej
Wzorcowy roztwór kwasu sorbowego rozcieƒcza
si´, uzyskujàc w ten sposób cztery robocze roztwory
wzorcowe, zawierajàce odpowiednio 0,5 mg, 1,0 mg,
2,5 mg i 5,0 mg kwasu sorbowego w litrze. Nast´pnie
mierzy si´ absorbancj´ roztworów za pomocà spektrofotometru przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 256 nm. Pierwszy
pomiar nale˝y przeprowadziç na próbie Êlepej sporzàdzonej z wody destylowanej. Po dokonaniu pomiaru
wykreÊla si´ krzywà wzorcowà dla roboczych roztworów wzorcowych w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´, c — oznacza st´˝enie kwasu sorbowego w roboczych roztworach wzorcowych w mg/l. Wykres jest zale˝noÊcià liniowà.
Oznaczanie
W parownicy o Êrednicy 55 mm umieszcza si´ 5 ml
destylatu i dodaje si´ 1 ml roztworu wodorotlenku
wapnia Ca(OH)2, a zawartoÊç parownicy odparowuje
si´ do sucha na ∏aêni wodnej.
Pozosta∏oÊç z odparowania rozpuszcza si´ w kilku
ml wody destylowanej i przenosi si´ bez strat do kolby
miarowej o pojemnoÊci 20 ml, nast´pnie uzupe∏nia si´
do 20 ml wodà u˝ywanà do przep∏ukiwania.
Absorbancj´ mierzy si´ przy d∏ugoÊci fali 256 nm za
pomocà spektrofotometru, jako próby Êlepej u˝ywa si´
roztworu, który otrzymuje si´ przez rozcieƒczenie 1 ml
roztworu wodorotlenku wapnia Ca(OH)2 wodà do obj´toÊci 20 ml.
Dla zmierzonej wartoÊci absorbancji odczytuje si´
na krzywej wzorcowej zawartoÊç (C) kwasu sorbowego
w roztworze.
Obliczanie wyniku oznaczania
ZawartoÊç kwasu sorbowego w winie, w mg na litr,
wynosi 100 x C, gdzie C oznacza zawartoÊç kwasu sor-
1. ODCZYNNIKI
1) eter etylowy (C2H5)2O destylowany przed u˝yciem;
2) roztwór wzorca wewn´trznego — roztwór kwasu
undekanowego (C11H2O2) o st´˝eniu 1 g/l w etanolu o st´˝eniu 95 % obj.;
3) wodny roztwór kwasu siarkowego (H2SO4) o g´stoÊci ρ20 = 1,84 g/ml, rozcieƒczony w stosunku 1:3
obj´toÊciowo.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) chromatograf gazowy wyposa˝ony w detektor p∏omieniowo-jonizacyjny i kolumn´ ze stali kwasoodpornej (o d∏ugoÊci 4 m i Êrednicy oko∏o 0,325 cm),
którà poddaje si´ uprzednio obróbce dimetylodichlorosilanem (DMDCS), z fazà stacjonarnà sk∏adajàcà si´ z mieszaniny 5 % bursztynianu glikolu etylenowego i jednoprocentowego kwasu fosforowego (DEGS — H3PO4) lub mieszaniny 7 % adypinianu glikolu etylowego i jednoprocentowego kwasu
fosforowego (DEGA — H3PO4), osadzonà na noÊniku Gaschrom Q 80 — 100 mesh
a) obróbka kolumny za pomocà DMDCS — przez
kolumn´ przepuszcza si´ roztwór zawierajàcy
od 2 g do 3 g DMDCS w toluenie, nast´pnie kolumn´ natychmiast przemywa si´ metanolem
i przep∏ukuje azotem oraz przemywa si´ heksanem i ponownie przep∏ukuje wi´kszà iloÊcià
azotu,
b) warunki rozdzia∏u
— temperatura pieca: 175 °C,
— temperatura dozownika i detektora: 230 °C,
— gaz noÊny: azot (szybkoÊç przep∏ywu =
200 ml/min);
2) mikrostrzykawka o pojemnoÊci 10 µl, skalowana
co 0,1 µl.
Mo˝liwe jest u˝ycie kolumn innego rodzaju,
a szczególnie kolumny kapilarnej.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Przygotowanie próbki do analizy
Do szklanej próbówki o obj´toÊci oko∏o 40 ml, zamykanej korkiem szklanym ze szlifem, odmierza si´ 20 ml
wina, nast´pnie dodaje si´ 2 ml roztworu wzorca wewn´trznego i 1 ml rozcieƒczonego kwasu siarkowego.
Po zmieszaniu roztworów, przez kilkakrotne odwracanie próbówki dnem do góry, dodaje si´ 10 ml eteru
etylowego (C2H5)2O. Kwas sorbowy ekstrahuje si´ do
fazy organicznej, wstrzàsajàc próbówkà przez 5 minut,
nast´pnie próbk´ odstawia si´ do rozdzielenia faz.
Przygotowanie roztworu wzorcowego
Do przygotowania roztworu wzorcowego wybiera
si´ wino, którego chromatogram ekstraktu eterowego
nie wykazuje piku odpowiadajàcego kwasowi sorbowemu. Do wina dodaje si´ kwas sorbowy w iloÊci
100 mg na litr, nast´pnie 20 ml. Tak przygotowane
próbki poddaje si´ obróbce.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) p∏ytki do chromatografii cienkowarstwowej o wymiarach 20 cm x 20 cm, pokryte ˝elem poliamidowym (gruboÊç warstwy ˝elu 0,15 mm) z dodatkiem
wskaênika fluorescencyjnego;
2) komora do chromatografii cienkowarstwowej;
3) mikropipety lub mikrostrzykawki do nanoszenia
obj´toÊci 5 µl z dok∏adnoÊcià ± 0,01 µl;
4) promiennik lampowy nadfioletu 254 nm.
Rozdzia∏ chromatograficzny
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Do chromatografu przy u˝yciu mikrostrzykawki
wprowadza si´ kolejno 2 µl fazy eterowej.
Przygotowanie próbki do analizy
Rejestrujàc odpowiednie chromatogramy, sprawdza si´ zgodnoÊç czasów retencji kwasu sorbowego
i wzorca wewn´trznego. Nast´pnie mierzy si´ wysokoÊç lub powierzchni´ ka˝dego zarejestrowanego piku.
Obliczanie wyniku oznaczania
ZawartoÊç kwasu sorbowego (C) w analizowanym
winie, wyra˝onà w mg na litr, oblicza si´ wed∏ug wzoru
C = 100 × (h : H) × (I : i),
Poz. 1173
Do szklanej próbówki o pojemnoÊci oko∏o 25 ml,
z doszlifowanym korkiem szklanym, odmierza si´
10 ml wina. Dodaje si´ 1 ml rozcieƒczonego kwasu
siarkowego oraz 5 ml eteru etylowego, nast´pnie zawartoÊç próbówki miesza si´ przez kilkakrotne odwracanie próbówki dnem do góry i pozostawia do rozdzielenia faz.
Przygotowanie rozcieƒczonego roztworu wzorcowego
Z wzorcowego roztworu kwasu sorbowego przygotowuje si´ 5 rozcieƒczonych roztworów wzorcowych
zawierajàcych odpowiednio 2, 4, 6, 8 i 10 mg kwasu
sorbowego w litrze.
gdzie
H — oznacza wysokoÊç piku kwasu sorbowego w roztworze wzorcowym,
h — oznacza wysokoÊç piku kwasu sorbowego w analizowanej próbce,
I — oznacza wysokoÊç piku wzorca wewn´trznego
w roztworze wzorcowym.
ZawartoÊç kwasu sorbowego jest mo˝liwa do obliczenia w analogiczny sposób przez okreÊlenie wielkoÊci powierzchni pików.
Wykrywanie Êladowych iloÊci kwasu sorbowego metodà chromatografii cienkowarstwowej
Kwas sorbowy, wyekstrahowany octanem etylu,
rozdziela si´ metodà chromatografii cienkowarstwowej, a jego zawartoÊç oznacza si´ pó∏iloÊciowo.
Rozdzia∏ chromatograficzny
Za pomocà mikropipety lub mikrostrzykawki nanosi si´ 5 µl przygotowanej fazy eterowej i 5 µl ka˝dego
z rozcieƒczonych roztworów wzorcowych w punktach
oddalonych o 2 cm od dolnej kraw´dzi p∏ytki i 2 cm od
siebie nawzajem.
Do komory chromatograficznej wlewa si´ faz´ ruchomà odpowiednio do wysokoÊci oko∏o 0,5 cm i pozostawia si´ do nasycenia komory parami rozpuszczalnika. Nast´pnie p∏ytk´ umieszcza si´ w komorze. Chromatogram rozwija si´ na drodze od 12 cm do 15 cm
(czas rozwijania oko∏o 30 minut). Nast´pnie p∏ytk´ osusza si´ w strumieniu ch∏odnego powietrza, a chromatogram oglàda si´ pod promiennikiem nadfioletu przy
254 nm.
1. ODCZYNNIKI
Plamy wskazujàce na obecnoÊç kwasu sorbowego
majà barw´ ciemnofioletowà na ˝ó∏tym fluorescencyjnym tle p∏ytki.
1) eter etylowy (C2H5)2O;
Interpretacja oznaczania
2) roztwór wodny kwasu siarkowego (H2SO4 o st´˝eniu ρ20 = 1,84 g/ml), rozcieƒczony w stosunku
1:3 obj.;
3) roztwór wzorcowy kwasu sorbowego w oko∏o
10 % obj. roztworze etanolu w wodzie, zawierajàcy
20 mg kwasu w litrze;
Pó∏iloÊciowe oznaczenie kwasu sorbowego w st´˝eniu od 2 do 10 mg na litr ustala si´ przez porównanie
nat´˝enia barwy plam uzyskanych w wyniku rozdzia∏u
próbki z intensywnoÊcià plam roztworów wzorcowych.
St´˝enie 1 mg na litr oznacza si´, nanoszàc na p∏ytk´
10 µl roztworu badanej próbki.
4) faza ruchoma — heksan : pentan : kwas octowy
(C6H14/C5H12/CH3COOH o st´˝eniu ρ20 = 1,05 g/ml),
w proporcji 20:20:3.
Kwas sorbowy o st´˝eniu powy˝ej 10 mg na litr
oznacza si´, nanoszàc na p∏ytk´ mniej ni˝ 5 µl roztworu badanej próbki odmierzonego mikrostrzykawkà.
Za∏àcznik nr 23
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU L-ASKORBINOWEGO
Metoda umo˝liwia oznaczanie kwasu L-askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego obecnego w winie lub moszczu.
4) mieszad∏o — pr´t szklany;
Kwas L-askorbinowy jest utleniany na w´glu aktywnym do kwasu dehydroaskorbinowego. Ten ostatni daje zwiàzek fluorescencyjny w reakcji z ortofenylenodiaminà (OPDA). Próba kontrolna w obecnoÊci kwasu borowego umo˝liwia oznaczanie fluorescencji zak∏ócanej przez wytworzenie kompleksu kwasu borowego z kwasem dehydroaskorbinowym i odj´cie wyniku
uzyskanego w tej próbie od wyniku oznaczania.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
1. ODCZYNNIKI
1) roztwór dwuchlorowodorku ortofenylenodiaminy
(C6H10Cl2N2) przygotowuje si´ bezpoÊrednio przed
u˝yciem, rozpuszczajàc 0,02 g dwuchlorowodorku
ortofenylenodiaminy (C6H10Cl2N2) w 100 ml wody;
2) roztwór trójwodnego octanu sodowego sporzàdza
si´, rozpuszczajàc 500 g trójwodnego octanu sodowego (CH3COONa ⋅ 3 H2O) w litrze wody;
3) roztwór kwasu borowego i octanu sodu przygotowuje si´ bezpoÊrednio przed u˝yciem, rozpuszczajàc
3 g kwasu borowego (H3BO3) w 100 ml roztworu trójwodnego octanu sodowego, (CH3COONa ⋅ 3 H2O),
500 g/l;
4) roztwór lodowatego kwasu octowego (CH3COOH)
(o g´stoÊci ρ20 = 1,05 g/ml), rozcieƒczony do
56 % obj., o pH oko∏o 1,2;
5) wzorcowy roztwór kwasu L-askorbinowego
(1 g/l) sporzàdza si´ bezpoÊrednio przed u˝yciem,
rozpuszczajàc 50 mg kwasu L-askorbinowego
(C6H8O6) osuszonego w eksykatorze zabezpieczonym przed dost´pem Êwiat∏a w 50 ml roztworu
kwasu octowego;
6) bardzo czysty w´giel aktywny, który przygotowuje
si´ w nast´pujàcy sposób: do dwulitrowej kolby
sto˝kowej odwa˝a si´ 100 g w´gla aktywnego i dodaje 500 ml 10 % obj. roztworu kwasu solnego
(HCl) (ρ20 = 1,19 g/ml), nast´pnie zawartoÊç kolby
doprowadza si´ do wrzenia i przesàcza przez tygiel
ze spiekiem szklanym nr 3, tak przygotowany w´giel przenosi si´ do kolby sto˝kowej o pojemnoÊci
2 litrów, nast´pnie dodaje si´ litr wody, wstrzàsa
si´ kolbà, a zawartoÊç kolby przesàcza si´ przez tygiel ze spiekiem szklanym nr 3, czynnoÊç powtarza
si´ dwukrotnie; pozosta∏oÊç przesàczu umieszcza
si´ w piecu o temperaturze kontrolowanej
115 ± 5 °C na 12 godzin.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) fluorymetr;
2) tygiel ze spiekiem szklanym nr 3;
3) próbówki o Êrednicy oko∏o 10 mm;
5) kolby miarowe o pojemnoÊci 100 ml.
Przygotowanie próbki
Pobranà próbk´ wina albo moszczu rozcieƒcza si´
56 % roztworem kwasu octowego w kolbie miarowej
o pojemnoÊci 100 ml, w celu uzyskania roztworu o zawartoÊci kwasu L-askorbinowego od 0 do 60 mg/l, nast´pnie dok∏adnie miesza si´ zawartoÊç kolby i dodaje
si´ 2 g w´gla aktywnego. Tak przygotowanà próbk´ odstawia si´ na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu,
nast´pnie zawartoÊç próbki przesàcza si´ przez zwyk∏à
bibu∏´ filtracyjnà, odrzucajàc kilka pierwszych mililitrów przesàczu.
Próbka Êlepa
Do kolby miarowej o pojemnoÊci 100 ml wprowadza si´ po 5 ml przesàczu, nast´pnie dodaje si´ 5 ml
roztworu mieszaniny kwasu borowego i octanu sodu.
Próbka badana
Do kolby miarowej o pojemnoÊci 100 ml wprowadza si´ po 5 ml przesàczu, nast´pnie dodaje si´ 5 ml
roztworu octanu sodu.
Tak przygotowane próbki odstawia si´ na 15 minut,
mieszajàc od czasu do czasu, nast´pnie uzupe∏nia si´
wodà destylowanà do 100 ml.
Z ka˝dej kolby pobiera si´ po 2 ml roztworu, nast´pnie dodaje si´ 5 ml roztworu dwuchlorowodorku
ortofenylenodiaminy i dok∏adnie miesza si´. Reakcj´
prowadzi si´ przez oko∏o 30 minut. Po up∏ywie 30 minut, gdy barwa roztworu pociemnieje, przeprowadza
si´ pomiar fluorometryczny.
Przygotowanie krzywej wzorcowej
Do trzech kolb miarowych o pojemnoÊci 100 ml odmierza si´ odpowiednio 2 ml, 4 ml i 6 ml wzorcowego roztworu kwasu L-askorbinowego, nast´pnie uzupe∏nia si´
do 100 ml roztworem kwasu octowego i dok∏adnie miesza si´. Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe
zawierajà 2, 4 i 6 mg kwasu L-askorbinowego w 100 ml.
Do ka˝dej kolby dodaje si´ 2 g w´gla aktywnego
i odstawia si´ na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu. Tak przygotowane roztwory wzorcowe sàczy si´
przez zwyk∏à bibu∏´ filtracyjnà, odrzucajàc kilka pierwszych mililitrów przesàczu.
Nast´pnie odmierza si´ 5 ml ka˝dego przesàczu do
trzech kolb miarowych o pojemnoÊci 100 ml (pierwsza
seria) — próbka Êlepa. CzynnoÊç t´ nale˝y powtórzyç
drugi raz w celu otrzymania drugiej serii wyników dla
trzech kolb miarowych.
Do ka˝dej z kolb pierwszej serii, które odpowiadajà
próbie Êlepej, dodaje si´ 5 ml roztworu kwasu borowego i kwasu octowego, natomiast do ka˝dej z kolb stanowiàcych drugà seri´ dodaje si´ 5 ml roztworu octanu sodu.
Kolby z dwóch serii odstawia si´ na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu, nast´pnie uzupe∏nia si´ wodà destylowanà do 100 ml.
Z ka˝dej kolby pobiera si´ 2 ml roztworu oraz dodaje si´ 5 ml roztworu dwuchlorowodorku ortofenylenodiaminy, miesza si´ i prowadzi reakcj´ przez oko∏o
30 minut do pociemnienia barwy roztworu, nast´pnie
przeprowadza si´ pomiar fluorometryczny.
Poz. 1173
wiednià próbk´ wzorcowà. Nast´pnie mierzy si´ nat´˝enie fluorescencji ka˝dego roztworu wzorcowego
i badanej próbki.
Po dokonaniu pomiaru wykreÊla si´ krzywà wzorcowà w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza nat´˝enie
fluorescencji, c — oznacza st´˝enie kwasu L-askorbinowego. Wykres ma postaç linii prostej przechodzàcej
przez poczàtek uk∏adu wspó∏rz´dnych.
Dla wartoÊci fluorescencji badanej próbki z krzywej
wzorcowej odczytuje si´ zawartoÊç (C) kwasu L-askorbinowego + kwasu dehydroaskorbinowego w badanym roztworze.
Obliczanie wyniku oznaczania
Wykonanie pomiaru fluorometrycznego
Dla roztworu, którego u˝ywa si´ do przygotowania
krzywej wzorcowej, oraz dla roztworu badanego ustawia si´ zero na skali pomiarowej, wykorzystujàc odpo-
ZawartoÊç kwasu L-askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego w winie w mg na litr oblicza si´,
mno˝àc uzyskanà z pomiaru fluorometrycznego wartoÊç (C) przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
Za∏àcznik nr 24
OZNACZANIE WARTOÂCI pH
Metoda oznaczania pH polega na pomiarze ró˝nicy
potencja∏u mi´dzy dwoma elektrodami zanurzonymi
w badanej cieczy. Jedna elektroda wykazuje potencja∏,
który jest funkcjà wartoÊci pH cieczy, natomiast druga
elektroda b´dàca elektrodà odniesienia wykazuje sta∏y
i znany potencja∏.
ranu(V)dipotasu (K2HPO4) rozpuszcza si´ w wodzie
i uzupe∏nia si´ wodà do 1000 ml. Tak sporzàdzony
roztwór przechowuje si´ nie d∏u˝ej ni˝ dwa miesiàce, o pH
— 6,90 w temperaturze 15 °C,
— 6,88 w temperaturze 20 °C,
1. ODCZYNNIKI
— 6,86 w temperaturze 25 °C,
Roztwory buforowe
— 6,85 w temperaturze 30 °C.
1) nasycony roztwór wodorowinianu potasu, zawierajàcy co najmniej 5,7 g wodorowinianu potasu
(C4H5KO6) w litrze w temperaturze 20 °C, roztwór
przechowuje si´ do 2 miesi´cy, dodajàc 0,1 g tymolu na 200 ml, o pH
— 3,57 w temperaturze 20°C,
— 3,56 w temperaturze 25 °C,
— 3,55 w temperaturze 30 °C;
2) 0,05-molowy roztwór wodoroftalanu potasu zawierajàcy 10,211 g wodoroftalanu potasu
(C8H5KO4) w litrze w temperaturze 20 °C, który
przechowuje si´ nie d∏u˝ej ni˝ dwa miesiàce, o pH
— 3,999 w temperaturze 15 °C,
— 4,003 w temperaturze 20 °C,
— 4,008 w temperaturze 25 °C,
2. APARATURA
1) pehametr, wyskalowany w jednostkach pH, umo˝liwiajàcy pomiar z dok∏adnoÊcià co najmniej
± 0,05 jednostki pH;
2) elektrody
a) elektroda szklana, przechowywana w wodzie
destylowanej,
b) kalomelowa nasycona elektroda odniesienia,
przechowywana w nasyconym roztworze chlorku potasowego,
lub
c) elektroda
kombinowana,
w wodzie destylowanej.
przechowywana
3. WYKONANIE OZNACZANIA
— 4,015 w temperaturze 30 °C;
3) wzorcowy roztwór buforowy, sporzàdzony w nast´pujàcy sposób: 3,402 g diwodoroortofosforan(V)potasu (KH2PO4) i 4,354 g wodoroortofosfo-
Przygotowanie próbki do analizy
Próbk´ moszczu lub wina pobiera si´ bezpoÊrednio
z moszczu lub wina.
Zerowanie aparatu
Aparat zeruje si´ przed ka˝dym pomiarem.
Poz. 1173
najmniej odbiegaç od 20 °C. Nast´pnie odczytuje si´
wartoÊç pH na skali pehametru.
Kalibracja pehametru
Wykonuje si´ co najmniej dwa równoleg∏e oznaczania badanej próbki.
Pehametr skaluje si´ w temperaturze 20 °C, stosujàc roztwory buforowe o pH = 6,88 i pH = 3,57 o temperaturze 20 °C. Do sprawdzenia kalibracji skali u˝ywa si´
roztworu buforowego o pH = 4,00 o temperaturze 20 °C.
Wynik koƒcowy oblicza si´ jako Êrednià arytmetycznà z dwóch oznaczaƒ.
Wykonanie oznaczania
Obliczanie wyniku oznaczania
Elektrod´ zanurza si´ w badanej próbce, której temperatura wynosi od 20 °C do 25 °C, temperatura ma jak
WartoÊç pH moszczu lub wina podaje si´ z dok∏adnoÊcià do dwóch miejsc po przecinku.
Za∏àcznik nr 25
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI DWUTLENKU SIARKI
Wolny dwutlenek siarki jest to dwutlenek siarki
obecny w moszczu lub winie w formie kwasu siarkawego (H2SO3) lub powstajàcej z jego rozpadu czàsteczki
HSO3. Równowaga mi´dzy tymi dwoma postaciami
jest funkcjà pH i temperatury
H2SO3 <=> H+ + HSO3
H2SO3 jest czàsteczkowym dwutlenkiem siarki.
Dwutlenek siarki ogó∏em sà to wszystkie formy
dwutlenku siarki obecne w winie, zarówno w stanie
wolnym, jak i zwiàzane ze sk∏adnikami wina.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) aparat o konstrukcji odpowiadajàcej nast´pujàcemu opisowi
a) barboter o przep∏ywie gazu oko∏o 40 litrów na
godzin´,
b) rurka doprowadzajàca gaz do barbotera o zakoƒczeniu w formie kulki o Êrednicy 1 cm,
z dwudziestoma otworami, ka˝dy o Êrednicy
0,2 mm, albo w formie p∏ytki ze spieku szklanego, który powoduje powstawanie du˝ej iloÊci
bardzo ma∏ych p´cherzyków gazu,
c) ch∏odnica zbudowana z czterech wewn´trznych
koncentrycznych rurek o Êrednicach 45 mm,
34 mm, 27 mm i 10 mm,
Wolny i zwiàzany dwutlenek siarki
Wina i moszcze
Dwutlenek siarki jest wydzielany z próbki strumieniem powietrza lub azotu, nast´pnie jest wiàzany i utleniany przez rozcieƒczony i oboj´tny roztwór nadtlenku
wodoru. Powsta∏y kwas siarkowy oznacza si´, miareczkujàc mianowanym roztworem wodorotlenku sodowego. Wolny dwutlenek siarki jest wydzielany z próbki
przez odparowanie w temperaturze oko∏o 10 °C. Dwutlenek siarki ogó∏em jest wydzielany z wina przez odparowanie w temperaturze oko∏o 100 °C.
d) butelka do ograniczania redukcji ciÊnienia, którà powoduje pompka wodna,
e) przep∏ywomierz z rurkami pó∏kapilarnymi zainstalowany pomi´dzy barboterem a butelkà, dla
utrzymania pró˝ni na odpowiednim poziomie,
f) kolba o pojemnoÊci 250 ml;
2) mikrobiureta.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
1. ODCZYNNIKI
1) 85 % kwas fosforowy
ρ20 = 1,71 g/ml);
(H3PO4,
o
g´stoÊci
2) roztwór nadtlenku wodoru sporzàdza si´, rozpuszczajàc 9,1 g (H2O2) w litrze wody;
3) wskaênik, który sporzàdza si´ ze 100 mg czerwieni
metylowej, 50 mg b∏´kitu metylenowego i 100 ml
50 % obj. alkoholu;
4) 0,01-molowy roztwór wodorotlenku sodu (NaOH).
Oznaczanie wolnego dwutlenku siarki
Przed wykonaniem oznaczania wino przechowuje
si´ w ca∏kowicie nape∏nionej butelce w temperaturze
20 °C przez dwa dni.
Do barbotera odmierza si´ 2 ml do 3 ml roztworu
nadtlenku wodoru i dwie krople wskaênika, po czym
zoboj´tnia si´ roztwór nadtlenku wodoru 0,01-molowym roztworem wodorotlenku sodu, nast´pnie barboter przy∏àcza si´ do aparatu.
Do kolby wprowadza si´ 50 ml próbki i 15 ml kwasu fosforowego, nast´pnie kolb´ przy∏àcza si´ do aparatu.
Przez 15 minut przez aparat przepuszcza si´ powietrze lub azot. Wolny dwutlenek siarki wydzielajàcy si´
z próbki utlenia si´ do kwasu siarkowego. Nast´pnie
barboter od∏àcza si´ od aparatu, a powsta∏y kwas siarkowy miareczkuje si´ 0,01-molowym roztworem wodorotlenku sodu.
Obliczanie wyniku oznaczania
IloÊç uwolnionego dwutlenku siarki podaje si´
w mg/l, zaokràglajàc wynik do liczby ca∏kowitej.
ZawartoÊç wolnego dwutlenku siarki w miligramach na litr wynosi 6,4 n, gdzie n oznacza iloÊç ml
0,01-molowego roztworu wodorotlenku sodu zu˝ytego
do miareczkowania.
Oznaczanie dwutlenku siarki ogó∏em
Je˝eli oczekiwana zawartoÊç dwutlenku siarki ogó∏em w próbce nie jest wi´ksza ni˝ 50 mg na litr, do kolby odmierza si´ 50 ml próbki i 15 ml 85 % kwasu fosforowego, nast´pnie kolb´ przy∏àcza si´ do aparatu.
Je˝eli szacunkowa zawartoÊç dwutlenku siarki ogó∏em w próbce jest wi´ksza ni˝ 50 mg na litr, do kolby
odmierza si´ 20 ml próbki i 5 ml 85 % kwasu fosforowego, nast´pnie kolb´ przy∏àcza si´ do aparatu.
Do barbotera odmierza si´ 2 ml do 3 ml roztworu
nadtlenku wodoru, zoboj´tnionego w opisany sposób,
nast´pnie wino w kolbie doprowadza si´ do wrzenia za
pomocà p∏omienia o wysokoÊci 4 cm do 5 cm dotykajàcego dna kolby. Nie nale˝y umieszczaç kolby na p∏ytce metalowej, lecz na krà˝ku z otworem o Êrednicy oko∏o 30 mm, co zapobiega przegrzaniu substancji wydzielanych z wina, które osadzajà si´ na Êciankach kolby.
Próbk´ utrzymuje si´ w stanie wrzenia, przepuszczajàc przez nià strumieƒ powietrza lub azotu. W czasie
15 minut wydziela si´ i utlenia z próbki ca∏oÊç dwutlenku siarki wolnego i zwiàzanego. IloÊç wytworzonego
kwasu siarkowego oblicza si´, miareczkujàc 0,01-molowym roztworem wodorotlenku sodu.
Obliczanie wyniku oznaczania
ZawartoÊç dwutlenku siarki ogó∏em wyra˝a si´
w mg/l.
ZawartoÊç dwutlenku siarki ogó∏em w miligramach
na litr wynosi
— 6,4 n dla próbki o niskiej zawartoÊci dwutlenku
siarki w przypadku, gdy obj´toÊç badanej próbki
wynosi 50 ml,
— 16 n dla pozosta∏ych próbek w przypadku, gdy obj´toÊç badanej próbki wynosi 20 ml, gdzie n oznacza iloÊç ml roztworu wodorotlenku sodu zu˝ytego
do miareczkowania.
Poz. 1173
4. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku powy˝szego oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi
1) r = 1 mg/l dla próbki badanej o obj´toÊci
50 ml < 50 mg/l;
2) r = 6 mg/l dla próbki badanej o obj´toÊci
20 ml > 50 mg/l.
5. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku powy˝szego oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi
1) R = 9 mg/l dla próbki badanej o obj´toÊci
50 ml < 50 mg/l;
2) R = 15 mg/l dla próbki badanej o obj´toÊci
20 ml > 50 mg/l.
Czàsteczkowy dwutlenek siarki
Procentowy udzia∏ czàsteczkowego dwutlenku siarki H2SO3 w wolnym dwutlenku siarki oblicza si´ jako
funkcj´ pH, zawartoÊci alkoholu i temperatury.
Dla danej temperatury i zawartoÊci alkoholu
H2SO3 <=> H+ + HSO3–
L
[H2SO3] = —————— (1)
10’ pH pKM+ I
gdzie
—
A√ Ι
pKM = pK T – ————
—
I + B√ Ι
L = [H2SO3] + [HSO3–],
gdzie
I — oznacza si∏´ jonowà,
A — oznacza wspó∏czynnik zale˝ny od temperatury,
B — oznacza wspó∏czynnik zale˝ny od zawartoÊci alkoholu,
KT — oznacza termodynamicznà sta∏à dysocjacji —
wartoÊci KT dla ró˝nej temperatury i ró˝nej mocy alkoholowej sà podane w tabeli 1,
KM — oznacza mieszanà sta∏à dysocjacji.
Dla Êredniej wartoÊci si∏y jonowej I = 0,038 w tabeli 2 jest podana wartoÊç pKM dla ró˝nej temperatury
i zawartoÊci alkoholu. ZawartoÊç czàsteczkowego dwutlenku siarki obliczona na podstawie wzoru (1) jest podana w tabeli 3 dla ró˝nej wartoÊci pH, temperatury
i zawartoÊci alkoholu.
Poz. 1173
ry T °C obliczona na podstawie znanej wartoÊci pH wina i zawartoÊci alkoholu.
ZawartoÊç czàsteczkowego
w mg/l wynosi
dwutlenku
siarki
X × C,
Obliczanie wyniku oznaczania
W tabeli 3 jest podana procentowa zawartoÊç
czàsteczkowego dwutlenku siarki (X) dla temperatu-
gdzie C — oznacza zawartoÊç wolnego dwutlenku siarki w mg/l.
TABELA 1
WartoÊci termodynamicznej sta∏ej dysocjacji pKT
TABELA 2
WartoÊci mieszanej sta∏ej dysocjacji pKM (I = 0,038)
TABELA 3
Procentowa zawartoÊç czàsteczkowego dwutlenku siarki w stosunku do wolnego dwutlenku siarki
Za∏àcznik nr 26
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SODU
ZawartoÊç sodu oznacza si´ bezpoÊrednio w winie
metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej po dodaniu chlorku cezu (CsCl) w celu przeciwdzia∏ania jonizacji sodu.
1. ODCZYNNIKI
1) roztwór zawierajàcy 1 g sodu w litrze
u˝ywa si´ wzorcowego roztworu sporzàdzonego
przez rozpuszczenie 2,542 g bezwodnego chlorku
sodu (NaCl) w wodzie destylowanej do obj´toÊci
1 litra; sporzàdzony roztwór przechowuje si´
w butelce z polietylenu;
2) matryca — roztwór modelowy sporzàdza si´, dodajàc
a) 3,5 g kwasu cytrynowego (C6H8O7 • H2O),
D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 589,0 nm, nast´pnie ustawia si´ zero na skali absorbancji, stosujàc
roztwór wzorcowy zawierajàcy 1 g cezu w litrze, bez zawartoÊci sodu. Do palnika spektrofotometru wprowadza si´ bezpoÊrednio przygotowanà wczeÊniej próbk´
rozcieƒczonego wina, a nast´pnie sporzàdzone wczeÊniej roztwory wzorcowe, i odczytuje si´ absorbancj´.
Pomiary si´ powtarza.
Obliczanie wyniku oznaczania
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie A —
oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç sodu
w roztworach wzorcowych w mg/l.
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) sodu w miligramach na litr.
b) 1,5 g sacharozy (C12H22O11),
c) 5,0 g glicerolu (C3H8O3),
d) 50 mg bezwodnego chlorku wapnia (CaCl2),
e) 50 mg bezwodnego chlorku magnezu (MgCl2),
f) 50 ml alkoholu bezwodnego (C2H5OH),
— uzupe∏niajàc wodà zdemineralizowanà
500 ml;
Oznaczanie
ZawartoÊç sodu w miligramach na litr wina wynosi 20 X C i jest wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej.
do
3) roztwór chlorku cezu zawierajàcy 5 % cezu sporzàdza si´, rozpuszczajàc 6,330 g chlorku cezu (CsCl)
w 100 ml wody destylowanej.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) spektrofotometr absorpcji atomowej wyposa˝ony
w palnik powietrzno-acetylenowy;
2) lampa sodowa z katodà wn´kowà.
4. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi
3. WYKONANIE OZNACZANIA
r = 1 + 0,024 xi (mg/l),
Przygotowanie próbki
gdzie
Pipetà przenosi si´ 2,5 ml wina do kolby miarowej
o pojemnoÊci 50 ml, nast´pnie dodaje si´ 1 ml roztworu chlorku cezu i uzupe∏nia si´ do 50 ml wodà destylowanà.
xi — oznacza zawartoÊç sodu w próbce w mg/l.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Do ka˝dej z pi´ciu kolb miarowych o pojemnoÊci
100 ml przenosi si´ 5,0 ml roztworu matrycy i dodaje
si´ odpowiednio 0 ml; 2,5 ml; 5,0 ml; 7,5 ml i 10,0 ml
roztworu sodu o st´˝eniu 1 g/l, rozcieƒczonego uprzednio w stosunku 1:100. Nast´pnie do ka˝dej kolby dodaje si´ 2 ml roztworu chlorku cezu i uzupe∏nia si´ do
100 ml wodà destylowanà.
Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe
zawierajà odpowiednio 0 mg; 0,25 mg; 0,50 mg;
0,75 mg i 1,00 mg sodu na litr i 1 g cezu w litrze. Roztwory przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
5. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi
R = 2,5 + 0,05 xi (mg/l),
gdzie
xi — oznacza zawartoÊç sodu w próbce w mg/l.
Za∏àcznik nr 27
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI POTASU
ZawartoÊç potasu oznacza si´ bezpoÊrednio w winie metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej, dodajàc chlorku cezu (CsCl) w celu przeciwdzia∏ania jonizacji potasu.
1. ODCZYNNIKI
1) roztwór zawierajàcy 1 g potasu w litrze
u˝ywa si´ wzorcowego roztworu zawierajàcego
1 g potasu w litrze albo sporzàdza si´ roztwór, rozpuszczajàc 4,813 g wodorowinianu potasowego
(C4H5KO6) w wodzie destylowanej i uzupe∏niajàc
wodà destylowanà do obj´toÊci 1 litra;
2) matryca — roztwór modelowy sporzàdza si´, dodajàc
a) 3,5 g kwasu cytrynowego (C6H8O7 • H2O),
b) 1,5 g sacharozy (C12H22O11),
c) 5,0 g glicerolu (C3H8O3),
d) 50 mg bezwodnego chlorku wapnia (CaCl2),
e) 50 mg bezwodnego chlorku magnezu (MgCl2),
f) 50 ml alkoholu bezwodnego (C2H5OH),
— uzupe∏niajàc wodà do 500 ml;
3) roztwór chlorku cezu zawierajàcy 5 % cezu sporzàdza si´, rozpuszczajàc 6,33 g chlorku cezu (CsCl)
w 100 ml wody destylowanej.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) spektrofotometr absorpcji atomowej wyposa˝ony
w palnik powietrzno-acetylenowy;
Oznaczanie
D∏ugoÊç fali ustawia si´ na 769,9 nm, nast´pnie
ustawia si´ zero na skali absorbancji, stosujàc roztwór
wzorcowy zawierajàcy 1 g cezu w litrze, bez zawartoÊci
sodu. Do palnika spektrofotometru absorbcji atomowej wprowadza si´ próbk´ bezpoÊrednio rozcieƒczonego wina, a nast´pnie roztwory wzorcowe. Oznaczanie koƒczy si´ odczytaniem absorbancji. Wszystkie pomiary powtarza si´ dwa razy.
Obliczanie wyniku oznaczania
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç potasu w roztworach wzorcowych w mg/l.
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) potasu w miligramach na litr.
ZawartoÊç potasu w miligramach na litr wina, wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej, wynosi
F × C, gdzie F jest wspó∏czynnikiem rozcieƒczenia
(w tym przypadku 200).
Mo˝liwe jest wyra˝enie wyniku w
— miligramorównowa˝nikach na litr: 0,0256 × F × C
albo
— miligramach wodorowinianu
4,813 x F x C.
potasu
na
litr
2) lampa potasowa z katodà wn´kowà.
4. POWTARZALNOÂå METODY
3. WYKONANIE OZNACZANIA
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
Przygotowanie próbki
Do kolby miarowej o pojemnoÊci 50 ml przenosi si´
pipetà 2,5 ml wina (rozcieƒczonego uprzednio wodà
w stosunku 1:10), nast´pnie dodaje si´ 1 ml roztworu
chlorku cezu i uzupe∏nia wodà destylowanà do 50 ml.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Do ka˝dej z pi´ciu kolb miarowych o pojemnoÊci
100 ml przenosi si´ 5,0 ml roztworu modelowego (matryca) i dodaje si´ odpowiednio 0 ml; 2,0; 4,0 ml; 6,0 ml
i 8,0 ml roztworu potasu o st´˝eniu 1 g/l (rozcieƒczonego uprzednio w stosunku 1:10). Nast´pnie do ka˝dej
kolby dodaje si´ 2 ml roztworu chlorku cezu i uzupe∏nia wodà destylowanà do 100 ml.
Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe
zawierajà odpowiednio 1 g cezu w litrze oraz 2 mg,
4 mg, 6 mg i 8 mg potasu na litr, a piàty roztwór wzorcowy nie zawiera potasu. Roztwory przechowuje si´
w butelkach z polietylenu.
W przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi: 35 mg/l.
5. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest
mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej
metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego
sprz´tu.
W przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi: 66 mg/l.
Za∏àcznik nr 28
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI MAGNEZU
ZawartoÊç magnezu oznacza si´ bezpoÊrednio
w odpowiednio rozcieƒczonym winie metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej.
1. ODCZYNNIKI
1) st´˝ony roztwór wzorcowy zawierajàcy 1 g magnezu w litrze; u˝ywa si´ wzorcowego roztworu magnezu zawierajàcego 1 g/l albo sporzàdza si´ roztwór, rozpuszczajàc 8,3646 g chlorku magnezu
(MgCl2 ⋅ 6 H2O) w wodzie destylowanej, uzupe∏niajàc wodà destylowanà do obj´toÊci 1 litra;
2) rozcieƒczony roztwór wzorcowy zawierajàcy 5 mg
magnezu w litrze; wzorcowe roztwory magnezu
przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) spektrofotometr absorpcji atomowej wyposa˝ony
w palnik powietrzno-acetylenowy;
wej wprowadza si´ bezpoÊrednio rozcieƒczone wino,
a nast´pnie sporzàdzone roztwory wzorcowe.
Nast´pnie odczytuje si´ absorbancj´ i powtarza
wszystkie pomiary dwa razy.
4. WYRA˚ANIE WYNIKU
Sposób obliczania
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A – oznacza absorbancj´, c – oznacza zawartoÊç magnezu w roztworach wzorcowych w mg/l.
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) magnezu w miligramach na litr.
ZawartoÊç magnezu w miligramach na litr wina jest
wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej i wynosi
100 × C.
2) lampa magnezowa z katodà wn´kowà.
5. POWTARZALNOÂå METODY
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Przygotowanie próbki
Wino rozcieƒcza si´ wodà destylowanà w stosunku 1:100.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Do ka˝dej z czterech kolb miarowych o pojemnoÊci
100 ml przenosi si´ odpowiednio 5 ml, 10 ml, 15 ml
i 20 ml rozcieƒczonego wzorcowego roztworu magnezu i uzupe∏nia do 100 ml wodà destylowanà. Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe zawierajà odpowiednio 0,25 mg; 0,50 mg; 0,75 mg i 1,0 mg magnezu na litr. Roztwory przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
Oznaczanie
D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 285 nm. Zero
ustawia si´ na skali absorbancji, stosujàc wod´ destylowanà. Do palnika spektrofotometru absorpcji atomo-
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi
3 mg/l.
6. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi 8 mg/l.
Za∏àcznik nr 29
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI WAPNIA
ZawartoÊç wapnia oznacza si´ metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej bezpoÊrednio w odpowiednio rozcieƒczonym winie, dodajàc czynnik zmniejszajàcy jonizacj´.
1. ODCZYNNIKI
1) roztwór wzorcowy zawierajàcy 1 g wapnia w litrze
u˝ywa si´ wzorcowego roztworu wapnia o st´˝eniu 1 g/l albo sporzàdza si´ roztwór, rozpuszczajàc
2,5 g w´glanu wapnia (CaCO3) w kwasie chlorowodorowym (HCl) rozcieƒczonym w stosunku
1:10 obj., w iloÊci pozwalajàcej na ca∏kowite rozpuszczenie w´glanu, i uzupe∏nia do obj´toÊci 1 litra wodà destylowanà;
Oznaczanie
D∏ugoÊç fali ustawia si´ na 422,7 nm. Zero na skali
absorbancji ustawia si´, stosujàc roztwór zawierajàcy
5 g lantanu na litr (przygotowanie roztworów wzorcowych). Do palnika spektrofotometru absorpcji atomowej wprowadza si´ bezpoÊrednio rozcieƒczone wino,
a nast´pnie kolejno pi´ç roztworów wzorcowych sporzàdzonych w podany sposób. Odczytuje si´ absorbancj´ i powtarza wszystkie pomiary dwa razy.
4. WYRA˚ANIE WYNIKU
Sposób obliczania
2) rozcieƒczony roztwór wzorcowy wapnia zawierajàcy 50 mg wapnia w litrze przechowuje si´ w butelkach z polietylenu;
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç sodu w roztworach wzorcowych w mg/l.
3) roztwór chlorku lantanu zawierajàcy 50 g lantanu
w litrze sporzàdza si´, rozpuszczajàc 13,369 g
chlorku lantanu (LaCl3 ⋅ 7H2O) w wodzie destylowanej i dodajàc 1 ml HCl rozcieƒczonego w stosunku 1:10 obj., i uzupe∏nia do 100 ml wodà destylowanà.
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç
(C) wapnia w miligramach na litr.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) spektrofotometr absorpcji atomowej wyposa˝ony
w palnik powietrzno-acetylenowy;
2) lampa wapniowa z katodà wn´kowà;
3) kolby miarowe.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Przygotowanie próbki
Do kolby miarowej na 20 ml przenosi si´ 1 ml wina,
2 ml roztworu chlorku lantanu i uzupe∏nia wodà do
20 ml. Próbka wina, rozcieƒczonego w stosunku 1:20,
zawiera 5 g lantanu w litrze.
W przypadku win s∏odkich st´˝enie 5 g lantanu w litrze jest wystarczajàce, o ile w wyniku rozcieƒczania zawartoÊç cukrów nie spadnie poni˝ej 2,5 g na litr.
W przypadku win o wi´kszym st´˝eniu cukrów zwi´ksza si´ st´˝enie lantanu do 10 g na litr.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Do ka˝dej z pi´ciu kolb miarowych na 100 ml przenosi si´ odpowiednio 0 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml i 20 ml
rozcieƒczonego wzorcowego roztworu wapnia, dodaje
si´ 10 ml roztworu lantanu i uzupe∏nia do 100 ml wodà
destylowanà. Przygotowane w ten sposób roztwory
wzorcowe zawierajà odpowiednio 0; 0,25; 5,0; 7,5;
10 mg wapnia na litr, ka˝dy roztwór zawiera 5 g lantanu na litr. Roztwory przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
ZawartoÊç wapnia w miligramach na litr wina wynosi 20 x C i jest wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej.
5. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
W przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi
1) przy st´˝eniu < 60 mg/l: r = 2,7 mg/l;
2) przy st´˝eniu > 60 mg/l: r = 4 mg/l.
6. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi 0,114 xi — 0,5,
gdzie
xi — oznacza zawartoÊç wapnia w próbce w mg/l.
Za∏àcznik nr 30
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI ˚ELAZA
Po odpowiednim rozcieƒczeniu wina i usuni´ciu
alkoholu zawartoÊç ˝elaza oznacza si´ bezpoÊrednio
metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej.
Je˝eli potrzeba, próbk´ rozcieƒcza si´ przed
oznaczaniem, podajàc wspó∏czynnik rozcieƒczenia (F).
Przygotowanie roztworów wzorcowych
1. ODCZYNNIKI
1) st´˝ony roztwór ˝elaza zawierajàcy jeden gram
Fe (III) w litrze;
u˝ywa si´ wzorcowego handlowego roztworu
˝elaza (1 g/l) albo sporzàdza si´ roztwór,
rozpuszczajàc 8,6341 g siarczanu amino˝elaza(III)
(FeNH4(SO4)2 · 12 H2O) w wodzie destylowanej
lekko zakwaszonej jednomolowym kwasem
chlorowodorowym, i uzupe∏nia do 1 litra;
2) rozcieƒczony roztwór ˝elaza zawierajàcy 100 mg
˝elaza w litrze.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) wyparka rotacyjna z ∏aênià wodnà z termostatem;
2) spektrofotometr absorpcji atomowej wyposa˝ony
w palnik powietrzno-acetylenowy;
Do ka˝dej z pi´ciu kolb miarowych na 100 ml
przenosi si´ odpowiednio 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml i 5 ml
roztworu ˝elaza o st´˝eniu 100 mg na litr i uzupe∏nia do
100 ml wodà destylowanà. Przygotowane w ten
sposób roztwory wzorcowe zawierajà odpowiednio
1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg i 5 mg ˝elaza w litrze. Roztwory
przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
Oznaczanie
D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 248,3 nm. Zero
na skali absorbancji spektrofotometru ustawia si´ w
stosunku do wody destylowanej. Do palnika
spektrofotometru wprowadza si´ bezpoÊrednio
rozcieƒczonà próbk´, a nast´pnie kolejno pi´ç
roztworów wzorcowych. Odczytuje si´ absorbancj´ i
powtarza wszystkie pomiary.
4. WYRA˚ANIE WYNIKU
3) lampa ˝elazowa z katodà wn´kowà;
Obliczanie wyniku oznaczania
4) kolby miarowe.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Przygotowanie próbki
Alkohol usuwa si´ z wina, zmniejszajàc obj´toÊç
próbki o po∏ow´ za pomocà wyparki rotacyjnej
(temperatura od 50 do 60 °C). Nast´pnie uzupe∏nia si´
do poczàtkowej obj´toÊci wodà destylowanà.
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç ˝elaza w roztworach wzorcowych w mg/l. Dla wartoÊci
absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina
odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) ˝elaza w miligramach na litr. ZawartoÊç ˝elaza w miligramach na litr wina, wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej, wynosi F x C, gdzie F — jest wspó∏czynnikiem rozcieƒczenia.
Za∏àcznik nr 31
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI MIEDZI
Metoda opiera si´ na zastosowaniu spektrofotometrii absorpcji atomowej.
1. ODCZYNNIKI
1) miedê metaliczna;
2) kwas azotowy (HNO3) o st´˝eniu 65 % (o g´stoÊci
ρ20 = 1,38 g/ml);
3) kwas azotowy rozcieƒczony w stosunku 1:2 obj.;
4) roztwór zawierajàcy miedê w st´˝eniu 1 g/l — u˝ywa
si´ wzorcowego handlowego roztworu miedzi albo
roztwór ten sporzàdza si´, odwa˝ajàc 1,000 g metalicznej miedzi i przenoszàc jà bez strat do kolby mia-
rowej na 1000 ml. Dodaje si´ kwas azotowy rozcieƒczony w stosunku 1:2 obj. w iloÊci wystarczajàcej do
rozpuszczenia metalu, nast´pnie dodaje si´ 10 ml
st´˝onego kwasu azotowego i uzupe∏nia do 1000 ml
wodà destylowanà;
5) roztwór zawierajàcy miedê w st´˝eniu 100 mg/l
sporzàdza si´, przenoszàc 10 ml roztworu przygotowanego do kolby miarowej na 100 ml, i uzupe∏nia do 100 ml wodà redestylowanà.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) naczynko platynowe;
2) spektrofotometr absorpcji atomowej;
3) lampa miedziowa z katodà wn´kowà;
4) sprz´t do doprowadzania gazu o sk∏adzie: powietrze-acetylen albo podtlenek azotu-acetylen;
Poz. 1173
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç
(C) miedzi w miligramach na litr.
Je˝eli F jest wspó∏czynnikiem rozcieƒczenia, zawartoÊç miedzi, podawana w miligramach na litr z dok∏adnoÊcià do dwóch znaków po przecinku, wynosi F x C.
5) kolby miarowe.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Przygotowanie próbki i oznaczanie zawartoÊci miedzi
Je˝eli potrzeba, sporzàdza si´ odpowiednio rozcieƒczony roztwór, u˝ywajàc wody redestylowanej.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Do trzech kolb miarowych na 100 ml przenosi si´
odpowiednio 0,5 ml, 1 ml i 2 ml roztworu miedzi
(100 mg miedzi w litrze) i uzupe∏nia wodà redestylowanà; przygotowane w ten sposób roztwory zawierajà
odpowiednio 0,5 mg, 1 mg i 2 mg miedzi w litrze.
Pomiary absorbancji wykonuje si´ przy 324,8 nm.
Na skali spektrofotometru absorbancji atomowej
ustawia si´ zero dla wody redestylowanej. Wykonuje
si´ kolejno bezpoÊrednie pomiary absorbancji roztworów wzorcowych przygotowanych w opisany sposób,
nast´pnie wykonuje si´ dwa równoleg∏e oznaczania.
4. WYRA˚ANIE WYNIKU
Obliczanie wyniku oznaczania
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç miedzi w roztworach wzorcowych w mg/l.
St´˝enia roztworów do wyznaczania krzywej wzorcowej i rozcieƒczenie próbki dobiera si´ w∏aÊciwie do
czu∏oÊci u˝ywanego spektrofotometru absorbancji atomowej oraz do zawartoÊci miedzi w badanej próbce.
Je˝eli w badanej próbce oczekiwana zawartoÊç
miedzi jest bardzo ma∏a, post´puje si´ nast´pujàco
w naczynku platynowym umieszcza si´ 100 ml próbki
i odparowuje na ∏aêni wodnej o temperaturze 100 °C do
konsystencji syropu. Nast´pnie dodaje si´ po kropli
2,5 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 %, ca∏kowicie
pokrywajàc cieczà dno naczynka. Ostro˝nie spopiela
si´ pozosta∏oÊç na elektrycznej p∏ytce grzejnej lub w niskim p∏omieniu palnika, a nast´pnie wk∏ada naczynko
do pieca muflowego o temperaturze 500±25 °C i pozostawia na oko∏o jednà godzin´. Po wystudzeniu popió∏
zwil˝a si´ 1 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 %, rozkruszajàc próbk´ szklanà bagietkà, pozostawia mieszanin´ do odparowania i spopiela jak uprzednio. Ponownie umieszcza si´ naczynko w piecu muflowym na
15 minut. Obróbk´ kwasem azotowym powtarza si´ co
najmniej trzykrotnie. Popió∏ rozpuszcza si´, dodajàc do
naczynka 1 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 % oraz
2 ml wody redestylowanej, i przenosi do kolby na
10 ml. Naczynko przemywa si´ trzykrotnie, za ka˝dym
razem u˝ywajàc 2 ml wody redestylowanej. Nast´pnie
dodaje si´ wody redestylowanej do 10 ml.
Za∏àcznik nr 32
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KADMU
ZawartoÊç kadmu oznacza si´ bezpoÊrednio w winie metodà bezp∏omieniowej spektrofotometrii absorpcji atomowej.
1. ODCZYNNIKI
Stosuje si´ wod´ dwukrotnie destylowanà w aparacie ze szk∏a borokrzemowego, dopuszcza si´ u˝ycie
wody o podobnej czystoÊci. Wszystkie odczynniki majà czystoÊç analitycznà i nie zawierajà kadmu
1) 85 % kwas fosforowy (o g´stoÊci ρ20 = 1,71 g/ml);
2) roztwór kwasu fosforowego, otrzymany przez rozcieƒczenie 8 ml kwasu fosforowego wodà do 100 ml;
3) 0,02-molowy roztwór soli dwusodowej kwasu etylenodwuaminoczterooctowego (EDTA);
4) roztwór buforowy o pH 9 sporzàdza si´, rozpuszczajàc w kolbie miarowej na 100 ml 5,4 g chlorku
amonu w kilku mililitrach wody, nast´pnie dodaje
si´ 35 ml roztworu wodorotlenku amonu (o g´stoÊci ρ20 = 0,92 g/ml) rozcieƒczonego do 25 % obj.
i uzupe∏nia do 100 ml wodà;
5) czerƒ eriochromowa T — 1 % wagowy, sucha mieszanina z chlorkiem sodowym;
6) roztwór siarczanu kadmu (CdSO4 . 8H2O), którego
miano sprawdza si´ nast´pujàco: do cylindrycznego
naczynia z wodà odwa˝a si´ dok∏adnie 102,6 mg siarczanu kadmu i wstrzàsa do rozpuszczenia, nast´pnie
dodaje si´ 5 ml roztworu buforowego o pH = 9 i oko∏o 20 mg czerni eriochromowej T — miareczkuje roztworem EDTA do zmiany barwy wskaênika na niebieskà (iloÊç zu˝ytego roztworu EDTA powinna wynosiç
20 ml), je˝eli zu˝yta obj´toÊç niewiele odbiega od
20 ml — odpowiednio koryguje si´ iloÊç siarczanu
kadmu odwa˝anego do przygotowania roztworu
wzorcowego;
7) roztwór wzorcowy kadmu o st´˝eniu 1 g/l — u˝ywa si´ wzorcowego handlowego roztworu kadmu
albo sporzàdza si´ roztwór, rozpuszczajàc 2,2820 g
siarczanu kadmowego w wodzie i uzupe∏niajàc do
1 litra.
Poz. 1173
2) mineralizacja w temperaturze 900 °C przez 20 sekund;
3) atomizacja w temperaturze 2250 °C przez 2 do 3 sekund;
4) przep∏yw azotu (gaz p∏uczàcy): 6 litrów/minut´.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) szk∏o laboratoryjne przed u˝yciem myje si´ w st´˝onym kwasie azotowym podgrzanym do temperatury od 70 do 80 °C, nast´pnie sp∏ukuje si´ wodà
redestylowanà;
W celu oczyszczenia pieca temperatur´ podnosi si´
do 2700 °C.
2) spektrofotometr absorpcji atomowej wyposa˝ony
w piec grafitowy, korekcj´ t∏a i multipotencjometr;
3. WYKONANIE OZNACZANIA
D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 228,8 nm. Zero ustawia si´ na skali absorbancji w stosunku do wody redestylowanej. Za pomocà mikropipety wprowadza si´ do pieca trzy 5 µl porcje ka˝dego z roztworów
wzorcowych i roztworu badanej próbki, nast´pnie odczytuje si´ wartoÊci absorbancji. WartoÊç Êrednià absorbancji oblicza si´ na podstawie pomiarów trzech
wprowadzonych porcji.
Przygotowanie próbki
4. WYRA˚ANIE WYNIKU
Wino rozcieƒcza si´ w stosunku 1:2 obj., u˝ywajàc
roztworu kwasu fosforowego.
Obliczanie wyniku oznaczania
3) lampa kadmowa z katodà wn´kowà;
4) mikropipety na 5 µl ze specjalnymi koƒcówkami do
pomiarów metodà absorpcji atomowej.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Wykorzystujàc wzorcowy roztwór kadmu, przygotowuje si´ seri´ roztworów o st´˝eniach odpowiednio
2,5; 5; 10 i 15 µg kadmu w litrze.
Temperatur´ pieca programuje si´ w nast´pujàcy
sposób
1) suszenie w temperaturze 100 °C przez 30 sekund;
Pomiary metodà absorpcji atomowej
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç kadmu w roztworach wzorcowych w mg/l.
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) kadmu w miligramach na litr.
ZawartoÊç kadmu w mikrogramach na litr wina wynosi: 2 x C.
Za∏àcznik nr 33
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SREBRA
Metoda oparta jest na zastosowaniu spektrofotometrii absorpcji atomowej po spopieleniu próbki.
10 ml roztworu zawierajàcego 1 g srebra sporzàdzonego w opisany sposób rozcieƒcza si´ do 1000 ml rozcieƒczonym roztworem kwasu azotowego.
1. ODCZYNNIKI
1) azotan srebra (AgNO3);
2. APARATURA I SPRZ¢T
2) kwas azotowy (HNO3), o st´˝eniu 65 % i g´stoÊci
ρ20 = 1,38 g/ml;
1) naczynko platynowe;
3) kwas azotowy rozcieƒczony w stosunku 1:10 obj.;
4) roztwór zawierajàcy 1 g srebra w litrze: u˝ywa si´
wzorcowego handlowego roztworu srebra albo
sporzàdza si´ roztwór, rozpuszczajàc 1,575 g azotanu srebra w rozcieƒczonym kwasie azotowym
i uzupe∏niajàc do 1000 ml rozcieƒczonym kwasem
azotowym;
5) roztwór zawierajàcy 10 mg srebra w litrze;
2) ∏aênia wodna z termostatem o temperaturze 100 °C;
3) piec o kontrolowanej temperaturze od 500 do
525 °C;
4) spektrofotometr absorpcji atomowej;
5) lampa srebrowa z katodà wn´kowà;
6) gazy zasilajàce: powietrze, acetylen;
7) kolby miarowe.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Przygotowanie próbki
20 ml próbki umieszcza si´ w naczynku platynowym
i odparowuje do sucha na wrzàcej ∏aêni wodnej. Nast´pnie spopiela si´ próbk´ w piecu w temperaturze 500 do
525 °C. Bia∏y popió∏ zwil˝a si´ za pomocà 1 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 %. Próbk´ odparowuje si´ na wrzàcej ∏aêni wodnej, powtórnie dodaje 1 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 % i odparowuje po raz drugi. Nast´pnie
dodaje si´ 5 ml rozcieƒczonego kwasu azotowego w stosunku 1:10 obj. i lekko ogrzewa do rozpuszczenia.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Do szeÊciu kolb miarowych na 100 ml odmierza si´
pipetà odpowiednio 2 ml, 4 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml oraz
20 ml roztworu zawierajàcego 10 mg srebra w litrze
i uzupe∏nia do 100 ml rozcieƒczonym kwasem azotowym w stosunku 1:10 obj. Przygotowane w ten sposób
roztwory zawierajà odpowiednio 0,20 mg, 0,40 mg,
0,60 mg, 0,80 mg, 1,0 mg i 2,0 mg srebra w litrze.
Poz. 1173
D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 328,1 nm. Zero ustawia si´ na skali spektrofotometru absorbancji
atomowej w stosunku do wody redestylowanej. Wykonuje si´ kolejno bezpoÊrednie pomiary absorbancji
roztworów wzorcowych. Wykonuje si´ dwa równoleg∏e oznaczania.
4. WYRA˚ANIE WYNIKU
Obliczanie wyniku oznaczania
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç srebra w roztworach wzorcowych w mg/l.
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç
(C) srebra w miligramach na litr.
ZawartoÊç srebra w winie w miligramach na litr
wynosi 0,25 x C. WartoÊç ta jest podawana z dok∏adnoÊcià do dwóch znaków po przecinku.
Za∏àcznik nr 34
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CYNKU
Po usuni´ciu alkoholu zawartoÊç cynku jest oznaczana bezpoÊrednio w winie metodà spektrofotometrii
absorpcji atomowej.
j´toÊç próbki do po∏owy. Nast´pnie uzupe∏nia si´ do pierwotnej obj´toÊci 100 ml za pomocà wody redestylowanej.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
1. ODCZYNNIKI
Stosuje si´ wod´ redestylowanà w aparacie ze
szk∏a borokrzemowego. Jest mo˝liwe u˝ycie wody
o podobnym wskaêniku czystoÊci.
1) wzorcowy roztwór cynku zawierajàcy jeden gram
cynku w litrze
u˝ywa si´ wzorcowego handlowego roztworu cynku
lub sporzàdza si´ roztwór, rozpuszczajàc 4,3975 g
siarczanu cynku (ZnSO4 · 7 H2O) w wodzie i uzupe∏niajàc do obj´toÊci 1 litra;
2) rozcieƒczony roztwór wzorcowy zawierajàcy 100 mg
cynku w litrze.
2. APARATURA I SPRZ¢T
Do czterech kolb miarowych na 100 ml odmierza
si´ odpowiednio 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml i 2 ml roztworu zawierajàcego 100 mg cynku w litrze i uzupe∏nia wodà redestylowanà do 100 ml. Przygotowane w ten sposób
roztwory zawierajà odpowiednio 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg
i 2 mg cynku w litrze.
Oznaczanie
D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 213,9 nm. Zero ustawia si´ na skali absorbancji w stosunku do wody redestylowanej. Do palnika spektrofotometru absorpcji atomowej wprowadza si´ bezpoÊrednio wino,
a nast´pnie kolejno cztery roztwory wzorcowe. Nast´pnie odczytuje si´ absorbancj´. Wykonuje si´ dwa równoleg∏e oznaczania.
1) wyparka rotacyjna z ∏aênià wodnà z termostatem;
2) spektrofotometr absorpcji atomowej z palnikiem
powietrzno-acetylenowym;
4. WYRA˚ANIE WYNIKU
Obliczanie wyniku oznaczania
3) lampa cynkowa z katodà wn´kowà.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Przygotowanie próbki
Za pomocà wyparki rotacyjnej (temperatura od 50 do
60 °C) usuwa si´ alkohol ze 100 ml wina, zmniejszajàc ob-
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç cynku w roztworach wzorcowych w mg/l.
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) cynku w miligramach na litr.
Za∏àcznik nr 35
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI O¸OWIU
ZawartoÊç o∏owiu oznacza si´ bezpoÊrednio w winie metodà bezp∏omieniowej spektrofotometrii absorpcji atomowej.
1. ODCZYNNIKI
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Przygotowuje si´ seri´ roztworów, o st´˝eniach
odpowiednio 2,5 µg; 5 µg; 10 µg i 15 µg o∏owiu w litrze,
przez rozcieƒczanie wodà redestylowanà wzorcowego
roztworu o∏owiu.
Stosuje si´ wod´ redestylowanà w aparacie ze
szk∏a borokrzemowego, dopuszcza si´ u˝ycie wody
o podobnej czystoÊci. Wszystkie odczynniki sà czystoÊci analitycznej i nie zawierajà o∏owiu.
Programowanie temperatury pieca przeprowadza
si´ w nast´pujàcy sposób
1) 85 % kwas fosforowy o g´stoÊci ρ20 = 1,71 g/ml;
2) mineralizacja w temperaturze 900 °C do 20 sekund;
2) roztwór kwasu fosforowego otrzymany przez rozcieƒczenie 8 ml kwasu fosforowego wodà do
100 ml;
3) atomizacja w temperaturze 2250 °C od 2 do 3 sekund;
3) kwas azotowy o g´stoÊci ρ20 = 1,38 g/ml;
4) przep∏yw azotu (gaz p∏uczàcy): 6 litrów/minut´.
4) roztwór o∏owiu o st´˝eniu 1 g w litrze — u˝ywa si´
wzorcowego handlowego roztworu o∏owiu albo sporzàdza si´ taki roztwór, rozpuszczajàc 1,600 g azotanu
o∏owiu(II) Pb(NO3)2 w kwasie azotowym rozcieƒczonym do 1 % obj. i uzupe∏niajàc do 1 litra. Tak przygotowany roztwór przechowuje si´ w butelce ze szk∏a
borokrzemowego z korkiem na szlif.
W celu oczyszczenia pieca temperatur´ podnosi si´
do 2700 °C.
2. APARATURA I SPRZ¢T
Szk∏o laboratoryjne przed u˝yciem myje si´ w st´˝onym kwasie azotowym podgrzanym do temperatury
od 70 do 80 °C i sp∏ukuje wodà redestylowanà.
1) suszenie w temperaturze 100 °C do 30 sekund;
Pomiary
D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 217 nm, zero
ustawia si´ na skali absorbancji w stosunku do wody
redestylowanej. Za pomocà mikropipety wprowadza
si´ do pieca, o zaprogramowanej temperaturze, trzy
5 µl porcje ka˝dego z roztworów do kalibracji i roztworu badanej próbki. Odczytuje si´ wartoÊci absorbancji,
nast´pnie oblicza si´ Êrednià wartoÊç absorbancji na
podstawie wyników pomiaru trzech porcji.
1) spektrofotometr absorpcji atomowej wyposa˝ony
w piec grafitowy, niespecyficznà korekcj´ absorpcji i multipotencjometr;
4. WYRA˚ANIE WYNIKU
2) lampa o∏owiowa z katodà wn´kowà;
3) mikropipety na 5 µl z koƒcówkami do pomiarów
metodà absorpcji atomowej.
Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie
A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç o∏owiu w roztworach wzorcowych w mg/l.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç
(C) o∏owiu w miligramach na litr.
Przygotowanie próbki
Wino rozcieƒcza si´ w stosunku 1:2 lub 1:3 roztworem kwasu fosforowego, zale˝nie od oczekiwanej zawartoÊci o∏owiu okreÊlajàc wspó∏czynnik rozcieƒczenia (F).
Obliczanie wyniku oznaczania
ZawartoÊç o∏owiu w winie w miligramach na litr
wynosi
C x F,
gdzie F — oznacza wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
Za∏àcznik nr 36
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI FLUORKÓW
ZawartoÊç fluorków w winie, wprowadzonych do
roztworu buforowego, jest oznaczana za pomocà elektrody selektywnej z membranà sta∏à. Zmierzony za pomocà elektrody potencja∏ jest proporcjonalny do logarytmu aktywnoÊci jonów fluorkowych w badanym Êrodowisku, zgodnie z równaniem
E = E0 ± S log aF,
gdzie
E — oznacza potencja∏ elektrody jonoselektywnej
mierzony w stosunku do elektrody odniesienia
w badanym Êrodowisku,
3) miliwoltomierz (pehametr z rozszerzonà skalà miliwoltowà) o dok∏adnoÊci odczytu 0,1 mV;
4) mieszad∏o magnetyczne z p∏ytkà izolacyjnà, chroniàcà badany roztwór przed ciep∏em wytwarzanym
przez silnik nap´du mieszad∏a;
5) naczynie do mieszania roztworu zamykane pokrywkà z tworzywa sztucznego (z polietylenu lub
podobnego materia∏u);
6) zlewki z tworzywa sztucznego o pojemnoÊci od 30
do 50 ml i butelki z tworzywa sztucznego (z polietylenu lub podobnego materia∏u);
E0 — oznacza standardowy potencja∏ czujnika pomiarowego,
7) dok∏adne pipety (pipety skalowane w mikrolitrach
lub podobne).
S — oznacza nachylenie elektrody jonoselektywnej
(wspó∏czynnik Nernsta). W temperaturze
25 °C teoretyczne nachylenie wynosi 59,2 mV,
3. WYKONANIE OZNACZANIA
aF — oznacza aktywnoÊç jonów fluorkowych w badanym roztworze.
Wszystkie roztwory w trakcie oznaczania majà temperatur´ 25 °C (±1 °C). Odchylenie o wi´cej ni˝ 1 °C powoduje zmian´ mierzonego potencja∏u o oko∏o 0,2 mV.
1. ODCZYNNIKI
Metoda bezpoÊrednia
1) roztwór podstawowy fluorku o st´˝eniu 1 g/l
— u˝ywa si´ wzorcowego handlowego roztworu
o st´˝eniu 1 g/l albo roztwór ten sporzàdza si´, rozpuszczajàc 2,210 g fluorku sodowego (suszonego
od 3 do 4 godzin w temperaturze 105 °C) w wodzie
destylowanej, nast´pnie uzupe∏nia si´ wodà destylowanà do 1 litra;
Do zlewki z tworzywa sztucznego przenosi si´ odmierzonà iloÊç wina i takà samà obj´toÊç roztworu buforowego.
2) wzorcowe roztwory fluorku o odpowiednim st´˝eniu w mg/l sporzàdza si´ przez rozcieƒczanie roztworu podstawowego wodà destylowanà i przechowuje w butelce z tworzywa sztucznego. Roztwory wzorcowe przygotowuje si´ na potrzeby bie˝àce;
3) roztwór buforowy o pH 5,5 — 10 g kwasu trans-1,2-dwuaminocykloheksanoczterooctowego (CDTA)
wprowadza si´ do wody (oko∏o 50 ml); dodaje si´
58 g chlorku sodu i 29,4 g cytrynianu trójsodowego w 700 ml wody destylowanej. CDTA rozpuszcza
si´ po dodaniu oko∏o 6 ml 32 % (m/v) roztworu wodorotlenku sodu, na koniec dodaje si´ 57 ml kwasu octowego o st´˝eniu ρ20 = 1,05 g/ml i doprowadza pH do 5,5 za pomocà 32 % roztworu wodorotlenku sodowego (oko∏o 45 ml). Tak sporzàdzony
roztwór pozostawia si´ do ostygni´cia i uzupe∏nia
do 1 litra wodà destylowanà.
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) elektroda z membranà krystalicznà selektywna
w stosunku do jonów fluorkowych;
2) elektroda odniesienia (kalomelowa lub Ag/AgCl);
Roztwór miesza si´ w sposób równomierny i ∏agodny. Gdy wskazówka miliwoltomierza ustabilizuje
si´ (stabilnoÊç jest osiàgana, gdy wahania potencja∏u
nie przekraczajà 0,2 do 0,3 mV w ciàgu trzech minut),
odczytuje si´ wartoÊç potencja∏u w mV.
Metoda dodawania znanych iloÊci fluorku
Do badanej próbki dodaje si´ za pomocà mikropipety, przy ciàg∏ym mieszaniu, znanà obj´toÊç wzorcowego roztworu fluorku. Gdy wskazówka miliwoltomierza ustabilizuje si´, odczytuje si´ wartoÊç potencja∏u
w mV.
St´˝enie dodawanego roztworu wzorcowego ustala si´ w nast´pujàcy sposób
1) dwukrotnie lub trzykrotnie zwi´ksza si´ st´˝enie
fluorku w roztworze badanej próbki;
2) dopuszczalny przyrost obj´toÊci roztworu badanej
próbki co najwy˝ej 1 %.
Przybli˝one st´˝enie roztworu badanej próbki odczytuje si´ z krzywej wzorcowej wykreÊlonej na skali
pó∏logarytmicznej za pomocà roztworów wzorcowych
o st´˝eniu 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 i 2,0 mg/l.
Je˝eli przybli˝one st´˝enie roztworu badanej próbki znajduje si´ poza zakresem st´˝eƒ roztworów wzorcowych, próbk´ nale˝y rozcieƒczyç.
Obliczanie wyniku oznaczania
ZawartoÊç fluorków (CF) w roztworze badanej próbki w mg/l oblicza si´ wed∏ug wzoru
Va × Ca
1
CF = ————— × —————————— ,
(antylog ∆E/S) — 1
Vo
Poz. 1173
Va — oznacza obj´toÊç roztworu badanej próbki po
dodaniu roztworu fluorku (ml),
∆E — oznacza ró˝nic´ potencja∏ów otrzymanà w metodzie bezpoÊredniej i w metodzie dodawania
znanych iloÊci fluorku (mV),
S — oznacza nachylenie elektrody w badanym roztworze.
Je˝eli Va jest bardzo zbli˝one do Vo, stosuje si´
wzór
gdzie
CF — oznacza zawartoÊç fluorków w roztworze badanej próbki (mg/l),
Ca — oznacza zawartoÊç fluorków w roztworze dodanym (mg/l) do roztworu badanej próbki (Va),
Vo — oznacza poczàtkowà obj´toÊç roztworu badanej
próbki przed dodaniem roztworu fluorku (ml),
1
CF = Ca × ——————————— .
(antylog ∆E/S) — 1
Uzyskanà wartoÊç nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia, wynikajàcy z dodania do próbki
roztworu buforowego.
Za∏àcznik nr 37
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI DWUTLENKU W¢GLA
Wina inne ni˝ wina musujàce i gazowane (nadciÊnienie wywo∏ywane przez CO2 < 0,5 x 105 Pa)
Przygotowanie próbki
Odmierzona obj´toÊç wina jest sch∏adzana do temperatury oko∏o 0 °C i mieszana z wodorotlenkiem sodu
w iloÊci wystarczajàcej do sprowadzenia pH do wartoÊci 10—11. Miareczkowanie wykonuje si´ za pomocà
roztworu kwasu w obecnoÊci anhydrazy w´glowej (dehydrataza w´glanowa). ZawartoÊç dwutlenku w´gla
oblicza si´ na podstawie obj´toÊci kwasu potrzebnego
do zmiany pH z 8,6 (forma wodorow´glanowa) na 4,0
(kwas w´glowy). W celu uwzgl´dnienia iloÊci wodorotlenku sodowego zwiàzanego przez kwasy obecne
w winie przeprowadza si´ prób´ Êlepà, miareczkujàc
w tych samych warunkach wino pozbawione dwutlenku w´gla.
1. ODCZYNNIKI
1) 0,1-molowy roztwór wodorotlenku sodu (NaOH);
Do zlewki na 100 ml odmierza si´ 25 ml 0,1-molowego roztworu wodorotlenku sodu, dodaje dwie krople wodnego roztworu anhydrazy w´glowej o st´˝eniu
g/l, a nast´pnie za pomocà pipety sch∏odzonej do temperatury 0 °C wprowadza si´ 10 ml wina.
Zlewk´ umieszcza si´ na mieszadle magnetycznym, wk∏ada elektrod´ pehametru i miesza z umiarkowanà pr´dkoÊcià.
Gdy roztwór osiàgnie temperatur´ pokojowà, miareczkuje si´ powoli roztworem kwasu siarkowego do
uzyskania wartoÊci pH 8,6. IloÊç u˝ytego kwasu zapisuje si´.
Kontynuuje si´ miareczkowanie 0,05-molowym
roztworem kwasu siarkowego do uzyskania wartoÊci
pH 4,0. IloÊç ml kwasu zu˝ytego na zmian´ pH z 8,6 do
4,0 — oznacza si´ symbolem n. Z próbki wina o obj´toÊci oko∏o 50 ml usuwa si´ CO2 przez wstrzàsanie pod
pró˝nià przez 3 minuty, ogrzewajàc kolb´ w ∏aêni wodnej do temperatury 25 °C.
2) 0,05-molowy roztwór kwasu siarkowego (H2SO4);
3) roztwór anhydrazy w´glowej sporzàdzony w nast´pujàcy sposób — 1 g anhydrazy w´glowej rozpuszcza si´ w 1 litrze wody.
CzynnoÊci powtarza si´, u˝ywajàc 10 ml wina pozbawionego dwutlenku w´gla. IloÊç ml kwasu zu˝ytego w próbie Êlepej oznacza si´ symbolem n’.
2. APARATURA I SPRZ¢T
Obliczanie wyniku oznaczania
1) mieszad∏o magnetyczne;
1 ml odmiareczkowanego 0,1-molowego wodorotlenku sodowego odpowiada 4,4 mg CO2.
2) pehametr.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
ZawartoÊç CO2 w gramach na litr wina wynosi
0,44 x (n — n’).
Wino razem z pipetà na 10 ml u˝ywanà do pobierania próbek sch∏adza si´ do temperatury oko∏o 0 °C.
WartoÊç t´ podaje si´ z dok∏adnoÊcià do dwóch
znaków po przecinku.
Je˝eli wino zawiera poni˝ej 1 g/l CO2, nie jest konieczne dodawanie anhydrazy w´glowej w celu katalizowania reakcji hydratacji CO2.
Poz. 1173
10 ml zalkalizowanego wina. Zlewk´ umieszcza si´ na
mieszadle magnetycznym, wk∏ada elektrod´ oraz mieszade∏ko magnetyczne i miesza si´ z umiarkowanà
pr´dkoÊcià.
Wina musujàce i pó∏musujàce
Przygotowanie próbki
Próbk´ wina do analizy sch∏adza si´ w temperaturze bliskiej temperaturze zamarzania. Po pobraniu
pewnej iloÊci wina do wykonania próby Êlepej po usuni´ciu dwutlenku w´gla wino pozosta∏e w butelce alkalizuje si´ w celu zwiàzania ca∏ego dwutlenku w´gla
w formie Na2CO3. Miareczkowanie wykonuje si´ za pomocà roztworu kwasu w obecnoÊci anhydrazy w´glowej. ZawartoÊç dwutlenku w´gla oblicza si´ na podstawie obj´toÊci kwasu potrzebnej do zmiany pH z 8,6
(forma wodorow´glanowa) na 4,0 (kwas w´glowy).
W celu uwzgl´dnienia iloÊci wodorotlenku sodowego
zwiàzanego przez kwasy obecne w winie prób´ Êlepà
wykonuje si´, miareczkujàc w tych samych warunkach
wino pozbawione dwutlenku w´gla.
1. ODCZYNNIKI
1) roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) 50 % wagowo;
2) 0,05-molowy roztwór kwasu siarkowego (H2SO4);
Miareczkuje si´ powoli 0,05-molowym roztworem
kwasu siarkowego do osiàgni´cia pH 8,6. Zapisuje si´
iloÊç zu˝ytego roztworu kwasu.
Miareczkuje si´ dalej powoli 0,05-molowym roztworem kwasu siarkowego do uzyskania wartoÊci
pH 4,0.
Z próbki wina o obj´toÊci v ml, pozostawionego do
wykonania próby Êlepej, usuwa si´ CO2 przez wstrzàsanie pod pró˝nià przez 3 minuty, ogrzewajàc kolb´
w ∏aêni wodnej do temperatury 25 °C. Pobiera si´ 10 ml
wina pozbawionego dwutlenku w´gla i dodaje 30 ml
przegotowanej wody destylowanej, nast´pnie dodaje
si´ dwie do trzech kropli roztworu wodorotlenku sodu
(50 % obj.), aby sprowadziç pH do wartoÊci 10—11.
Zlewk´ umieszcza si´ na mieszadle magnetycznym,
wk∏ada elektrod´ oraz mieszade∏ko magnetyczne i miesza si´ z umiarkowanà pr´dkoÊcià. Miareczkuje si´ powoli 0,05-molowym roztworem kwasu siarkowego do
osiàgni´cia pH 8,6. Zapisuje si´ iloÊç zu˝ytego roztworu kwasu.
3) roztwór anhydrazy w´glowej sporzàdzony w nast´pujàcy sposób: 1 g anhydrazy w´glowej rozpuszcza si´ w 1 litrze wody.
Miareczkuje si´ dalej powoli 0,05-molowym roztworem kwasu siarkowego do uzyskania wartoÊci
pH 4,0.
2. APARATURA I SPRZ¢T
Obliczanie wyniku oznaczania
1) cylinder miarowy;
1 ml 0,05-molowego roztworu kwasu siarkowego
odpowiada 4,4 mg CO2.
2) mieszad∏o magnetyczne;
3) pehametr.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Zaznacza si´ poziom wina w butelce, nast´pnie
sch∏adza si´ do rozpocz´cia zamarzania tego wina. Butelk´ ogrzewa si´ lekko, stale wstrzàsajàc do znikni´cia
kryszta∏ów lodu. Szybko wyjmuje si´ korek i odmierza
45 do 50 ml wina do cylindra miarowego w celu wykonania próby Êlepej. Dok∏adnà iloÊç odmierzonego wina
(v ml) odczytuje si´ w cylindrze miarowym po sprowadzeniu próbki do temperatury oko∏o 20 °C.
Natychmiast po pobraniu wina do próby Êlepej do
butelki o pojemnoÊci 750 ml dodaje si´ 20 ml roztworu
wodorotlenku sodu (50 % obj.).
Wino pozostawia si´, a˝ osiàgnie temperatur´ pokojowà.
Do zlewki na 100 ml odmierza si´ 30 ml przegotowanej wody destylowanej i dodaje dwie krople roztworu anhydrazy w´glowej (1 g/l), a nast´pnie dodaje si´
Opró˝nia si´ butelk´ wina, które zosta∏o zalkalizowane, i oznacza poczàtkowà obj´toÊç wina (V) z dok∏adnoÊcià do 1 ml przez nape∏nienie butelki wodà do
zaznaczonej wysokoÊci.
ZawartoÊç CO2 (G) w gramach na litr wina oblicza
si´ wed∏ug wzoru
(V — v + 20)
G = 0,44 (n — n’) × —————— ,
V—v
gdzie
n’ — oznacza iloÊç ml zu˝ytego 0,5-molowego roztworu kwasu siarkowego,
n — oznacza iloÊç ml kwasu zu˝ytego na zmian´ pH
z 8,6 na 4,0,
V — oznacza zmierzonà poczàtkowà obj´toÊç wina
w ml,
v — oznacza zmierzonà koƒcowà obj´toÊç wina
w ml.
Wynik podaje si´ z dok∏adnoÊcià do dwóch znaków
po przecinku.
NadciÊnienie w temperaturze 20 °C (Paph20) wyra˝ane w paskalach oblicza si´ wed∏ug wzoru
Q
Paph20 = —————————————————————— — Patm ,
–5
1,951 x 10 x (0,86 x 0,01 A) x (1 — 0,00144 S)
gdzie
Q
A
— oznacza zawartoÊç CO2 w g/l wina,
— oznacza zawartoÊç alkoholu w winie w temperaturze 20 °C,
S
— oznacza zawartoÊç cukrów w winie w g/l,
Patm — oznacza ciÊnienie atmosferyczne, wyra˝one
w paskalach.
Za∏àcznik nr 38
OZNACZANIE ZAWARTOÂCI POCHODNYCH CYJANKOWYCH
Wolny kwas cyjanowodorowy jest uwalniany
w wyniku hydrolizy kwasowej i wydzielany metodà destylacji. Utworzony po reakcji z chloraminà-T i pirydynà dialdehyd glutakonowy jest oznaczany kolorymetrycznie na podstawie niebieskiego zabarwienia, jakie
daje z kwasem 1,3-dimetylo-barbiturowym.
1. ODCZYNNIKI
1) 25 % kwasu fosforowego (H3PO4) (m/v);
2) 3 % roztwór chloraminy-T (C7H7ClNaO2S⋅3H2O) (m/v);
3) roztwór kwasu 1,3-dimetylo-barbiturowego: rozpuszcza si´ 3,658 g kwasu 1,3-dimetylo-barbiturowego (C6H8N2O3) w 15 ml pirydyny i 3 ml kwasu
solnego (o g´stoÊci ρ20 = 1,019 g/ml) i dodaje si´
50 ml wody destylowanej;
4) cyjanek potasu (KCN);
5) 10 % roztwór jodku potasu (KJ) (m/v);
6) 0,1-molowy roztwór azotanu srebra (AgNO3).
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) aparatura destylacyjna; stosowaç aparat do destylacji do oznaczania zawartoÊci alkoholu w winie
opisany w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia;
2) kolba okràg∏odenna na 500 ml z zakoƒczeniem na
szlif;
3) ∏aênia wodna z termostatem umo˝liwiajàca kontrol´ temperatury w 20 °C;
4) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar absorbancji przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 590 nm;
5) kuwety szklane lub jednorazowe kuwety o d∏ugoÊci drogi optycznej 20 mm;
6) wyskalowane naczynie o pojemnoÊci 300 ml.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Destylacja
Do kolby o pojemnoÊci 500 ml odmierza si´ 25 ml
wina, 50 ml wody destylowanej i 1 ml 25 % kwasu fosforowego oraz dodaje si´ kilka kulek szklanych. Kolb´
pod∏àcza si´ do aparatu do destylacji. U˝ywa si´ sto˝kowej rurki (przed∏u˝acz ch∏odnicy) doprowadzajàcej
destylat do kolby miarowej na 50 ml zawierajàcej 10 ml
wody. Kolb´ miarowà zanurza si´ w lodowatej wodzie.
Do kolby miarowej zbiera si´ 30 do 35 ml destylatu (lub
oko∏o 45 ml p∏ynu w sumie).
Sto˝kowà rurk´ ch∏odnicy przep∏ukuje si´ kilkoma
mililitrami wody destylowanej, destylat doprowadza
si´ do temperatury 20 °C i uzupe∏nia si´ kolb´ wodà destylowanà do 50 ml.
Wykonanie pomiaru
Odmierza si´ 25 ml destylatu do kolby sto˝kowej na
50 ml z zakoƒczeniem na szlif, dodaje 1 ml 3 % roztworu chloraminy-T, a nast´pnie kolb´ zamyka si´ korkiem. Po dok∏adnie 60 s dodaje si´ 3 ml roztworu kwasu 1,3-dimetylo-barbiturowego, kolb´ zamyka si´ i pozostawia na 10 minut. Nast´pnie mierzy si´ absorbancj´ próbki i próby Êlepej (25 ml wody destylowanej zamiast 25 ml destylatu) przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej
590 nm w kuwecie o d∏ugoÊci drogi optycznej równej
20 mm.
4. WYKONANIE KRZYWEJ WZORCOWEJ
Argentometryczne miareczkowanie cyjanku potasu
W wyskalowanym naczyniu o pojemnoÊci 300 ml
rozpuszcza si´ oko∏o 0,2 g cyjanku potasu w 100 ml wody destylowanej. Dodaje si´ 0,2 ml 10 % roztworu jodku potasu i miareczkuje si´ 0,1-molowym roztworem
azotanu srebra do uzyskania trwa∏ego ˝ó∏tego zabarwienia.
Przy za∏o˝eniu, ˝e 1 ml 0,1-molowego roztworu azotanu srebra iloÊciowo odpowiada 13,2 mg cyjanku potasu, wylicza si´ zawartoÊç cyjanku potasu w próbce.
Przygotowanie roztworów wzorcowych
Majàc ustalonà zawartoÊç cyjanku potasu, przygotowuje si´ roztwór wzorcowy zawierajàcy 30 mg/l kwasu cyjanowodorowego (30 mg HCN = 72,3 KCN). Rozcieƒcza si´ w stosunku 1 do 10.
Poz. 1173
5. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
Do kolb miarowych na 100 ml odmierza si´ po
1,0 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml i 5,0 ml rozcieƒczonej próbki i uzupe∏nia wodà destylowanà. Przygotowane roztwory zawierajà odpowiednio po 30 µg; 60 µg; 90 µg;
120 µg i 150 µg kwasu cyjanowodorowego w litrze.
W przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi
dla
WykreÊlanie krzywej wzorcowej
gdzie
Do kolb sto˝kowych na 50 ml, z zakoƒczeniem na
szlif, pobiera si´ po 25 ml roztworów wzorcowych. Nast´pnie dodaje si´ po 1 ml 3 % roztworu chloraminy-T,
po czym kolb´ zamyka si´ korkiem. Po dok∏adnie
60 s dodaje si´ 3 ml roztworu kwasu 1,3-dimetylo-barbiturowego, kolb´ zamyka si´ i pozostawia na 10 minut. Nast´pnie mierzy si´ absorbancj´ przy d∏ugoÊci
fali Êwietlnej 590 nm w kuwecie o d∏ugoÊci drogi
optycznej równej 20 mm. Z uzyskanych wartoÊci absorbancji wykreÊla si´ krzywà wzorcowà w uk∏adzie
A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´ roztworów
wzorcowych, c — oznacza st´˝enie kwasu cyjanowodorowego w roztworach wzorcowych w µg/l. Krzywa
wzorcowa ma postaç linii prostej przechodzàcej przez
poczàtek uk∏adu wspó∏rz´dnych.
xi — oznacza Êrednià zawartoÊç HCN w winie,
Obliczanie wyniku oznaczania
1) wina bia∏ego 3,1 µg/l lub w przybli˝eniu 6 % xi;
2) wina czerwonego 6,4 µg/l lub w przybli˝eniu 8 % xi,
xi — dla wina bia∏ego wynosi 48,4 µg/l,
xi — dla wina czerwonego wynosi 80,5 µg/l.
6. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
W przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi dla
1) wina bia∏ego 12 µg/l lub w przybli˝eniu 25 % xi;
ZawartoÊç kwasu cyjanowodorowego jest wyra˝ana
w mikrogramach na litr (µg/l) z dok∏adnoÊcià do jednoÊci.
2) wina czerwonego 23 µg/l lub w przybli˝eniu 29 % xi,
Sposób wyliczenia
gdzie
Odczytuje si´ zawartoÊç kwasu cyjanowodorowego z krzywej wzorcowej. JeÊli próbka by∏a rozcieƒczona, uzyskany wynik mno˝y si´ przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
xi — oznacza Êrednià zawartoÊç HCN w winie,
xi — dla wina bia∏ego wynosi 48,4 µg/l,
xi — dla wina czerwonego wynosi 80,5 µg/l.
Za∏àcznik nr 39
WYKRYWANIE OBECNOÂCI IZOTIOCYJANIANU ALLILOWEGO
Izotiocyjanian allilowy obecny w winie oddestylowuje si´ i identyfikuje metodà chromatografii gazowej.
3) mieszanina zamra˝ajàca, sk∏adajàca si´ z etanolu
i suchego lodu (temperatura –60 °C).
2. APARATURA I SPRZ¢T
1. ODCZYNNIKI
1) etanol bezwodny;
2) roztwór wzorcowy izotiocyjanianu allilowego
w bezwodnym alkoholu sporzàdza si´, rozpuszczajàc 15 mg izotiocyjanianu allilowego w litrze;
1) aparat destylacyjny (przedstawiony na schemacie), przez który przep∏ywa strumieƒ azotu;
2) p∏aszcz grzejny z termostatem;
3) przep∏ywomierz;
4) chromatograf gazowy z detektorem p∏omieniowo-spektrofotometrycznym, wyposa˝ony w filtr selektywny dla zwiàzków siarkowych (d∏ugoÊç fali
= 394 nm) lub inny odpowiedni detektor;
5) kolumna chromatograficzna ze stali kwasoodpornej, o Êrednicy wewn´trznej 3 mm i d∏ugoÊci 3 m,
z fazà stacjonarnà 10 % Carbowax 20M osadzonà
na noÊniku Chromosorb WHP, 80 do 100 mesh;
6) mikrostrzykawka, 10 µl.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Do kolby destylacyjnej odmierza si´ 2 litry wina, do
dwóch próbówek odbierajàcych dodaje si´ kilka mililitrów bezwodnego etanolu, tak aby porowata cz´Êç rurek rozprowadzajàcych gaz by∏a ca∏kowicie zakryta.
Och∏adza si´ obie próbówki od zewnàtrz mieszaninà
zamra˝ajàcà. ¸àczy si´ kolb´ z próbówkami odbierajàcymi i rozpoczyna przep∏ukiwanie aparatu azotem
z pr´dkoÊcià 3 litrów na minut´. Wino podgrzewa si´
do temperatury 80 °C za pomocà p∏aszcza grzejnego
Poz. 1173
i destyluje, zbierajàc 45 do 50 ml destylatu. Nast´pnie
chromatograf stabilizuje si´. Zaleca si´ przestrzegaç
nast´pujàcych warunków
1) temperatura komory nastrzykowej 200 °C;
2) temperatura kolumny 130 °C;
3) przep∏yw gazu noÊnego helu 20 ml/min.
Za pomocà mikrostrzykawki wprowadza si´ takà
obj´toÊç roztworu wzorcowego, aby pik odpowiadajàcy izotiocyjanianowi allilowemu móg∏ byç ∏atwo zidentyfikowany na uzyskanym chromatogramie.
W podobny sposób wprowadza si´ do chromatografu próbk´ destylatu. Sprawdza si´, czy czas retencji
uzyskanego piku odpowiada czasowi retencji piku izotiocyjanianu allilowego.
W wy˝ej podanych warunkach sk∏adniki wyst´pujàce naturalnie w winie nie b´dà dawa∏y zak∏ócajàcych
pików na chromatogramie badanej próbki.
Schemat aparatu do destylacji w strumieniu azotu
Za∏àcznik nr 40
OZNACZANIE WSKAèNIKA FOLIN-CIOCALTEU
Wskaênik Folin-Ciocalteu jest to wynik oznaczania
uzyskany wed∏ug nast´pujàcej metody: wszystkie
zwiàzki fenolowe wyst´pujàce w winie sà utleniane
przez odczynnik Folin-Ciocalteu. Odczynnik ten stanowi
mieszanina kwasu fosfowolframowego (H3PW12O40)
i kwasu fosfomolibdenowego (H3PMo12O40), które po
utlenieniu fenoli ulegajà redukcji do mieszaniny niebieskich tlenków wolframu (W8O23) i molibdenu (Mo8O23).
Powsta∏a barwa niebieska wykazuje maksimum
absorbcji w pobli˝u 750 nm, a jej nat´˝enie jest proporcjonalne do ca∏kowitej iloÊci zwiàzków fenolowych
obecnych w winie.
1. ODCZYNNIKI
1) odczynnik Folin-Ciocalteu sporzàdza si´, rozpuszczajàc 100 g wolframianu sodu (Na2WO4 · 2H2O)
i 25 g molibdenianu sodu (Na2MoO4 · 2H2O) w 700 ml
wody destylowanej. Nast´pnie dodaje si´ 50 ml 85 %
kwasu fosforowego (o g´stoÊci ρ20 = 1,71 g/ml)
i 100 ml st´˝onego kwasu solnego (o g´stoÊci
ρ20 = 1,19 g/ml). Doprowadza si´ do wrzenia i gotuje
przez 10 godzin pod ch∏odnicà zwrotnà, nast´pnie dodaje si´ 150 g siarczanu litu (Li2SO4 · H2O), kilka kropli
bromu i ponownie gotuje si´ przez 15 minut i odstawia do ostygni´cia, i uzupe∏nia wodà destylowanà do
1 litra;
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Wino czerwone
Do kolby miarowej na 100 ml odmierza si´ odpowiednio 1 ml wina (rozcieƒczonego uprzednio w stosunku 1 : 5), 50 ml wody destylowanej, 5 ml odczynnika Folin-Ciocalteu, 20 ml roztworu w´glanu sodu i uzupe∏nia wodà do 100 ml.
ZawartoÊç próbki miesza si´ dok∏adnie i pozostawia na 30 minut do ustabilizowania si´ reakcji. Absorbancj´ oznacza si´ przy 750 nm i d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm w stosunku do próby Êlepej, w której zamiast
wina u˝ywa si´ wody.
Je˝eli absorbancja jest wi´ksza od wartoÊci 0,3,
próbk´ si´ rozcieƒcza.
Wina bia∏e
Do kolby miarowej o pojemnoÊci 100 ml odmierza
si´ odpowiednio 1 ml nierozcieƒczonego wina bia∏ego,
50 ml wody destylowanej, 5 ml odczynnika Folin-Ciocalteu, 20 ml roztworu w´glanu sodu i uzupe∏nia wodà
do 100 ml.
2) bezwodny w´glan sodu (Na2CO3), w 20 % (m/v)
roztworze;
ZawartoÊç próbki miesza si´ dok∏adnie i pozostawia na 30 minut do ustabilizowania si´ reakcji. Absorbancj´ oznacza si´ przy 750 nm i d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm w stosunku do próby Êlepej, w której zamiast
wina u˝ywa si´ wody.
3) u˝ywa si´ wody destylowanej lub wody o podobnej czystoÊci.
Je˝eli absorbancja jest wi´ksza od wartoÊci 0,3,
próbk´ si´ rozcieƒcza.
2. APARATURA I SPRZ¢T
4. POWTARZALNOÂå
1) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 750 nm;
2) kolby miarowe o pojemnoÊci 100 ml.
Ró˝nica pomi´dzy dwoma wynikami dwóch oznaczaƒ wykonanych równolegle lub zaraz po sobie, przez
t´ samà osob´, nie mo˝e byç wi´ksza od jednoÊci.
Za∏àcznik nr 41
OZNACZANIE STOSUNKU IZOTOPÓW TLENU O MASIE ATOMOWEJ 18 I 16 (18O/16O)
W WODZIE ZAWARTEJ W WINIE
Metodà tà mierzy si´ stosunek izotopów tlenu
18O/16O w wodzie. Wyra˝a si´ go w odchyleniu (δ ‰)
w stosunku do wartoÊci stosunku izotopów mi´dzynarodowego wzorca V.SMOW, przy zastosowaniu nast´pujàcego
wzoru
[
]
R
δ ‰ = ———— – 1 x 1000,
RSMOW
gdzie
R
— oznacza
stosunek
izotopów
18O/16O w badanej próbce,
RSMOW — oznacza
stosunek
18O/16O we wzorcu.
izotopów
tlenu
tlenu
Stosunek izotopów tlenu 18O/16O jest okreÊlany za
pomocà spektrometrii masowej stosunków izotopo-
wych
(MSIR)
dla
strumieni
jonowych
12C16O18O (m/z 46) oraz 12C16O (m/z 44) produkowa2
nych przez dwutlenek w´gla uzyskany po wymianie
z wodà w winie zgodnie z reakcjà
12C16O + H 18O ↔ C16O18O + H 16O
2
2
2
1. ODCZYNNIKI
oznaczania
proporcji
izotopów
rów. Nast´pnie zamyka si´ zawory i pozwala, aby
wszystko si´ ponownie podgrza∏o. Cykl odgazowywania jest powtarzany do momentu, gdy przestanà wyst´powaç wahania lub zmiany ciÊnienia.
Wyrównywanie wody i CO2
W analizie jest wykorzystywany dwutlenek w´gla
w fazie gazowej.
Do
Poz. 1173
tlenu
18O/16O stosuje si´ nast´pujàce odczynniki
1) dwutlenek w´gla do analiz;
2) SMOW (Standard Mean Ocean Water — Standard
Wody Oceanicznej);
3) SLAP (Standard Light Arctic Precipitation — Standard Osadu Arktycznego);
4) referencyjna woda wystandaryzowana w odniesieniu do próbki referencyjnej Mi´dzynarodowej
Agencji Energii Atomowej w Wiedniu (IAEA).
2. APARATURA I SPRZ¢T
1) spektrometr masowy z powtarzalnoÊcià wewn´trznà 0,05 ‰;
2) podwójny kolektor do mierzenia jonów m/z 44 i 46;
3) termostat (± 0,5 °C) w celu wyrównania temperatury mi´dzy CO2 i wodà zawartà w winie;
4) pompa pró˝niowa zdolna do osiàgni´cia wewn´trznego ciÊnienia 0,13 Pa;
5) fiolki na próbki o pojemnoÊci 15 ml oraz dodatkowa rurka kapilarna o wewn´trznej Êrednicy oko∏o
0,015 mm;
6) pipeta Eppendorfa z plastikowà wymiennà koƒcówkà;
7) kolba okràg∏odenna.
3. WYKONANIE OZNACZANIA
Metoda r´czna
Wprowadzenie próbki
W celu wprowadzenia próbki bierze si´ pipet´ Eppendorfa o pojemnoÊci 1,5 ml, nak∏ada w∏aÊciwà koƒcówk´ i wpompowuje p∏yn do kolby okràg∏odennej.
Nast´pnie dooko∏a szyjki kolby okràg∏odennej nak∏ada
si´ smar silikonowy i przy∏àcza si´ kolb´ do zaworu,
sprawdzajàc, czy jest dok∏adnie zamkni´ty.
CzynnoÊç powtarza si´ dla ka˝dej kolby na rampie
roboczej, przy czym do jednej z nich wprowadza si´ referencyjnà wod´ laboratoryjnà.
Odgazowywanie rampy
Dwie rampy ch∏odzone p∏ynnym azotem odpowietrza si´ do ciÊnienia 0,1 mm Hg przez otworzenie zawo-
Rampy robocze sch∏adza si´ do –70 °C (mieszankà
p∏ynnego azotu i alkoholu) w celu zamro˝enia wody,
a nast´pnie umieszcza w pró˝ni. Po ustabilizowaniu
pró˝ni odizolowuje si´ ramp´ przez zamkni´cie zaworów oraz odgazowanie systemu wprowadzajàcego
CO2. Pod∏àcza si´ dop∏yw gazowego CO2 do rampy roboczej i po odizolowaniu jej od reszty systemu umieszcza si´ ramp´ w ∏aêni z termostatem w temperaturze
25 °C (± 0,5 °C) na 12 godzin.
Transfer wymienionego CO2 do cel pomiarowych
spektrometru masowego
Stosuje si´ stojak na próbki, który pozwala wstawiç
tyle celek pomiarowych, ile jest kolb okràg∏odennych
zawierajàcych wymieniony CO2, które sà przystosowane do pustej linii za rampà roboczà. Puste celki sà
ostro˝nie odgazowywane i wymieniony gaz zawarty
w kolbach jest przenoszony do próbówek uprzednio
sch∏odzonych p∏ynnym azotem. Nast´pnie próbówki
pozostawia si´ do ogrzania do temperatury pokojowej.
Metoda automatyczna
W celu osiàgni´cia równowagi próbówki nape∏nia
si´ 2 ml wina oraz 2 ml wody (referencyjna do prac laboratoryjnych) i sch∏adza si´ do temperatury –18 °C.
Prowadnice zawierajàce zamro˝one produkty sà przystosowywane do systemu wyrównywania i po osiàgni´ciu pró˝ni w systemie jest wprowadzany dwutlenek w´gla pod ciÊnieniem 800 hPa. Równowaga jest
osiàgana przy temperaturze 22 ± 0,5 °C po minimalnym okresie pi´ciu godzin przy umiarkowanym mieszaniu. Poniewa˝ czas osiàgni´cia równowagi zale˝y
od kszta∏tu fiolki, najpierw okreÊla si´ optymalny czas
potrzebny do uzyskania równowagi dla danego systemu.
Dwutlenek w´gla zawarty w fiolkach jest nast´pnie
przenoszony do komory nastrzykowej spektrometru
masowego przez rurk´ kapilarnà. Pomiar jest przeprowadzany zgodnie z procedurà pomiaru na danym instrumencie.
4. OBLICZANIE WYNIKÓW OZNACZANIA
Wzgl´dna ró˝nica (δ’) stosunków nat´˝enia jonów
m/z 46 i 44 [I46/I44] pomi´dzy próbkà a wzorcem jest wyra˝ona w ‰ za pomocà nast´pujàcego równania
[
]
(I46/I44 próbki)
δ’próbki = ———————
– 1 × 1000,
I46/I44 wzorca
gdzie
I46/I44 próbki — oznacza stosunek nat´˝enia jonów
m/z 46 i 44 w próbce,
I46/I44 wzorca — oznacza stosunek nat´˝enia jonów
m/z 46 i 44 we wzorcu.
ZawartoÊç 18O w próbce (δ’18O) w porównaniu ze
wzorcem V.SMOW na skali V.SMOW/SLAP jest uzyskiwana za pomocà nast´pujàcego równania
δ’ próbki – δ’ SMOW
δ’18O = —————————— × 55,5,
δ’ SMOW – δ’ SLAP
[
]
gdzie
δ’ próbki — oznacza wzgl´dnà ró˝nic´ stosunków nat´˝enia jonów m/z 46 i 44 w próbce,
δ’ SMOW — oznacza wzgl´dnà ró˝nic´ stosunków nat´˝enia jonów m/z 46 i 44 we wzorcu
SMOW,
δ’ SLAP — oznacza wzgl´dnà ró˝nic´ stosunków nat´˝enia jonów m/z 46 i 44 we wzorcu
SLAP.
WartoÊç akceptowana dla SLAP jest równa 55,5 ‰
w porównaniu z V.SMOW. Proporcja izotopów we
wzorcu jest okreÊlana po ka˝dej serii 10 pomiarów nieznanych próbek.
Poz. 1173
5. POWTARZALNOÂå METODY
PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez
tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
PowtarzalnoÊç metody (r) jest równa 0,24 ‰.
6. ODTWARZALNOÂå METODY
OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna
ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody,
dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez
ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
OdtwarzalnoÊç metody (R) jest równa 0,50 ‰.
Egzemplarze bie˝àce oraz archiwalne mo˝na nabywaç
– w Zak∏adzie Wydawnictw i Poligrafii Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów, ul. Powsiƒska 69/71,
02-903 Warszawa, tel. 694-67-00, 694-60-96 — na podstawie nades∏anego zamówienia (wy∏àcznie sprzeda˝ wysy∏kowa);
– w punktach sprzeda˝y Dziennika Ustaw i Monitora Polskiego w Warszawie (sprzeda˝ wy∏àcznie za gotówk´)
– ul. Powsiƒska 69/71, tel. 694-62-96
– al. Szucha 2/4, tel. 629-61-73 (od 1997 r.)
Reklamacje z powodu niedor´czenia poszczególnych numerów zg∏aszaç nale˝y na piÊmie do Zak∏adu Wydawnictw i Poligrafii
Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów, ul. Powsiƒska 69/71, 02-903 Warszawa,
do 15 dni po otrzymaniu nast´pnego kolejnego numeru
O wszelkich zmianach nazwy lub adresu prenumeratora prosimy niezw∏ocznie informowaç na piÊmie Zak∏ad Wydawnictw i Poligrafii
Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów
Dziennik Ustaw i Monitor Polski dost´pne sà w Internecie pod adresem www.cokprm.gov.pl
Wydawca: Kancelaria Prezesa Rady Ministrów
Redakcja: Rzàdowe Centrum Legislacji — Redakcja Dziennika Ustaw Rzeczypospolitej Polskiej
oraz Dziennika Urz´dowego Rzeczypospolitej Polskiej „Monitor Polski”,
Al. Ujazdowskie 1/3, 00-583 Warszawa, tel. 622-66-56
Sk∏ad, druk i kolporta˝: Zak∏ad Wydawnictw i Poligrafii Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów
ul. Powsiƒska 69/71, 02-903 Warszawa, tel.: 694-67-50, 694-67-52; faks 694-62-06
Bezp∏atna infolinia: 0-800-287-581
www.cokprm.gov.pl
e-mail: dziust@cokprm.gov.pl
'8
Z\G
!
T∏oczono z polecenia Prezesa Rady Ministrów w Zak∏adzie Wydawnictw i Poligrafii Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów,
ul. Powsiƒska 69/71, 02-903 Warszawa
Zam. 425/W/C/2003
ISSN 0867-3411
Cena 9,80 z∏ (w tym 7% VAT)
34. Namibia
35. Norwegia
36. Republika Po∏udniowej Afryki
37. Republika Ârodkowoafrykaƒska
38. Rzeczpospolita Polska
39. Federacja Rosyjska
40. Sierra Leone
41. S∏owenia
42. Sri Lanka
43. Stany Zjednoczone Ameryki
44. Suazi
45. Szwajcaria
46. Tajlandia
47. Tanzania
48. Togo
49. Tunezja
50. Turcja
51. Ukraina
52. kraje cz∏onkowskie Unii Europejskiej
53. Wenezuela
54. W´gry
55. Wietnam
56. Wybrze˝e KoÊci S∏oniowej
57. Zimbabwe
58. Zjednoczone Emiraty Arabskie
9. Chiƒska Republika Ludowa
10. Cypr
11. Republika Czeska
12. Filipiny
13. Gabon
14. Ghana
15. Gujana
16. Gwinea
17. Indie
18. Izrael
19. Japonia
20. Kamerun
21. Kanada
22. Demokratyczna Republika Konga
23. Republika Konga
24. Koreaƒska Republika Ludowo-Demokratyczna
25. Republika Korei
26. Laos
27. Lesotho
28. Liban
29. Malezja
30. Mali
31. Malta
32. Mauritius
33. Meksyk
1173
ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI1)
z dnia 12 maja 2003 r.
w sprawie metod analiz wyrobów winiarskich do celów urz´dowej kontroli
pod wzgl´dem jakoÊci handlowej
Na podstawie art. 29 pkt 2 ustawy z dnia 25 lipca
2001 r. o wyrobie i rozlewie wyrobów winiarskich oraz
obrocie tymi wyrobami (Dz. U. Nr 128, poz. 1401) zarzàdza si´, co nast´puje