Põllumajandusminister — Söötade analüüsi ja hindamise metoodikate kinnitamine — RTL, 65, 853

Söödaseaduse (RT I 1998, 64/65, 1004) paragrahvi 4 lõike 3 punkti 6 alusel ning kooskõlas Euroopa Liidu direktiividega 70/373/EMÜ, 70/250/EMÜ, 71/393/EMÜ, 72/199/EMÜ, 72/275/EMÜ, 73/46/EMÜ, 73/47/EMÜ, 74/203/EMÜ, 75/84/EMÜ, 76/372/EMÜ, 78/633/EMÜ, 81/680/EMÜ, 81/715/EMÜ, 84/4/EMÜ, 84/425/EMÜ, 92/89/EMÜ, 92/95/EMÜ, 93/28/EMÜ, 93/70/EMÜ, 93/117/EÜ, 94/14/EÜ: Kinnitan «Söötade analüüsi ja hindamise metoodikad» alljärgnevalt: 1) «Söötade analüüsimetoodikate üldised tingimused» (lisa 1); 2) «Niiskuse määramise metoodika» (lisa 2); 3) «Loomsetes ja taimsetes rasvades ja õlides niiskuse määramise metoodika» (lisa 3); 4) «Toorproteiini määramise metoodika» (lisa 4); 5) «Pepsiinis ja vesinikkloriidhappes lahustuva toorproteiini määramise metoodika» (lisa 5); 6) «Pepsiini aktiivsuse hindamise metoodika» (lisa 6); 7) «Toorkiu määramise metoodika» (lisa 7); 8) «Toorõli ja -rasva määramise metoodika» (lisa 8); 9) «Toortuha määramise metoodika» (lisa 9); 10) «Vesinikkloriidhappes lahustumatu tuha määramise metoodika» (lisa 10); 11) «Kogu fosfori fotomeetrilise määramise metoodika» (lisa 11); 12) «Kaltsiumi määramise metoodika» (lisa 12); 13) «Kaaliumi määramise metoodika» (lisa 13); 14) «Magneesiumi aatomabsorptsioon-spektrofotomeetrilise määramise metoodika» (lisa 14); 15) «Naatriumi määramise metoodika» (lisa 15); 16) «Mikroelementide raua, vase, mangaani ja tsingi määramise metoodika» (lisa 16); 17) «Karbonaatide määramise metoodika» (lisa 17); 18) «Kloori kloriidides määramise metoodika» (lisa 18); 19) «Lenduvate lämmastikaluste mikrodifusiooni teel määramise metoodika» (lisa 19); 20) «Lenduvate lämmastikaluste destillatsiooni teel määramise metoodika» (lisa 20); 21) «Vesiniktsüaniidhappe määramise metoodika» (lisa 21); 22) «Tärklise polarimeetrilise määramise metoodika» (lisa 22); 23) «Tärklise määramise pankreatiinmetoodika» (lisa 23); 24) «Suhkru määramise metoodika» (lisa 24); 25) «Laktoosi määramise metoodika» (lisa 25); 26) «Karbamiidi määramise metoodika» (lisa 26); 27) «Sojasaaduste ureaasi aktiivsuse hindamise metoodika» (lisa 27); 28) «Retinooli (vitamiin A) määramise metoodika» (lisa 28); 29) «Tiamiini (vitamiin B1, aneuriin) määramise metoodika» (lisa 29); 30) «Askorbiinhappe ja dehüdroaskorbiinhappe (vitamiin C) määramise metoodika» (lisa 30); 31) «Menadiooni (vitamiin K3) määramise metoodika» (lisa 31); 32) «Sinepiõli määramise metoodika» (lisa 32); 33) «Lupiini alkaloidide määramise metoodika» (lisa 33); 34) «Vaba ja kogu gossüpoli määramise metoodika» (lisa 34); 35) «Teobromiini määramise metoodika» (lisa 35); 36) «Aflatoksiin B1 ühemõõtmelise õhukesekihikromatograafilise määramise metoodika» (lisa 36); 37) «Aflatoksiin B1 kõrgsurve vedelikkromatograafilise määramise metoodika» (lisa 37); 38) «Halofuginooni määramise metoodika» (lisa 38); 39) «Robenidiini määramise metoodika» (lisa 39); 40) «Metüülbensokaadi määramise metoodika» (lisa 40); 41) «Bukinolaadi määramise metoodika» (lisa 41); 42) «Amprooliumi määramise metoodika» (lisa 42); 43) «Etopabaadi määramise metoodika» (lisa 43); 44) «Dinitolmiidi (DOT) määramise metoodika» (lisa 44); 45) «Nikarbasiini määramise metoodika» (lisa 45); 46) «Sulfakinoksaliini määramise metoodika» (lisa 46); 47) «Furasolidooni määramise metoodika» (lisa 47), 48) «Tetratsükliini rühma antibiootikumide avastamise ja identifitseerimise metoodika» (lisa 48); 49) «Kloortetratsükliini, oksütetratsükliini ja tetratsükliini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 49); 50) «Kloortetratsükliini, oksütetratsükliini ja tetratsükliini turbidimeetrilise määramise metoodika» (lisa 50); 51) «Oleandomütsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 51); 52) «Tülosiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 52); 53) «Virginiamütsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 53); 54) «Tsinkbatsitratsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 54); 55) «Flavofosfolipooli difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 55); 56) «Avopartsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 56); 57) «Monensiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 57); 58) «Spiramütsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika» (lisa 58); 59) «Aflatoksiinide määramise kvantitatiivne metoodika» (lisa 59); 60) «Ohratoksiini määramise kvantitatiivne metoodika» (lisa 60); 61) «Zearalenooni määramise kvantitatiivne metoodika» (lisa 61); 62) «Vomitoksiini (DON) määramise metoodika» (lisa 62). Minister Andres VARIK Kantsler Ilmar TUPITS Lisa 1 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Söötade analüüsimetoodikate üldised tingimused 1. Proovide ettevalmistamine analüüsiks 1.1. Eesmärk Allpool kirjeldatud protseduurid puudutavad kontroll-laboratooriumidesse saadetud lõpp-proovide ettevalmistamist analüüsiks pärast proovi võtmist. Proovid tuleb ette valmistada nii, et välja kaalutud kogused, nagu analüüsimetoodikates kehtestatud, oleksid homogeensed ja vastaksid lõpp-proovidele. 1.2. Vajalikud ettevaatusabinõud Kõik vajalikud operatsioonid tuleb läbi viia nii, et proov ei saastuks ja koostis ei muutuks. Jahvatamine, segamine ja sõelumine tuleb teha nii kiiresti kui võimalik, et proov minimaalselt puutuks kokku õhu ja valgusega. Veskeid ja jahvatajaid, mis proovi märgatavalt kuumendavad, ei tohi kasutada. Söötade analüüsimisel, mis on kuumuse suhtes eriti tundlikud, tuleb kasutada käsitsijahvatamist. Tuleb tagada, et aparaat ise ei oleks elementide jälgedega saastumise allikas. Kui ettevalmistust ei saa teha ilma oluliste muutusteta proovi niiskusesisalduses, tuleb määrata niiskusesisaldus enne ja pärast ettevalmistamist vastavalt niiskuse määramise metoodikale. 1.3. Proovide ettevalmistamine 1.3.1. Lõpp-proov tuleb hoolikalt segada kas mehhaaniliselt või käsitsi. Proov jaotatakse kaheks võrdseks portsjoniks (kus võimalik, tuleks kasutada kvarteerimismeetodit). Üht portsjonit hoitakse sobivas puhtas ja kuivas õhukindlalt suletavas nõus ja teine portsjon või selle osa, vähemalt 100g, valmistatakse ette järgmiselt: 1.3.1.1. Söötade proov, mida on võimalik kohe jahvatada, kui analüüsimetoodikates ei ole teisiti näidatud, sõelutakse pärast jahvatamist vajaduse korral läbi 1-mm avadega sõela. Vältida tuleb ülejahvatamist. Sõelutud proov segatakse ja kogutakse sobivasse puhtasse ja kuiva õhukindla korgiga nõusse. Vahetult enne analüüsiks vajaliku koguse kaalumist segatakse proov uuesti; 1.3.1.2. Söötade proov, mida võib jahvatada pärast kuivatamist, kui analüüsimetoodikates ei ole teisiti määratletud, kuivatatakse niiskusesisalduseni 8-st kuni 12%-ni vastavalt niiskuse määramise metoodikale. Jahvatamist jätkatakse vastavalt punktile 1.3.1.1. 1.3.1.3. Vedelate või poolvedelate söötade proov kogutakse sobivasse puhtasse ja kuiva nõusse, millel on õhukindel kork. Enne analüüsiks vajaliku koguse kaalumist segatakse hoolikalt; 1.3.1.4. Söötade proove, mida ei saa ette valmistada ühe eespool nimetatud protseduuri kohaselt, tuleks töödelda mingi muu protseduuri abil, mis kindlustab, et analüüsiks kaalutud kogused on homogeensed ja lõppproovidele tüüpilised. 2. Proovide hoidmine 2.1. Proove tuleb hoida temperatuuril, mis ei muuda nende koostist. Proove, mis on ette nähtud vitamiinide või eriti valgustundlike ainete analüüsiks, tuleb hoida tumedast klaasist nõudes. 3. Analüüsimetoodikates vajalike reaktiivide ja aparaatide kasutamise tingimused 3.1. Kõik keemilised reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad (a. p.), kvaliteediga analüütiline reaktiiv (AR). Mikroelemente määrates tuleb reaktiivide puhtust kontrollida pimekatsega. Sõltuvalt saadud tulemustest võib vajalik olla reaktiivide edasine puhastamine. 3.2. Iga operatsioon, millega on seotud lahuste valmistamine, lahjendamine, loputamine või pesemine ja mida analüüsimetoodikates nimetatakse, näitamata kasutatud lahusti või lahjendi iseloomu, eeldab vee kasutamist. Üldreeglina peab vesi olema demineraliseeritud või destilleeritud. Eri juhtudel, mida nimetatakse analüüsimetoodikates, peab vesi alluma eri puhastusprotseduuridele. 3.3. Analüüsimetoodikates viidatakse ainult nendele instrumentidele ja aparaatidele, mis on erilised või nõuavad eri kasutamist. 4. Analüüsimetoodikate rakendamine ja tulemuste väljendamine 4.1. Reeglina kehtestatakse iga söötades oleva aine määramiseks üks analüüsimetoodika. Kui antud on mitu metoodikat, peab analüüsiaruandes olema näidatud kontroll-laboratooriumi poolt kasutatud metoodika. 4.2. Analüüsiaruandes antud tulemus on keskmine väärtus, mis on saadud vähemalt kahe analüüsiga ning on tehtud proovi eraldi portsjonitega ja rahuldava korratavusega. See tulemus väljendatakse analüüsimetoodikas kehtestatud viisil õige arvu tüvenumbritega ja seda võib vajaduse korral korrigeerida, võttes arvesse proovi esialgset niiskusesisaldust. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 2 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Niiskuse määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda niiskusesisalduse. Metoodika ei ole rakendatav piimatoodete kui lihtsööda analüüsil, mineraalainete ja peamiselt mineraalainetest koosnevate segude analüüsil, loomsete ja taimsete rasvade ja õlide ning õliseemnete ja õlipuuviljade analüüsil. 2. Põhimõte Proov kuivatatakse eritingimustes olenevalt sööda koostisest. Massikadu määratakse kaalumise teel. Suure niiskusesisaldusega tahkete söötade puhul on vajalik eelkuivatamine. 3. Vahendid 3.1. Purustaja, mis on valmistatud niiskust mitteneelavast materjalist, mida on lihtne puhastada, mis võimaldab kiiret ja ühtlast purustamist, tekitamata seejuures märkimisväärset kuumenemist, ning väldib nii palju kui võimalik kontakti välisõhuga ja vastab punktides 4.1.1 ja 4.1.2 sätestatud nõuetele (näiteks vasarpurustajad või veejahutusega mikropurustajad, kokkupandavad koonusveskid, aeglustatud liikumisega või hammasratastega purustajad). 3.2. Analüütiline kaal täpsusega 0,5 mg. 3.3. Kuivad korrosioonikindlast materjalist või klaasist õhukindlate kaantega nõud, mille põhjapinna suurus võimaldab proovi jaotumist kihina ligikaudu 0,3 g/cm2. 3.4. Elektriküttega isotermiline kuivatuskapp (± 1 °C), mis on korralikult ventileeritav ja võimaldab temperatuuri kiiret reguleerimist (1). 3.5. Reguleeritav elektriküttega vaakumkuivatuskapp, mis on varustatud õlipumbaga ja mehhanismiga kuuma kuivatatud õhu sisselaskmiseks või kuivatusainega (nt kaltsiumoksiid). 3.6. Paksu perforeeritud metall- või portselanplaadiga eksikaator, mis sisaldab efektiivset kuivatusainet. 4. Analüüsi käik 4.1. Ettevalmistamine 4.1.1. Söödad, mida ei ole käsitletud punktides 4.1.2 ega 4.1.3 Võtta vähemalt 50 g proovi. Vajaduse korral purustada või jaotada see nii, et vältida muutusi selle niiskusesisalduses (vt punkt 6). 4.1.2. Teravili ja tangud Võtta vähemalt 50 g proovi. Jahvatada see osakesteks, millest vähemalt 50% läbib 0,5-mm avadega sõela ja 1-mm ümaravadega sõela kasutamisel ei jää sõelale alles rohkem kui 10% proovi. 4.1.3. Vedelsööt või söödapasta, valdavalt õlist ja rasvast koosnev sööt Kaaluda 25 g proovi 10 mg täpsusega, lisada sobiv kogus kuivatatud liiva, mis on kaalutud 10 mg täpsusega ning segada, kuni saadakse homogeenne produkt. 4.2. Kuivatamine 4.2.1. Söödad, mida ei ole käsitletud punktides 4.2.2 ega 4.2.3. Kaaluda nõu koos kaanega 0,5 mg täpsusega. Kaaluda sellesse 1 mg täpsusega ligikaudu 5 g proovi ja jaotada see ühtlase kihina nõu põhjale. Asetada nõu ilma kaaneta temperatuurini 103 °C eelkuumutatud kuivatuskappi. Vältimaks kuivatuskapi temperatuuri liigset langemist, asetada nõu kappi nii kiiresti kui võimalik. Jätta kuivama neljaks tunniks, arvestades hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on uuesti 103 °C. Sulgeda nõu kaanega, võtta kuivatuskapist välja, jätta 30--45 minutiks eksikaatorisse jahtuma ja kaaluda 1 mg täpsusega. Valdavalt rasvast ja õlist koosneva sööda puhul kuivatada seda kuivatuskapis täiendavalt 30 minutit temperatuuril 130 °C. Kahe kaalumise vahe ei tohi ületada 0,1% niiskust. 4.2.2. Teravili, peenjahu, tangud ja jäme jahu Kaaluda nõu koos kaanega 0,5 mg täpsusega. Kaaluda sellesse 1 mg täpsusega ligikaudu 5 g jahvatatud proovi ja jaotada see ühtlase kihina nõu põhjale. Asetada nõu ilma kaaneta temperatuurini 130 °C eelkuumutatud kuivatuskappi. Vältimaks kuivatuskapi temperatuuri liigset langemist, asetada nõu kuivatuskappi nii kiiresti kui võimalik. Jätta kuivama kaheks tunniks, arvestades hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on uuesti 130 °C. Sulgeda nõu kaanega, võtta kuivatuskapist välja, jätta 30--45 minutiks eksikaatorisse jahtuma ja kaaluda 1 mg täpsusega. 4.2.3. Üle 4% sahharoosi või laktoosi sisaldavad segasöödad, lihtsöödad, näiteks robiiniaoad, hüdrolüüsitud teraviljatooted, linnaseseemned, kuivatatud peediliistakud, kalast ja suhkrust lahustuvsöödad ning üle 25% mineraalsooli, sealhulgas kristallvett sisaldavad segasöödad Kaaluda nõu koos kaanega 0,5 mg täpsusega. Kaaluda sellesse 1 mg täpsusega ligikaudu 5 g proovi ja jaotada see ühtlase kihina nõu põhjale. Asetada nõu ilma kaaneta temperatuurini 80--85 °C eelkuumutatud vaakumkuivatuskappi. Vältimaks kuivatuskapi temperatuuri liigset langemist, asetada nõu kuivatuskappi nii kiiresti kui võimalik. Vähendada rõhk 100 torrini ja jätta proov selle rõhu all neljaks tunniks kuivama kas kuuma ja kuiva õhu voolus või kasutades kuivatusainet (umbes 300 g 20 proovi jaoks). Viimasel juhul lülitada vaakumpump välja, kui on saavutatud ettenähtud rõhk. Arvestada kuivatusaega hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on uuesti 80--85 °C. Taastada vaakumkuivatuskapis ettevaatlikult atmosfäärirõhk. Avada kuivatuskapp, sulgeda nõu kohe kaanega, jätta 30--45 minutiks eksikaatorisse jahtuma ja kaaluda 1 mg täpsusega. Kuivatada täiendavalt 30 minutit vaakumkuivatuskapis temperatuuril 80--85 °C ja kaaluda. Kahe kaalumise vahe ei tohi ületada 0,1% niiskust. 4.3. Eelkuivatamine 4.3.1. Söödad, mida ei ole käsitletud punktis 4.3.2 Tahked söödad, mille suur niiskusesisaldus muudab purustamise keerukaks, tuleb eelkuivatada. Kaaluda sobivasse anumasse, näiteks 20 × 12-cm alumiiniumplaat äärega 0,5 cm, 10 mg täpsusega 50 g purustamataproovi (kokkupressitud sööta võib vajaduse korral osadeks jaotada). Jätta kuivama kuivatuskappi temperatuuril 60--70 °C, kuni niiskusesisaldus on vähenenud 8--12%-ni. Võtta proov kuivatuskapist välja, jätta laboratooriumis üheks tunniks katmata jahtuma ning kaaluda 10 mg täpsusega. Purustada kohe, nagu on kirjeldatud punktis 4.1.1 ja kuivatada, nagu on kirjeldatud punktis 4.1.2 või 4.1.3. vastavalt sööda iseloomule. 4.3.2. Teravili Üle 17% niiskust sisaldavad terad tuleb eelkuivatada. Kaaluda sobivasse anumasse, näiteks 20 × 12-cm alumiiniumplaat äärega 0,5 cm, 10 mg täpsusega 50 g jahvatamata teri. Jätta 5--7 minutiks kuivatuskappi temperatuuril 130 °C kuivama. Võtta proov kuivatuskapist välja, jätta laboratooriumis kaheks tunniks katmata jahtuma ning kaaluda 10 mg täpsusega. Jahvatada kohe, nagu on kirjeldatud punktis 4.1.2 ja kuivatada, nagu on kirjeldatud punktis 4.2.2. Analüüs tuleb teha kohe pärast proovinõude või pakendite avamist ning vähemalt kahe paralleelprooviga. 5. Tulemuste arvutamine Niiskuse protsendiline sisaldus proovis arvutatakse järgmiste valemite abil: 5.1. Kuivatamine ilma eelkuivatamiseta (E­m) 100/E, kus: E -- proovi esialgne mass grammides; m -- kuiva proovi mass grammides. 5.2. Kuivatamine eelkuivatamisega [(M' -- m)M/M' + E -- M] 100/E = 100 (1 -- Mm/EM'), kus: E -- proovi esialgne mass grammides; M -- proovi mass grammides pärast eelkuivatamist; M' -- proovi mass grammides pärast purustamist või peenestamist; m -- kuiva proovi mass grammides. 5.3. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 0,2% niiskust. 6. Märkus Kui purustamine osutub vajalikuks ja ilmneb, et see muudab toote niiskusesisaldust, tuleb sööda koostisainete analüüsi tulemusi korrigeerida proovi esialgse niiskusesisalduse põhjal. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 3 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Loomsetes ja taimsetes rasvades ja õlides niiskuse määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Käesolev metoodika võimaldab määrata loomsete ja taimsete rasvade ja õlide vee- ning lenduvate ainete sisaldust söödas. 2. Põhimõte Proov kuivatatakse konstantse kaaluni 103 °C juures. Massikadu määratakse kaalumisega. 3. Vahendid 3.1. Lamedapõhjaline korrosioonikindlast materjalist nõu, mille läbimõõt on 8--9 cm ja kõrgus ligikaudu 3 cm. 3.2. Elavhõbetermomeeter, paisumiseks vajaliku tugeva laiendatud ülaosaga; gradueeritud vahemik 80--110 °C on ligikaudu 10 cm pikk. 3.3. Liivavann või elektripliit. 3.4. Eksikaator, mis sisaldab efektiivset kuivatusainet. 3.5. Analüütilised kaalud. 4. Analüüsi käik Kaaluda 1 mg täpsusega ligi 20 g homogeniseeritud proovi kuiva, kaalutud nõusse, milles on termomeeter. Kuumutada liivavannil või elektripliidil, segades pidevalt termomeetriga, nii et temperatuur jõuab 90 °C-ni ligi 7 minutiga. Vähendada kuumust, jälgides sagedust, millega mullid tõusevad nõu põhjast. Temperatuur ei tohi ületada 105 °C. Jätkata segamist, riivates nõu põhja, kuni mulle enam ei teki. Et tagada täielik niiskuse eemaldamine, kuumutada mitu korda 103 °C ±2 °C, jahutades üksteisele järgnevate kuumutamiste vahel 93 °C-ni. Seejärel jätta eksikaatorisse toatemperatuurini jahtuma ja kaaluda. Korrata seda protseduuri, kuni massikadu kahe teineteisele järgneva kaalumise vahel ei ületa 2 mg. Proovi massi suurenemine pärast korduvat kuumutamist näitab rasva oksüdeerumist, mille puhul arvutada tulemus kaalumisest, mis oli tehtud vahetult enne massi suurenemist. 5. Tulemuste arvutamine Proovi niiskusesisalduse protsent antakse järgmise valemiga

kus: M0 -- proovi mass (g); M1 -- nõu mass koos prooviga enne kuumutamist (g); M2 -- nõu mass koos prooviga pärast kuumutamist (g). Sisaldused alla 0,05% peab andma järgmiselt: «vähem kui 0,05%». 6. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelse niiskusemääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 0,05% absoluutväärtuses. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 4 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Toorproteiini määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata toorproteiini sisaldust söötades lämmastikusisalduse alusel, mida määratakse Kjeldahli metoodikaga. 2. Põhimõte Proov kuumutatakse väävelhappega katalüsaatori juuresolekul. Happeline lahus leelistatakse naatriumhüdroksiidi lahusega. Vabanenud ammoniaak destilleeritaks ja kogutakse mõõdetud väävelhappekogusesse, mille ülejääk tiitritakse täpse kontsentratsiooniga naatriumhüdroksiidi lahusega. 3. Reaktiivid 3.1. Kaaliumsulfaat. 3.2. Katalüsaator: vask(II)oksiid CuO või vask(II)sulfaatpentahüdraat CuSO4 5H2O. 3.3. Granuleeritud tsink. 3.4. Väävelhape, tihedus 1,84 g/ml. 3.5. Väävelhape 0,5M. 3.6. Väävelhape 0,1M. 3.7. Metüülpunane (indikaator): lahustage 300 mg metüülpunast 100 ml-s 95--96% (mahu%) etanoolis. 3.8. Naatriumhüdroksiidi (võib kasutada tehnilise puhtusega reaktiivi) 40% (mass/ruumala) lahus (40 g/100 ml). 3.9. Naatriumhüdroksiidi lahus 0,25 M. 3.10. Naatriumhüdroksiidi lahus 0,1 M. 3.11. Granuleeritud pimsskivi, vesinikkloriidhappes pestud ja tuhastatud. 3.12. Atseetaniliid (sulamistemperatuur 114 °C; 10,36% N). 3.13. Sahharoos (lämmastikuvaba). 4. Vahendid Aparaadid, mis sobivad märgtuhastamise, destilleerimise ja tiitrimise läbiviimiseks vastavalt Kjeldahli meetodile. 5. Analüüsi käik 5.1. Märgtuhastamine Kaaluda 1 g proovi 1 mg täpsusega ja paigutada see märgtuhastamisaparaadi kolbi. Lisada 15 g kaaliumsulfaati, sobiv kogus katalüsaatorit (0,3--0,4 g vask(II)oksiidi või 0,9--1,2 g vask(II)sulfaatpentahüdraati), 25 ml väävelhapet ja mõned pimsskivi graanulid ning segada. Kuumutada kolbi mõõdukalt, aeg-ajalt loksutades, kuni mass on söestunud ja vaht kadunud; seejärel kuumutada intensiivsemalt vedeliku püsiva keemiseni. Kuumutamine on küllaldane, kui keev hape kondenseerub kolvi seinale.Vältida seinte liigset kuumendamist ja orgaaniliste osakeste kleepumist neile. Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkata keetmist veel kahe tunni jooksul, seejärel jätta jahtuma. 5.2. Destilleerimine Lisada ettevaatlikult küllalt vett, et kindlustada sulfaatide täielik lahustumine. Lasta jahtuda ja seejärel lisada mõned graanulid tsinki. Viia destilleerimisaparaadi vastuvõtukolbi täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet 0,5M või 0,1M, olenevalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisada mõned tilgad indikaator metüülpunast. Ühendada märgtuhastamiskolb destilleerimisaparaadi jahutiga ja viia jahuti ots vastuvõtukolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vaata punkt 8.3). Valada aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust märgtuhastamiskolbi, vältides ammoniaagi kadusid (vaata punkt 8.1). Kuumutada kolbi, kuni ammoniaak on üle destilleeritud. 5.3. Tiitrimine Tiitrida ülejäänud väävelhape vastuvõtukolvis naatriumhüdroksiidi lahusega 0,25M või 0,1M, olenevalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt. 5.4. Pimekatse Selleks, et kindlaks teha, kas reaktiivid on lämmastikuvabad, viia läbi pimekatse (märgtuhastamine, destilleerimine ja tiitrimine), kasutades 1 g sahharoosi proovi asemel. 6. Tulemuste arvutamine Toorproteiini protsendiline sisaldus arvutada järgmise valemi järgi

kus: V0 -- pimekatses kasutatud NaOH lahuse (3.9 või 3.10) maht (ml); V1 -- proovi tiitrimisel kasutatud NaOH lahuse (3.9 või 3.10) maht (ml); C -- naatriumhüdroksiidi lahuse (3.9 või 3.10) kontsentratsioon (mol/l); m -- proovi mass (g). 7. Metoodika kontrollimine 7.1. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 0,2% absoluutväärtuses toorproteiinisisalduste puhul, mis on väiksemad kui 20%; -- 1,0% kõrgema väärtuse suhtes 20--40%-liste toorproteiinisisalduste puhul; -- 0,4% absoluutväärtuses toorproteiinisisalduste puhul, mis on suuremad kui 40%. 7.2. Täpsus Viia analüüs (märgtuhastamine, destilleerimine ja tiitrimine) läbi 1,5--2,0 g atseetaniliidiga 1 g sahharoosi juuresolekul; 1 g atseetaniliidile kulub 14,80 ml väävelhapet. Regenereeruvus peab olema vähemalt 99%. 8. Märkused 8.1. Aparatuur peab olema manuaalset, poolautomaatset või automaatset tüüpi. Kui aparaat nõuab ülekannet märgtuhastamise ja destilleerimise vahel, tuleb see ülekanne kadudeta läbi viia. Kui destillatsiooniaparaadi kolb ei ole varustatud tilklehtriga, lisada naatriumhüdroksiid vahetult enne kolvi ühendamist jahutiga, valades vedelikku aeglaselt kolvi külge mööda alla. 8.2. Kui märgtuhastamisel proov tahkestub, alustada uuesti määramist, kasutades suuremat kogust väävelhapet kui eespool määratletud. 8.3. Väikese lämmastikusisaldusega toodete puhul võib vastvõtukolbi viidava väävelhappe mahtu vähendada vajadusel 10--15 ml-ni ja lahjendada veega 25 ml-ni. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 5 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Pepsiinis ja vesinikkloriidhappes lahustuva toorproteiini määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata toorproteiini seda osa, mis määratletud tingimustes lahustub pepsiinis ja vesinikkloriidhappes. Metoodika sobib kõikide söötade jaoks. 2. Põhimõte Proovi kuumutatakse pepsiinhüdrokloriidi lahuses 48 tundi temperatuuril 40 °C. Suspensioon filtreeritakse ning filtraadi lämmastikusisaldus määratakse toorproteiini määramise metoodika järgi. 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape, tihedus 1,125 g/ml. 3.2. Vesinikkloriidhape 0,075N. 3.3. Pepsiin aktiivsusega 2,0 ühikut milligrammi kohta; pepsiini aktiivsus määratletakse käesoleva lisa osas 4 kirjeldatud meetodil ning tuleb kindlaks teha seda meetodit kasutades. 3.4. Värskelt valmistatud [ligikaudu 0,2% (mass/ruumala)] pepsiinilahus vesinikkloriidhappes; aktiivsus: 400 ühikut liitri kohta. 3.5. Vahutamisvastane emulsioon (nt silikoon). 3.6. Kõik reaktiivid, mis on loetletud toorproteiini määramismetoodika punktis 3. 4. Vahendid 4.1. Veevann või inkubaator temperatuuril 40 °C ± 1 °C. 4.2. Kjeldahli märgtuhastus- ja destillatsiooniaparaat. 5. Analüüsi käik 5.1. Lahuse ettevalmistamine (vt punkt 8.2) Kaaluda 2 g proovi 1 mg täpsusega ja paigutada see mõõtekolbi mahuga 500 ml. Lisada 450 ml pepsiinhüdrokloriidi lahust, mis on eelnevalt kuumutatud temperatuurini 40 °C ja loksutada, et vältida kämpude tekkimist. Kontrollida, et suspensiooni pH oleks alla 1,7. Paigutada kolb veevanni või inkubaatorisse ning jätta sinna 48 tunniks. Loksutada 8, 24 ja 32 tunni möödudes. 48 tunni möödudes lisada 15 ml vesinikkloriidhapet, jahutada temperatuurini 20 °C, täita kolb veega märgini ja filtreerida. 5.2. Märgtuhastamine Võtta 250 ml filtraati ja paigutada see destillatsiooniaparaadi kolbi. Lisada reaktiivid, mida on vaja märgtuhastamiseks vastavalt kirjeldusele toorproteiini määramise metoodika punkti 5.1 teises lauses. Segada ja kuumutada keemiseni. Kui tekib vaht, lisada mõned tilgad vahutamisvastast emulsiooni. Jätkata intensiivset keetmist, kuni vesi on peaaegu täielikult aurustunud. Vähendada kuumust ja kõrvaldada ettevaatlikult viimased vee jäljed. Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkata keetmist veel üks tund. Jätta jahtuma. 5.3. Destilleerimine Lisada ettevaatlikult küllalt vett, et kindlustada sulfaatide täielik lahustumine. Lasta jahtuda ja seejärel lisada mõned graanulid tsinki. Viia destilleerimisaparaadi vastuvõtukolbi täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet 0,5M või 0,1M, olenevalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisada mõned tilgad indikaator metüülpunast. Ühendada märgtuhastamiskolb destilleerimisaparaadi jahutiga ja viia jahuti ots vastuvõtukolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vaata punkt 8.3). Valada aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust märgtuhastamiskolbi, vältides ammoniaagi kadusid (vaata punkt 8.1). Kuumutada kolbi, kuni ammoniaak on üle destilleeritud. 5.4. Tiitrimine Tiitrida ülejäänud väävelhape vastuvõtukolvis naatriumhüdroksiidi lahusega 0,25M või 0,1M, olenevalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt. 5.5. Pimekatse Viia sama analüüsi käiku kasutades läbi pimekatse, jättes analüüsitava proovi lisamata. 6. Tulemuste arvutamine Lahutada pimekatsele kulunud väävelhappe maht sellest mahust, mis kulus analüüsitavale proovile. 1 ml 0,1N väävelhapet vastab 1,4 mg lämmastikule. Korrutada lämmastiku kogus faktoriga 6,25. Väljendada tulemus protsendilise sisaldusena proovis. 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: --0,4 absoluutväärtuses sisalduste puhul, mis on väiksemad kui 20%; -- 2,0% suhtelises väärtuses sisalduste puhul 20%--40%; -- 0,8 absoluutväärtuses sisalduste puhul, mis on suuremad kui 40%. 8. Märkused 8.1. Selle metoodikaga saadud väärtused ei ole otseses seoses in vivo seeduvusega. 8.2. Üle 10% õli või rasva sisaldavad produktid tuleb kõigepealt rasvatustada petrooleetris (keemistemperatuuri vahemik 40--60 °C). Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 6 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Pepsiini aktiivsuse hindamise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab kindlaks teha pepsiinis ja vesinikkloriidhappes lahustuvate toorproteiinide määramisel kasutatava pepsiini aktiivsuse. 2. Põhimõte Hemoglobiini töödeldakse määratletud tingimustes vesinikkloriidhappe keskkonnas pepsiiniga. Proteiini hüdrolüüsumata osa sadestatakse trikloroäädikhappega. Filtraadile lisatakse naatriumhüdroksiidi ja Folin-Ciocalteu reaktiivi. Lahuse optiline tihedus mõõdetakse lainepikkusel 750 nm ning kalibreerimisgraafikult loetakse sellele vastav türosiinikogus. Määratlus: pepsiini ühik määratletakse nimetatud ensüümi kogusena, mis käsitletava metoodika tingimustes vabastab ühes minutis hüdroksüarüülrühmade koguse, mille optiline tihedus Folin-Ciocalteu reaktiiviga värvitult vastab ühele µmoolile samal viisil värvitud türosiinile. 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape 0,2N. 3.2. Vesinikkloriidhape 0,06N. 3.3. Vesinikkloriidhape 0,025N. 3.4. Trikloroäädikhappe 5% (mass/ruumala) lahus. 3.5. Naatriumhüdroksiidi lahus 0,5N. 3.6. Folin-Ciocalteu reaktiiv. Paigutada 2-liitrilisse standardse klaaslihviga ümarkolbi 100 g naatriumvolframaati (Na2 WO4 2H2O), 25 g naatriummolübdaati (Na 2MoO4 2H2O) ja 700 ml vett. Lisada 50 ml fosforhapet (tihedus 1,71 g/ml) ja 100 ml kontsentreeritud vesinikkloriidhapet (tihedus 1,19 g/ml), ühendada kolviga püstjahuti, kuumutada lahus keemiseni ja keeta tasaselt 10 tundi. Jätta jahtuma, eemaldada püstjahuti, lisada 175 g liitiumsulfaati (Li2 SO4 2H2O), 50 ml vett ja 1 ml broomi. Keeta 15 minutit, et eemaldada liigne broom. Jätta jahtuma, kanda lahus 1-liitrilisse mõõtekolbi, täita kolb veega märgini, segada ja filtreerida. Rohekat värvust ei tohi jääda. Enne kasutamist lahjendada 1 mahuosa reaktiivi 2 mahuosa veega. 3.7. Hemoglobiinilahus: kaaluda hemoglobiinikogus (ligikaudu 2 g proteiinisubstraati, määratud Ansoni järgi), mis vastab 354 mg lämmastikule(2), ning paigutada see 200 ml mahuga standardse klaaslihviga kolbi. Lisada mõned milliliitrid vesinikkloriidhapet, ühendada kolb vaakumpumbaga ja loksutada, kuni hemoglobiin on täielikult lahustunud. Lülitada vaakumpump välja. Võtta kolb ära, lisada loksutades vesinikkloriidhapet, kuni lahuse maht on 200 ml. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.8. Türosiini standardlahus: lahustada vesinikkloriidhappes 181,2 mg türosiini ning viia lahuse maht vesinikkloriidhappe lisamisel kuni 1 liitrini. Võtta 20 ml saadud lahust ja lahjendada vesinikkloriidhappe abil 100 ml-ni. 1 ml seda lahust sisaldab 0,2 µmooli türosiini. 4. Vahendid 4.1. Veevann, mis on ultratermostaadi abil seatud temperatuurile 25 °C ± 0,1 °C. 4.2. Spektrofotomeeter 4.3. Stopper täpsusega 1 sekund. 4.4. pH-meeter. 5. Analüüsi käik 5.1. Lahuse ettevalmistamine (vt punkt 7.1) Lahustada 100 ml vesinikkloriidhappes 150 mg pepsiini. Pipeteerida 2 ml seda lahust 50-ml mahuga mõõtekolbi ja täita kolb vesinikkloriidhappega kuni märgini. pH-meetri abil kontrollitud pH väärtus peab olema 1,6 ± 0,1. Asetada kolb veevanni. 5.2. Hüdrolüüs Pipeteerida katseklaasi 5,0 ml hemoglobiinilahust, kuumutada veevannis temperatuurini 25 °C, lisada 1,0 ml pepsiini lahust (mis on saadud vastavalt punktile 5.1) ja segada ühest otsast jämedama klaaspulgaga umbes kümme korda edasi-tagasi. Jätta katseklaas 25 °C veevanni täpselt 10 minutiks, arvestades aega pepsiini lahuse lisamisest alates (kestust ja temperatuuri tuleb rangelt jälgida). Seejärel lisada 10,0 ml trikloroäädikhappe lahust, mis on eelnevalt soojendatud temperatuurini 25 °C, segada ja filtreerida läbi kuiva filtri. 5.3. Värvuse teke ja optilise tiheduse mõõtmine Pipeteerida 5,0 ml filtraati Erlenmeyeri kolbi mahuga 50 ml, lisada 10,0 ml naatriumhüdroksiidi lahust ja pidevalt loksutades 3,0 ml lahjendatud FolinCiocalteu reaktiivi. 5--10 minuti pärast määrata spektrofotomeetri abil lainepikkusel 750 nm 1-cm küvettides lahuse optiline tihedus võrreldes veega. 5.4. Pimekatse Iga määramise puhul viia läbi pimekatse järgmiselt. Pipeteerida katseklaasi 5,0 ml hemoglobiinilahust, kuumutada veevannis temperatuurini 25 °C, lisada 10,0 ml trikloroäädikhappe lahust, mis on eelnevalt soojendatud temperatuurini 25 °C, segada, seejärel lisada 1,0 ml pepsiini lahust, mis on saadud vastavalt punktile 5.1. Segada klaaspulgaga ning jätta katseklaas täpselt 10 minutiks 25 °C veevanni. Segada ja filtreerida läbi kuiva filtri. Jätkata vastavalt punktis 5.3 kirjeldatud protseduurile. 5.5. Kalibreerimisgraafik Mõõta türosiini standardlahuse alikvootsed osad 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ja 5,0 ml, mis vastavad 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ja 1,0 µmoolile türosiinile, Erlenmeyeri kolbidesse mahuga 50 ml. Lõpetada seeria türosiinivaba kontroll-lahusega.Viia lahuse maht kolbides vesinikkloriidhappe lisamisel 5 ml-ni. Lisada 10,0 ml naatriumhüdroksiidi lahust ja pidevalt loksutades 3,0 ml lahjendatud Folin-Ciocalteu reaktiivi. 5--10 minuti pärast määrata spektrofotomeetri abil lainepikkusel 750 nm 1-cm küvettides lahuse optiline tihedus võrreldes veega. Koostada kalibreerimisgraafik, kandes sinna türosiini kogused ja neile vastavad optilised tihedused. 6. Tulemuste arvutamine Leida kalibreerimisgraafikult türosiini kogus µmoolides, mis vastab värvilise lahuse optilisele tihedusele, mis on korrigeeritud pimekatse tulemuse alusel. Pepsiini aktiivsus (mg kohta minutis) türosiini µmoolides 25 °C juures arvutada järgmist valemit kasutades

kus: a -- türosiini kogus µmoolides, leitud kalibreerimisgraafikult; p -- pepsiini kogus milligrammides, lisatud punktis 5.2. 7. Märkused 7.1. Lahustatava pepsiini kogus peab olema selline, et lõplikul fotomeetrilisel mõõtmisel saada optiline tihedus vahemikus 0,35--0,035. 7.2. Selle metoodikaga saadud kaks ühikut mg kohta vastavad: -- 3,64 Ansoni milliühikule / mg (µmooli türosiini / mg min-s temperatuuril 35,5 °C) või 36 400 kommertsühikule / g (µmooli türosiini / g 10 min-s temperatuuril 35,5 °C). Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 7 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Toorkiu määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Käesolev metoodika võimaldab söötades määrata rasvavabasid orgaanilisi aineid, mis ei lahustu happelises ega leeliselises keskkonnas ja mida tavapäraselt kirjeldatakse toorkiuna. 2. Põhimõte Proovi, mis vajadusel on rasvatustatud, töödeldakse järgemööda täpse kontsentratsiooniga väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi keevate lahustega. Jääk eraldatakse filtreerimisega klaasfiltertiiglil, pestakse, kuivatatakse, kaalutakse ja tuhastatakse 475--500 °C juures. Tuhastamisest tulenev massikadu vastab toorkiule analüüsitavas proovis. 3. Reaktiivid 3.1. Väävelhape, 0,13M. 3.2. Vahutamisvastane aine (nt n-oktanool). 3.3. Filteraine (Celite 545 või selle analoog), kuumutatakse 500 °C juures neli tundi (vt 8.6). 3.4. Atsetoon. 3.5. Petrooleeter, keemistemperatuuri vahemik 40--60 °C. 3.6. Vesinikkloriidhape, 0,5 M. 3.7. Kaaliumhüdroksiidi lahus, 0,23 M. 4. Vahendid 4.1. Kuumutusseade väävelhappe või kaaliumhüdroksiidi lahuse kuumutamiseks. Kuumutusseade on varustatud toega filtertiigli hoidmiseks ning väljalasketoruga, millel on kraan vedeliku väljalaskmiseks ja ühendamiseks vaakumi või suruõhuga. Enne kasutamist eelkuumutada seadet keeva veega viis minutit. 4.2. Klaasfiltertiigel, mille sulatatud poorsest klaasist filterplaadi pooride läbimõõt on 40--90 µm. Enne esimest kasutamist kuumutada mõni minut kuni 500 °C ja jahutada (vt punkt 8.6). 4.3. Püstjahutiga varustatud vähemalt 270-ml mahuga kitsas silindritaoline klaas, mis sobib keetmiseks. 4.4. Termoregulaatoriga kuivatuskapp. 4.5. Termoregulaatoriga muhvelahi. 4.6. Ekstraheerimisseade, millel on toetusplaat filtertiigli fikseerimiseks ning kraaniga väljalasketoru vaakumiga ühendamiseks ja vedeliku väljalaskmiseks. 4.7. Ühendusrõngad kuumutusseadme, tiigli ja silindritaolise klaasi ühendamiseks ning selleks, et ühendada külmekstraheerimisseade ja tiigel. 5. Analüüsi käik Kaaluda 1 g ettevalmistatud proovi 1 mg täpsusega ja asetada tiiglisse (vt punktid 8.1, 8.2 ja 8.3) ning lisada 1 g filterainet. Ühendada kuumutusseade ning filtertiigel, seejärel kinnitada silindritaoline klaas tiigli külge. Valada 150 ml keevat väävelhapet tiigliga ühendatud silindritaolisse klaasi ja vajadusel lisada mõni tilk vahutamisvastast ainet. Kuumutada vedelik 5±2 minuti jooksul keemiseni ning keeta tugevasti täpselt 30 minutit. Avada väljalasketoru kraan ja vaakumi all filtreerida väävelhapet läbi filtertiigli ning pesta jääki kolme järjestikuse 30-ml portsjoni keeva veega, kindlustades, et jääk filtreeritakse pärast iga pesemist kuivaks. Sulgeda väljalaskekraan ja valada 150 ml keevat kaaliumhüdroksiidi lahust tiigliga ühendatud silindritaolisse klaasi ning lisada mõni tilk vahutamisvastast ainet. Viia vedelik 5±2 minuti jooksul keemiseni ning keeta tugevasti täpselt 30 minutit. Filtreerida ja korrata pesemisprotseduuri, mida kasutati väävelhappe etapi puhul. Pärast viimast pesemist ja kuivatamist eraldada tiigel koos sisuga kuumutusseadmest ning ühendada ta külmekstraheerimisseadmega. Kasutades vaakumit pesta jääki tiiglis kolme järjestikuse 25-ml portsjoni atsetooniga, kindlustades, et jääk filtreeritakse pärast iga pesemist kuivaks. Kuivatada tiigel kuivatuskapis 130 °C juures konstantse kaaluni. Pärast iga kuivatamist jahutada eksikaatoris ja kaaluda kiiresti. Asetada tiigel muhvelahju ning tuhastada vähemalt 30 minutit 475--500 °C juures konstantse kaaluni. Pärast iga kuumutamist jahutada kõigepealt ahjus ja seejärel enne kaalumist eksikaatoris. Viia ilma proovita läbi pimekatse. Tuhastamisest tulenev massikadu ei tohi ületada 4 mg. 6. Tulemuste arvutamine Toorkiu protsendiline sisaldus proovis arvutada valemiga

kus: a -- proovi mass (g); b -- massikadu pärast tuhastamist analüüsitava proovi puhul (g); c -- massikadu pärast tuhastamist pimekatse puhul (g). 7. Korratavus Kahe paralleelse, sama prooviga läbi viidud määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 0,3 absoluutväärtuses toorkiusisalduste puhul, mis on väiksemad kui 10%; -- 3% suurimast väärtusest toorkiusisalduste puhul, mis on 10% või suuremad. 8. Märkused 8.1. Söödad, mis sisaldavad rohkem kui 10% toorrasva, tuleb enne analüüsi rasvatustada petrooleetriga. Ühendada filtertiigel koos sisuga külmekstraheerimisseadmega. Kasutades vaakumit pesta jääki kolme järjestikuse 30-ml portsjoni petrooleetriga, kindlustades, et jääk filtreeritakse pärast iga pesemist kuivaks. Ühendada tiigel ja selle sisu kuumutusseadmega ja jätkata, nagu kirjeldatud punktis 5. 8.2. Söödad, mis sisaldavad rasvu, mida ei saa otse petrooleetriga ekstraheerida, tuleb rasvatustada, nagu näidatud punktis 8.1, ning rasvatustada veel kord pärast happega keetmist. Pärast happega keetmist ja järgnevat pesemist ühendada tiigel koos sisuga külmekstraheerimisseadmega ja pesta kolm korda 30 ml atsetooniga ning sellele järgnevalt veel kolm korda 30-ml petrooleetriportsjonitega. Filtreerida vaakumi all kuivaks ning jätkata analüüsi, nagu kirjeldatud punktis 5, alustades kaaliumhüdroksiidiga töötlemisest. 8.3. Kui söödad sisaldavad üle 5% kaltsiumkarbonaadina väljendatud karbonaate, ühendada kaalutud prooviga tiigel kuumutusseadmega. Pesta proovi kolm korda 30 ml vesinikkloriidhappega. Pärast iga lisamist lasta proovil enne filtreerimist ligi üks minut seista. Pesta üks kord 30 ml veega ja seejärel jätkata, nagu kirjeldatud punktis 5. 8.4. Kui kasutatakse statiivikujulist aparaati (mitu tiiglit kinnitatud sama kuumutusseadme külge), ei pea samas seerias viima läbi kaht individuaalset määramist sama analüüsitava prooviga. 8.5. Kui pärast keetmist on raske happelisi ja aluselisi lahuseid filtreerida, juhtida suruõhku läbi kuumutusseadme väljalasketoru ja seejärel jätkata filtreerimist. 8.6. Tuhastamistemperatuur ei tohiks olla kõrgem kui 500 °C, et pikendada klaasfiltri eluiga. Tuleb vältida järske temperatuuri muutusi kuumutamis- ja jahutamistsüklite vältel. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 8 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Toorõli ja -rasva määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata söödas toorõli ja -rasva sisalduse. Metoodika ei hõlma õliseemnete ja õlipuuviljade analüüsi. Olenevalt sööda iseloomust võib kasutada ühte kahest metoodikast. 1.1. Metoodika A Sobib taimset päritolu lihtsööda puhul, välja arvatud need söödad, mis teadaolevalt sisaldavad õli ja rasva, mida ei ole võimalik petrooleetri abil ilma eelneva hüdrolüüsita täielikult ekstraheerida. Selliste ainete hulka kuuluvad gluteenid, pärmid, soja- ja kartuliproteiinid. Samuti sobib see metoodika segasöötade puhul, välja arvatud need, mis sisaldavad piimapulbrit, ja need, millest ei ole võimalik õli ja rasva petrooleetri abil ilma eelneva hüdrolüüsita täielikult ekstraheerida. 1.2. Metoodika B Sobib loomset päritolu lihtsöötade puhul, samuti nende söötade puhul, mida on punktis 1.1 osutatud kui metoodika A erandeid. 2. Põhimõte 2.1. Metoodika A Õli ja rasv ekstraheeritakse petrooleetriga. Lahusti destilleeritakse ning jääk kuivatatakse ja kaalutakse. 2.2. Metoodika B Proov hüdrolüüsitakse kuumutamisel vesinikkloriidhappega. Lahus jahutatakse ja filtreeritakse. Jääk pestakse ja kuivatatakse ning seejärel viiakse läbi määramine metoodika A järgi. 3. Reaktiivid 3.1. Petrooleeter (keemistemperatuuri vahemik 40--60 °C). Broomiarv peab olema alla 1 ning aurustusjääk alla 2 mg/100 ml. 3.2. Veevaba naatriumsulfaat. 3.3. Vesinikkloriidhape 3N. 3.4. Filteraine, nt Kieselgur, Hyflosupercel. 4. Vahendid 4.1. Ekstraheerimisaparaat. Kui see on varustatud sifooniga (Soxhleti aparaat), peab tagasivoolukiirus olema selline, et saadakse umbes 10 tsüklit tunnis. Kui aparaat on sifoonita tüüpi, peaks tagasivoolukiirus olema umbes 10 ml minutis. 4.2. Ekstraheerimishülsid, mis ei sisalda petrooleetris lahustuvaid aineid ja mille poorsus vastab punkti 4.1 nõuetele. 4.3. Kuivatuskapp, ka vaakumkuivatuskapp, seatud temperatuurile 75 °C ± 3 °C või ventileeritav kuivatuskapp, seatud temperatuurile 100 °C ± 3 °C. 5. Analüüsi käik 5.1. Metoodika A (vt punkt 8.1) Kaaluda 5 g proovi 1 mg täpsusega, paigutada see ekstraheerimishülssi ja katta rasvavaba puuvillvatist tropiga. Asetada hülss ekstraheerimisaparaati ja ekstraheerida kuus tundi petrooleetriga. Koguda petrooleetri ekstrakt kuiva kaalutud kolbi, mis sisaldab pimsskivi tükikesi(3). Destilleerida lahusti. Kuivatada aurustusjääk, hoides kolbi poolteist tundi kuivatuskapis. Jahutada eksikaatoris ja kaaluda. Kuivatada veel 30 minutit, et tagada õli ja rasva massi konstantseks jäämine (massi erinevus kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema alla 1 mg). 5.2. Metoodika B Kaaluda 2,5 g proovi 1 mg täpsusega (vt punkt 8.2) ja asetada see 400-ml mahuga keeduklaasi või 300-ml mahuga koonilisse kolbi ning lisada 100 ml 3N vesinikkloriidhapet ja pimsskivi tükikesi. Katta keeduklaas uuriklaasiga või kinnitada koonilisele kolvile püstjahuti. Kuumutada segu tasase keemiseni madalal leegil või kuumal plaadil ja hoida seal üks tund. Vältida proovi kleepumist anuma seina külge. Jahutada ja lisada filterainet koguses, millest piisab vältimaks filtreerimise ajal mis tahes õli- või rasvakadu. Filtreerida läbi niisutatud rasvavaba kahekordse filterpaberi. Pesta jääki külma veega kuni filtraadi neutraalse reaktsioonini. Kontrollida, et filtraat ei sisaldaks mingit õli ega rasva. Nende esinemine filtraadis näitab, et proovi tuleb enne hüdrolüüsi ekstraheerida petrooleetriga kasutades metoodikat A. Asetada jääki sisaldav kahekordne filterpaber uuriklaasile ja kuivatada poolteist tundi kuivatuskapis temperatuuril 100 °C ± 3 °C. Asetada kahekordne filterpaber ja kuiv jääk ekstraheerimishülssi ja katta rasvavaba puuvillvatist tropiga. Asetada hülss ekstraheerimisaparaati ja jätkata, nagu on kirjeldatud punkti 5.1 teises ja kolmandas lõigus. 6. Tulemuste väljendamine Väljendada tulemus toorõli ja -rasva protsendilise sisaldusena proovis. 7. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 0,2% absoluutväärtuses, kui toorõli- ja -rasvasisaldus on väiksem kui 5%; -- 4,0% suurima tulemuse suhtes, kui sisaldus on 5--10%; -- 0,4% absoluutväärtuses, kui sisaldus on suurem kui 10%. 8. Märkused 8.1. Suure õli- ja rasvasisaldusega toodete puhul, mida on raske purustada või mis ei ole sobivad homogeense keskmise proovi võtmiseks, toimida järgmiselt. Kaaluda 20 g proovi 1 mg täpsusega ja segada see 10 g (või suurema koguse) veevaba naatriumsulfaadiga. Ekstraheerida petrooleetriga, nagu on kirjeldatud punktis 5.1. Viia saadud ekstrakti maht petrooleetriga 500 milliliitrini ja segada. Võtta 50 ml saadud lahust ja paigutada see väikesesse kuiva kaalutud kolbi, mis sisaldab pimsskivi tükikesi (4). Destilleerida lahusti, kuivatada ja jätkata, nagu on kirjeldatud punkti 5.1 viimases lõigus. Eraldada lahusti hülssi jäänud ekstraheerimisjäägist ja purustada jääk peensuseni 1 mm, paigutada jääk uuesti ekstraheerimishülssi (mitte lisada naatriumsulfaati) ja jätkata, nagu on kirjeldatud punkti 5.1 teises ja kolmandas lõigus. Arvutada õli ja rasva protsendiline sisaldus proovis, kasutades järgmist valemit: (10 a + b) 5, kus: a -- jäägi mass grammides pärast esimest ekstraheerimist (ekstrakti alikvootne osa); b -- jäägi mass grammides pärast teist ekstraheerimist. 8.2. Vähese õli- ja rasvasisaldusega produktide puhul võib proovi kaalutist suurendada 5 grammini. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 9 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Toortuha määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda toortuhasisaldust. 2. Põhimõte Proov tuhastatakse 550 °C juures; jääk kaalutakse. 3. Reaktiivid 20% (mass/ruumala) ammooniumnitraadi lahus. 4. Vahendid 4.1. Kuumutusplaat. 4.2. Elektriline termoregulaatoriga muhvelahi. 4.3. Plaatinast või plaatina ja kulla sulamist (10% Pt, 90% Au) valmistatud nelinurksed (60 40 25 mm) või ümmargused (läbimõõt 60--75 mm, kõrgus 20--25 mm) tiiglid tuhastamise jaoks. 5. Analüüsi käik Kaaluda 5 g proovi 1 mg täpsusega (2,5 g produktide puhul, millel on kalduvus paisuda) ja paigutada see tuhastamiseks tiiglisse, mida on enne kuumutatud ja kaalutud. Asetada tiigel kuumutusplaadile ja kuumutada aeglaselt, kuni aine söestub. Viia tiigel muhvelahju, mis on seatud temperatuurile 550 °C ± 5 °C. Hoida proovi sel temperatuuril, kuni tekib valge, helehall või punakas tuhk, mis on ilmselt vaba söeosakestest. Asetada tiigel eksikaatorisse, jätta jahtuma ja seejärel kaaluda kohe. 6. Tulemuste arvutamine Arvutada jäägi mass, arvestades maha tiigli massi. Leida toortuha protsendiline sisaldus proovis. 7. Märkused 7.1. Raskesti tuhastatavat ainet tuleb kõigepealt vähemalt kolm tundi eeltuhastada ning jahutada. Lisada mõned tilgad 20% ammooniumnitraadi lahust (ettevaatlikult, et vältida tuha laialiminekut või kämpude tekkimist). Jätkata tuhastamist pärast kuivatuskapis kuivatamist. Korrata toimingut vastavalt vajadusele, kuni tuhastamine on täielikult lõpule viidud. 7.2. Kui punktis 7.1 kirjeldatud protseduuri puhul aine ei tuhastu, siis pärast kolmetunnist tuhastamist viia tuhk sooja vette ja filtreerida läbi väikese tuhavaba filtri. Tuhastada filter ja selle sisu tiiglis. Viia filtraat jahutatud tiiglisse, aurutada kuivaks, tuhastada ja kaaluda. 7.3. Õli ja rasva puhul kaaluda sobiva suurusega tiiglisse 25 g proovi. Söestada proov, süüdates aine tuhavaba filterpaberi ribaga. Pärast põlemist niisutada nii vähese veega kui võimalik. Kuivatada ja seejärel tuhastada, nagu on kirjeldatud punktis 5. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 10 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Vesinikkloriidhappes lahustumatu tuha määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab söödas määrata vesinikkloriidhappes lahustumatuid mineraalaineid. Olenevalt proovi iseloomust on võimalik kasutada kahte metoodikat. 1.1. Metoodika A: sobib orgaanilise lihtsööda ja enamiku segasöötade puhul; 1.2. Metoodika B: sobib mineraalühendite ja -segude ning segasööda puhul, mis vastavalt metoodikaga A kindlaksmääratule sisaldavad vesinikkloriidhappes lahustumatuid aineid rohkem kui 1%. 2. Põhimõte 2.1. Metoodika A: proov tuhastatakse, tuhka keedetakse vesinikkloriidhappes ning lahustumatu jääk filtreeritakse ja kaalutakse. 2.2. Metoodika B: proovi töödeldakse vesinikkloriidhappega. Lahus filtreeritakse, jääk tuhastatakse ja selliselt saadud tuhka töödeldakse vastavalt metoodikale A. 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape 3N. 3.2. 20% (mass/ruumala) trikloroäädikhappe lahus. 1% (mass/ruumala) trikloroäädikhappe lahus. 4. Vahendid 4.1. Kuumutusplaat. 4.2. Elektriline termoregulaatoriga muhvelahi. 4.3. Plaatinast või plaatina ja kulla sulamist (10% Pt, 90% Au) valmistatud nelinurksed (60 40 25 mm) või ümmargused (läbimõõt 60--75 mm, kõrgus 20--25 mm) tiiglid tuhastamise jaoks. 5. Analüüsi käik 5.1. Metoodika A Kaaluda 5 g proovi 1 mg täpsusega (2,5 g produktide puhul, millel on kalduvus paisuda) ja paigutada see tuhastamiseks tiiglisse, mida on enne kuumutatud ja kaalutud. Asetada tiigel kuumutusplaadile ja kuumutada aeglaselt, kuni aine söestub. Viia tiigel muhvelahju, mis on seatud temperatuurile 550 °C ± 5 °C. Hoida proovi sel temperatuuril, kuni tekib valge, helehall või punakas tuhk, mis on ilmselt vaba söeosakestest. Asetada tiigel eksikaatorisse, jätta jahtuma ja seejärel kaaluda kohe. Paigutada tuhk 250--400-ml keeduklaasi ja lisada 75 ml 3N vesinikkloriidhapet. Kuumutada aeglaselt keemiseni ja keeta tasakesi viisteist minutit. Filtreerida soe lahus läbi tuhavaba filterpaberi ja pesta jääki sooja veega, kuni happelise reaktsiooni kadumiseni. Kuivatada jääki sisaldav filter ning tuhastada see kaalutud tiiglis vähemalt 550 °C ja mitte kõrgemal kui 700 °C juures. Jahutada eksikaatoris ja kaaluda. 5.2. Metoodika B Kaaluda 5 g proovi 1 mg täpsusega ja paigutada see 250--400-ml keeduklaasi. Lisada 25 ml vett ja seejärel 25 ml 3N vesinikkloriidhapet, segada ja oodata, kuni kihisemine lakkab, seejärel lisada veel 50 ml 3N vesinikkloriidhapet. Oodata, kuni gaasi eraldumine on täielikult lõppenud. Seejärel asetada keeduklaas keevale veevannile ja hoida seal 30 minutit või vajaduse korral kauem, et täielikult hüdrolüüsuks proovis leiduda võiv tärklis. Filtreerida soojalt läbi tuhavaba filtri ja pesta filter 50 ml sooja veega (vt punkt 7). Asetada jääki sisaldav filter tuhastamiseks tiiglisse, kuivatada ning tuhastada vähemalt 550 °C ja mitte kõrgemal kui 700 °C juures. Paigutada tuhk 250--400-ml keeduklaasi ja lisada 75 ml 3N vesinikkloriidhapet. Jätkata nii, nagu on kirjeldatud punkti 5.1 teises lõigus. 6. Tulemuste arvutamine Arvutada välja tuhastamisel saadud jäägi mass, arvestades maha tiigli massi. Väljendada tulemus protsendilise sisaldusena proovis. 7. Märkused Kui filtreerimine osutub raskeks, alustada analüüsi uuesti, asendades 50 ml 3N vesinikkloriidhapet 50 ml 20% trikloroäädikhappega ja pestes filtrit sooja 1% trikloroäädikhappe lahusega. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 11 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Kogu fosfori fotomeetrilise määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda kogu fosforisisalduse. Eriti sobib see metoodika vähese fosforisisaldusega toodete analüüsiks. Teatavatel juhtudel (fosforirikkad tooted) võib kasutada gravimeetrilist metoodikat. 2. Põhimõte Proov mineraliseeritakse kas kuivtuhastamise (orgaanilise sööda puhul) või märgtuhastamise (mineraalühendite ja vedelsööda puhul) teel ning lahustatakse happes. Lahust töödeldakse molübdatovanadaat-reaktiiviga. Tekkiva kollase lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm. 3. Reaktiivid 3.1. Kaltsiumkarbonaat (AR). 3.2. Vesinikkloriidhape (AR), tihedus 1,1 g/ml (ligikaudu 6N). 3.3. Lämmastikhape (AR), tihedus 1,045 g/ml. 3.4. Lämmastikhape (AR), tihedus 1,38--1,42 g/ml. 3.5. Väävelhape (AR), tihedus 1,84 g/ml. 3.6 Molübdatovanadaat-reaktiiv: segada 200 ml ammooniumheptamolübdaadi lahust, 200 ml ammooniummetavanadaadi lahust ja 134 ml lämmastikhapet 1-liitrilises mõõtekolvis. Täita kolb veega märgini. 3.6.1. Ammooniumheptamolübdaadi lahus: lahustada kuumas vees 100 g ammooniumheptamolübdaati (AR) (NH4)6 Mo 7O24 4H2O. Lisada 10 ml ammoniaagi lahust (tihedus 0,91 g/ml) ja viia lahuse maht vee lisamisel 1 liitrini. 3.6.2. Ammooniummetavanadaadi lahus: lahustada 400 ml kuumas vees 2,35 g ammooniummetavanadaati (AR) NH4VO3. Pidevalt segades, lisada aeglaselt 20 ml lahjendatud lämmastikhapet (7 ml HNO 3 (3.4) + 13 ml H2O) ning viia lahuse maht vee lisamisel 1 liitrini. 3.7. Standardlahus, mis sisaldab 1 mg fosforit ml kohta: lahustada vees 4,387 g kaaliumdivesinikfosfaati (AR) KH2PO4 ja viia lahuse maht vee lisamisel 1 liitrini. 4. Vahendid 4.1. Kvarts- või portselantiiglid tuhastamise jaoks. 4.2. Termoregulaatoriga elektriline muhvelahi, mis on seatud temperatuurile 550 °C. 4.3. Kjeldahli kolb mahuga 250 ml. 4.4. Mõõtekolvid ja pipetid. 4.5. Spektrofotomeeter. 4.6. Ligikaudu 16-mm läbimõõduga lihvkorkidega katseklaasid (korkide läbimõõt 14,5 mm); maht 25--30 ml. 5. Analüüsi käik 5.1. Lahuse valmistamine Vastavalt proovi iseloomule valmistada lahus, nagu on näidatud punktis 5.1.1 või 5.1.2. 5.1.1. Harilik lahuse valmistamisviis Kaaluda 1 mg täpsusega 1 g või rohkem proovi. Paigutada proov Kjeldahli kolbi, lisada 20 ml väävelhapet, loksutada, et aine täielikult happega läbi immutada ja vältida selle kleepumist kolvi seinte külge, kuumutada ja hoida keemistemperatuuril 10 minutit. Jätta kergelt jahtuma, lisada 2 ml lämmastikhapet, kuumutada veidi, jätta kergelt jahtuma, lisada veel veidi lämmastikhapet ja viia uuesti keemistemperatuurini. Korrata seda toimingut, kuni värvusetu lahuse saamiseni. Jahutada, lisada veidi vett, dekanteerida vedelik 500-ml mahuga mõõtekolbi, loputades Kjeldahli kolbi kuuma veega. Jätta jahtuma, täita kolb veega märgini, segada ja filtreerida. 5.1.2. Orgaanilisi aineid sisaldavad proovid, mis ei sisalda kaltsium- ja magneesiumdivesinikfosfaate Kaaluda tuhastamistiiglisse ligikaudu 2,5 g proovi 1 mg täpsusega. Segada proov 1 g kaltsiumkarbonaadiga kuni täieliku segunemiseni. Tuhastada ahjus temperatuuril 550 °C ± 5 °C, kuni tekib valge või hall tuhk (veidi sütt ei sega määramist). Paigutada tuhk 250-ml mahuga keeduklaasi. Lisada 20 ml vett ja vesinikkloriidhapet kuni kihisemine lakkab. Lisada veel 10 ml vesinikkloriidhapet. Asetada keeduklaas liivavannile ja aurutada kuivaks, et muuta ränihape lahustumatuks. Lahustada jääk uuesti 10 ml-s lämmastikhappes ja keeta liivavannil 5 minutit ilma kuivaks aurutamata. Dekanteerida vedelik 500-ml mahuga mõõtekolbi, loputades keeduklaasi mitu korda keeva veega. Jätta jahtuma, täita kolb veega märgini, segada ja filtreerida. 5.2. Värvilise ühendi teke ja optilise tiheduse mõõtmine Lahjendada alikvootne osa vastavalt punktile 5.1.1 või 5.1.2 saadud filtraadist, nii et fosfori kontsentratsioon ei oleks rohkem kui 40 µg/ml. Mõõta 10 ml seda lahust katseklaasi ja lisada 10 ml molübdatovanadaat-reaktiivi. Segada ja jätta vähemalt 10 minutiks seisma temperatuuril 20 °C. Mõõta spektrofotomeetriga lahuse optiline tihedus lainepikkusel 430 nm lahuse suhtes, mis on saadud, lisades 10 ml veele 10 ml molübdatovanadaat-reaktiivi. 5.3. Kalibreerimisgraafik Valmistada standardlahusest lahused, mis sisaldavad vastavalt 5, 10, 20, 30 ja 40 µg fosforit ml kohta. Võtta igast lahusest 10 ml ja lisada sellele 10 ml molübdatovanadaat-reaktiivi. Segada ja jätta vähemalt 10 minutiks seisma temperatuuril 20 °C. Mõõta optiline tihedus, nagu on kirjeldatud punktis 5.2. Koostada kalibreerimisgraafik, kandes sinna fosfori kogused ja neile vastavad optilised tihedused. Kontsentratsioonide vahemikus 0--40 µg/ml on graafik lineaarne. 6. Tulemuste arvutamine Määrata kalibreerimisgraafiku abil fosfori kogus proovis. Arvutada fosfori protsendiline sisaldus proovis. 7. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 3% suhtelises väärtuses fosforisisalduste puhul, mis on väiksemad kui 5%; -- 0,15% absoluutväärtuses, kui fosforisisaldus on 5% või sellest suurem. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 12 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Kaltsiumi määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda kogu kaltsiumisisaldust. 2. Põhimõte Proov tuhastatakse, tuhka töödeldakse vesinikkloriidhappega ning kaltsium sadestatakse kaltsiumoksalaadina. Sade lahustatakse väävelhappes ja tekkiv oblikhape tiitritakse kaaliumpermanganaadi lahusega. 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape (AR), tihedus 1,14 g/ml. 3.2. Lämmastikhape (AR), tihedus 1,40 g/ml. 3.3. Väävelhape (AR), tihedus 1,13 g/ml. 3.4. Ammoniaagi vesilahus (AR), tihedus 0,98 g/ml. 3.5. Ammooniumoksalaadi (AR) külm küllastunud lahus. 3.6. Sidrunhappe (AR) 30% (mass/ruumala) lahus. 3.7. Ammooniumkloriidi (AR) 5% (mass/ruumala) lahus. 3.8. Broomkresoolrohelise 0,04% (mass/ruumala) lahus. 3.9. Kaaliumpermanganaadi lahus 0,1N. 4. Vahendid 4.1. Elektriline muhvelahi õhu tsirkulatsiooni ja termoregulaatoriga. 4.2. Plaatina-, kvarts- või portselantiiglid tuhastamise jaoks. 4.3. Klaasfiltertiiglid poorsusega G4. 5. Analüüsi käik Kaaluda 1 mg täpsusega 5 g proovi (vajaduse korral rohkem), tuhastada see 550 °C juures ja viia tuhk 250-ml keeduklaasi. Lisada 40 ml vesinikkloriidhapet, 60 ml vett ja mõned tilgad lämmastikhapet. Kuumutada keeduklaasi sisu keemiseni ja hoida keemistemperatuuril 30 minutit. Jahutada ning viia lahus 250-ml mõõtekolbi. Lisada loputusvesi, täita kolb veega kuni märgini. Segada ja filtreerida. Pipeteerida 250-ml keeduklaasi selline kogus lahust, mis sisaldab 10--40 mg kaltsiumi vastavalt eeldatavale kaltsiumisisaldusele. Lisada 1 ml sidrunhappe lahust ja 5 ml ammooniumkloriidi lahust. Viia lahuse maht vee lisamisel ligikaudu 100 ml-ni. Kuumutada keemiseni, lisada kaheksa kuni kümme tilka broomkresoolrohelise lahust ja 30 ml sooja ammooniumoksalaadi lahust. Kui tekib sade, lahustada see, lisades mõned tilgad vesinikkloriidhapet. Neutraliseerida väga aeglaselt ammoniaagi lahusega, pidevalt segades, kuni on saavutatud pH väärtus 4,4--4,6 (st kuni indikaator muudab värvi). Asetada keeduklaas keevale veevannile ja hoida seda seal 30 minutit, et tekkinud sade saaks settida. Eemaldada keeduklaas veevannilt. Lasta tund aega seista ja filtreerida läbi G4 filtertiigli. Pesta keeduklaasi ja tiiglit veega, kuni järelejäänud ammooniumoksalaat on täielikult eemaldatud (piisavat pesemist näitab kloriidi puudumine pesuvees). Lahustada sade filtril 50 ml sooja väävelhappega. Loputada tiiglit sooja veega ja viia filtraadi ruumala ligikaudu 100 ml-ni. Tõsta temperatuur 70--80 °C-ni ja tiitrida tilkhaaval kaaliumpermanganaadi lahusega, kuni tekib roosa värvus, mis püsib ühe minuti. 6. Tulemuste arvutamine 1 ml 0,1N kaaliumpermanganaadi lahust vastab 2,004 mg kaltsiumile. Arvutage kaltsiumi protsendiline sisaldus proovis. 7. Märkused 7.1. Väga väikeste kaltsiumisisalduste korral toimida järgmiselt: filtreerida kaltsiumoksalaadi sadet sisaldav lahus läbi tuhavaba filterpaberi. Pärast pesemist kuivatada filter ja tuhastada see plaatinatiiglis 550 °C juures. Lahustada jääk uuesti mõnes tilgas väävelhappes, aurutada kuivaks, kuumutada uuesti 550 °C juures ja kaaluda. Kui W on saadud kaltsiumsulfaadi mass, siis prooviks võetud osa kaltsiumisisaldus = W 0,2944. 7.2. Kui proov koosneb üksnes mineraalainetest, lahustada see vesinikkloriidhappes ilma eelneva tuhastamiseta. Happes raskesti lahustuvate produktide puhul nagu kaltsiumalumiiniumfosfaat sulandada need enne lahustamist järgmiselt: segada analüüsitav proov plaatinatiiglis hoolikalt seguga, mis kaalub proovist viis korda rohkem ja sisaldab võrdsetes kogustes kaaliumkarbonaati ja naatriumkarbonaati. Kuumutada ettevaatlikult, kuni segu on täielikult sulanud. Jahutada see ja lahustada vesinikkloriidhappes. 7.3. Kui proovi magneesiumisisaldus on suur, sadestada kaltsiumoksalaat teistkordselt. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 13 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Kaaliumi määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda kaaliumisisalduse. 2. Põhimõte Proov tuhastatakse ja tuhk lahustatakse vesinikkloriidhappes. Lahuse kaaliumisisaldus määratakse leekfotomeetria abil tseesiumkloriidi ja alumiiniumnitraadi juuresolekul. Nende ainete lisamine vähendab tunduvalt segavate elementide mõju. 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape (AR), tihedus 1,12 g/ml. 3.2. Tseesiumkloriid (AR). 3.3. Alumiiniumnitraat Al(NO3)3 9H 2O. 3.4. Kaaliumkloriid (AR), veevaba. 3.5. Koormusaine: lahustada vees 50 g tseesiumkloriidi ja 250 g alumiiniumnitraati, viia lahuse maht vee lisamisel kuni 1 liitrini ning segada. Hoida lahust plastpudelites. 3.6. Kaaliumi standardlahus: lahustada vees 1,907 g kaaliumkloriidi, lisada 5 ml vesinikkloriidhapet, viia lahuse maht vee lisamisel kuni 1 liitrini ning segada. Hoida lahust plastpudelites. 1 ml seda lahust sisaldab 1,00 mg kaaliumi. 4. Vahendid 4.1. Plaatina-, kvarts- või portselantiiglid tuhastamise jaoks, vajaduse korral kaanega. 4.2. Elektriline termoregulaatoriga muhvelahi. 4.3. Leekfotomeeter. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi analüüs Üldreeglina kaaluda 10 g proovi 10 mg täpsusega, paigutada see tiiglisse ja tuhastada kolm tundi 450 °C juures. Pärast jahutamist viige tuhk kvantitatiivselt 500-ml mahuga mõõtekolbi, kasutades 250--300 ml vett ja seejärel 50 ml vesinikkloriidhapet. Kui kogu süsinikdioksiidi eraldumine on lakanud, kuumutada lahust ja hoida seda kaks tundi temperatuuril umbes 90 °C, aegajalt segades. Pärast jahutamist toatemperatuurini täita mõõtekolb veega kuni märgini, loksutada ja filtreerida. Mõõta alikvootne osa filtraati, mis sisaldab maksimaalselt 1,0 mg kaaliumi, mõõtekolbi mahuga 100 ml, lisada 10,0 ml koormusainet, täita kolb veega kuni märgini ning segada. Suurema kaaliumisisalduse puhul lahjendada analüüsitav lahus sobivas vahekorras, enne kui lisada koormusainet. Järgmine tabel annab juhised umbes 10 g proovi kohta. Proovi eeldatav kaaliumisisaldus (% K) Lahjendus ml Lahuse alikvootne osa kuni 0,1 -- 50 0,1--0,5 -- 10 0,5--1,0 -- 5 1,0--5,0 1:10 10 5,0--10,0 1:10 5 10,0--20,0 1:20 5 Mõõta leekfotomeetriga lainepikkusel 768 nm. Arvutada tulemus välja kalibreerimisgraafiku abil. 5.2. Kalibreerimisgraafik Pipeteerida 10 ml standardlahust 250-ml mõõtekolbi, täita kolb veega kuni märgini ning segada. Pipeteerida 100-ml mahuga mõõtekolbidesse 5, 10, 15, 20 ja 25 ml seda lahust, mis vastab kaaliumikogustele vastavalt 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ja 1,0 mg. Lõpetada seeria kolviga, mis ei sisalda standardlahust. Lisada igasse kolbi 10 ml koormusainet, täita kolvid veega kuni märgini ning segada. Teostada mõõtmised, nagu on kirjeldatud punktis 5.1. Kalibreerimisgraafik on üldiselt lineaarne kuni kaaliumi kontsentratsioonini 1 mg 100 ml-s lahuses. 6. Tulemuste arvutamine Arvutada kaaliumi protsendiline sisaldus proovis. 7. Märkused Alati ei ole tarvis lisada koormusainet, et hoida ära segavate elementide mõju. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 14 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Magneesiumi aatomabsorptsioon-spektrofotomeetrilise määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata magneesiumi kogust söötades. Eriti sobiv on see metoodika väiksemate kui 5%-liste magneesiumi koguste määramiseks. 2. Põhimõte Proov tuhastatakse ja lahustatakse vesinikkloriidhappes. Kui proov ei sisalda orgaanilisi aineid, lahustatakse see otse lahjendatud vesinikkloriidhappes. Lahus lahjendatakse ja magneesiumisisaldus määratakse aatomabsorptsioon-spektrofotomeetriliselt 285,2 nm juures, võrreldes standardlahustega. 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape (AR), tihedus 1,16 g/ml. 3.2. Kontsentreeritud vesinikkloriidhape (AR), tihedus 1,19 g/ml. 3.3. Magneesiumilint või -traat või magneesiumsulfaatheptahüdraat, mis on kuivatatud toatemperatuuril. 3.4. Strontsiumi soola lahus, mis sisaldab 2,5% (mass/ruumala) strontsiumit [= 76,08 g SrCl2 6H 2O (AR), või 60,38 g Sr(NO3)2 (AR)]. 3.5. Magneesiumi standardlahus: kaaluda 1 mg täpsusega 1 g magneesiumi, millelt eelnevalt on oksiidikiht ettevaatlikult eemaldatud või vastav kogus (10,143 g) magneesiumsulfaatheptahüdraati. Viia 1000-ml mõõtekolbi, lisada 80 ml vesinikkloriidhapet, jätta lahustuma ja täita kolb veega märgini. 1 ml seda lahust sisaldab 1,000 mg magneesiumi. 4. Vahendid 4.1. Plaatinast, kvartsist või portselanist tiiglid tuhastamise jaoks. 4.2. Termoregulaatoriga elektriline muhvelahi. 4.3. Aatomabsorptsioon-spektrofotomeeter. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovilahuse ettevalmistamine 5.1.1. Söödad, mis koosnevad ainult mineraalainetest Kaaluda 1 mg täpsusega 5 g proovi 500-ml mõõtekolbi, milles on 250--300 ml vett. Lisada 40 ml vesinikkloriidhapet, kuumutada keemiseni ja keeta tasakesi 30 minutit. Jätta jahtuma, täita kolb veega märgini, segada ja filtreerida läbi kuiva kurdfiltri kuiva keeduklaasi, valades ära filtraadi esimesed 30 ml. Ränidioksiidi esinemisel töödelda 5 g proovi küllaldase koguse (15--30 ml) vesinikkloriidhappega, aurutada veevannil kuivaks ja asetada üheks tunniks kuivatuskappi 105 °C juures. Jätkata nagu on näidatud punktis 5.1.2 kolmandast lausest alates. 5.1.2. Söödad, mis koosnevad peamiselt mineraalainetest Kaaluda 1 mg täpsusega 5 g proovi tiiglisse ja tuhastada 550 °C juures muhvelahjus, kuni saadakse tuhk, mis on vaba süsinikku sisaldavatest osakestest ja jätta jahtuma. Et ränidioksiidi eemaldada, lisada tuhale küllaldane kogus (15--30 ml) vesinikkloriidhapet, aurutada veevannil kuivaks ja asetada üheks tunniks kuivatuskappi, mille temperatuur on 105 °C. Töödelda jääki 10 ml vesinikkloriidhappega ja viia sooja vett kasutades üle 500-ml mõõtekolbi. Jätta jahtuma ja täita kolb veega märgini, segada ja filtreerida läbi kuiva kurdfiltri kuiva keeduklaasi. Valada ära filtraadi esimesed 30 ml. 5.1.3. Söödad, mis koosnevad peamiselt orgaanilistest ainetest Kaaluda 1 mg täpsusega 5 g proovi tiiglisse ja tuhastada 550 °C juures muhvelahjus, kuni saadakse tuhk, mis on vaba süsinikku sisaldavatest osakestest. Töödelda tuhka 5 ml vesinikkloriidhappega, aurutada veevannil kuivaks ja siis kuivatada üks tund kuivatuskapis 105 °C juures, et muuta ränidioksiid mittelahustuvaks. Töödelda tuhka 5 ml vesinikkloriidhappega, viia sooja vett kasutades üle 250-ml mõõtekolbi, kuumutada keemiseni, jätta jahtuma ja täita kolb veega märgini. Segada ja filtreerida läbi kuiva kurdfiltri kuiva keeduklaasi. Valada ära filtraadi esimesed 30 ml. 5.2. Mõõtmine aatomabsorptsioon-spektrofotomeetriga Lahjendades standardlahust veega, valmistada vähemalt viis kasvava kontsentratsiooniga võrdluslahust, mis vastavad spektrofotomeetri optimaalsele mõõtepiirkonnale. Lisada igale lahusele 10 ml strontsiumi soola lahust ja viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. Lahjendada alapunktis 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 saadud filtraadi alikvootne osa veega, et saada magneesiumi kontsentratsioon, mis on võrdluslahuste kontsentratsiooni piires. Selle lahuse vesinikkloriidhappe kontsentratsioon ei tohi ületada 0,4N. Lisada 10 ml strontsiumi soola lahust ja viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. Mõõta määratava lahuse ja võrdluslahuste absorptsioon 285,2 nm juures. 6. Tulemuste arvutamine Arvutada magneesiumi kogus proovis võrreldes võrdluslahustega. Leida magneesiumi protsendiline sisaldus proovis. 7. Korratavus Erinevus sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste vahel ei tohi ületada 5% suhtelises väärtuses. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 15 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Naatriumi määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda naatriumisisalduse. 2. Põhimõte Proov tuhastatakse ja tuhk lahustatakse vesinikkloriidhappes. Lahuse naatriumisisaldus määratakse leekfotomeetria abil tseesiumkloriidi ja alumiiniumnitraadi juuresolekul. Nende ainete lisamine vähendab tunduvalt segavate elementide mõju. 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape (AR), tihedus 1,12 g/ml. 3.2. Tseesiumkloriid (AR). 3.3. Alumiiniumnitraat Al(NO3)3 9 H 2O. 3.4. Naatriumkloriid (AR), veevaba. 3.5. Koormusaine: lahustada vees 50 g tseesiumkloriidi ja 250 g alumiiniumnitraati, viia lahuse maht vee lisamisel 1 liitrini ning segada. Hoida lahust plastpudelites. 3.6. Naatriumi standardlahus: lahustada vees 2,542 g naatriumkloriidi, lisada 5 ml vesinikkloriidhapet, viia lahuse maht vee lisamisel 1 liitrini ning segada. Hoida lahust plastpudelites. Lahus sisaldab 1,00 mg naatriumi. 4. Vahendid 4.1. Plaatina-, kvarts- või portselantiiglid tuhastamise jaoks, vajaduse korral kaanega. 4.2. Elektriline termoregulaatoriga muhvelahi. 4.3. Leekfotomeeter. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi analüüs Üldreeglina kaaluda 10 g proovi 10 mg täpsusega, paigutada see tiiglisse ja tuhastada kolm tundi 450 °C juures. Vältida ülekuumutamist (süttimist). Pärast jahutamist viia tuhk kvantitatiivselt 500-ml mahuga mõõtekolbi, kasutades 250--300 ml vett ja seejärel 50 ml vesinikkloriidhapet. Kui kogu süsinikdioksiidi eraldumine on lakanud, kuumutada lahust ja hoida seda kaks tundi temperatuuril umbes 90 °C, aeg-ajalt segades. Pärast jahutamist toatemperatuurini täita kolb veega kuni märgini, loksutada ja filtreerida. Mõõta alikvootne osa filtraati, mis sisaldab maksimaalselt 1,0 mg naatriumi, 100-ml mahuga mõõtekolbi, lisada 10,0 ml koormusainet, täita kolb veega kuni märgini ning segada. Suurema naatriumisisalduse puhul lahjendada analüüsitav lahus sobivas vahekorras, enne kui lisada koormusainet. Järgmine tabel annab juhised umbes 10 g proovi kohta: Proovi eeldatav naatriumisisaldus (% Na) Lahjendus Lahuse alikvootne osa, ml kuni 0,1 -- 50 0,1--0,5 -- 10 0,5--1,0 -- 5 1,0--5,0 1 : 10 10 5,0--10,0 1 : 10 5 10,0--20,0 1 : 20 5 Mõõta leekfotomeetriga lainepikkusel 589 nm. Arvutada tulemus kalibreerimisgraafiku abil. 5.2. Kalibreerimisgraafik Pipeteerida 10 ml standardlahust 250-ml mahuga mõõtekolbi, täita kolb veega kuni märgini ning segada. Pipeteerida 100-ml mahuga mõõtekolbidesse 5, 10, 15, 20 ja 25 ml seda lahust, mis vastab naatriumikogustele vastavalt 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ja 1,0 mg. Lõpetada seeria kolviga, mis ei sisalda standardlahust. Lisada igasse kolbi 10 ml koormusainet, täita kolvid veega kuni märgini ning segada. Teostada mõõtmised, nagu on kirjeldatud punktis 5.1. Kalibreerimisgraafik on üldiselt lineaarne kuni naatriumi kontsentratsioonini 1 mg 100 ml-s lahuses. 6. Tulemuste arvutamine Väljendada tulemus protsendilise sisaldusena proovis. 7. Märkused 7.1. Üle 4% naatriumi sisaldavate produktide puhul on eelistatav tuhastada ainet kaks tundi kaanega tiiglis. Pärast jahutamist lisada tuhale vett, segada plaatinatraadi abil suspensiooniks, kuivatada ja tuhastada veel kord kaks tundi kaanega tiiglis. 7.2. Kui proov koosneb üksnes mineraalainetest, lahustada see ilma eelneva tuhastamiseta. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 16 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Mikroelementide raua, vase, mangaani ja tsingi määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata mikroelementide raua, vase, mangaani ja tsingi sisalduse söödas. Määratavad miinimumid on järgmised: -- raud (Fe): 20 mg/kg; -- vask (Cu): 10 mg/kg; -- mangaan (Mn): 20 mg/kg; -- tsink(Zn): 20 mg/kg. 2. Põhimõte Proov lahustatakse vesinikkloriidhappes pärast vajadusel proovis esineva orgaanilise aine tuhastamist. Elemendid raud, vask, mangaan ja tsink määratakse pärast sobivat lahjendamist, kasutades aatomabsorptsioon-spektromeetriat. 3. Reaktiivid Reaktiivide ja analüüsitavate lahuste valmistamiseks kasutada vett, mis ei sisalda määratavaid katioone ja mis on saadud kas kahekordsel destillatsioonil boorsilikaat- või kvartsklaasist destillaatoris või kahekordsel töötlemisel ioonvahetusvaikudel. Reaktiivid peavad olema vähemalt «analüütilise reaktiivi» puhtusastmega (AR). Määratava elemendi puudumist tuleb kontrollida pimekatse abil. Vajaduse korral tuleb reaktiive täiendavalt puhastada. Edaspidi kirjeldatud standardlahuste asemel võib kasutada kaubanduses saadaolevaid standardlahuseid, tingimusel, et need on garanteeritud ja et neid on enne kasutamist kontrollitud. 3.1. Vesinikkloriidhappe (AR), tihedus 1,19 g/ml. 3.2. Vesinikkloriidhape (AR), 6N. 3.3. Vesinikkloriidhape (AR), 0,5N. 3.4. Vesinikfluoriidhape 38--40% (mahu%), mille rauasisaldus on alla 1 mg Fe liitri kohta ning jääk pärast kokkuaurutamist alla 10 mg (sulfaadina) liitri kohta. 3.5. Väävelhape (AR), tihedus 1,84 g/ml. 3.6. Vesinikperoksiid (AR), [(ligikaudu 100 mahuosa hapnikku (30% massi järgi)]. 3.7. Raua standardlahus (1000 µg Fe/ml), mis valmistatakse järgmiselt: lahustada 1 g raudtraati (AR) 200 ml 6N vesinikkloriidhappes 1-liitrilises mõõtekolvis, lisada 16 ml vesinikperoksiidi ja täita kolb veega märgini. 3.7.1. Raua tööstandardlahus (100 µg Fe/ml), mis saadakse standardlahuse lahjendamisel veega vahekorras 1/9. 3.8. Vase standardlahus (1000 µg Cu/ml) valmistatakse järgmiselt: lahustada 1 g vasepulbrit (AR) 25 ml 6N vesinikkloriidhappes 1-liitrilises mõõtekolvis, lisada 5 ml vesinikperoksiidi ja täita kolb veega märgini. 3.8.1. Vase tööstandardlahus (10 µg/ml) saadakse standardlahuse lahjendamisel veega vahekorras 1/9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1/9. 3.9. Mangaani standardlahus (1000 µg Mn/ml) valmistatakse järgmiselt: lahustada 1 g mangaanipulbrit (AR) 25 ml 6N vesinikkloriidhappes 1-liitrilises mõõtekolvis ja täita kolb veega märgini. 3.9.1. Mangaani tööstandardlahus (10 µg Mn/ml) saadakse standardlahuse lahjendamisel veega vahekorras 1/9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1/9. 3.10. Tsingi standardlahus (1000 µg/ml) valmistatakse järgmiselt: lahustada 1 g riba- või lehttsinki (AR) 25 ml 6N vesinikkloriidhappes 1-liitrilises mõõtekolvis ja täita kolb veega märgini. 3.10.1. Tsingi tööstandardlahus (10 µg Zn/ml) saadakse standardlahuse lahjendamisel veega vahekorras 1/9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1/9. 3.11. Lantaankloriidi lahus valmistatakse järgmiselt: lahustada 12 g lantaanoksiidi 150 ml vees 1-liitrilises mõõtekolvis, lisada 100 ml 6N vesinikkloriidhapet ja täita kolb veega märgini. 4. Vahendid 4.1. Muhvelahi temperatuuri regulaatori ja püromeetriga. 4.2. Klaasnõud peavad olema vastupidavast boorsilikaatklaasis. On soovitav kasutada vahendeid, mis on mõeldud ainult mikroelementide määramise jaoks. 4.3. Plaatinatiigel ja (mittekohustuslik) kvartstiigel. 4.4. Aatomabsorptsioon-spektrofotomeeter, mis vastab kasutatava meetodi tundlikkus- ja täpsusnõuetele. 5. Analüüsi käik(5) 5.1. Orgaanilist ainet sisaldavad proovid 5.1.1. Tuhastamine ja lahuse ettevalmistamine analüüsiks (6) Paigutada 5--10 g 0,2 mg täpsusega kaalutud proovi kvarts- või plaatinatiiglisse(7), kuivatada kuivatuskapis temperatuuril 105 °C ning asetada tiigel külma muhvelahju. Sulgeda ahi (8) ning tõsta 90 minuti jooksul järk-järgult temperatuuri kuni 450--475 °C. Hoida seda temperatuuri 4--16 tundi (nt üleöö), et eemaldada süsinikku sisaldavad aineosakesed, seejärel avada ahi ja jätta jahtuma(9). Kui jääk filtril on musta värvi (süsi), paigutada see tagasi ahju ning tuhastada uuesti temperatuuril 450--475 °C. See tuhastamine, mis võtab mõned tunnid (kolm kuni viis tundi), on lõppenud, kui tuhk on valge või peaaegu valge. Lahustada jääk ligikaudu 2 ml vesinikkloriidhappes, aurutada kuivaks ning lisada 5 ml 6N vesinikkloriidhapet. Kuumutada, filtreerida lahus mõõtekolbi ning täita veega märgini (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 N). 5.1.2. Spektrofotomeetriline määramine 5.1.2.1. Kalibreerimislahuste valmistamine Iga määratava elemendi jaoks valmistada punktides 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.10.1 näidatud tööstandardlahustest rida kalibreerimislahuseid, kusjuures iga kalibreerimislahuse HCl kontsentratsioon on ligikaudu 0,5N ning (raua, mangaani ja tsingi puhul) lantaankloriidi kontsentratsioon vastab 0,1% La (massi%). Valitud mikroelementide sisaldused peavad jääma kasutatava spektrofotomeetri tundlikkuse piirkonda. Olenevalt kasutatava spektrofotomeetri tüübist ja tundlikkusest võib olla vaja valida vastavad kontsentratsioonid. Allpool esitatud tabelites on toodud näited kalibreerimislahuste vastava koostise kohta: kalibreerimislahuste tüüpilised koostised. Raud µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5 ml tööstandardlahust (1ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5 + ml 6N HCl 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantaankloriidi lahust ning lisada vett 100 ml-ni. Vask µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml tööstandardlahust (1 ml = 10 µg Cu) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6N HCl 8 8 8 8 8 8 8 Lisada vett 100 ml-ni. Mangaan µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml tööstandardlahust (1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6N HCl 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantaankloriidi lahust ning lisada vett 100 ml-ni. Tsink µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 ml tööstandardlahust (1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8 + ml 6N HCl 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantaankloriidi lahust ning lisada vett 100 ml-ni. 5.1.2.2. Lahuse valmistamine analüüsiks Vase määramiseks võib punkti 5.1.1 alusel valmistatud lahust harilikult kohe kasutada. Kui on vaja reguleerida selle kontsentratsiooni vastavalt kalibreerimislahuste ulatusele, võib pipeteerida alikvootse osa mõõtekolbi mahuga 100 ml ning täita kolvi 0,5N vesinikkloriidhappe abil märgini. Raua, mangaani ja tsingi määramiseks pipeteerida punkti 5.1.1 alusel valmistatud lahuse alikvootne osa mõõtekolbi mahuga 100 ml, lisada 10 ml lantaankloriidi lahust ning täita kolb 0,5N vesinikkloriidhappe abil märgini (vt ka punkt 8). 5.1.2.3. Pimekatse Pimekatse peab sisaldama kõiki analüüsi käiguga ette nähtud etappe, üksnes analüüsitav proov jäetakse välja. Kalibreerimislahust «0» ei tohi kasutada pimekatsena. 5.1.2.4. Aatomabsorptsiooni mõõtmine Mõõta kalibreerimislahuste ja analüüsitava lahuse aatomabsorptsioon, kasutades oksüdeerivat õhk-atsetüleenleeki, järgmistel lainepikkustel: Fe 248,3 nm; Cu 324,8 nm; Mn 279,5 nm; Zn 213,8 nm. Viia iga mõõtmist läbi neli korda. 5.2. Mineraalsöödad Kui proov ei sisalda orgaanilist ainet, ei ole eelnevat tuhastamist vaja. Toimida, nagu on kirjeldatud punktis 5.1.1 alates teisest lõigust. Kuivaks aurutamise vesinikfluoriidhappega võib ära jätta. 6. Tulemuste arvutamine Arvutada kalibreerimisgraafiku abil mikroelementide kontsentratsioon analüüsitavas lahuses ning väljendada tulemus mikroelemendi milligrammides proovi kilogrammi kohta. 7. Korratavus Ühe ja sama prooviga ning ühe ja sama analüütiku poolt läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 5 mg/kg absoluutväärtuses, kui määratavat mikroelementi on kuni 50 mg/kg; -- 10% suurimast tulemusest, kui määratavat mikroelementi on 50 kuni 100 mg/kg; -- 10 mg/kg absoluutväärtuses, kui määratavat mikroelementi on 100 kuni 200 mg/kg; -- 5% suurimast tulemusest, kui määratavat mikroelementi on rohkem kui 200 mg/kg. 8. Märkused Suured fosfaadikogused võivad segada raua, mangaani ja tsingi määramist. Fosfaadi segava mõju kõrvaldamiseks lisada lantaankloriidi lahust. Kui proovis on massisuhe (Ca + Mg): P = 2, võidakse ära jätta lantaankloriidi lahuse lisamine analüüsitavasse lahusesse ja kalibreerimislahustesse. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 17 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Karbonaatide määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab enamiku söötade puhul määrata karbonaatide koguse, mida kokkuleppeliselt väljendatakse kaltsiumkarbonaadina. 2. Põhimõte Karbonaadid lagundatakse vesinikkloriidhappes, eralduv süsinikdioksiid kogutakse gradueeritud büretti ja selle mahtu võrreldakse mahuga, mis vabaneb samades tingimustes teatud kindlast kogusest kaltsiumkarbonaadist (AR). 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape, tihedus 1,10 g/ml. Kaltsiumkarbonaat (AR). 4. Vahendid Scheibler-Dietrichi aparaat (vt joonis) või selle analoog. 5. Analüüsi käik Analüüsiks võetava proovi kaalutise suurus valida vastavalt toodete karbonaatide sisaldusele: -- toodete puhul, mis sisaldavad 50--100% karbonaate väljendatud kaltsiumkarbonaadina, 0,5 g; -- toodete puhul, mis sisaldavad 40--50% karbonaate väljendatud kaltsiumkarbonaadina, 1 g; -- muude toodete puhul 2--3 g. Paigutada proov aparaadi (vt joonis) spetsiaalsesse kolbi, milles on väike purunemiskindlast materjalist katseklaas 10 ml vesinikkloriidhappega, ning ühendada kolb aparaadiga. Keerata kolmikkraani nii, et gradueeritud gaasimõõtmise bürett on ühendatud väljapoole. Kasutades tõstetavat toru, mis on täidetud värvitud väävelhappega ja ühendatud gradueeritud büretiga, tõsta vedeliku taset kuni nullmärgini. Büreti ja toru ühendamiseks keerata kraani ning kontrollida, et tase püsiks nullis. Scheibler-Dietrichi aparaat CO2 määramiseks

Kallutades kolbi, valada vesinikkloriidhape aeglaselt proovile. Võrdsustada rõhk, langetades toru. Loksutada kolbi, kuni süsinikdioksiidi eraldumine on täielikult lõppenud. Taastada rõhk, tuues vedeliku gradueeritud büretis ja torus samale tasemele. Mõne minuti pärast, kui gaasi maht on muutunud konstantseks, võtta näit. Viia samades tingimustes läbi kontrollkatse 0,5 g kaltsiumkarbonaadiga. 6. Tulemuste arvutamine Karbonaatide sisaldus, väljendatud kaltsiumkarbonaadi protsendilise sisaldusena proovis, arvutatakse järgmise valemi abil

kus: V -- proovist eraldunud CO2 maht milliliitrites; T -- 0,5 g CaCO3-st eraldunud CO2 maht milliliitrites; W -- proovi mass grammides. 7. Märkused 7.1. Kui proovi mass on suurem kui 2 g, lisada kolbi kõigepealt 15 ml vett ja segada, enne kui alustate analüüsi. Kontrollkatse puhul kasutada sama veekogust. 7.2. Kui kasutatava aparaadi maht erineb Scheibler-Dietrichi aparaadi omast, tuleb sellele vastavalt kohandada proovi ja kontrollaine kaalutud kogused ning tulemuste väljaarvutamine. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 18 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Kloori kloriidides määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata kloorikoguse vees lahustuvates kloriidides, mida kokkuleppeliselt väljendatakse naatriumkloriidina. Metoodika sobib kõikide söötade jaoks. 2. Põhimõte Kloriidid lahustatakse vees. Kui toode sisaldab orgaanilist ainet, siis lahus selitatakse. Lahus hapestatakse kergelt lämmastikhappega ja kloriidid sadestatakse hõbenitraadi lahuse abil hõbekloriidina. Hõbenitraadi liig tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega Volhardi meetodil. 3. Reaktiivid 3.1. Ammooniumtiotsüanaadi lahus 0,1N. 3.2. Hõbenitraadi lahus 0,1N. 3.3. Ammooniumraudsulfaadi küllastunud lahus. 3.4. Lämmastikhape, tihedus 1,38 g/ml. 3.5. Dietüüleeter (AR). 3.6. Atsetoon (AR). 3.7. Carrez' I lahus: lahustada vees 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Lisada vett kuni lahuse maht on 100 ml. 3.8. Carrez' II lahus: lahustada vees 10,6 g kaaliumheksatsüanoferraat(II) K4[Fe(CN)6] 3H 2O. Lisada vett kuni lahuse maht on 100 ml. 3.9. Aktiivsüsi (AR), kloriidivaba ja kloriide mitteabsorbeeriv. 4. Vahendid Segisti (trummel); umbes 35--40 p/min. 5. Analüüsi käik 5.1. Lahuse ettevalmistamine Olenevalt proovi iseloomust valmistada lahus ette, nagu on näidatud punktides 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3. Samal ajal viia läbi pimekatse, jättes analüüsitava proovi välja. 5.1.1. Proovid, mis ei sisalda orgaanilist ainet Kaaluda 1 mg täpsusega kuni 10 g proovi, mis ei sisalda rohkem kui 3 g kloori kloriidide kujul. Viia proov koos 400 ml veega 500-ml mõõtekolbi ligikaudu 20 °C juures. Segada segistis 30 minutit, täita mõõtekolb veega kuni märgini, segada ja filtreerida. 5.1.2. Proovid, mis sisaldavad orgaanilist ainet, v.a punktis 5.1.3. loetletud tooted Kaaluda 5 g proovi 1 mg täpsusega ning paigutada see koos 1 g aktiivsöega 500-ml mõõtekolbi. Lisada 400 ml vett ligikaudu 20 °C juures ja 5 ml Carrez' I lahust, segada ja seejärel lisada 5 ml Carrez' II lahust. Segada segistis 30 minutit, täita mõõtekolb veega kuni märgini, segada ja filtreerida. 5.1.3. Kuumtöödeldud söödad, linakoogid ja -jahu, linajahurikkad produktid ja muud taimeliimirikkad või kolloidainerikkad produktid (näiteks dekstrineeritud tärklis) Valmistada lahus ette, nagu on kirjeldatud punktis 5.1.2, kuid mitte filtreerida. Dekanteerida (vajaduse korral tsentrifuugida), mõõta 100 ml sademe peal olevat selget lahust ja viia see 200-ml mõõtekolbi. Segada atsetooniga ja täita mõõtekolb atsetooniga kuni märgini, segada ja filtreerida. 5.2. Tiitrimine Pipeteerida Erlenmeyeri kolbi (olenevalt eeldatavast kloriidisisaldusest) 25--100 ml filtraati, mis on saadud vastavalt punktides 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kirjeldatule. Võetud ruumala ei tohi sisaldada üle 150 mg kloori (Cl). Vajaduse korral lahjendada veega vähemalt 50 ml-ni, lisada 5 ml lämmastikhapet, 20 ml ammooniumraudsulfaadi küllastunud lahust ja kaks tilka ammooniumtiotsüanaadi lahust nullnivooni täidetud büretist. Lisada hõbenitraadi lahust büreti abil selliselt, et saada 5 ml liig. Lisada 5 ml dietüüleetrit ja loksutada tugevasti, et sade koaguleerida. Tiitrida hõbenitraadi liig tagasi ammooniumtiotsüanaadi lahusega, kuni punakaspruun värvus on püsinud ühe minuti. 6. Tulemuste arvutamine Tiitrimiseks võetud filtraadi mahus sisalduva kloori kogus (W) väljendatud naatriumkloriidina arvutatakse järgmise valemi abil: W = 5,845 (V1 -- V2) mg, kus: V1 -- lisatud 0,1N hõbenitraadi lahuse ruumala (ml), V2 -- tiitrimiseks kulunud 0,1N ammooniumtiotsüanaadi lahuse ruumala (ml). Pimekatsele kulunud 0,1N hõbenitraadi lahuse ruumala lahutada ruumalade vahest (V1 -- V2). 7. Märkused 7.1. Tiitrida võib ka potentsiomeetriliselt. 7.2. Väga õli- ja rasvarikaste produktide puhul rasvatustAda need kõigepealt eetri või petrooleetri abil. 7.3. Kalajahu puhul võib tiitrida Mohri meetodil. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 19 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Lenduvate lämmastikaluste mikrodifusiooni teel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab söödas määrata lenduvate lämmastikaluste sisalduse väljendatud ammoniaagina. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused tõrjutakse mikrodifusiooni teel kaaliumkarbonaadi lahuse abil välja, kogutakse boorhappe lahusesse ja tiitritakse väävelhappega. 3. Reaktiivid 3.1. 20% (mass/ruumala) trikloroäädikhappe lahus. 3.2. Indikaator: lahustada 100 ml-s 95--96% (mahu%) etanoolis 33 mg broomkresoolrohelist ja 65 mg metüülpunast. 3.3. Boorhappe lahus: lahustada 1-liitrises mõõtekolvis 10 g boorhapet (AR) 200 ml 95--96% (mahu%) etanoolis ja 700 ml vees. Lisada 10 ml indikaatorit. Segada ja vajaduse korral reguleerida lahuse värvus helepunaseks, lisades naatriumhüdroksiidi lahust. 1 ml seda lahust fikseerib maksimaalselt 300 µg NH3. 3.4. Kaaliumkarbonaadi küllastunud lahus: lahustada 100 ml keevas vees 100 g kaaliumkarbonaati (AR). Jätta jahtuma, filtreerida. 3.5. Väävelhape 0,02N. 4. Vahendid 4.1. Segisti (trummel): umbes 35--40 pööret minutis. 4.2. Klaasist või plastikust Conway kambrid (vt joonist). 4.3. Mikrobüretid gradueeringuga 1/100 ml. CONWAY kamber

5. Analüüsi käik Kaaluda 1 mg täpsusega 10 g proovi ja viia see koos 100 ml veega mõõtekolbi mahuga 200 ml. Segada segistis 30 minutit. Lisada 50 ml trikloroäädikhappe lahust, täita kolb veega kuni märgini, loksutada tugevasti ja filtreerida läbi kurdfiltri. Pipeteerida 1 ml boorhappe lahust Conway kambri keskossa ja 1 ml proovi filtraati kambri välimisse ossa. Katta osaliselt kamber vaseliiniga määritud lihvkaanega. Tilgutada kambri välimisse ossa kiiresti 1 ml küllastunud kaaliumkarbonaadi lahust ning sulgeda kamber kaanega õhukindlalt. Pöörata kambrit ettevaatlikult horisontaaltasandil, nii et kaks lahust kambri välimises osas omavahel segunevad. Jätta kas toatemperatuuril vähemalt neljaks tunniks või 40 °C juures vähemalt tunniks ajaks inkubeeruma. Kasutades mikrobüretti tiitrida lenduvad alused boorhappe lahuses 0,02N väävelhappega. Sedasama analüüsi käiku kasutades viia läbi pimekatse, lisamata analüüsitavat proovi. 6. Tulemuste arvutamine 1 ml 0,02N H2SO4 vastab 0,34 mg ammoniaagile. Arvutada ammoniaagi protsendiline sisaldus proovis. 7. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 10% suhtelises väärtuses, kui ammoniaagisisaldus on väiksem kui 1,0%; -- 0,1% absoluutväärtuses, kui ammoniaagisisaldus on 1,0% või sellest suurem. 8. Märkused Kui proovi ammoniaagisisaldus ületab 0,6%, lahjendada esialgne filtraat. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 20 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Lenduvate lämmastikaluste destillatsiooni teel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab sisuliselt karbamiidivabas kalajahus määrata lenduvate lämmastikaluste sisalduse väljendatud ammoniaagina. Metoodika sobib üksnes vähem kui 0,25% ammoniaagisisalduse puhul. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused tõrjutakse keemispunktis välja, lisades magneesiumoksiidi, ning kogutakse teatud kindlasse kogusesse väävelhappesse, mille ülejääk tiitritakse tagasi naatriumhüdroksiidi lahusega. 3. Reaktiivid 3.1. 20% (mass/ruumala) trikloroäädikhappe lahus. 3.2. Magneesiumoksiid (AR). 3.3. Vahutamisvastane emulsioon (nt silikoon). 3.4. Väävelhape 0,1N. 3.5. Naatriumhüdroksiidi lahus 0,1N. 3.6. 0,3% (mass/ruumala) metüülpunase lahus 95--96% (mahu%) etanoolis. 4. Vahendid 4.1. Segisti (trummel): umbes 35--40 p/min. 4.2. Kjeldahli tüüpi destillatsiooniaparaat. 5. Analüüsi käik Kaaluda 10 g proovi 1 mg täpsusega ja viia see 100 ml veega mõõtekolbi mahuga 200 ml. Segada segistis 30 minutit. Lisada 50 ml trikloroäädikhappe lahust, täita kolb veega märgini, loksutada tugevasti ja filtreerida läbi kurdfiltri. Võtta selge filtraadi kogus, mis vastab eeldatavale lenduvate lämmastikaluste sisaldusele (harilikult sobib 100 ml). Lahjendada 200 ml-ni ning lisada 2 g magneesiumoksiidi ja mõned tilgad vahutamisvastast emulsiooni. Lahus peab olema lakmuspaberi suhtes leeliseline, vastasel korral lisada veidi magneesiumoksiidi. Destilleerida ligikaudu 150 ml lahust Kjeldahli aparaadis ja koguda destillaat Erlenmeyeri kolbi, mis sisaldab täpselt väljamõõdetud koguse (25--50 ml) 0,1N väävelhapet. Destilleerimise ajal vältida kolvi külgede liigset kuumendamist. Keeta väävelhappelist lahust kaks minutit, jahutada ja tiitrida ülejäänud väävelhape 0,1N naatriumhüdroksiidi lahusega tagasi, kasutades indikaatorina metüülpunast. Viia sedasama analüüsi käiku kasutades läbi pimekatse, lisamata analüüsitavat proovi. 6. Tulemuste arvutamaine 1 ml 0,1N H2SO4 vastab 1,7 mg ammoniaagile. Arvutada ammoniaagi protsendiline sisaldus proovis. 7. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10% (suhteline väärtus) ammoniaaki. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 21 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Vesiniktsüaniidhappe määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata vesiniktsüaniidhappesisalduse söödas ja glükosiide sisaldavates produktides, eriti aga linaseemnetest, tapiokijahust ja teatavat liiki ubadest saadud produktides. 2. Põhimõte Proov suspendeeritakse vees. Vesiniktsüaniidhape vabaneb ensüümide toimel, destilleeritakse veeauruga ja kogutakse hapestatud hõbenitraadi lahuse kindlasse kogusesse. Hõbetsüaniid eraldatakse filtreerimise teel ning hõbenitraadi liig tiitritakse tagasi ammooniumtiotsüanaadi lahusega. 3. Reaktiivid 3.1. Hariliku mandli suspensioon: purustada 20 kooritud harilikku mandlit 100 ml vees 37--40 °C juures. Kontrollida vesiniktsüaniidhappe puudumist 10 ml suspensioonis, kasutades naatriumpikrootpaberit või viies läbi pimekatse, nagu on kirjeldatud punkti 5 viimases lõigus. 3.2. 10% (mass/ruumala) naatriumatsetaadi lahus, fenoolftaleiini suhtes neutraalne. 3.3. Vahutamisvastane emulsioon (nt silikoon). 3.4. Lämmastikhape, tihedus 1,40 g/ml. 3.5. Hõbenitraadi lahus 0,02 N. 3.6. Ammooniumtiotsüanaadi lahus 0,02 N. 3.7. Ammooniumraudsulfaadi küllastunud lahus. 3.8. Ammoniaagi vesilahus, tihedus 0,958 g/ml. 4. Vahendid 4.1. Kuivatuskapp, mis on reguleeritud temperatuurile 38 °C. 4.2. Veeaurdestillatsiooni aparaat, varustatud jahutiga, millel on kumer alt laienev pikendustoru. 4.3. Lihvkorkidega seisukolvid mahuga 1000 ml. 4.4. Õlivann. 4.5. 1/20 ml jaotistega bürett. 5. Analüüsi käik Kaaluda 20 g proovi 5 mg täpsusega, viia see liitrisesse seisukolbi ning lisada 50 ml vett ja 10 ml hariliku mandli suspensiooni. Sulgeda kolb korgiga ja asetada 16 tunniks kuivatuskappi, mille temperatuur on 38 °C. Seejärel jahutada toatemperatuurini ning lisada 80 ml vett, 10 ml naatriumatsetaadi lahust ja 1 tilk vahutamisvastast emulsiooni. Ühendada kolb veeaurdestillatsiooni aparaadiga ning asetada õlivanni, mis on enne viidud temperatuurile veidi üle 100 °C. Destilleerida 200--300 ml vedelikku, juhtides läbi kolvi tugeva aurujoa ja kergelt kuumutades õlivanni. Koguda destillaat valguse eest kaitstud Erlenmeyeri kolbi, mis sisaldab täpselt 50 ml 0,02N hõbenitraadi lahust ja 1 ml lämmastikhapet. Veenduda, et jahuti pikendustoru ots asub hõbenitraadi lahuses. Viia Erlenmeyeri kolvi sisu üle 500-ml mõõtekolbi, täita see veega kuni märgini, segada ja filtreerida. Mõõta 250 ml filtraati, lisada ligikaudu 1 ml ammooniumraudsulfaadi lahust ja tiitrida hõbenitraadi liig tagasi 0,02N ammooniumtiotsüanaadi lahusega, kasutades 1/20 ml jaotistega büretti. Vajaduse korral võib läbi viia pimekatse, rakendades sama analüüsi käiku 10 ml hariliku mandli suspensiooni puhul, jättes analüüsitava proovi lisamata. 6. Tulemuste arvutamine Lahutada pimekatsele kulunud 0,02N AgNO3 lahuse ruumala sellest 0,02N AgNO3 ruumalast, mis kulus analüüsitava proovi destillaadile. 1 ml 0,02N AgNO3 vastab 0,54 mg HCN-le. Arvutage vesiniktsüaniidhappe protsendiline sisaldus proovis. 7. Märkused Kui proov sisaldab suurel hulgal sulfiide (nt oad), tekib musta värvi hõbesulfiidi sade, mis filtreeritakse koos hõbetsüaniidikogusega. Selle sademe tekkimiseks kulunud 0,02N hõbenitraadi lahuse ruumala tuleb lahutada HCN sisalduse arvutamiseks kasutatavast ruumalast. Selleks toimida järgmiselt: -- töödelda filtril olevat sadet 50 ml ammoniaagi lahusega hõbetsüaniidi lahustamiseks; -- pesta jääk lahjendatud ammoniaagi lahusega ja määrata seejärel kindlaks selle hõbedasisaldus; -- arvestada saadud väärtus ümber 0,02 N hõbenitraadi lahuse milliliitriteks. Proovi HCN-sisaldust võib kindlaks määrata ka tiitrides ammoniakaalset filtraati lämmastikhappega. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 22 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Tärklise polarimeetrilise määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata söödas tärklise ja suure molekulmassiga tärklise laadsete produktide sisalduse, välja arvatud nende söötade puhul, mis sisaldavad peediliistakuid, peedipulpi, kuivatatud peedipealseid või -lehti, kartulipulpi, veetustatud pärmi, inuliinirikkaid produkte (nt maapirniliistakuid või -jahu) või kõrneid. 2. Põhimõte Metoodika hõlmab kaks määramist. Esiteks töödeldakse proovi kuumalt lahjendatud vesinikkloriidhappega. Pärast selitamist ja filtreerimist mõõdetakse polarimeetriliselt lahuse polarisatsioonitasandi pööre. Teiseks ekstraheeritakse proov 40% etanooliga. Pärast filtraadi hapestamist vesinikkloriidhappega, selitamist ja filtreerimist mõõdetakse polarisatsioonitasandi pööre, nagu on kirjeldatud esimese määramise juures. Nende kahe määramise vahe korrutatuna teatud faktoriga annab proovi tärklisesisalduse. 3. Reaktiivid 3.1. 25% (massi %) vesinikkloriidhape, tihedus 1,126 g/ml. 3.2. 1,128% (mass/ruumala) vesinikkloriidhape Kontsentratsiooni tuleb kontrollida tiitrimise teel, kasutades 0,1N naatriumhüdroksiidi lahust ning 0,1% (mass/ruumala) metüülpunase lahust 94%-lises (mahu%) etanoolis. 10 ml = 30,94 ml 0,1N NaOH. 3.3. Carrez' I lahus: lahustada vees 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH 3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. 3.4. Carrez' II lahus: lahustada vees 10,6 g kaaliumheksatsüanoferraat(II) K4[Fe(CN)6] 3H 2O. Viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. 3.5. 40% (mahu%) etanool, tihedus: 0,948 g/ml temperatuuril 20 °C. 4. Vahendid 4.1. 250-ml mahuga Erlenmeyeri kolb standardse lihviga ja püstjahutiga. 4.2. Polarimeeter või sahharimeeter. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ettevalmistamine Peenestada proovi, kuni see täielikult läbib 0,5-mm ümaravadega sõela. 5.2. Polarisatsioonitasandi pöörde määramine (P või S) (vt punkt 7.1) Kaaluda 25 g peenestatud proovi 1 mg täpsusega ning paigutada see 100-ml mahuga mõõtekolbi. Lisada 25 ml vesinikkloriidhapet, loksutada, et proov ühtlaselt jaotuks ning lisada 25 ml vesinikkloriidhapet. Asetada kolb keevasse veevanni, loksutades tugevasti esimesed kolm minutit, et vältida kämpude tekkimist. Vannis olevast veest peab piisama selleks, et vesi jääks kolvi sisseasetamisel keemistemperatuurile. Kolbi ei tohi loksutamise ajal vannist välja võtta. Täpselt 15 minuti pärast võtta kolb vannist välja, lisada 30 ml külma vett ja jahutada kohe temperatuurini 20 °C. Lisada 5 ml Carrez' I lahust ja loksutada 1 minut. Seejärel lisada 5 ml Carrez' II lahust ja loksutada 1 minut. Täita kolb veega märgini, segada ja filtreerida. Kui filtraat ei ole täiesti selge (ehkki seda juhtub harva), korrata määramist, kasutades rohkem (näiteks 10 ml) Carrez' I ja II lahust. Mõõta polarimeetri või sahharimeetri 200-mm torus lahuse polarisatsioonitasandi pööre. 5.3. 40% etanoolis lahustuvate ainete polarisatsioonitasandi pöörde määramine (P või S) Kaaluda 5 g proovi 1 mg täpsusega, paigutada see 100-ml mahuga mõõtekolbi ning lisada ligikaudu 80 ml etanooli (vt punkt 7.2). Jätta kolb üheks tunniks toatemperatuurile seisma; samal ajal loksutada kolbi kuus korda tugevasti, nii et proov etanooliga põhjalikult seguneb. Täita kolb etanooliga kuni märgini, segada ja filtreerida. Pipeteerida 50 ml filtraati (= 2,5 g proovi) Erlenmeyeri kolbi mahuga 250 ml, lisada 2,1 ml vesinikkloriidhapet ja loksutada tugevasti. Ühendada Erlenmeyeri kolb püstjahutiga ja asetada kolb keevasse veevanni. Täpselt 15 minuti pärast eemaldada kolb vannist, viia selle sisu 100-ml mahuga mõõtekolbi, loputades vähese külma veega ja jahutada temperatuurini 20 °C. Selitada Carrez' I ja II lahuse abil, täita kolb veega märgini, segada, filtreerida ja mõõta polarisatsioonitasandi pööre, nagu on kirjeldatud punkti 5.2 teises ja kolmandas lõigus. 6. Tulemuste arvutamine Tärklise protsendiline sisaldus proovis arvutatakse järgmiselt: 6.1. Mõõtmine polarimeetriga

kus: P -- polarisatsioonitasandi kogupööre kraadides; P' -- 40%-lises etanoolis lahustuvate ainete polarisatsioonitasandi pööre kraadides;

-- puhta tärklise polarisatsioonitasandi eripööre, mille väärtused on järgmised: 185,9 riisitärklis; 185,4 kartulitärklis; 184,6 maisitärklis; 182,7 nisutärklis; 181,8 odratärklis; 181,3 kaeratärklis; 184,0 muud tärkliseliigid ja tärklisesegud segasöötades. 6.2. Mõõtmine sahharimeetriga

kus: S -- polarisatsioonitasandi kogupööre sahharimeetri kraadides; S' -- 40%-lises etanoolis lahustuvate ainete polarisatsioonitasandi pööre sahharimeetri kraadides; N -- sahharoosi mass grammides 100 ml vees, mis annab polarisatsioonitasandi pöörde 100 sahharimeetri kraadi 200 mm torus. Mass varieerub olenevalt kasutatud sahharimeetri tüübist: 1629 g prantsuse sahharimeetrite puhul, 2600 g saksa sahharimeetrite puhul, 2000 g muude sahharimeetrite puhul;

-- puhta tärklise polarisatsioonitasandi eripööre (vt punkt 6.1). 7. Märkused 7.1. Kui proov sisaldab üle 6% karbonaate arvutatud kaltsiumkarbonaadina, tuleb need lagundada sobiva koguse lahjendatud väävelhappega enne polarisatsioonitasandi kogupöörde määramist. 7.2. Suure laktoosisisaldusega toodete, näiteks pulbrilise piimavadaku või lõssipulbri puhul toimida pärast 80 ml etanooli lisamist järgmiselt: ühendada kolb püstjahutiga ning asetada viimane 30 minutiks 50 °C veevanni. Jätta jahtuma ja jätkata analüüsi, nagu on kirjeldatud punktis 5.3. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 23 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Tärklise määramise pankreatiinmetoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata tärklise ja selle kõrge molekulmassiga lõhustumisproduktide sisaldust söötades, mis sisaldavad peediliistakuid, peedipulpi, kuivatatud peedipealseid või -lehti, kartulipulpi, kuivatatud pärmi, inuliinirikkaid tooteid (nt maapirniliistakuid ja -jahu) ning kõrneid sisaldavaid tooteid. Määramine tuleks läbi viia ainult siis, kui mikroskoopiline uurimine näitab, et proovis on märkimisväärne kogus tärklist. 2. Põhimõte Proovis olevad suhkrud ekstraheeritakse etanooliga. Ekstraheerimisjäägis olev tärklis redutseeritakse pankreatiiniga suhkruks. Tekkinud suhkrud hüdrolüüsitakse vesinikkloriidhappega ja moodustunud glükoos määratakse LuffSchoorli meetodi abil. Nii saadud glükoosi kogus, mida on korrutatud konstantse faktoriga, annab proovi tärklisesisalduse. 3. Reaktiivid 3.1. 90% (mahu%) etanool, neutraalne fenoolftaleiini suhtes. 3.2. Pentaan-1-ol (amüülalkohol) (AR). 3.3. Tolueen. 3.4. Puhverlahus: lahustada vees 9,078 g kaaliumdivesinikfosfaati KH 2PO4 ja 11,876 g dinaatriumvesinikfosfaati Na2 HPO4 2H2O. Viige veega 1 liitrini. 3.5. Naatriumkloriidi lahus 0,2 N. 3.6. Carrez' I lahus: lahustada vees 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH 3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Viia veega 100 ml-ni. 3.7. Carrez' II lahus: lahustada vees 10,6 g kaaliumheksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 3H2O. Viia veega 100 ml-ni. 3.8. Vesinikkloriidhape, 1N. 3.9. Vesinikkloriidhape (AR), ligikaudu 8N, tihedus 1,125 g/ml. 3.10. Naatriumhüdroksiidi (AR) lahus, ligikaudu 10N, tihedus 1,33 g/ml. 3.11. Indikaator: 0,1% (mass/ruumala) metüüloranþi lahus. 3.12. Pulbriline pankreatiin, kontrollitud vastavalt punktile 8. Hoida korgiga suletud kolbides, kaitstuna valguse ja niiskuse eest. 3.13. Luff-Schoorli reaktiiv: lisada sidrunhappe lahus naatriumkarbonaadi lahusele, segades lisamisel hoolikalt. Seejärel lisada vasksulfaadi lahus ja viia veega 1 liitrini. Jätta ööseks seisma ja filtreerida. Kontrollida nii saadud reaktiivi kontsentratsiooni (Cu 0,1N; Na2CO3 2N). Lahuse pH peab olema ligikaudu 9,4. 3.13.1. Vasksulfaadi lahus: lahustada 25 g vasksulfaati (AR) CuSO 4 5H2O 100 ml vees. 3.13.2. Sidrunhappe lahus: lahustada 50 g sidrunhapet (AR) C 6H8O7 H2O 50 ml vees. 3.13.3. Naatriumkarbonaadi lahus: lahustada 143,8 g veevaba naatriumkarbonaati (AR) ligikaudu 300 ml kuumas vees. Jätta jahtuma. 3.14. Pimsskivi graanulid, mida on puhastatud vesinikkloriidhappes keetmisel, pestud vees ja kuivatatud. 3.15. 30% (mass/ruumala) kaaliumjodiidi (AR) lahus. 3.16. Väävelhape, ligikaudu 6N, tihedus 1,18 g/ml. 3.17. Naatriumtiosulfaadi lahus 0,1N. 3.18. Tärklise lahus: lisada segu, mis koosneb 5 g lahustuvast tärklisest 30 ml vees, 1 liitrile keevale veele. Keeta 3 minutit, jätta jahtuma. See lahus tuleb värskelt valmistada. 4. Vahendid 4.1. Ekstraheerimisaparaat (vt joonis), mis koosneb: 4.1.1. laia kaelaga 500-ml kooniline kolb; 4.1.2. püstjahuti, millel on lihv ühendamiseks koonilise kolviga; 4.1.3. liugvarb püstjahuti keskel, mille alumises otsas on konks ja ülaosas kinnitusnäpits, et liugvarba kindlalt hoida; 4.1.4. metallanum, mis ripub liugvarvakonksu otsas ja mis on ette nähtud filtertiigli hoidmiseks; 4.1.5. filtertiigel kiireks filtreerimiseks; maksimaalne pooride suurus 90 kuni 150 µm (nt poorsus 1, maht ligi 30 ml); 4.1.6. filterpaberid, mis oma kuju ja suuruse poolest sobivad filtertiiglile. 4.2. Inkubaator, mis on seatud temperatuurile 38 °C. 4.3. 200-ml mõõtekolvid standardse klaaslihviga ja püstjahutiga. 4.4. 100-ml mõõtekolvid standardse klaaslihviga ja püstjahutiga. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ettevalmistamine Purustada proov nii, et ta läheb täielikult läbi 0,5-mm avadega sõela (ISO sõel R 565). 5.2. Ekstraheerimine Kaaluda 1 mg täpsusega 2 g proovi ja asetada see filtertiiglisse, mille põhi on eelnevalt kaetud etanooliga niisutatud filterpaberiga. Viia koonilisse kolbi 55 ml etanooli ja mõned pimsskivi graanulid. Asetada filtertiigel metallanumasse ja riputada viimane liugvarvakonksu otsa. Asetada püstjahuti koonilise kolvi peale ja lasta varba allapoole nii, et tiigli põhi puudutab etanooli pinda. Kinnitada varb sellel tasemel tugevasti. Kuumutada etanool keemiseni ja keeta 3 tundi. Seejärel jätta jahtuma ja tõsta varba, et tiigel koonilises kolvis tõuseks nii kõrgele kui võimalik. Võtta koonilise kolvi lihv ettevaatlikult lahti ja lasta 45 ml vett kolvi külgi mööda alla voolata. Panna püstjahuti Erlenmeyeri kolvi peale ja hoida filtertiiglit 10 cm vedeliku pinnast kõrgemal. Kuumutada vedelik keemiseni ja keeta 3 tundi. Seejärel jätta jahtuma, võtta koonilisel kolvil lihv pealt ja eemaldada tiigel anumast. Ekstraheerimisaparaat

5.3. Suhkrustamine ja hüdrolüüs Asetada tiigel vaakumkolvile ja kuivatada, kasutades vaakumit. Viia ekstraheerimisjääk uhmrisse ja peenestada hoolikalt. Kasutades ligikaudu 60 ml vett viia pulber kvantitatiivselt 200-ml mõõtekolbi, millel on standardne klaaslihv ja lisada mõned tilgad amüülalkoholi. Ühendada püstjahuti kolviga. Kuumutada keemiseni ja keeta 1 tund. Seejärel jätta jahtuma ja võtta püstjahuti ära. Lisada 25 ml puhverlahust, 250 mg pankreatiini, 2,5 ml naatriumkloriidi lahust ja 10 tilka tolueeni. Loksutada 2 minutit, asetada kolb inkubaatorisse ja hoida seal 21 tundi, aeg-ajalt loksutades. Seejärel jätta toatemperatuurini jahtuma. Lisada 5 ml Carrez' I lahust ja loksutada üks minut. Lisada 5 ml Carrez' II lahust ja loksutada veel üks minut. Täita kolb veega märgini, segada ja filtreerida. Pipeteerida 50 ml filtraati 100-ml mõõtekolbi (võib töötada ka 100 ml filtraadiga 200-ml mõõtekolvis). Lisada mõned tilgad indikaatorit ja hapestada 8N vesinikkloriidhappega kuni indikaator värvub punaseks. Seejärel lisada veel 6,25 ml 8N vesinikkloriidhapet (12,50 ml, kui töötatakse 100 ml filtraadiga). Ühendada püstjahuti kolviga, kuumutada lahus keemiseni ja keeta 1 tund. Jätta jahtuma, neutraliseerida 10N naatriumhüdroksiidi lahusega, kuni indikaator värvub kollaseks. Seejärel hapestada kergelt, lisades veidi 1N vesinikkloriidhapet, täita kolb veega märgini ja segada. Määrata glükoosisisaldus Luff-Schoorli meetodi järgi nagu näidatud punktis 5.4. 5.4. Tiitrimine Luff-Schoorli järgi Pipeteerida 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi 300-ml koonilisse kolbi, lisada pipetiga 25 ml lahust, mis saadud punktis 5.3 toodud viisil. See lahus ei tohi sisaldada rohkem kui 60 mg glükoosi. Lisada kaks pimsskivi graanulit, kuumutada käsitsi, loksutades keskmise leegi kohal ja viia vedelik ligi kahe minuti jooksul keemiseni. Asetada kooniline kolb kohe traatvõrgule, millel on asbestkate ja selles ligikaudu 6-cm läbimõõduga auk. Süüdatakse traatvõrgu all tuli ja reguleeritakse see nii, et kuumutatakse ainult koonilise kolvi põhja. Seejärel ühendada püstjahuti koonilise kolviga. Keeta kohe täpselt 10 minutit. Jahutada kohe külmas vees ja ligikaudu 5 minuti pärast tiitrida järgmiselt: lisada 10 ml kaaliumjodiidi lahust ja kohe pärast seda ettevaatlikult (ülemäärase vahutamise vältimiseks) 25 ml 6N väävelhapet. Tiitrida 0,1N naatriumtiosulfaadi lahusega, kuni tekib tuhmkollane värvus, lisada mõned tilgad tärkliseindikaatorit ja viia tiitrimine lõpuni. Viia samasugune tiitrimine läbi 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi ja 25 ml vee täpselt mõõdetud seguga, olles lisanud 10 ml kaaliumjodiidi lahust ja 25 ml 6N väävelhapet, kuid ilma tiitrimisele eelneva kuumutamiseta. 5.5. Pimekatse Viia läbi pimekatse, kasutades punktides 5.3 ja 5.4 kirjeldatud analüüsi käiku, kuid ilma proovita. 6. Tulemuste arvutamine Kasutades Luff-Schoorli tabelit, määrata glükoosi kogus mg-des, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel (väljendatud 0,1N naatriumtiosulfaadi ml-tes) nii proovianalüüsi kui ka pimekatse puhul. Tärklise protsendiline sisaldus proovis antakse valemiga: 0,72 (a -- b), kus a -- glükoosi sisaldus (mg) analüüsitavas proovis; b -- glükoosi sisaldus (mg) pimekatses (vt märkus 7.2). 7. Märkused 7.1. Kui osaliselt või täielikult dekstrineeritud tärklis ja laktoos on mõlemad proovis olemas, võib tulemus olla 0,5 kuni 3,0% suurem. Niisugustel juhtudel saadakse tegelik tärklisesisaldus järgmiselt: a) määrata punktis 5.2 saadud etanooliekstrakti redutseerivate suhkrute sisaldus ja väljendada tulemus glükoosi protsendina; b) määrata vees lahustuvate redutseerivate suhkrute sisaldus proovis ja väljendada tulemus glükoosi protsendina; c) lahutada tulemus (a) tulemusest (b) ja korrutada erinevus 0,9-ga; d) lahutada saadud väärtus (c) meetodi kasutamisel saadud tärklisesisaldusest, mis arvutatud nagu näidatud punktis 6. 7.2. Pimekatse glükoosisisaldus on tavaliselt 0,25 mg. See ei või olla suurem kui 0,50 mg. Väärtuste tabel 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi jaoks 1N Na2S2O3 (ml), kaks minutit kuumutamist, kümme minutit keetmist 0,1 N Na2S2O3 Glükoos, fruktoos, invertsuhkrud C6H12O6 Laktoos C6H22O11 Maltoos C6H22O11 0,1 N Na2S2O3 ml mg vahe mg vahe mg vahe ml 1 2,4 3,6 3,9 1 2,4 3,7 3,9 2 4,8 7,3 7,8 2 2,4 3,7 3,9 3 7,2 11,0 11,7 3 2,5 3,7 3,9 4 9,7 14,7 15,6 4 2,5 3,7 4,0 5 12,2 18,4 19,6 5 2,5 3,7 3,9 6 14,7 22,1 23,5 6 2,5 3,7 4,0 7 17,2 25,8 27,5 7 2,6 3,7 4,0 8 19,8 29,5 31,5 8 2,6 3,7 4,0 9 22,4 33,2 35,5 9 2,6 3,8 4,0 10 25,0 37,0 39,5 10 2,6 3,8 4,0 11 27,6 40,8 43,5 11 2,7 3,8 4,0 12 30,3 44,6 47,5 12 2,7 3,8 4,1 13 33,0 48,4 51,6 13 2,7 3,8 4,1 14 35,7 52,2 55,7 14 2,8 3,8 4,1 15 38,5 56,0 59,8 15 2,8 3,9 4,1 16 41,3 59,9 63,9 16 2,9 3,9 4,1 17 44,2 63,8 68,0 17 2,9 3,9 4,2 18 47,1 67,7 72,2 18 2,9 4,0 4,3 19 50,0 71,7 76,5 19 3,0 4,0 4,4 20 53,0 75,7 80,9 20 3,0 4,1 4,5 21 56,0 79,8 85,4 21 3,1 4,1 4,6 22 59,1 83,9 90,0 22 3,1 4,1 4,6 23 62,2 88,0 94,6 23 8. Juhtnöörid pankreatiini kvaliteedi kontrolliks Välimus: kollakasvalge, amorfne pulber. Glükoosisisaldus: pimekatse glükoosisisaldus on tavaliselt 0,25 mg. Suurem tulemus kui 0,50 näitab, et pankreatiini ei või enam kasutada. Kontrollida pankreatiinile kuluvat joodikogust: suspendeerida 62,5 mg pankreatiini ligikaudu 50 ml vees, mis on kuumutatud 25--30 °C. Lisada 1 ml 0,1N joodilahust. Segada 2 minutit. Tiitrida 0,1N naatriumtiosulfaadi lahusega tärkliseindikaatori juuresolekul. Joodilahust ei tohi pankreatiinile kuluda üle 0,5 ml. Kontrollida amülolüütilist aktiivsust: segada 100 ml tärklise lahust, 5 ml puhverlahust, 0,5 ml naatriumkloriidi lahust ja 62,5 mg pankreatiini. Kuumutada segu 25--30 °C, segada 2 minutit. Lisada 1 ml 0,1N joodilahust. Sinine värvus peab olema kadunud 15 minuti jooksul pärast joodilahuse lisamist. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 24 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Suhkru määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata redutseeriva suhkru ja kogu suhkrusisalduse pärast inversiooni, väljendatud glükoosina või vajaduse korral sahharoosina, kasutades ümberarvutusfaktorit 0,95. Metoodika sobib segasöötade jaoks. 2. Põhimõte Suhkur ekstraheeritakse lahjendatud etanooliga; lahus selitatakse Carrez' I ja II lahuse abil. Pärast etanooli eemaldamist määratakse Luff-Schoorli meetodil kindlaks kogused enne ja pärast inversiooni. 3. Reaktiivid 3.1. 40% (mahu%) etanool, tihedus 0,948 g/ml temperatuuril 20 °C, fenoolftaleiini suhtes neutraliseeritud. 3.2. Carrez' I lahus: lahustada vees 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH 3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. 3.3. Carrez' II lahus: lahustada vees 10,6 g kaaliumheksatsüanoferraat(II) K4[Fe(CN)6] 3H 2O. Viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. 3.4. 0,1% (mass/ruumala) metüüloranþi lahus. 3.5. Vesinikkloriidhape 4N. 3.6. Vesinikkloriidhape 0,1N. 3.7. Naatriumhüdroksiidi lahus 0,1N. 3.8. Luff-Schoorli reaktiiv Valada sidrunhappe lahus ettevaatlikult segades naatriumkarbonaadi lahusesse. Lisada vasksulfaadi lahus ja viia lahuse maht vee lisamisel kuni 1 liitrini. Jätta ööseks selginema ja filtreerida. Kontrollida sel teel saadud reaktiivi normaalsust (Cu 0,1N; Na2CO3 2N). Lahuse pH peab olema umbes 9,4. 3.8.1. Vasksulfaadi lahus: lahustada 100 ml vees 25 g rauavaba vasksulfaati CuSO4 5H2O (AR). 3.8.2. Sidrunhappe lahus: lahustada 50 ml vees 50 g sidrunhapet C 6H8O7 H2O (AR). 3.8.3. Naatriumkarbonaadi lahus: lahustada umbes 300 ml soojas vees 143,8 g veevaba naatriumkarbonaati (AR). Jätta jahtuma. 3.9. Naatriumtiosulfaadi lahus 0,1N. 3.10. Tärklise lahus: lisada 5 g lahustuva tärklise ja 30 ml vee segu 1 liitrile keevale veele. Keeta kolm minutit, jätta jahtuma ja vajaduse korral lisada säilitusaineks 10 mg elavhõbejodiidi. 3.11. Väävelhape 6N. 3.12. 30% (mass/ruumala) kaaliumjodiidi lahus. 3.13. Soolhappes keedetud, veega pestud ning kuivatatud granuleeritud pimsskivi. 3.14. 3-metüülbutaan-1-ol. 4. Vahendid Segisti (trummel): umbes 35--40 p/min. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ekstraheerimine Kaaluda 2,5 g proovi 1 mg täpsusega ning viia see 250-ml mõõtekolbi. Lisada 200 ml etanooli ja segada üks tund segistis. Lisada 5 ml Carrez' I lahust ja segada üks minut. Lisada 5 ml Carrez' II lahust ja segada veel kord üks minut. Täita kolb etanooli abil märgini, segada ja filtreerida. Mõõta 200 ml filtraati ja aurutada see umbes poole ruumalani, et eemaldada suurem osa etanooli. Viia aurutamisjääk kvantitatiivselt sooja veega üle 200-ml mõõtekolbi, seejärel jahutada, täita kolb veega kuni märgini, segada ja vajaduse korral filtreerida. Lahust kasutatakse redutseeriva suhkru ning pärast inversiooni ka kogu suhkru määramiseks. 5.2. Redutseeriva suhkru määramine Pipeteerida kuni 25 ml lahust, mis sisaldab vähem kui 60 mg redutseerivat suhkrut väljendatud glükoosina. Vajaduse korral lisada vett kuni 25 ml-ni ning määrata Luff-Schoorli meetodil kindlaks redutseeriva suhkru sisaldus. Tulemus väljendatakse glükoosi protsendilise sisaldusena proovis. 5.3. Kogu suhkru määramine pärast inversiooni Pipeteerida 50 ml lahust 100-ml mahuga mõõtekolbi. Lisada mõned tilgad metüüloranþi lahust, seejärel lisada ettevaatlikult ja pidevalt segades 4N vesinikkloriidhapet, kuni lahus värvub punaseks. Lisada 15 ml 0,1N vesinikkloriidhapet, asetada kolb intensiivselt keevasse vette ja hoida seal 30 minutit. Jahutada kiiresti temperatuurini umbes 20 °C ning lisada 15 ml 0,1N naatriumhüdroksiidi lahust. Täita kolb veega kuni märgini ning segada. Pipeteerida kuni 25 ml lahust, mis sisaldab vähem kui 60 mg redutseerivat suhkrut väljendatud glükoosina. Vajaduse korral lisada vett 25 ml-ni ning määrata LuffSchoorli meetodil kindlaks redutseeriva suhkru sisaldus. Tulemus väljendatakse glükoosi või vajaduse korral sahharoosi protsendina, korrutades selle faktoriga 0,95. 5.4. Tiitrimine Luff-Schoorli meetodil Pipeteerida 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi, paigutada see 300-ml mahuga Erlenmeyeri kolbi, lisada täpselt 25 ml selitatud suhkrulahust. Lisada 2 pimsskivi graanulit, kuumutada pidevalt segades keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal, nii et lahus hakkaks umbes 2 minuti jooksul keema. Asetada Erlenmeyeri kolb kohe traatvõrgule, millel on asbestkate ja selles ligikaudu 6-cm läbimõõduga auk, mille alla on süüdatud tuli. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutatakse ainult Erlenmeyeri kolvi põhja. Kinnitada Erlenmeyeri kolvile püstjahuti. Keeta täpselt kümme minutit. Jahutada kohe külmas vees ja umbes viie minuti pärast tiitrida järgmiselt: lisada 10 ml kaaliumjodiidi lahust ja kohe pärast seda (ettevaatlikult, arvestades intensiivse vahutamise ohtu) 25 ml 6N väävelhapet. Tiitrida 0,1N naatriumtiosulfaadi lahusega kuni tuhmkollase värvuseni, seejärel lisada tärklisindikaator ja lõpetada tiitrimine. Samal viisil tiitrida täpselt välja mõõdetud ilma keetmata segu, mis koosneb 25 ml Luff-Schoorli reaktiivist ja 25 ml veest, pärast seda, kui on lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust ja 25 ml 6N väävelhapet. 6. Tulemuste arvutamine Määrata tabeli abil milligrammides kindlaks glükoosikogus, mis vastab kahe tiitrimise väärtuste vahele väljendatuna 0,1N naatriumtiosulfaadi milliliitrites. Väljendada tulemus protsendilise sisaldusena proovis. 7. Erimääramised 7.1. Melassirikaste söötade puhul ja muude söötade puhul, mis ei ole eriti homogeensed, kaaluda 20 g proovi ja viia see koos 500 ml veega 1-liitrilisse mõõtekolbi. Segada üks tund segistis. Selitada Carrez' I reaktiivi ja Carrez' II reaktiivi abil, nagu on kirjeldatud punktis 5.1, kasutades seekord mõlema reaktiivi neljakordset kogust. Täita kolb märgini 80% (mahu%) etanooliga. Segada ja filtreerida. Eemaldada etanool, nagu on kirjeldatud punktis 5.1. Kui dekstrineeritud tärklis puudub, täita kolb veega kuni märgini. 7.2. Suhkrurikka ja peaaegu tärklisevaba melassi ja lihtsööda (jaanileib, kuivatatud peedijuurikaliistakud) puhul kaaluda 5 g proovi ja viia see 250-ml mõõtekolbi, lisada 200 ml vett ja segada segistis üks tund või vajaduse korral kauem. Selitada Carrez' I reaktiivi ja Carrez' II reaktiivi abil, nagu on kirjeldatud punktis 5.1. Täita kolb külma veega kuni märgini, segada ja filtreerida. Kogu suhkrusisalduse kindlaksmääramiseks jätkata analüüsi, nagu on kirjeldatud punktis 5.3. [Väärtuste tabel 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi jaoks vt lk 3645--3646.] 8. Märkused 8.1. Vahutamise vältimiseks on (hoolimata mahust) soovitav lisada umbes 1 ml 3-metüülbutaan-1-ol (3.14) enne keetmist Luff-Schoorli reaktiiviga. 8.2. Glükoosina väljendatud inversioonijärgse kogu suhkrusisalduse ja glükoosina väljendatud redutseeriva suhkru sisalduse vahe annab faktoriga 0,95 korrutatuna sahharoosi protsendilise sisalduse. 8.3. Redutseeriva suhkru sisalduse määramiseks ilma laktoosita võib rakendada kahte meetodit: 8.3.1. ligikaudseks väljaarvutamiseks korrutada erineva analüüsimeetodiga kindlaks tehtud laktoosisisaldus faktoriga 0,675 ning lahutada saadud tulemus redutseeriva suhkru sisaldusest; 8.3.2. redutseeriva suhkru sisalduse täpseks väljaarvutamiseks ilma laktoosita tuleb üht ja sama proovi kasutada kahe lõppmääramise jaoks. Üks analüüsidest viiakse läbi punkti 5.1 järgi saadud lahuse osaga, teine analüüs aga osaga lahusest, mis on saadud laktoosi määramisel selleks ette nähtud meetodil (pärast muud tüüpi suhkrute fermenteerimist ja lahuse selitamist). Mõlemal puhul määratakse olemasoleva suhkru kogus Luff-Schoorli meetodil ning arvutatakse välja glükoosi milligrammides. Üks väärtus lahutatakse teisest ning vahe väljendatakse protsendilise sisaldusena proovis. Näide: Mõlemad kahe määramise jaoks võetud lahuse kogused vastavad 250 mg proovile. Esimesel puhul kulub 17 ml 0,1N naatriumtiosulfaadi lahust, mis vastab 44,2 mg glükoosile, teisel puhul kulub 11 ml, mis vastab 27,6 mg glükoosile. Vahe on 16,6 mg glükoosi. Redutseeriva suhkru sisaldus ilma laktoosita, väljendatud glükoosina on seega: 4 16,6 : 10 = 6,64%. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 25 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Laktoosi määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata laktoosi söötades, mis sisaldavad rohkem kui 0,5% laktoosi. 2. Põhimõte Suhkur lahustatakse vees. Lahust fermenteeritakse pärmiga Saccharomyces cerevisiae, mis jätab laktoosi puutumata. Pärast selitamist ja filtreerimist määratakse filtraadi laktoosisisaldus Luff-Schoorli meetodil. 3. Reaktiivid 3.1. Saccharomyces cerevisiae suspensioon: suspendeerida 25 g värsket pärmi 100 ml vees. Supensioon säilib külmikus maksimaalselt ühe nädala. 3.2. Carrez' I lahus: lahustada vees 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH 3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. 3.3. Carrez' II lahus: lahustada vees 10,6 g kaaliumheksatsüanoferraat(II) K4[Fe(CN)6] 3H 2O. Viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. 3.4. Luff-Schoorli reaktiiv: valada sidrunhappe lahus ettevaatlikult segades naatriumkarbonaadi lahusesse. Lisada vasksulfaadi lahus ja viia lahuse maht vee lisamisel 1 liitrini. Jätta ööseks selginema ja filtreerida. Kontrollida sel teel saadud reaktiivi normaalsust (0,1N Cu, 2N Na2CO3). Lahuse pH peab olema ligikaudu 9,4; 3.4.1. vasksulfaadi lahus: lahustada 100 ml vees 25 g rauavaba vasksulfaati CuSO4 5H 2O (AR); 3.4.2. sidrunhappe lahus: lahustada 50 ml vees 50 g sidrunhapet C 6H8O7 H2O (AR); 3.4.3. naatriumkarbonaadi lahus: lahustada ligikaudu 300 ml soojas vees 143,8 g veevaba naatriumkarbonaati (AR). Jätta jahtuma. 3.5. Vesinikkloriidhappes keedetud, veega pestud ning kuivatatud granuleeritud pimsskivi. 3.6. 30% (mass/ruumala) kaaliumjodiidi lahus. 3.7. Väävelhape 6N. 3.8. Naatriumtiosulfaadi lahus 0,1N. 3.9. Tärklise lahus: lisada 5 g lahustuva tärklise ja 30 ml vee segu 1 liitrile keevale veele. Keeta kolm minutit, jätta jahtuma ja vajaduse korral lisada säilitusaineks 10 mg elavhõbejodiidi. 4. Vahendid Temperatuurile 38--40 °C seatud termoregulaatoriga veevann. 5. Analüüsi käik Kaaluda 1 g proovi 1 mg täpsusega ja viia see 100-ml mõõtekolbi. Lisada 25--30 ml vett. Asetada kolb 30 minutiks keevale veevannile ning seejärel jahutada temperatuurini umbes 35 °C. Lisada 5 ml pärmisuspensiooni ja segada. Jätta kolb kaheks tunniks veevannile temperatuuril 38--40 °C. Jahutada temperatuurini umbes 20 °C. Lisada 2,5 ml Carrez' I lahust ja segada 30 sekundit, seejärel lisada 2,5 ml Carrez' II lahust ja segada veel kord 30 sekundit. Täita kolb veega kuni märgini, segada ja filtreerida. Mõõta pipetiga filtraadikogus, mis ei ületa 25 ml ja mis eelistatavalt sisaldab 40--80 mg laktoosi, ning viia see Erlenmeyeri kolbi mahuga 300 ml. Vajaduse korral lisada vett 25 ml-ni. Viia 5 ml pärmisuspensiooniga eespool kirjeldatud viisil läbi pimekatse. Määrata laktoosisisaldus Luff-Schoorli meetodil järgmiselt: lisada täpselt 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi ja kaks pimsskivi graanulit. Kuumutada pidevalt segades keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal, nii et lahus hakkaks umbes 2 minuti jooksul keema. Asetada Erlenmeyeri kolb kohe traatvõrgule, millel on asbestkate ja selles ligikaudu 6-cm läbimõõduga auk, mille alla on süüdatud tuli. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutatakse ainult Erlenmeyeri kolvi põhja. Kinnitada Erlenmeyeri kolvile püstjahuti. Keeta täpselt kümme minutit. Jahutada kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitrida järgmiselt: lisada 10 ml kaaliumjodiidi lahust ja kohe pärast seda (ettevaatlikult, arvestades intensiivse vahutamise ohtu) 25 ml 6N väävelhapet. Tiitrida 0,1N naatriumtiosulfaadi lahusega kuni tuhmkollase värvuseni, seejärel lisada tärklisindikaator ja lõpetada tiitrimine. Eespool kirjeldatud viisil tiitrida täpselt välja mõõdetud ilma keetmata segu, mis koosneb 25 ml Luff-Schoorli reaktiivist ja 25 ml veest, pärast seda, kui on lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust ja 25 ml 6N väävelhapet. [Väärtuste tabel 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi jaoks vt lk 3645--3646.] 6. Tulemuste arvutamine Määrata Luff-Schoorli tabeli abil milligrammides kindlaks laktoosikogus, mis vastab kahe tiitrimise väärtuste vahele väljendatuna 0,1N naatriumtiosulfaadi milliliitrites. Arvutada veevaba laktoosi protsendiline sisaldus proovis. 7. Märkused Üle 40% fermenteeritavat suhkrut sisaldavate produktide puhul kasutada rohkem kui 5 ml pärmisuspensiooni. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 26 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Karbamiidi määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda karbamiidisisalduse. 2. Põhimõte Proov suspendeeritakse vees koos selitusainega. Suspensioon filtreeritakse. Filtraadi karbamiidisisaldus määratakse pärast 4-dimetüülaminobensaldehüüdi (4-DMAB) lisamist, mõõtes optilise tiheduse lainepikkusel 420 nm. 3. Reaktiivid 3.1. 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahus: lahustada 1,6 g 4-DMAB (AR) 100 ml-s 96% etanoolis ning lisada 10 ml vesinikkloriidhapet (AR; tihedus 1,19 g/ml). See reaktiiv säilib maksimaalselt kaks nädalat. 3.2. Carrez' I lahus: lahustada vees 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH 3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. 3.3. Carrez' II lahus: lahustada vees 10,6 g kaaliumheksatsüanoferraat(II) K4[Fe(CN)6] 3H 2O. Viia lahuse maht vee lisamisel 100 ml-ni. 3.4. Aktiivsüsi (AR), mis ei absorbeeri karbamiidi (tuleb kontrollida). 3.5. 0,1% (mass/ruumala) karbamiidi (AR) lahus. 4. Vahendid 4.1. Segisti (trummel): umbes 35--40 pööret minutis. 4.2. Lihvkorkidega katseklaasid: 160 16 mm. 4.3. Spektrofotomeeter. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi analüüs Kaaluda 1 mg täpsusega 2 g proovi ja viia see koos 1 g aktiivsöega 500-ml mahuga mõõtekolbi. Lisada 400 ml vett ning 5 ml Carrez' I lahust ja 5 ml Carrez' II lahust. Segada segistis 30 minutit. Täita kolb veega märgini, loksutada ja filtreerida. Mõõta 5 ml selget värvusetut filtraati lihvkorkidega katseklaasidesse, lisada 5 ml 4-DMAB lahust ja segada. Asetada katseklaasid veevanni temperatuuriga 20 °C. Viieteistkümne minuti möödudes mõõta spektrofotomeetriga proovi lahuse optiline tihedus lainepikkusel 420 nm, võrreldes reaktiivilahuste pimekatsega. 5.2. Kalibreerimisgraafik Mõõta karbamiidilahust vastavalt 1, 2, 4, 5 ja 10 ml mõõtekolbidesse mahuga 100 ml ning täita kolvid veega märgini. Mõõta igast lahusest 5 ml, lisada neist igale 5 ml 4-DMAB lahust, segada ja mõõta eespool kirjeldatud viisil optiline tihedus, võrreldes lahusega, mis sisaldab 5 ml 4-DMAB ja 5 ml karbamiidivaba vett. Koostada kalibreerimisgraafik. 6. Tulemuste arvutamine Määrata kalibreerimisgraafiku abil kindlaks proovi karbamiidisisaldus. Arvutada karbamiidi protsendiline sisaldus proovis. 7. Märkused 7.1. Üle 3% karbamiidisisalduse puhul vähendada proovi kaalutist 1 grammini või lahjendada esialgset lahust, nii et 500 ml-s ei oleks rohkem kui 50 mg karbamiidi. 7.2. Vähese karbamiidisisalduse korral suurendada proovi kaalutist, kuni filtraat jääb veel selgeks ja värvituks. 7.3. Kui proov sisaldab lihtsaid lämmastikuühendeid, näiteks aminohappeid, tuleks optiline tihedus mõõta lainepikkusel 435 nm. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 27 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Sojasaaduste ureaasi aktiivsuse hindamise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab hinnata sojasaaduste ureaasi aktiivsust ja näidata, kas neid saadusi on piisavalt kuumutatud. 2. Põhimõte Ureaasi aktiivsust hinnatakse ammoniaaklämmastiku koguse põhjal, mis vabaneb minutis 30 °C juures karbamiidilahusest 1 g produkti kohta. 3. Reaktiivid 3.1. Vesinikkloriidhape 0,1N. 3.2. Naatriumhüdroksiidi lahus 0,1N. 3.3. Fosfaatpuhverlahus 0,05 M, mille 1000 ml sisaldab 4,45 g dinaatriumfosfaati (Na2HPO4 2H2 O) ja 3,40 g kaaliumdivesinikfosfaati (KH2PO4). 3.4. Värskelt valmistatud karbamiidkoormusaine lahus, mis sisaldab 30,0 g karbamiidi 1000 ml fosfaatpuhverlahuse kohta; pH 6,9--7,0. 4. Vahendid 4.1. Potsentsiomeetrilise tiitrimise aparaat või suure tundlikkusega pH-meeter (0,02 pH ühikut) magnetsegajaga. 4.2. Termoregulaatoriga veevann, reguleeritud temperatuurile täpselt 30 °C. 4.3. Lihvkorkidega katseklaasid, 150 18 mm. 5. Analüüsi käik Peenestada (näiteks kohviveskiga) ligikaudu 10 g proovi, nii et see läbib 0,2-mm avadega sõela. Kaaluda 1 mg täpsusega 0,2 g peenestatud proovi, viia see lihvkorgiga katseklaasi ja lisada 10 ml karbamiidkoormusaine lahust. Sulgeda kohe korgiga ja loksutada tugevasti. Asetada katseklaas veevanni, mis on seatud temperatuurile täpselt 30 °C ja hoida seda seal täpselt 30 minutit. Lisada kohe 10 ml 0,1N vesinikkloriidhapet, jahutada kiiresti temperatuurini 20 °C ja viia katseklaasi sisu kvantitatiivselt tiitrimisnõusse, loputades katseklaasi kaks korda 5 ml veega. Kasutades klaaselektroodi, tiitrida kohe ja kiiresti potentsiomeetriliselt 0,1N naatriumhüdroksiidi lahusega pH väärtuseni 4,7. Viia läbi pimekatse järgmiselt: kaaluda 0,2 g proovi 1 mg täpsusega ja viia see kiiresti lihvkorgiga katseklaasi, lisada 10 ml 0,1N vesinikkloriidhapet ja seejärel 10 ml karbamiidkoormusaine lahust. Jahutada katseklaas kohe jäävees ja jätta see sinna 30 minutiks. Viia katseklaasi sisu eespool kirjeldatud tingimustes tiitrimisnõusse ja tiitrida 0,1N naatriumhüdroksiidi lahusega kuni pH väärtuseni 4,7. 6. Tulemuste arvutamine Ureaasi aktiivsus arvutatakse järgmise valemi abil

kus: a -- proovi tiitrimiseks kulunud 0,1N naatriumhüdroksiidi lahuse ruumala (ml); b -- pimekatse tiitrimiseks kulunud 0,1N naatriumhüdroksiidi lahuse ruumala (ml); E -- proovi mass (g). 7. Märkused 7.1. Meetod sobib ureaasi aktiivsuse puhul kuni 1 mg N/g/min 30 °C juures. Aktiivsemate toodete korral võib proovi kaalutise vähendada 50 mg-ni. 7.2. Üle 10% toorrasvainet sisaldavad tooted tuleb enne külmalt rasvatustada. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 28 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Retinooli (vitamiin A) määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata retinooli (vitamiin A) sisaldust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimum on 10 000 RÜ/kg rohkesti pigmente sisaldavate söötade puhul ja 4000 RÜ/kg teiste puhul (10). Tooted klassifitseeritakse kahte gruppi vastavalt eeldatavale retinoolisisaldusele: -- grupp A: sisaldus väiksem kui 200 000 RÜ/kg; -- grupp B: sisaldus 200 000 RÜ/kg või suurem. 2. Põhimõte Proov hüdrolüüsitakse kuumalt kaaliumhüdroksiidi lahusega etanooli keskkonnas ja antioksüdandi juuresolekul või lämmastiku atmosfääris. Segu ekstraheeritakse 1,2-dikloroetaaniga. Ekstrakt aurutatakse kuivaks ja töödeldakse petrooleetriga. Lahus kromatografeeritakse alumiiniumoksiidi kolonnil (grupi B toodete puhul on kromatograafia nõutav ainult teatud juhtudel). Grupi A toodete puhul määratakse retinool spektrofotomeetriga 610 nm juures pärast värvilise kompleksühendi moodustumist vastavalt Carr-Price reaktsioonile; grupi B toodete puhul määratakse retinool spektrofotomeetriliselt UV-piirkonnas 325 nm juures. 3. Reaktiivid A- ja B-gruppide toodete analüüsiks kasutatakse punktides 3.1--3.13 toodud reaktiive. Ainult A-grupi toodetele kasutatakse punktides 3.14--3.17 toodud reaktiive. Ainult B-grupi toodetele kasutatakse punktis 3.18 toodud reaktiivi. 3.1. 96% (mahu%) etanool. 3.2. 10% (mass/ruumala) naatriumaskorbaadi lahus (AR). 3.3. Puhastatud lämmastik. 3.4. 50% (mass/ruumala) kaaliumhüdroksiidi lahus (AR). 3.5. Kaaliumhüdroksiidi lahus 1N (AR). 3.6. Kaaliumhüdroksiidi lahus 0,5N (AR). 3.7. 1,2-dikloroetaan (AR); 3.8. Petrooleeter, keemistemperatuuri vahemik: 30--50 °C. Kui vajalik, puhastada järgmiselt: loksutada 1000 ml petrooleetrit 20 ml kontsentreeritud väävelhappe portsjonitega, kuni hape jääb värvusetuks. Eemaldada hape ja pesta petrooleetrit järgemööda 500 ml veega, kaks korda 250 ml 10% (mass/ruumala) naatriumhüdroksiidi lahusega ja kolm korda 500 ml veega. Eemaldada veekiht, kuivatada petrooleetrit üks tund aktiivsöel ja veevaba naatriumsulfaadiga, filtreerida ja destilleerida. 3.9. Alumiiniumoksiid, standardiseeritud vastavalt Brockmannile: tuhastada 8 tundi 750 °C juures, jahutada eksikaatoris ja hoida pruunist klaasist lihvkorgiga purgis. Enne kasutamist kromatograafias niisutada järgmiselt: viia pruunist klaasist purki 10 g alumiiniumoksiidi ja 0,7 ml vett, sulgeda korgiga, kuumutada 5 minutit loksutades keevas veevannis. Jätta jahtuma. Kontrollida sel viisil ettevalmistatud alumiiniumoksiidi aktiivsust, viies läbi kindla koguse retinooliga (ca 500 RÜ) punktides 5.3 ja 5.4 kirjeldatud analüüsi käigu ja kontrollides lisatud retinooli regenereeruvust. 3.10. Aluseline alumiiniumoksiid, aktiivsuse aste 1 (Woelm, Merck või nende analoog). 3.11. Puhas dietüüleeter. Eemaldada peroksiidid ja vee jäljed kromatograafiliselt aluselise alumiiniumoksiidi kolonnil (25 g alumiiniumoksiidi 250 ml dietüüleetri kohta). 3.12. Petrooleetri lahused 4, 8, 12, 16 ja 20% (mahu%) dietüüleetriga. 3.13. Naatriumsulfiidi (AR) lahus 0,5 molaarne, 70% (mahu%) glütseriinis. 3.14. Kristalliseeruv benseen (AR). 3.15. Kloroform (AR). Eemaldada etanool, fosgeen ja vee jäljed kromatograafiliselt aluselise alumiiniumoksiidi kolonnil 50 g alumiiniumoksiidi 200 ml kloroformi kohta. Soovitav on kromatografeerida eluaadi esimesed 50 ml teist korda. 3.16. Carr-Price reaktiiv: segada ligikaudu 25 g antimontrikloriidi (AR) (hoitud eksikaatoris) 100 ml kloroformiga kuni lahus on küllastunud. Väike antimontrikloriidi jääk ei sega. Lisada 2 ml atseetanhüdriidi (AR). Hoida külmkapis pruunist klaasist lihvkorgiga pudelis. Lahus on püsiv mitu nädalat. 3.17. Retinool -- standardiseeritud spektrofotomeetriliselt. 3.18. Isopropanool, kromatograafia jaoks. 4. Vahendid 4.1. Veevann. 4.2. Vaakumauruti erineva mahuga ümarkolbidega. 4.3. Klaaskolonnid kromatografeerimiseks (pikkus 300 mm; siseläbimõõt ligikaudu 3 mm). 4.4. Spektrofotomeeter 10 mm küvettidega. Kvartsküvetid mõõtmisteks UV-piirkonnas. 4.5. UV-lambid, mis võimaldavad kiirgust 365 nm. 5. Analüüsi käik Kõik operatsioonid tuleb läbi viia otsesest valgusest eemal, kui vaja, pruunist klaasist laboratooriuminõudes. 5.1. Analüüsitav proov Hoolikalt peenestatud uuritavast materjalist kaaluda analüüsitav proov vastavalt eeldatavale retinoolisisaldusele: -- 0,1--1,0 g kontsentraatide jaoks (sisaldused suuremad kui 20 000 RÜ/g); -- 3,0--5,0 g premiksite jaoks (sisaldused 400 kuni 20 000 RÜ/g); -- 10--20 g mineraalsegude jaoks; -- 30 g grupi A toodete jaoks. Viia analüüsitav proov kohe 500 ml lihvkorgiga kolbi. 5.2. Hüdrolüüs ja ekstraheerimine(11) Lisada proovile järgemööda 40 ml etanooli, 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (12). Kuumutada 30 minutit 70--80 °C juures püstjahutiga kolvis ja jätta seejärel veevoolu all jahtuma. Lisada 50 ml etanooli ja 100 ml 1,2-dikloroetaani (pipetiga mõõdetud). Loksutada tugevasti ja dekanteerida seejärel proovi peal olev vedelik jaotuslehtrisse. Lisada jaotuslehtrisse 150 ml kaaliumhüdroksiidi lahust, loksutada 30 sekundit ja jätta seisma, kuni kihid eralduvad. Koguda dikloroetaani kiht (alumine kiht) jaotuslehtrisse, lisada 40 ml kaaliumhüdroksiidi lahust, loksutada 10 sekundit ja jätta seisma, kuni kihid eralduvad. Koguda dikloroetaani kiht jaotuslehtrisse ja pesta 6--8 korda 40-ml veekogustega leelisevabaks (proov fenoolftaleiiniga). Koguda dikloroetaani kiht ja eemaldada viimased vee jäljed, kasutades filterpaberi ribasid. Aurutada kuivaks lahuse alikvootne osa veevannil 40 °C juures, kasutades vaakumit. Töödelda jääki kiiresti 5 ml petrooleetriga. Grupi A tooteid kromatografeerida, nagu näidatud punktis 5.3.1. Grupi B toodete puhul viia lahus üle 50-ml mõõtekolbi, täita kolb petrooleetriga kuni märgini, segada ja mõõta optiline tihedus, nagu näidatud punktis 5.4.2. 5.3. Kromatografeerimine 5.3.1. Grupi A tooted Täita kromatografeerimiskolonn 200 mm kõrguseni 10 g alumiiniumoksiidiga, mis on eelnevalt segatud petrooleetriga. Viia kolonni lahus, mis saadud punktis 5.2 ja lisada kohe 20 ml petrooleetrit. Elueerige järgemööda 10 ml petrooleetri lahuse kogustega, milles on 4, 8, 12, 16 ja 20% dietüüleetrit surve all või osalise vaakumi abil, voolu kiirusega 2--3 tilka sekundis. Karotiin elueeritakse esimesena(13). Retinool elueeritakse tavaliselt petrooleetri lahusega, milles on 20% dietüüleetrit. Elueerimisele järgneb UV-kiirgusega ergastamine (lühiajaline kolonni kiiritamine elavhõbelambiga). Retinooli fluorestseeruv tsoon on selgelt eraldatav sellele järgnevatest kollastest ksantofülli tsoonidest. Koguge retinooli sisaldav eluaadifraktsioon Erlenmeyeri kolbi. 5.3.2. Grupi B tooted Kromatografeerimine tuleb läbi viia ainult siis, kui punktis 5.4.2 tehtud optilise tiheduse mõõtmised ei vasta punktis 5.4.2 toodud nõuetele. Kui kromatografeerimine osutub vajalikuks, viia kromatografeerimiskolonni punkti 5.2 järgi petrooleetris saadud lahuse alikvootne osa, mis sisaldab ligikaudu 500 RÜ retinooli ning kromatografeerige, nagu näidatud punktis 5.3.1. 5.4. Optilise tiheduse mõõtmine 5.4.1. Grupi A tooted Aurutada vaakumi all kuivaks eluaat, mis sisaldab punktis 5.3.1 saadud retinooli. Töödelda jääki 2 ml benseeniga. Võtta 0,3 ml seda lahust ja lisada 3 ml Carr-Price reaktiivi. Tekib sinine värvus. Mõõta spektrofotomeetriga lahuse optiline tihedus 610 nm juures täpselt 30 sekundit pärast seda, kui reaktsioon on alanud. Määrata retinoolisisaldus kalibreerimisgraafiku abil, mis on saadud retinool-standardi kasvavate kontsentratsioonidega benseeni lahustest, mida on töödeldud Carr-Price reaktiiviga (2--16 RÜ retinool-standardit) 0,3 ml benseeni kohta + 3 ml Carr-Price reaktiivi. Kalibreerimisgraafikut tuleb regulaarselt ja sageli kontrollida, kasutades standardlahuseid ja värskelt valmistatud Carr-Price reaktiivi lahust. 5.4.2. Grupi B tooted Võtta punktis 5.2 saadud petrooleetri lahuse alikvootne osa, mis sisaldab ligikaudu 200 RÜ retinooli. Aurutada vaakumit kasutades kuivaks ja töödelda jääki 25 ml isopropanooliga. Mõõta lahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga 325, 310 ja 334 nm juures. Neeldumismaksimum asub 325 nm juures. Lahuse retinoolisisaldus arvutatakse järgmiselt: E325 18,30 = RÜ retinooli/ml. Optiliste tiheduste suhe E310 : E325 ja E334 : E325 peab olema 6 : 7 = 0,857.

Kui üks nendest suhetest erineb märgatavalt sellest väärtusest ( 0,830 või > 0,880), peab optiliste tiheduste mõõtmisele eelnema kromatografeerimine vastavalt meetodile, mis on antud punktis 5.3.2. Kui pärast kromatografeerimist läbi viidud optiliste tiheduste mõõtmine näitab, et eespool nimetatud suhted erinevad ikka märgatavalt väärtusest 0,857 ( 0,830 või > 0,880), tuleb määramine läbi viia vastavalt meetodile, mis on antud grupi A toodete kohta. 6. Tulemuste arvutamine Arvutada proovi retinoolisisaldus, võttes arvesse analüüsitava proovi massi ja lahjendamisi, mis on tehtud analüüsi käigus. Väljendada tulemused retinooli RÜ-des sööda kg kohta või kontsentraadi või premiksi kg kohta. 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 20% suhtelises väärtuses retinoolisisalduste puhul, mis on väiksemad kui 75 000 RÜ/kg; - 15 000 RÜ, kui sisaldused on 75 000 kuni 150 000 RÜ/kg; -- 10% suhtelises väärtuses, kui sisaldused on 150 000 kuni 250 000 RÜ/kg; -- 25 000 RÜ, kui sisaldused on 250 000 kuni 500 000 RÜ/kg; -- 5% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on suuremad kui 500 000 RÜ/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 29 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Tiamiini (vitamiin B1, aneuriin) määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab tiamiini (aneuriin, vitamiin B1) sisalduse määramist söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimumkogus on 5 mg/kg. 2. Põhimõte Kuuma lahust töödeldakse lahjendatud väävelhappega ja seejärel hüdrolüüsitakse ensümaatiliselt. Järgneb lahuse leeliseline oksüdeerimine. Moodustunud tiokroom ekstraheeritakse isobutanooliga ja määratakse fluoromeetriliselt. 3. Reaktiivid 3.1. Tiamiini standardlahus 100 µg/ml: lahustada 112,3 mg tiamiinhüdrokloriidi, mis on eelnevalt vaakumi all kuivatatud konstantse kaaluni 1000 ml 0,2N väävelhappes. Hoituna jahedas pimedas kohas säilib see lahus üks kuu. 3.2. Väävelhape 0,2N. 3.3. Puhas naatriumvesiniksulfit. 3.4. 20% (mass/ruumala) kaaliumheksatsüanoferraat(III) lahus (AR). 3.5. 25% (mass/ruumala) kaaliumhüdroksiidi lahus (AR). 3.6. Oksüdeeriv segu: segada 2 ml kaaliumheksatsüanoferraat(III) lahust 48 ml kaaliumhüdroksiidi lahusega. Segu ei säili kauem kui neli tundi. 3.7. Isobutanool (AR). 3.8. Naatriumatsetaadi lahus 2,5N. 3.9. Multiensümaatiline preparaat, mis sisaldab proteaasi, fosfataasi ja amülaasi (näiteks klaraas). 3.10. 96% (mahu%) etanool. 4. Vahendid 4.1. Veevann. 4.2. Tsentrifuug (3500 p/min), varustatud lihvkorkidega 30--50-ml tsentrifuugikatseklaasidega. 4.3. Fluoromeeter. 5. Analüüsi käik 5.1. Ensümaatiline hüdrolüüs Viia kahte 250-ml mõõtekolbi A ja B ühesugune kogus hoolikalt peenestatud proovi, mis sisaldab ligikaudu 100 µg tiamiini ja 125 ml väävelhapet. Kolbi A lisada 1,0 ml standardlahust. Loksutada kolbe tugevasti, asetada keevale veevannile ja hoida seal 15 minutit vahetevahel loksutades. Jätta jahtuma, kuni temperatuur on ligikaudu 45 °C. Lisada mõlemasse kolbi 20 ml naatriumatsetaadi lahust ja 0,5 g multiensümaatilist preparaati. Jätta 20 minutiks toatemperatuuril seisma. Lisada 20 ml naatriumatsetaadi lahust, täita kolvid veega märgini, segada ja filtreerida. Koguda filtraadid A ja B, kui olete ära valanud esimesed 15 ml. Valmistada järgmised lahused: 5.1.1. Võrdluslahus T Viia tsentrifuugikatseklaasi 5 ml filtraati A ja ligikaudu 10 mg naatriumvesiniksulfitit. Asetada katseklaas 15 minutiks keevasse veevanni ja jätta seejärel toatemperatuurini jahtuma. 5.1.2. Lahused A (sisestandard) ja B (proov) Viia 5 ml filtraati A tsentrifuugikatseklaasi ja 5 ml filtraati B teise tsentrifuugikatseklaasi. 5.2. Oksüdeerimine Lisada lahustele T, A ja B 5 ml oksüdeerivat segu ja ühe minuti pärast 10 ml isobutanooli. Sulgeda katseklaasid korkidega ja loksutada tugevasti 5 sekundit. Jätta üheks minutiks seisma ja tsentrifuugida, et kihte eraldada. Igast katseklaasist viia 5 ml ülemisest isobutanoolikihist vastavasse 25-ml mõõtekolbi, täita kolvid etanooliga kuni märgini ja segada (ekstraktid T, A ja B). 5.3. Fluorestsentsi mõõtmine Viia läbi mõõtmised ergastamisel lainepikkusega, mille puhul tiokroomi fluorestsentsi intensiivsus on maksimaalne ja fluoromeeter annab optimaalse näidu. Ergastada ligikaudu 365 nm juures. Seada instrument null-näidule, kasutades ekstrakti T. Mõõta ekstraktide A ja B fluorestsentsi intensiivsus. 6. Tulemuste arvutamine Tiamiini sisaldus proovis mg/kg antakse suhtega

kus: a -- ekstrakti A (sisestandard) fluorestsentsi intensiivsus; b -- ekstrakti B (proov) fluorestsentsi intensiivsus; c -- analüüsitava proovi mass (g); d -- analüüsitavale proovile lisatud tiamiini kogus (µg) (sisestandard). 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 10% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on väiksemad kui 500 mg/kg; -- 5% suhtelises väärtuses, kui sisaldus on 500 mg/kg või sellest suurem. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 30 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Askorbiinhappe ja dehüdroaskorbiinhappe (vitamiin C) määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata kogu askorbiin- ja dehüdroaskorbiinhappe (vitamiin C) sisaldust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimum on 5 mg/kg. Tooted klassifitseeritakse kahte gruppi vastavalt nende eeldatavale vitamiin C sisaldusele: -- grupp A: sisaldused, mis on väiksemad kui 10 g/kg; -- grupp B: sisaldused, mis on 10 g/kg või sellest suuremad. 2. Põhimõte Proov suspendeeritakse metafosforhappe lahjendatud lahuses ja ekstraheeritakse kloroformiga. Veefaasi töödeldakse 2,6-diklorofenool-indofenooli lahusega, et muuta askorbiinhape dehüdroaskorbiinhappeks, ja seejärel 2,4-dinitrofenüülhüdrasiini lahusega. Moodustunud hüdrasoon ekstraheeritakse etüülatsetaadi, jää-äädikhappe ja atsetooni seguga. Lahus kromatografeeritakse silikageeli kolonnil, eluaat aurutatakse kuivaks ja jääk lahustatakse lahjendatud väävelhappes. Lahuse optiline tihedus mõõdetakse spektrofotomeetriga 509 nm juures. Grupi A toodete puhul viiakse kromatograafi kolonnist väljunud eluaadiga läbi õhukesekihikromatograafia, et hüdrasooni isoleerida. 3. Reaktiivid 3.1. 0,05% l-askorbiinhappe standardlahus: lahustada 50 mg l-askorbiinhapet (AR) 100-ml mahuga mõõtekolvis ligikaudu 20 ml metafosforhappe lahuses (3.2) ja täita kolb veega märgini. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.2. 10% (mass/ruumala) metafosforhappe lahus: pärast uhmris peenestamist lahustada vees 200 g metafosforhapet (AR) ja viia lahuse maht vee lisamisel 2000 ml-ni. Hoida 4 °C juures. Lahus säilib ühe nädala. 3.3. Kloroform (AR). 3.4. 0,5% (mass/ruumala) 2,6-diklorofenool-indofenooli (AR) lahus. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.5. Filteraine (S. ja S. nr 121 või selle analoog). 3.6. 2% (mass/ruumala) 2,4-dinitrofenüülhüdrasiini happeline lahus: lahustada 2 g 2,4-dinitrofenüülhüdrasiini 100 ml lahjendatud väävelhappes (25 ml väävelhapet (AR), tihedus 1,84, lahjendatud veega 100 ml-ni). Madalal temperatuuril hoides säilib lahus ühe nädala. 3.7. Lämmastik. 3.8. Süsinikdioksiid. 3.9. Etüülatsetaadi (AR)/jää-äädikhappe/atsetooni (AR) segu mahuvahekorras 96/2/2. 3.10. Diklorometaani (AR)/jää-äädikhappe segu mahuvahekorras 97/3. 3.11. Silikageel, osakeste suurus 0,05 kuni 0,2 mm. 3.12. Silikageel H (Stahl grade) õhukesekihikromatograafia jaoks. 3.13. Lahjendatud väävelhape: viia 105 ml vett 200-ml mõõtekolbi, täita kolb märgini väävelhappega (AR), tihedus 1,84 g/ml. 3.14. Elueeriv lahusti õhukesekihikromatograafia jaoks: segada 75 ml dietüüleetrit (AR), 25 ml etüülatsetaati (AR) ja 4,0 ml 96% (mass/ruumala) äädikhapet (AR). Valmistada uus segu pärast 2--3 kromatografeerimist. 4. Vahendid 4.1. Veevann, termostateeritud temperatuurile 20 °C. 4.2. Tsentrifuug (3500 p/min), varustatud lihvkorkidega 40--50-ml tsentrifuugikatseklaasidega. 4.3. Vaakumrootorauruti, 250-ml kolvidega. 4.4. Klaaskolonnid kromatografeerimiseks (pikkus 100 mm, siseläbimõõt 20 mm), mille põhjas on poorne filterplaat (nt Allihn'i kolonnid). 4.5. Spektrofotomeeter või filtritega kolorimeeter 10-mm küvettidega. 4.6. Aparaat õhukesekihikromatograafia jaoks silikageeli plaatidega, mis on kaetud 0,5--0,6 mm paksuse silikageeli kihiga (sobivad ka valmis plaadid). Kuivatada plaate 2,5--3 tundi kuivatuskapis 120--130 °C juures. Jätta jahtuma ja hoida seejärel eksikaatoris vähemalt 24 tundi enne kasutamist. 4.7. Kuivatuskapp, mis on seatud temperatuurile 120--130 °C. 5. Analüüsi käik 5.1. Ekstraheerimine Asetada kahte 250-ml mahuga lihvkorgiga mõõtekolbi A ja B võrdne kogus hoolikalt peenestatud proovi, mis sisaldab ligikaudu 200 µg vitamiini C. Lisada kolbi A 0,4 ml standardlahust ja segada kergelt loksutades (sisestandard). Lisada mõlemasse kolvi 30 ml kloroformi ja 25 ml metafosforhappe lahust 4 °C juures. Loksutada ja jätta seisma 10--15 minutiks. Lisada 25 ml vett, sulgeda kolvid korkidega, loksutada tugevasti 10 sekundit ja jätta 10--15 minutiks veevanni seisma. Tsentrifuugida, et eraldada veefaas kloroformi faasist. Edaspidine analüüs viia läbi üheaegselt kolbides A ja B olevate proovidega. 5.2. Oksüdeerimine Pipeteerida 40 ml punktis 5.1 saadud kloroformikihi peal olev vesilahus (kergelt hägune) lihvkorgiga reaktsioonikolvi, lisada 0,5--1 ml 2,6-diklorofenool-indofenooli lahust ja segada. Tekib punane värvus, mis peaks püsima vähemalt 15 minutit. Seejärel lisada ligikaudu 300 mg filterainet, loksutada ja filtreerida läbi kuiva kurdfiltri. Filtraat ei pea olema tingimata selge. 5.3. Reaktsioon 2,4-dinitrofenüülhüdrasiiniga ja hüdrasooni ekstraheerimine Pipeteerida 10 ml punktis 5.2 saadud filtraati tsentrifuugikatseklaasi, lisada 2 ml 2,4-dinitrofenüülhüdrasiini lahust ja segada. Juhtida lämmastiku või süsinikdioksiidi vool kiiresti tsentrifuugikatseklaasi, sulgeda katseklaas korgiga ja hoida seda ligikaudu 15 tundi (öö) veevannis. Seejärel lisada 3 ml vett, 20 ml etüülatsetaadi/jää-äädikhappe/atsetooni segu ja ligikaudu 800 mg filterainet. Sulgeda katseklaas korgiga, loksutada tugevasti 30 sekundit ja tsentrifuugida. Viia 15 ml ülemist faasi aurutamiskolbi ja aurutada alandatud rõhu all vaakumrootoraurutis, kuni saadakse õline jääk. Lahustada jääk 2 ml etüülatsetaadi/jää-äädikhappe/atsetooni segus kuumutamisel 50 °C juures, jätta jahtuma, lisada 10 ml diklorometaani/jää-äädikhappe segu ja segada. 5.4. Kromatografeerimine kolonnis Täita kromatografeerimiskolonn 30 mm kõrguseni diklorometaani/jäääädikhappe seguga. Suspendeerida (tugevasti loksutades) 5 g silikageeli 30 ml diklorometaani/jää-äädikhappe segus; valada suspensioon kolonni. Jätta seisma ja suruda silikageel lämmastiku väikese rõhu abil kokku. Valada kolonni punktis 5.3 saadud lahus, loputada kolb väikese koguse diklorometaani/jää-äädikhappe seguga ja viia kolonni, seejärel täita viimane seguga ja elueerida kolonn sama seguga (3--4 ligi 5-ml portsjonit), kuni saadakse värvitu eluaat. Kõrvaldada see osa eluaadist, mis on kollase värvusega. Elueerida punakas tsoon kolonni tipus etüülatsetaadi/jää-äädikhappe/atsetooni seguga (3.9), koguda eluaat kokku ja aurutada kuivaks. 5.4.1. Grupi A toodete puhul (vitamiin C sisaldus väiksem kui 10 g/kg) lahustada jääk 2,0 ml etüülatsetaadi/jää-äädikhappe/atsetooni segus ja kromatografeerida kohe õhukesel kihil vastavalt punktile 5.5. 5.4.2. Grupi B toodete puhul (vitamiin C sisaldus 10 g/kg või suurem) töödelda õlist jääki 4,0 ml lahjendatud väävelhappega, loksutada tugevasti, et jääk täielikult lahustuks ja mõõta optiline tihedus vastavalt punktile 5.6. 5.5. Õhukesekihikromatograafia Asetada õhukese joonena plaadile 0,5 ml punktis 5.4.1 saadud lahust. Elueerivat lahustit kasutades ilmutada vähemalt 20 minutit lahustiauruga küllastatud nõus, kuni roosavärviline hüdrasooni tsoon on selgelt eraldunud. Jätta lahtiselt kuivama. Märkida roosa tsooni piir, kraapida spaatliga tsoon ära ja viia saadud pulber kvantitatiivselt kromatografeerimiskolonni. Elueerida järgemööda üks kord 2 ml ja kaks korda 1,5 ml etüülatsetaadi/jää-äädikhappe/atsetooni seguga. Koguda eluaat väikesesse kolbi (viimane osa peab olema värvusetu). Aurutada kuivaks, töödelda õlist jääki 4,0 ml lahjendatud väävelhappega, loksutada tugevasti, et jääk täielikult lahustada ja mõõta optiline tihedus. 5.6. Optilise tiheduse mõõtmine Mõõta optiline tihedus spektrofotomeetriga 509 nm juures 20--30 minutit pärast jäägi lahustamist väävelhappes, kasutades lahjendatud väävelhapet võrdluslahusena. 5.7. Pimekatse Viia läbi pimekatse, rakendades eeltoodud analüüsi käiku, kuid ilma analüüsitava proovita. 6. Tulemuste arvutamine Vitamiin C sisaldus proovis g/kg on antud suhtega

kus: a -- pimekatselahuse optiline tihedus; b -- sisestandardilahuse optiline tihedus; c -- proovilahuse optiline tihedus; d -- proovi mass (g). 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 10% suhtelises väärtuses vitamiin C sisalduste puhul, mis on väiksemad kui 10 g/kg; -- 5% suhtelises väärtuses, kui sisaldus on 10 g/kg või suurem. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 31 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Menadiooni (vitamiin K3) määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata menadiooni (vitamiin K3 ) kogust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimum on 1 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse lahjendatud etanooliga. Segu selitatakse tanniinilahusega ja tsentrifuugitakse. Ekstrakti töödeldakse naatriumkarbonaadi lahusega; vabanenud menadioon ekstraheeritakse 1,2-dikloroetaaniga. Dikloroetaaniekstrakti töödeldakse vastavalt selle menadioonisisaldusele kas otse või pärast aurustamist 2,4-dinitrofenüülhüdrasiini etanoolilahusega, mis on hapestatud vesinikkloriidhappega. Saadud hüdrasoon moodustab ammoniaagi liiaga töötlemisel sinakasrohelise värvusega kompleksühendi, mille optilist tihedust mõõdetakse 635 nm juures. 3. Reaktiivid 3.1. 96% (mahu%) etanool. 3.2. Etanool, mis on veega lahjendatud 40%-ni. 3.3. 10% (mass/ruumala) tanniinilahus, mis on valmistatud puhastatud ja pulbriks peenestatud tanniinist. 3.4. 1,2-dikloroetaan (AR). 3.5. 10% (mass/ruumala) veevaba naatriumkarbonaadi (AR) lahus. 3.6. 37% (mass/ruumala) vesinikkloriidhape, tihedus 1,19 g/ml. 3.7. Absoluutne etanool (AR). 3.8. 2,4-dinitrofenüülhüdrasiinreaktiiv: lahustada 40 mg 2,4-dinitrofenüülhüdrasiini (AR) ligikaudu 40 ml keevas absoluutses etanoolis, lasta jahtuda ja viia üle 50-ml mõõtekolbi. Lisada 1 ml vesinikkloriidhapet ja täita kolb absoluutse etanooliga märgini. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.9. 25% (mass/ruumala) ammoniaagi vesilahus, tihedus 0,91 g/ml. 3.10. Ammoniakaalne etanool: segada etanool ja ammoniaagi vesilahus mahuvahekorras 1/1. 3.11. Menadiooni standardlahus: lahustada 20 mg menadiooni (vitamiin K 3) 1,2-dikloroetaanis 200-ml mõõtekolvis, täita kolb sama lahustiga märgini ja segada. Lahjendada selle lähtelahuse kindlad hulgad 1,2-dikloroetaaniga, et saada seeria lahuseid, mille kontsentratsioonid on vahemikus 2--10 µg menadiooni ml kohta. Lahused värskelt valmistada. 4. Vahendid 4.1. Mehhaaniline loksuti. 4.2. Tsentrifuug (3000 kuni 5000 p/min). 4.3. 100- ja 250-ml lihvkorkidega jaotuslehtrid. 4.4. Vaakumrootorauruti 250-ml kolbidega. 4.5. Veevann. 4.6. Spektrofotomeeter 10-mm küvettidega. 5. Analüüsi käik Kõik operatsioonid tuleb läbi viia otsesest valgusest eemal, kasutades vajaduse korral kollasest klaasist laboratooriuminõusid. 5.1. Analüüsitav proov Hoolikalt peenestatud materjalist kaaluge analüüsitav proov vastavalt eeldatavale menadioonisisaldusele (nt): -- 0,1--5,0 g kontsentraatide ja premiksite puhul; -- 20--30 g söötade puhul. Viia analüüsitav proov viivitamatult 250-ml lihvkorgiga kolbi. 5.2. Ekstraheerimine Lisada analüüsitavale proovile täpselt 96 ml lahjendatud etanooli ja loksutada mehhaaniliselt 15 minutit toatemperatuuril. Seejärel lisada 4,0 ml tanniinilahust, segada, viia ekstrakt tsentrifuugikatseklaasi, tsentrifuugida 3000--5000 p/min juures ja dekanteerida. Viia 20--40 ml täpselt mõõdetud ekstrakti 250 ml jaotuslehtrisse, lisada pipetiga 50 ml 1,2-dikloroetaani, segada ja lisada pipetiga 20 ml naatriumkarbonaadi lahust. Loksutada tugevasti 30 sekundit ja seejärel koguda dikloroetaani faas 100-ml jaotuslehtrisse. Lisada 20 ml vett, loksutada 15 sekundit, koguda dikloroetaani faas ja eemaldada sellest vee jäljed filterpaberiribadega. Kontsentraatide ja premiksite puhul võtta ekstrakti alikvootne osa ja lahjendada 1,2-dikloroetaaniga, et saada lahus, mis sisaldab 2--10 µg menadiooni ml kohta. Söötade puhul aurutada ekstrakti alikvootne osa kuivaks alandatud rõhu all lämmastiku atmosfääris 40 °C juures veevannil. Töödelda jääki kiiresti 1,2-dikloroetaaniga, et saada lahust, mis sisaldab 2--10 µg menadiooni ml kohta. 5.3. Hüdrasooni ja värvilise kompleksühendi moodustumine Viia 2,0 ml punktis 5.2 saadud dikloroetaani ekstrakti üle 10-ml mõõtekolbi ja lisada 3,0 ml 2,4-dinitrofenüülhüdrasiinreaktiivi, sulgeda kolb hoolikalt klaasist või teflonist korgiga, et vältida aurustumist, ja kuumutada kaks tundi 70 °C juures veevannil. Lasta jahtuda, lisada 3,0 ml ammoniakaalset etanooli, segada, täita kolb absoluutse etanooliga märgini ja segada. 5.4. Optilise tiheduse mõõtmine Mõõta sinakasrohelise värvusega kompleksühendi optiline tihedus spektrofotomeetriga 635 nm juures, võrreldes pimekatsega, mis on saadud 2,0 ml 1,2-dikloroetaani töötlemisel vastavalt punktile 5.3. Määrata menadiooni kogus, kasutades kalibreerimisgraafikut, mis koostatakse iga analüüsiseeria jaoks. 5.5. Kalibreerimisgraafik Töödelda 2,0 ml menadiooni standardlahuseid vastavalt punktis 5.3 kirjeldatule. Mõõta optiline tihedus vastavalt punktile 5.4. Koostada kalibreerimisgraafik, mis näitab lahuse optilise tiheduse sõltuvust menadiooni sisaldusest (ordinaatteljel optilise tiheduse väärtused, abstsissteljel menadiooni kogused µg-des). 6. Tulemuste arvutamine Arvutada proovi menadioonisisaldus, arvestades analüüsitava proovi massi ja analüüsi käigus tehtud lahjendusi. Leida menadioonisisaldus mg-des analüüsitava proovi kg kohta. 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 20% suhtelises väärtuses menadioonisisalduste puhul, mis on väiksemad kui 10 mg/kg; -- 2 mg/kg absoluutväärtuses sisalduste puhul, mis on 10--14 mg/kg; -- 15% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on 14--100 mg/kg; -- 15 mg/kg absoluutväärtuses sisalduste puhul, mis on 100--150 mg/kg; -- 10% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on suuremad kui 150 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 32 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Sinepiõli määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sinepiõlisisalduse liikidest Brassica ja Sinapis valmistatud kookides ja neist liikidest valmistatud kooke sisaldavates segasöötades, väljendatud allüülisotiotsüanaadina, mida on võimalik auru abil destilleerida. 2. Põhimõte Proov suspendeeritakse vees. Sinepiõli eraldub ensüümide toimel, mis seotakse etanooliga destilleerimisel ja kogutakse lahjendatud ammoniaagi lahusesse. Seda lahust töödeldakse soojalt teatud kindla koguse hõbenitraadi lahusega, seejärel jahutatakse ja filtreeritakse. Hõbenitraadi liig tiitritakse tagasi ammooniumtiotsüanaadi lahusega. 3. Reaktiivid 3.1. Valge sinep (Sinapis alba). 3.2. 95--96% (mahu%) etanool. 3.3. Vahutamisvastane emulsioon (nt silikoon). 3.4. Ammoniaagi lahus, tihedus 0,958 g/ml. 3.5. Hõbenitraadi lahus 0,1N. 3.6. Ammooniumtiotsüanaadi lahus 0,1N. 3.7. Lämmastikhape, tihedus 1,40 g/ml. 3.8. Ammooniumraudsulfaadi küllastunud lahus. 4. Vahendid 4.1. 500-ml lihvkorkidega seisukolvid. 4.2. Jahutiga destillatsiooniaparaat, mis on varustatud piisakeste ärakande vältimise seadmega. 5. Analüüsi käik Kaaluda 10 g proovi 1 mg täpsusega, viia see seisukolbi mahuga 500 ml ning lisada 2 g peeneksjahvatatud valget sinepit (ensüümi allikas) ja 200 ml vett 20 °C juures. Sulgeda kolb korgiga ja hoida umbes kaks tundi 20 °C juures, sageli loksutades. Lisada 40 ml etanooli ja üks tilk vahutamisvastast emulsiooni. Destilleerida ligikaudu 150 ml ja koguda destillaat 250-ml mõõtekolbi, mis sisaldab 20 ml ammoniaagi lahust, tehes kindlaks, et jahuti ots on vedelikus. Lisada ammoniakaalsele lahusele 50 ml 0,1N hõbenitraadi lahust (vajaduse korral rohkem), asetada mõõtekolvile väike lehter ja kuumutada segu üks tund keeval veevannil. Jätta jahtuma, täita mõõtekolb veega kuni märgini, segada ja filtreerida. Mõõta 100 ml selget filtraati, lisada 5 ml lämmastikhapet ja ligikaudu 5 ml ammooniumraudsulfaadi lahust. Tiitrida hõbenitraadi liig tagasi 0,1N ammooniumtiotsüanaadi lahusega. Viia läbi pimekatse, rakendades punkti 5 analüüsi käiku 2 g peeneksjahvatatud valge sinepi puhul, lisamata analüüsitavat proovi. 6. Tulemuste arvutamine Lahutada pimekatsele kulunud 0,1N hõbenitraadilahuse maht sellest, mis kulus lahuses olnud proovile. Saadud väärtus näitab, mitu milliliitrit 0,1N hõbenitraadi lahust kulus proovis sisaldunud sinepiõlile. 1 ml 0,1N AgNO3 vastab 4,956 mg allüülisotiotsüanaadile. Leida selle protsendiline sisaldus proovis. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 33 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Lupiini alkaloidide määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata alkaloidisisalduse lupiiniseemnetes. 2. Põhimõte Alkaloidid lahustatakse dietüüleetri ja kloroformi segus ning ekstraheeritakse vesinikkloriidhappega. Alkaloidid sadestatakse ränivolframhappega, sade tuhastatakse ja jääk kaalutakse. 3. Reaktiivid 3.1. Dietüüleeter. 3.2. Kloroform. 3.3. Naatriumhüdroksiidi lahus 4N. 3.4. Vesinikkloriidhape 0,3 N. 3.5. Naatriumkloriid (AR). 3.6. Ränivolframhappe SiO2 12WO3 26H2O 10% (mass/ruumala) lahus. 4. Vahendid 4.1. Mehhaaniline segisti. 4.2. Plaatina-, kvarts- või portselantiiglid tuhastamise jaoks. 4.3. Elektriline muhvelahi. 5. Analüüsi käik Kaaluda 15 g proovi 5 mg täpsusega ja viia see ligikaudu 200-ml mahuga lihvkorgiga jaotuslehtrisse. Lisada täpselt 100 ml dietüüleetrit ja 50 ml kloroformi ning seejärel pipeti abil 10 ml naatriumhüdroksiidi lahust. Loksutada tugevasti, et vältida kämpude moodustumist. Loksutada mõned korrad uuesti ja jätta ööseks seisma. Kui sademe peal olev vedelik ei ole täiesti selge, lisada mõni tilk vett. Filtreerida dietüüleetri ja kloroformi kiht. Koguda 50 ml filtraati mõõtekolbi mahuga 50 ml ning viia kvantitatiivselt 150-ml jaotuslehtrisse, kasutades 50 ml dietüüleetrit. Ekstraheerida järjest kolm korda 20 ml vesinikkloriidhappega, jätta seisma kihtide eraldumiseni ja eraldada pärast iga ekstraheerimist happeekstrakt. Koguda happeekstraktid 250-ml keeduklaasi ning eemaldada kergelt soojendades viimased dietüüleetri- ja kloroformijäägid. Lisada ligikaudu 1 g naatriumkloriidi, jätta jahtuma ning sadestada alkaloidid ränivolframhappe lahusega. Segada mehhaanilise segistiga 30 minutit. Jätta ööseks selginema, filtreerida läbi tuhavaba filtri ning pesta sadet järjest kaks korda 10 ml ja kaks korda 5 ml vesinikkloriidhappega. Asetada sadet sisaldav filter tiiglisse ja tuhastada 900 °C juures. Jätta jahtuma ja kaaluda. 6. Tulemuste arvutamine Proovi alkaloidisisaldus saadakse korrutades tuha massi faktoriga 0,2. Arvutada alkaloidi protsendiline sisaldus proovis. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 34 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Vaba ja kogu gossüpoli määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata vaba gossüpoli, kogu gossüpoli ja nendega keemiliselt seotud ainete sisalduse puuvillaseemnetes, puuvillasrotis ja puuvillakoogis ning neid aineid sisaldavates segasöötades, kui neid esineb rohkem kui 20 mg/kg. 2. Põhimõte Gossüpol ekstraheeritakse, kasutades 3-aminopropaan-1-ol või propaan-2-ol ja heksaani segu, et määrata vaba gossüpol, või dimetüülformamiidiga, et määrata kogu gossüpol. Gossüpol viiakse aniliini abil gossüpol-dianiliiniks, mille optiline tihedus mõõdetakse lainepikkusel 440 nm. 3. Reaktiivid 3.1. Propaan-2-ol ja heksaani segu: segada 60 mahuosa propaan-2-ol (AR) 40 mahuosa n-heksaaniga. 3.2. Lahusti A: paigutada 1-liitrilisse mõõtekolbi ligikaudu 500 ml propaan-2-ol-heksaani segu, 2 ml 3-aminopropaan-1-ol, 8 ml jää-äädikhapet ja 50 ml vett. Täita kolb propaan-2-ol-heksaani seguga märgini. Saadud reaktiiv püsib ühe nädala. 3.3. Lahusti B: pipeteerida 100-ml mahuga mõõtekolbi 2 ml 3-aminopropaan-1-ol ja 10 ml jää-äädikhapet. Jahutada toatemperatuurini ning täita kolb N,N-dimetüülformamiidi abil kuni märgini. Saadud reaktiiv püsib ühe nädala. 3.4. Aniliin (AR): kui pimekatses saadud optiline tihedus ületab 0,022, lisada aniliinile tsingitolmu ja destilleerida aniliin, jättes kasutamata esimese ja viimase kümnendiku destillaadist. Külmkapis säilib reaktiiv pruunis korgiga suletud klaaspudelis mitu kuud. 3.5. Gossüpoli standardlahus A: paigutada 250-ml mahuga mõõtekolbi 27,9 mg gossüpolatsetaati. Lahustada ja täita kolb lahusti A abil märgini. Pipeteerida 50 ml sellest lahusest mõõtekolbi mahuga 250 ml ning täita kolb lahusti A abil märgini. Saadud lahuse gossüpoli kontsentratsioon on 0,02 mg/ml. Enne kasutamist lasta üks tund toatemperatuuril seista. 3.6. Gossüpoli standardlahus B: paigutada 50-ml mahuga mõõtekolbi 27,9 mg gossüpolatsetaati. Lahustada ja täita kolb lahusti B abil märgini. Saadud lahuse gossüpoli kontsentratsioon on 0,5 mg/ml. Valguse eest kaitstult püsivad gossüpoli standardlahused A ja B 24 tundi. 4. Vahendid 4.1. Segisti (trummel): umbes 35 p/min. 4.2. Spektrofotomeeter. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi kaalutis Kasutatava proovi kogus sõltub analüüsitava materjali eeldatavast gossüpolisisaldusest. Eelistatud on töötada väikese prooviga ja filtraadi suhteliselt suure alikvootse osaga, et saada piisavalt gossüpoli, võimaldamaks täpset fotomeetrilist mõõtmist. Vaba gossüpoli määramiseks puuvillaseemnetes, puuvillasrotis ja puuvillakoogis ei tohi proov olla suurem kui 1 g, segasööda puhul võib see olla 5 g. Enamikul juhtudest sobib filtraadi alikvootne osa mahuga 10 ml; see peab sisaldama 50--100 µg gossüpoli. Kogu gossüpoli määramiseks peab proovi suurus olema 0,5--5 g, et filtraadi alikvootne osa 2 ml sisaldaks 40--200 µg gossüpoli. Analüüs tuleb läbi viia toatemperatuuril umbes 20 °C. 5.2. Vaba gossüpoli määramine Paigutada proov lihvitud kaelaga kolbi, mille maht on 250 ml ja mille põhi on kaetud purustatud klaasiga. Lisada pipeti abil 50 ml lahustit A, sulgeda kolb korgiga ja segada segistis üks tund. Filtreerida läbi kuiva filtri ja koguda filtraat väikesesse lihvitud kaelaga kolbi. Filtreerimise ajal katta lehter uuriklaasiga. Pipeteerida kahte 25-ml mahuga mõõtekolbi (A ja B) identsed filtraadi alikvootsed osad, mis sisaldavad 50--100 µg gossüpoli. Vajaduse korral viia filtraadi maht lahusti A lisamisel kuni 10 ml-ni. Seejärel täita kolb A propaan-2-ol-heksaani seguga märgini. Saadud lahust kasutatakse võrdluslahusena, mille suhtes mõõdetakse proovi lahust. Pipeteerida kahte teise 25-ml mahuga mõõtekolbi (C ja D) á 10 ml lahustit A. Täita kolb C propaan-2-ol-heksaani seguga märgini. Saadud lahust kasutatakse võrdluslahusena, mille suhtes mõõdetakse pimekatse lahust. Lisada kolbidesse D ja B á 2 ml aniliini. Kuumutada 30 minutit keeval veevannil värvuse tekkeks. Jahutada toatemperatuurini, täita kolvid propaan-2-ol-heksaani seguga märgini, segada ja lasta üks tund seista. Määrata spektrofotomeetriga lainepikkusel 440 nm 1-cm klaasküvettides pimekatse lahuse (D) optiline tihedus võrreldes võrdluslahusega (C) ning proovi lahuse (B) optiline tihedus võrreldes võrdluslahusega (A). Lahutada pimekatselahuse optiline tihedus proovilahuse omast (= korrigeeritud optiline tihedus). Selle väärtuse põhjal arvutada vaba gossüpoli sisaldus vastavalt punkti 6 kirjeldusele. 5.3. Kogu gossüpoli määramine Paigutada 1--5 mg gossüpoli sisaldav proov 50-ml mahuga mõõtekolbi ja lisada 10 ml lahustit B. Samal ajal valmistada ette pimekatse, paigutades teise 50-ml mahuga mõõtekolbi 10 ml lahustit B. Kuumutada neid kahte kolbi keeval veevannil 30 minutit. Jahutada toatemperatuurini ning täita mõlemad kolvid propaan-2-ol-heksaani seguga märgini, segada ja jätta 10--15 minutiks selginema. Seejärel filtreerida ja koguda filtraadid lihvitud kaelaga kolbidesse. Pipeteerida kahte 25-ml mahuga mõõtekolbi á 2 ml proovi filtraati ning kahte teise 25-ml mahuga mõõtekolbi á 2 ml pimekatse filtraati. Täita mõlema seeria üks kolb propaan-2-ol-heksaani seguga 25 ml-ni. Saadud lahuseid kasutatakse võrdluslahustena. Lisada kahte teise kolbi á 2 ml aniliini. Kuumutada 30 minutit keeval veevannil värvuse tekkeks. Jahutada toatemperatuurini, täita kolvid propaan-2-ol-heksaani seguga 25 ml-ni, segada ja lasta üks tund seista. Määrata optiline tihedus vastavalt punktile 5.2. Saadud väärtuse põhjal arvutada kogu gossüpoli sisaldus vastavalt punktile 6. 6. Tulemuste arvutamine Tulemused võib välja arvutada kas lähtudes eri optilisest tihedusest või kalibreerimisgraafiku järgi. 6.1. Eri optilisest tihedusest lähtudes Eri optilised tihedused, eelpool kirjeldatud tingimustes, on järgmised

Vaba või kogu gossüpoli sisaldus proovis arvutatakse järgmist valemit kasutades

kus: E -- korrigeeritud optiline tihedus, mis on määratud vastavalt punktile 5.2; p -- proovi mass (g); a -- filtraadi alikvootse osa ruumala (ml). 6.2. Kalibreerimisgraafiku järgi 6.2.1. Vaba gossüpol Valmistada ette kaks seeriat mõõtekolbe, kummaski viis kolbi mahuga 25 ml. Pipeteerida mõlema seeria kolbidesse gossüpoli standardlahuse A alikvootsed osad vastavalt 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 ja 10,0 ml. Viia lahuse maht kolbides lahusti A lisamisel 10 ml-ni. Lõpetada mõlemad seeriad 25-ml mahuga mõõtekolviga, mis sisaldab üksnes lahustit A (pimekatse). Täita esimese seeria kolvid (kaasa arvatud kolb pimekatsega) propaan-2-ol-heksaani seguga kuni märgini (võrdlusseeria). Lisada teise seeria igasse kolbi (kaasa arvatud kolb pimekatsega) 2 ml aniliini. Kuumutada 30 minutit keeval veevannil värvuse tekkeks. Jahutada toatemperatuurini, täita kolvid propaan-2-ol-heksaani seguga märgini, segada ja lasta üks tund seista (standardseeria). Määrata standardseeria lahuste optiline tihedus võrreldes vastavate lahustega võrdlusseerias vastavalt punktile 5.2. Koostada kalibreerimisgraafik, kandes sellele gossüpoli kogused µg-des ja neile vastavad optilised tihedused. 6.2.2. Kogu gossüpol Võtta kuus 50-ml mahuga mõõtekolbi. Viia esimesse kolbi 10 ml lahustit B ja teistesse gossüpoli standardlahust B vastavalt 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 ja 10,0 ml. Viia lahuse maht igas kolvis lahusti B lisamisel 10 ml-ni. Kuumutada 30 minutit keeval veevannil. Jahutada toatemperatuurini, täita kolvid propaan-2-ol-heksaani seguga märgini ja segada. Valmistada ette kaks seeriat mõõtekolbe, kummaski kuus kolbi mahuga 25 ml. Mõõta punktis 6.2.1 valmistatud lahustest vastavalt 2 ml igasse mõlema seeria kolbi. Täita esimese seeria kolvid propaan-2-ol-heksaani seguga kuni märgini (võrdlusseeria). Lisada teise seeria igasse kolbi 2 ml aniliini. Kuumutada 30 minutit keeval veevannil. Jahutada toatemperatuurini, täita kolvid propaan-2-ol-heksaani seguga kuni märgini, segada ja lasta üks tund seista (standardseeria). Määrata standardseeria lahuste optiline tihedus võrreldes vastavate lahustega võrdlusseerias vastavalt punkti 5.2 kirjeldusele. Koostada kalibreerimisgraafik, kandes sellele gossüpoli kogused µg-des ja neile vastavad optilised tihedused. 6.3. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 15% suhtelises väärtuses gossüpoli sisalduste puhul, mis on väiksemad kui 500 mg/kg; -- 75 mg/kg absoluutväärtuses sisalduste puhul 500--750 mg/kg; -- 10% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on suuremad kui 750 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 35 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Teobromiini määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata kakaoubade töötlemise kõrvalsaaduste teobromiinisisalduse. 2. Põhimõte Teobromiin ekstraheeritakse kloroformiga. Ekstrakt aurutatakse kuivaks, lahustatakse vees ja töödeldakse teatud kindla koguse hõbenitraadi lahusega. Vabanenud lämmastikhape tiitritakse naatriumhüdroksiidi lahusega. 3. Reaktiivid 3.1. Kloroform (AR). 3.2. Ammoniaagi vesilahus, tihedus 0,958 g/ml. 3.3. Naatriumsulfaat (AR), veevaba. 3.4. Naatriumhüdroksiidi lahus 0,1 N. 3.5. Hõbenitraadi lahus 0,1N. 3.6. Fenoolpunase 1% (mass/ruumala) etanooli lahus. 3.7. Petrooleeter, keemistemperatuuri vahemik 40--60 °C. 4. Vahendid 500-ml lihvkorkidega seisukolvid. 5. Analüüsi käik Kaaluda 1 mg täpsusega kuni 10 g proovi, mis ei sisalda üle 80 mg teobromiini. Viia proov lihvkorgiga 500-ml seisukolbi ning lisada 270 ml kloroformi ja 10 ml ammoniaagi vesilahust. Sulgeda kolb korgiga ja loksutada tugevasti viis minutit. Lisada 12 g veevaba naatriumsulfaati, loksutada ja jätta kuni järgmise päevani selginema. Filtreerida lahus Erlenmeyeri kolbi mahuga 500 ml ja pesta jääk 100 ml kloroformiga. Destilleerida solvent ja eemaldada selle jäljed keeval veevannil. Lahustada jääk 50 ml vees ja kuumutada lahus keemiseni. Jahutada. Seejärel neutraliseerida täpselt naatriumhüdroksiidi lahusega, kasutades 0,5 ml fenoolpunase lahust. Lisada 20 ml hõbenitraadi lahust. Tiitrida vabanenud lämmastikhape naatriumhüdroksiidi lahusega, kuni indikaator muudab värvust (pH 7,4). 6. Tulemuste arvutamine 1 ml 0,1N NaOH = 18 mg teobromiini. Väljendada tulemus teobromiini protsendilise sisaldusena proovis. 7. Märkus Üle 8% toorrasvainet sisaldavad produktid tuleb esmalt rasvatustada kuuetunnise ekstraheerimise teel petrooleetris (keemistemperatuuri vahemik 40--60 °C). Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 36 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Aflatoksiin B1 ühemõõtmelise õhukesekihikromatograafilise määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata aflatoksiin B1 taset toormaterjalides ja lihtsöötades. Antud metoodika pole rakendatav tsitrusepulbi esinemise korral. Määratav miinimum on 0,01 mg/kg. Segavate ainete esinemisel on vajalik analüüsi korrata, kasutades meetodit B (kõrgsurve vedelikkromatograafia). 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse kloroformiga. Ekstrakt filtreeritakse ja võetakse alikvootne osa, mis puhastatakse kromatografeerimisel silikageelkolonnis. Eluaat aurustatakse ja jääk lahustatakse kindlas koguses kloroformis või benseeni ja atsetonitriili segus. Selle lahuse alikvootse osaga viiakse läbi õhukesekihikromatograafia. Aflatoksiin B 1 kogus määratakse kromatogrammi UV-lambiga kiiritamisel kas visuaalselt või fluorodensitomeetri abil, võrreldes standardse aflatoksiin B 1 teadaolevate kogustega. Söödast ekstraheeritud aflatoksiin B 1 identsust peab kinnitama allpool toodud analüüsi käik. 3. Reaktiivid Reaktiivid peavad olema kvaliteediga (AR) (analüütiline reaktiiv), kui ei ole teisiti määratud. 3.1. Atsetoon. 3.2. Kloroform, stabiliseeritud 96% (mahu%) etanooliga, lisades seda 0,5--1,0%. 3.3. n-Heksaan. 3.4. Metanool. 3.5. Veevaba dietüüleeter, vaba peroksiididest. 3.6. Benseeni ja atsetonitriili segu mahuvahekorras 98/2. 3.7. Kloroformi ja metanooli segu mahuvahekorras 97/3. 3.8. Silikageel kolonnkromatograafia jaoks, osakeste suurus 0,05 kuni 0,20 mm. 3.9. Absorbeeriv puuvillavatt, mida on eelnevalt rasvatustatud kloroformiga või klaasvatt. 3.10. Naatriumsulfaat, veevaba, granuleeritud. 3.11. Inertgaas või lämmastik. 3.12. Vesinikkloriidhape, 1N. 3.13. Väävelhape, 50% (mahu%). 3.14. Kieselguhr (Hyflosupercel), happes pestud. 3.15. Silikageel G-HR või selle analoog õhukesekihikromatograafia jaoks. 3.16. Standardlahus, milles on ligi 0,1 µg aflatoksiin B 1 ml kohta kloroformis või benseeni/atsetonitriili segus, mis on valmistatud ja kontrollitud vastavalt punktile 7. 3.17. Standardlahus kvalitatiivseks määramiseks, mis sisaldab ligi 0,1 µg aflatoksiin B1 ja B2 ml kohta kloroformis või benseeni/atsetonitriili segus. Kontsentratsioonid on antud esialgsetena, mis vajavad korrigeerimist, saavutamaks mõlema aflatoksiini puhul ühesugune fluorestseerumisintensiivsus. 3.18. Ilmutuslahustid. 3.18.1. Kloroform/atsetoon mahuvahekorras 9/1, küllastamata ilmutusnõu. 3.18.2. Dietüüleeter/metanool/vesi mahuvahekorras 96/3/1, küllastamata ilmutusnõu. 3.18.3. Dietüüleeter/metanool/vesi mahuvahekorras 94/4,5/1,5, küllastatud ilmutusnõu. 3.18.4. Kloroform/metanool mahuvahekorras 94/6, küllastatud ilmutusnõu. 3.18.5. Kloroform/metanool mahuvahekorras 97/3, küllastatud ilmutusnõu. 4. Vahendid 4.1. Veski-segisti. 4.2. Loksuti või magnetsegaja. 4.3. Kurdfiltrid paberist Schleicher ja Schüll nr 588 või selle analoog, läbimõõt 24 cm. 4.4. Klaaskolonn kromatografeerimiseks (siseläbimõõt 22 mm, pikkus 300 mm) PTFE kraani ja 250-ml reservuaariga. 4.5. Vaakumrootorauruti 500-ml ümarkolviga. 4.6. 500-ml lihvkorkidega koonilised kolvid. 4.7. Õhukesekihikromatograafia vahendid. 4.8. Klaasplaadid õhukesekihikromatograafia jaoks, 200 200 mm. Asetada 30 g silikageeli G-HR koonilisse kolbi. Lisada 60 ml vett, sulgeda kolb korgiga ja loksutada üks minut. Katta plaadid suspensiooniga selliselt, et saavutada ühtlast 0,25 mm paksusega kihti. Lasta õhu käes kuivada ja asetada siis eksikaatorisse, mis sisaldab silikageeli. Kasutamisel aktiveerida plaadid, hoides neid 110 °C juures kuivatuskapis ühe tunni jooksul. Võib kasutada ka valmis plaate, kui need annavad tulemusi, mis on sarnased eespool nimetatud viisil ettevalmistatud plaatidega saadutele. 4.9. Pikalainelise ultraviolettkiirgusega kõrgrõhu Hg-lamp (360 nm). Kiiritamise intensiivsus peab olema küllaldane, et võimaldada 1ng aflatoksiin B1 laigu veel selget eristamist õhukesekihikromatograafia plaadil 10 cm kaugusel lambist. 4.10. 10-ml gradueeritud katseklaasid polüetüleenkorkidega. 4.11. UV-spektrofotomeeter. 4.12. Fluorodensitomeeter (vabalt valitav). 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ettevalmistamine (vt punkt 10 «Metoodikat puudutav märkus»). Jahvatada proov nii, et see läbiks täielikult 1-mm avadega sõela (vastavalt soovitusele ISO R 565). 5.2. Ekstraheerimine Asetada 50 g jahvatatud, homogeniseeritud proovi 500-ml koonilisse kolbi. Lisada 25 g kiiselguuri, 25 ml vett ja 250 ml kloroformi. Sulgeda kolb korgiga, loksutada või segada 30 minutit loksuti või magnetsegaja abil ja filtreerida läbi kurdfiltri. Valada esimesed 10 ml filtraati ära ja koguda seejärel 50 ml. 5.3. Ekstrakti puhastamine kolonnis Paigutada kromatografeerimiskolonni põhja puuvilla- või klaasvatitropp, täita kaks kolmandikku kolonnist kloroformiga ja lisada 5 g naatriumsulfaati. Kontrollida, et naatriumsulfaadikihi pealmine pind on sile, lisada seejärel väikeste portsjonitena 10 g silikageeli. Segada hoolikalt pärast iga juurdelisamist, et kõrvaldada õhumullid. Jätta 15 minutiks seisma ja seejärel lisada ettevaatlikult 15 g naatriumsulfaati. Lasta vedelikul läbi kolonni voolata, kuni see on jõudnud naatriumsulfaadi pealmise pinnani. Segada 50 ml punktis 5.2 kogutud ekstrakti 100 ml n-heksaaniga ja kanda segu kvantitatiivselt kolonni. Lasta vedelikul läbi kolonni voolata, kuni see on jõudnud naatriumsulfaadi pealmise pinnani. Valades kõrvaldada kolonnist välja voolanud vedelik. Seejärel lisada kolonni 100 ml dietüüleetrit ja lasta voolata naatriumsulfaadikihi pealmise pinnani. Operatsioonide ajal jälgida, et voolu kiirus on 8--12 ml minutis ja et kolonn ei voola kuivaks. Valada kolonnist välja voolanud vedelik ära. Elueerida 150 ml kloroformi/metanooli seguga ja koguda kogu eluaat kokku. Aurutada eluaat peaaegu kuivaks temperatuuril, mis ei ületa 50 °C inertgaasi voolus rootoraurutiga. Jääk viia kvantitatiivselt 10-ml gradueeritud katseklaasi, kasutades kloroformi või benseeni/atsetonitriili segu. Kontsentreerida lahus inertgaasi voolus ja viia ruumala kloroformi või benseeni/atsetonitriili seguga kuni 2 ml-ni. 5.4. Õhukesekihikromatograafia Kanda laiguna õhukesekihikromatograafia plaadile, 2 cm alumisest äärest ja 2-cm intervallidega standardlahuse ja ekstrakti allpool näidatud kogused: -- 10, 15, 20, 30 ja 40 µl aflatoksiin B1 standardlahust; -- 10µl punktis 5.3 saadud ekstrakti kanda täpselt peale 20 µl standardlahusega saadud laigule; -- 10 ja 20 µl punktis 5.3 saadud ekstrakti. Ilmutada kromatogramm pimedas ühe ilmutuslahustiga. Lahusti tuleb varem valida, asetades 25 µl kvalitatiivse määramise standardlahust plaadile ja kontrollides, et ilmutatult on aflatoksiin B1 ja B2 täielikult eraldatud. Lasta lahustitel pimedas aurustuda ja siis ergastada UV-valgusega, asetades plaadi 10 cm kaugusele lambist. Aflatoksiin B1 laigud fluorestseeruvad siniselt. 5.5. Kvantitatiivne määramine Määrata kas visuaalselt või fluorodensitomeetriga alljärgnevalt: 5.5.1. Visuaalsed mõõtmised Määrata aflatoksiin B1 kogus ekstraktis, võrreldes ekstraktilaikude fluorestsentsi intensiivsust standardlahuse laikude fluorestsentsi intensiivsusega. Vajadusel interpoleerida. Standardlahusel ekstrakti pealepaigutamisega saavutatud fluorestsents peab olema intensiivsem kui see on 10 µl ekstrakti puhul ja võib olla ainult üks nähtav laik. Kui ekstrakti 10 µl fluorestsentsi intensiivsus on suurem kui 40 µl standardlahuse puhul, lahjendada ekstrakti enne uut õhukesekihikromatograafiat kloroformi või benseeni/atsetonitriili seguga 10 kuni 100 korda. 5.5.2. Mõõtmised fluorodentsitomeetri abil Mõõta aflatoksiin B1 laikude fluorestsentsi intensiivsust fluorodensitomeetriga ergastuslainepikkusel 365 nm ja kiirguslainepikkusel 443 nm. Määrata aflatoksiin B1 kogus ekstrakti laikudes, võrreldes nende fluorestsentsi intensiivsust aflatoksiin B1 standardlahuse laikude fluorestsentsi intensiivsusega. 5.6. Aflatoksiin B1 identsuse kontroll Kontrollida aflatoksiin B1 identsust ekstraktis allpool näidatud katsetega. 5.6.1. Töötlemine väävelhappega. Pihustada väävelhapet punktis 5.4 saadud kromatogrammile. Aflatoksiin B 1 laikude fluorectsents peab UV-kiiritamisega muutuma sinisest kollaseks. 5.6.2. Kahemõõtmeline kromatograafia, tekib aflatoksiin B 1-hemiatsetaal (aflatoksiin B2a) (vt joonised 1, 2, 3) Allpool kirjeldatud operatsioonid tuleb läbi viia, jälgides hoolikalt diagrammi joonisel 3.

Joonis 1.

Joonis 2.

Joonis 3. 5.6.2.1. Lahuste plaadile kandmine Märkida plaadile kaks sirget joont, mis on paralleelsed kahele kokkupuutuvale küljele (6 cm igast küljest), et piirata kahe lahustifrondi migratsiooni. Kapillaarpipettide või mikrosüstalde abil kanda plaadile järgmiste lahuste tilgad: -- punktis A: punktis 5.3 saadud proovi puhastatud ekstrakti kogus, mis sisaldab ligikaudu 2,5 ng aflatoksiin B1; -- punktides B ja C: 25 µl standardlahust. 5.6.2.2. Ilmutamine Ilmutada kromatogrammi pimedas suunas I, kasutades ilmutuslahustit (1-cm kiht küllastamata ilmutusnõus) kuni lahusti front jõuab lahusti piirjooneni. Eemaldada plaat ilmutusnõust ja lasta kuivada toatemperatuuril pimedas viis minutit. Seejärel pihustada vesinikkloriidhapet piki 2,5 cm kõrgust vööti, kattes punktid A ja B (näidatud viirutusega joonisel 3), kuni vööt tumeneb, ülejäänud plaati kaitsta klaasplaadiga. Lasta 10 minutit pimedas reageerida ja kuivatada õhuvooluga toatemperatuuril. Järgmiseks ilmutada kromatogramm pimedas suunas II, kasutades ilmutuslahustit (1-cm kiht küllastamata ilmutusnõus), kuni lahusti front jõuab lahusti piirjooneni. Eemaldada plaat ilmutusnõust ja lasta kuivada toatemperatuuril. 5.6.2.3. Kromatogrammi lugemine Vaadelda kromatogrammi UV-valguses ja kontrollida järgmisi omadusi: (a) aflatoksiin B1 sinise fluorestseeruva laigu ilmumine, mis tuleneb punktis C kasutatud standardlahusest (migratsioon suunas I); (b) reageerimata (vesinikkloriidhappega) aflatoksiin B1 sinise fluorestseeruva laigu ja aflatoksiin B1-hemiatsetaali intensiivsema sinise fluorestseeruva laigu ilmumine, mõlemad tulenevad punktis B kasutatud (migratsioon suunas II) standardlahusest; (c) juba kirjeldatud (b) laikudega sobivate laikude ilmumine, mis tulenevad punktis A kasutatud prooviekstraktist. Esmalt määratleb laikude asendi aflatoksiin B1 migratsiooni kaugus punktist A suunas I (nagu punktis C kasutatud standardi puhul), seejärel aflatoksiin B1-hemiatsetaali migratsiooni kaugused sealt suunas II (nagu punktis B kasutatud standardi puhul). Ekstraktist ja punktis B kasutatud standardist tulenevate hemiatsetaallaikude fluorestseerumise intensiivsused peavad kokku langema. 6. Tulemuste arvutamine 6.1. Visuaalsed mõõtmised Aflatoksiin B1 sisaldus µg-des proovi kg kohta antakse valemiga

kus: Y ja X on sarnase fluorestsentsi intensiivsusega aflatoksiin B1 standardlahuse ja ekstrakti vastavad ruumalad (µl); S -- aflatoksiin B1 standardlahuse kontsentratsioon (µg/ml); V -- ekstrakti lõppruumala, võttes arvesse kõiki tehtud lahjendusi (µl); W -- proovi mass (g), mis vastab puhastamiseks kolonni viidud ekstrakti ruumalale. 6.2. Fluorodensitomeetrilised mõõtmised Aflatoksiin B1 sisaldus µg-des proovi kg kohta antakse valemiga

kus: Y -- plaadile kantud ekstrakti ruumala (µl) (10 või 20µl); S -- ekstrakti laigus sisalduva aflatoksiin B1 kogus (ng) (proportsionaalne võetud ruumalaga Y), mis on saadud fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmistulemustest; V -- ekstrakti lõppruumala (µl), võttes arvesse kõiki tehtud lahjendusi; W -- proovi mass (g), mis vastab puhastamiseks kolonni viidud ekstrakti ruumalale. 7. Standardlahuse (3.16) valmistamine ja kontrollimine 7.1. Aflatoksiin B1 kontsentratsiooni määramine Valmistada aflatoksiin B1 standardlahus kloroformis või benseeni/atsetonitriili segus kontsentratsiooniga 8--10 µg/ml. Määrata spektrofotomeetri abil neeldumisspekter 330 ja 370 nm vahel. Kloroformilahuse puhul määrata optiline tihedus (A) 363 nm juures või 348 nm juures, kui lahus on valmistatud benseeni/atsetonitriili segus. Arvutada aflatoksiin B1 kontsentratsioon µg-des ml lahuse kohta allpool oleva valemi järgi

Lahjendada standardlahust päevavalgusest eemal, et saada tööstandardlahus, mille aflatoksiin B1 kontsentratsioon on ligikaudu 0,1 µg/ml. Külmutuskapis 4 °C juures hoides on lahus stabiilne kaks nädalat. 7.2. Kromatograafilise puhtuse kontrollimine Kanda plaadile 5 µl aflatoksiin B1 standardlahust, kontsentratsiooniga 8--10 µg/ml. Ilmutada kromatogramm vastavalt punktile 5.4. UV-valguses peab kromatogrammil näha olema üks laik ja esialgses tsoonis ei tohi olla märgatavat fluorestsentsi. 8. Korratavus Erinevus sama analüütiku poolt sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste vahel ei tohi ületada: -- 25% suurimast tulemusest, kui aflatoksiin B1 sisaldus on 10--20 µg/kg; -- 5 µg absoluutväärtuses, kui sisaldused on suuremad kui 20 µg/kg ja kuni 50 µg/kg; -- 10% suurimast tulemusest, kui sisaldused on üle 50 µg/kg. 9. Reprodutseeritavus Tulemuste reprodutseeritavust, see tähendab sama prooviga kahe või enama laboratooriumi poolt saadud tulemuste varieerumist hinnatakse: ± 50% aflatoksiini B1 kontsentratsiooni keskmiste väärtuste keskmisest väärtusest, alates 10--20 µg/kg puhul; ± 10 µg/kg aflatoksiin B1 kontsentratsiooni keskmisest väärtusest keskmiste väärtuste puhul, mis on suuremad kui 20 ja kuni 50 µg/kg; ± 20% aflatoksiin B1 keskmisest väärtusest keskmiste väärtuste puhul, mis on suuremad kui 50 µg/kg. 10. Metoodikat puudutav märkus Rasvatustamine. Proovid, mis sisaldavad rohkem kui 5% rasvu, tuleb pärast punktis 5.1 näidatud ettevalmistusi rasvatustada petrooleetriga (keemistemperatuuri vahemik 40--60 °C). Analoogilistel juhtudel tuleb analüüsi tulemused väljendada rasvatustamata proovi massi kohta. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 37 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Aflatoksiin B1 kõrgsurve vedelikkromatograafilise määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika on aflatoksiin B1 määramiseks loomasöötades, sealhulgas nendes, mis sisaldavad tsitrusepulpi. Määratav miinimum on 0,001 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse kloroformiga. Ekstrakt filtreeritakse ja selle alikvootne osa puhastatakse Florisil padrunis, millele järgneb puhastamine C18 padrunis. Lõplik eraldamine ja määramine toimub kõrgsurve vedelikkromatograafia (KSVK) abil, kasutades pöördfaasiga C18 kolonni, millele järgneb kolonni-järgne derivatsioon joodi vesilahusega ja fluorestsentsi määramine. Märkus: mükotoksiinid on äärmiselt mürgised ained. Kasutada tuleb spetsiaalset tõmbekappi. Erilisi ettevaatusabinõusid tuleb rakendada juhul, kui toksiinid on kuivas olekus, sest siis on nad elektrostaatilised ning võivad nendega töötamise piirkonnas dispergeeruda. 3. Reaktiivid 3.1. Kloroform, stabiliseeritud 0,5--1,0% etanooliga (massi järgi), vt märkus 10.2. 3.2. Metanool, KSVK-le vastava puhtusastmega liikuva faasi valmistamiseks. 3.3. Atsetoon. 3.4. Atsetonitriil, KSKV-le vastava puhtusastmega. 3.5. Elueerivad lahustid: valmistada üks päev enne kasutamist või eemaldada ultraheliga lahustitest õhk. 3.5.1. Atsetooni ja vee segu, mahuvahekorras 98/2. 3.5.2. Vee ja metanooli segu mahuvahekorras 80/20. 3.5.3. Vee ja atsetooni segu mahuvahekorras 85/15. 3.6. Liikuv faas KSVK jaoks. Vee, metanooli ja atsetonitriili segu mahuvahekorras 130/70/40. Liikuva faasi lahusti koostis võib vajada täpsustamist olenevalt kasutatavast KSVK kolonnist. 3.7. Küllastunud joodilahus: lisada 2 g joodi 400 ml veele. Segada vähemalt 90 minutit ja filtreerida läbi membraanfiltri. Küllastunud lahust tuleb kaitsta valguse eest, et vältida fotodestruktsiooni. 3.8. Happega pestud Celite 545 või selle analoog. 3.9. Florisili padrun (Waters SEP-PAK) või selle analoog. 3.10. C18 padrun (Waters SEP-PAK) või selle analoog. 3.11. Inertgaas või lämmastik. 3.12. Aflatoksiin B1 standardlahus kloroformis, kontsentratsiooniga 10 µg/ml. Kontrollida lahuse kontsentratsiooni järgmiselt: määrata spektrofotomeetri abil kindlaks lahuse neeldumisspekter vahemikus 330--370 nm. Mõõta maksimaalne neeldumine (A) 363 nm lähedal. Arvutada aflatoksiin B1 kontsentratsioonmikrogrammides lahuse milliliitri kohta järgmise valemi järgi

3.12.1. Aflatoksiin B1 lähtestandardlahus kloroformis Viia kvantitatiivselt 2,5 ml aflatoksiin B1 standardlahust 50-ml mõõtekolbi ja täita märgini kloroformiga. Hoida lahust jahedas (4 °C), pimedas, hästi suletult ning alumiiniumfooliumisse pakitult. 3.13. Aflatoksiin B1 kalibreerimislahused KSVK jaoks Nende lahuste valmistamiseks kasutada happega pestud klaasnõusid (vt punkt 4). 3.13.1. Kalibreerimislahus, 4 ng/ml Lasta lähtestandardlahusega mõõtekolvil soojeneda alumiiniumfooliumis toatemperatuurini (mõned tunnid). Viia 400 µl lähtestandardlahust (200 ng aflatoksiin B1) 50-ml mõõtekolbi ja aurutada lahus inertgaasi voolus kuivaks. Saadud jääk lahustada ligikaudu 20 ml vee ja atsetooni segus, täita kolb märgini vee ja atsetooni seguga ning segada hoolikalt. 3.13.2. Kalibreerimislahus, 3 ng/ml Viia kvantitatiivselt 7,5 ml kalibreerimislahust 10-ml mõõtekolbi, täita märgini vee ja atsetooni seguga ning segada hoolikalt. 3.13.3. Kalibreerimislahus, 2 ng/ml Viia kvantitatiivselt 25 ml kalibreerimislahust 50-ml mõõtekolbi, täita märgini vee ja atsetooni seguga ning segada hoolikalt. Saadud lahusele viidatakse kui etalonile, mida kasutatakse kordussüstimiseks KSVK-s. 3.13.4. Kalibreerimislahus, 1 ng/ml Viia kvantitatiivselt 2,5 ml kalibreerimislahust 10-ml mõõtekolbi, täita märgini vee ja atsetooni seguga ning segada hoolikalt. 3.14. Ampull, mis sisaldab aflatoksiine B1, B2 , G1 ja G2, mille kontsentratsioonid on vastavalt 1; 0,5; 1 ja 0,5 µg/ml kloroformis. 3.14.1. Kromatograafiline kontroll-lahus Viia punktis 3.14 toodud ampulli sisu klaaskorgiga suletavasse katseklaasi või keeratava korgiga pudelisse. Seejärel viia 40 µl lahust klaaskorgiga katseklaasi (happega loputatud). Aurustada kloroform inertgaasi voolus ja lahustada jääk 10 ml vee ja atsetooni segus. 3.15. Reaktiivid kontrollmääramise jaoks (vt punkt 6). 3.15.1. Naatriumkloriidi küllastunud lahus. 3.15.2. Naatriumsulfaat, veevaba, granuleeritud. 4. Vahendid Hoiatus: happes pesemata klaasnõude kasutamine aflatoksiini vesilahuste jaoks võib põhjustada kadusid. Erilist tähelepanu tuleb pöörata uutele klaasnõudele ja ühekordse kasutusega nõudele, nagu automaatproovivõtja pipetid ja Pasteuri pipetid. Seetõttu tuleb aflatoksiini vesilahustega kokkupuutuvaid labori klaasnõusid leotada lahjendatud happes (näit 2M väävelhape) mõned tunnid, seejärel loputada põhjalikult veega, et eemaldada kõik happejäägid (kolm korda, kontrollida lakmuspaberiga). Praktikas tuleb selliselt töödelda ümarkolbe, mõõtekolbe, mõõtesilindreid, kalibreerimislahuste ja lõppekstraktide jaoks tarvitatavaid kolbe ning katseklaase (eriti pipette automaatseks proovivõtmiseks), samuti Pasteuri pipette, kui neid kasutatakse kalibreerimislahuste või ekstraktide ülekandmiseks. 4.1. Veski-segisti. 4.2. Sõel, mille avade läbimõõt on 1,0 mm (ISO R 565). 4.3. Mehhaaniline loksuti. 4.4. Vaakumrootorauruti, mis on varustatud 150--250-ml ümarkolviga. 4.5. Kõrgsurve vedelikkromatograaf, mille süstla silmus on sobiv 250 µl süstimiseks. Jälgida tootja instruktsiooni silmuse osaliseks või täielikuks täitmiseks. 4.6. KSVK analüüsikolonn: 3 µm või 5 µm C 18 täitematerjaliga. 4.7. Mittepulseeriv pump kolonnijärgse joodireaktiivi pumpamiseks. 4.8. Valco muutumatu ruumalaga T-kujuline roostevabast terasest toru (1/16 0,75 mm). 4.9. Spiraalne reaktsioonitoru teflonist või roostevabast terasest. Mõõdud 3000 0,5 mm kuni 5000 0,5 mm on osutunud sobivaks kombineeritult 5 µm või 3 µm KSVK kolonnidega. 4.10. Termostaatiliselt kontrollitav temperatuurile 60 °C reguleeritud veevann, mille temperatuuri on võimalik reguleerida vähemalt 0,1 °C täpsusega. 4.11. Fluorestsentsdetektor, ergastusega lainepikkusel 365 nm ja kiirgusega lainepikkusel 435 nm (Filtriga instrumendi jaoks on kiirguslainepikkus > 400 nm). Võimalik on kindlaks teha vähemalt 0,05 ng aflatoksiin B1. Selleks, et takistada õhumullide eraldumist läbivoolu küvetis, on soovitav mõningane vastusurve (nt piiraja, teflonist või roostevabast terasest toru, mis on ühendatud detektori avaga). 4.12. Ribagraafikute isekirjuti. 4.13. Elektrooniline integraator (vabalt valitav). 4.14. Kurdfilter, paberist, läbimõõduga 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 või selle analoog. 4.15. Membraanfilter, poori läbimõõt 0,45 µm, Millipore HAWP 04700 või selle analoog. 4.16. 500-ml klaaskorgiga kooniline kolb. 4.17. Klaaskolonn (siseläbimõõt ligikaudu 1 cm, pikkus ligikaudu 30 cm), mis on varustatud Luer'i otsikuga. 4.18. Luer'i kloroformikindel kraan (nt Bio-rad 7328017, Analytichem Al 6078, J. T. Baker 4514 või selle analoog). 4.19. Kemikaalikindel süstal, 10 ml Luer'i ühendustoru. 4.20. Süstal, mis sobib 250 µl süstimiseks KSVK-s (vt 4.5). 4.21. Kalibreerimislahuste valmistamiseks 100 µl-ne mikrosüstal (kaalumise teel kontrollida, et täpsus oleks 2% piires). 4.22. Klaaskorkidega 10-ml gradueeritud katseklaasid. 4.23. Spektrofotomeeter, mis sobib spektri UV piirkonnas mõõtmiseks. 4.24. Kontrollmääramise (6) läbiviimiseks vajalikud vahendid 4.24.1. Teflonist kraaniga, happega pestud 100-ml jaotuslehter. 4.24.2. Kuumutusplokk, 40--50 °C. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ettevalmistamine Proov peenestada nii, et see läbib sõela. 5.2. Analüüsitava proovi kogus Kaaluda 50 g ettevalmistatud analüüsitavat proovi koonilisse kolbi. 5.3. Ekstraheerimine Lisada proovile 25 g tseliiti, 250 ml kloroformi ja 25 ml vett. Sulgeda kolb korgiga ja loksutada 30 min mehhaanilisel loksutil. Filtreerida läbi kurdfiltri. Koguda 50 ml filtraati. Vajadusel võtta filtraadi alikvootne osa ja lahjendada kloroformiga 50 ml-ni nii, et aflatoksiin B 1 kontsentratsioon ei oleks suurem kui 4 ng/ml. 5.4. Puhastamise protseduur tuleb läbi viia ilma oluliste katkestusteta. Hoiatus: laborit, kus analüüsid tehakse, tuleb küllaldaselt kaitsta päevavalguse eest. Selleks kasutada: -- UV-kiirgust neelavat alumiiniumfooliumi akendel, kombineeritult mahendatud valgusega (mitte otsene päikesevalgus); -- pimenduskardinaid kombineeritult kunstliku valgusega (aktsepteeritavad on luminestsentslambid). Aflatoksiini sisaldavaid lahuseid peab kaitsma valguse eest niipalju kui võimalik (hoida pimedas, kasutada alumiiniumfooliumi). 5.4.1. Ekstrakti puhastamine Florisil SEP-PAK padrunis 5.4.1.1. Kolonn-padrunmooduli ettevalmistamine Kinnitada kraan Florisil padruni lühema otsa külge (vt joonis 1). Pesta padrun ja eemaldada õhk, võttes süstlaga 10 ml kloroformi ja viies sellest 8 ml kraani kaudu kiiresti läbi padruni. Kinnitada pikem padruni ots klaaskolonni külge ja viia ülejäänud 2 ml kloroformi läbi padruni kolonni. Sulgeda kraan. Eemaldada süstal. 5.4.1.2. Ekstrakti puhastamine Lisada punktis 5.3 kogutud filtraat kolonn-padrunmoodulisse ja lasta sellel välja voolata raskusjõu mõjul. Loputada 5 ml kloroformiga ning seejärel 20 ml metanooliga. Valada eluaadid ära. Operatsioonide ajal jälgida, et kolonn-padrunmoodul ei voolaks kuivaks. Elueerida aflatoksiin B1 40 ml atsetooni ja vee seguga ning koguda kogu eluaat rootorauruti ümarkolbi. Kontsentreerida eluaat rootoraurutis 40--50 °C juures, kuni atsetoon enam ei destilleeru. (NB! Sel hetkel jääb kolbi ligikaudu 0,5 ml vedelikku. Katsed on näidanud, et edasine aurutamine ei ole ohtlik ning 0,5-ml vedeliku jäägi korral ei ole atsetooni kogus märkimisväärne. Atsetoonijäägid võivad viia aflatoksiin B1 kadudeni C18 padrunis). Lisada 1 ml metanooli, keerata kolbi, et lahustada kolvi seintel olevat aflatoksiin B 1, lisada 4 ml vett ja segada. Eraldada padrun ja visata ära. Loputada klaaskolonn veega ja säilitada C18 puhastusetapi jaoks. 5.4.2. Ekstrakti puhastamine C18 SEP-PAK padrunis 5.4.2.1. Kolonn-padrunmooduli ettevalmistamine Kinnitada kraan C18 padruni lühema otsa külge (vt joonis 1). Seada padrun valmis ja eemaldada õhk, viies süstlaga 10 ml metanooli kiiresti kraani kaudu läbi padruni (õhumullid padrunis on nähtavad heledate täpikestena hallikal tagapõhjal). Võtta 10 ml vett ja viia sellest 8 ml läbi padruni (metanoolilt veele lülitamisel vältida õhu juurdepääsu padrunisse). Kinnitada padruni pikem ots klaaskolonni külge ja viia ülejäänud 2 ml vett läbi padruni kolonni. Sulgeda kraan. Eemaldada süstal. 5.4.2.2. Ekstrakti puhastamine Viia kogutud ekstrakt kvantitatiivselt klaaskolonni, loputades kolbi kaks korda 5 ml vee ja metanooli seguga ja lasta välja voolata raskusjõu mõjul. Operatsioonide käigus jälgida, et kolonn-padrunmoodul ei voolaks tühjaks. (Kui padruni lähedal kitsamas osas tekivad õhumullid, peatada vool ja õhumullide eemaldamiseks koputada kergelt klaaskolonni ülemisele otsale, seejärel jätkata). Elueerida 25 ml vee ja metanooli seguga. Valada eluaat ära. Elueerida aflatoksiin B1 50 ml vee ja atsetooni seguga ja koguda kogu eluaat 50-ml mõõtekolbi. Täita kolb veega märgini ja segada: lõpptulemusena saadud proovilahust kasutatakse kromatograafias. Hoiatus: lõppekstrakti filtreerimine enne KSVK-d ei ole tavaliselt vajalik. Kui seda peetakse vajalikuks, ei tohi kasutada tselluloosfiltreid, sest need võivad põhjustada aflatoksiin B 1 kadusid. Aktsepteeritavad on teflonfiltrid. 5.5. Kõrgsurve vedelikkromatograafia (KSVK) (Seadme ülespanemiseks vt joonis 2). Varuda piisavalt aega seadmete töökorda seadmiseks ja stabiliseerimiseks. Märkus 1: liikuva faasi ja kolonnijärgse reaktiivi voolukiirused on orienteeruvad. Need võivad vajada kohandamist sõltuvalt KSVK kolonni omadustest. Märkus 2: aflatoksiin B1 sisaldusele vastav detektori näit sõltub temperatuurist, seetõttu tuleb kõrvalekalle kompenseerida (vt joonis 3). Süstides kindla koguse aflatoksiin B 1 etaloni kindlate vaheaegadega (nt igal kolmandal süstimisel), saab parandada nende etalonide vahelisi aflatoksiin B1 piikide väärtusi, kasutades keskmist näitu eeldusel, et järjestikuste etalonide näitude vahelised erinevused on väga väikesed ( 10%). Seetõttu tuleb süstida ilma katkestusteta. Kui katkestus on vajalik, siis peab viimane süstimine enne ja esimene süstimine pärast katkestamist olema punktis 3.13.3 toodud etalon 23. Kuna kalibreerimisgraafik on lineaarne ja läbib alguspunkti, siis aflatoksiin B1 kogused prooviekstraktis on kindlaks määratud otseselt külgnevate etalonide suhtes.

Joonis 1. Kolonn-padrunmoodul.

Joonis 2. VK süsteemivooludiagramm kolonnijärgse joodi derivatsiooniga.

Joonis 3. Aflatoksiin B1 näidu kõrvalekalde kompenseerimine etaloni (3.13.3) regulaarse süstimise abil. 5.5.1. KSVK pumba paigaldamine Seada KSVK pump nii, et voolukiirus oleks 0,5 või 0,3 ml/min vastavalt 5-µm või 3-µm KSVK kolonnis, kasutades liikuvat faasi. 5.5.2. Kolonnijärgse pumba paigaldamine Seada pump nii, et joodi küllastunud vesilahuse voolukiirus oleks 0,2--0,4 ml/min. Üldjuhis: voolukiirusi ligikaudu 0,4 või 0,2 ml/min on soovitatav kombineerida liikuva faasi vastavate kiirustega 0,5 ja 0,3 ml/min. 5.5.3. Fluorestsentsdetektor Seada fluorestsentsdetektor töökorda: ergastus = 365 nm ja kiirgus = 435 nm (filtriga instrumendi korral > 400 nm). Seada detektori võimendi nii, et 1 ng aflatoksiin B1 korral moodustaks isekirjuti näit ligikaudu 80% kogu skaala ulatusest. 5.5.4. Süstal Süstida kõiki lahuseid 250 µl, jälgides süstla tootja instruktsioone. 5.5.5. Kromatograafilise eraldamise kontroll Süstida kromatograafilist kontroll-lahust. Piikide vahekaugused peavad olema kõrvutiasetsevate piikide kõrguste summast väiksemad kui 5%. 5.5.6. Süsteemi stabiilsuse kontroll Enne iga analüüsi seeriat süstida vastavat etaloni, kuni saavutatakse stabiilsed piigi piirkonnad (NB! Järjestikustel süstimistel saadud piikide näidud aflatoksiin B1 jaoks ei tohi erineda rohkem kui 6%). Asuda viivitamatult lineaarsuse kontrollimisele. 5.5.7. Lineaarsuse kontroll Süstida aflatoksiin B1 punktides 3.13.1--3.13.4 toodud kalibreerimislahuseid. Igal kolmandal süstimisel kasutada etaloni, et parandada näidu kõrvalekallet (NB! Sellele etalonile vastavad piigi näidud ei tohi erineda rohkem kui 10% 90 min jooksul). Kõrvalekalle parandada vastavalt punkti 7 valemile. Kalibreerimisgraafik peab olema lineaarne ja läbima alguspunkti Y-hinnangu kahekordse standardvea piires. Leitud väärtused ei tohi nominaalväärtustest erineda rohkem kui 3%. Kui need tingimused on täidetud, võib kohe jätkata, kui ei, siis tuleb enne jätkamist kindlaks teha ja kõrvaldada probleemi põhjus. 5.5.8. Prooviekstraktide süstimine Süstida puhastatud prooviekstraktid. Pärast iga kahte prooviekstrakti korrata etaloni süstimist järgmises järjestuses: etalon, ekstrakt, ekstrakt, etalon, ekstrakt, ekstrakt, etalon jne. 6. Kontrollmääramine 6.1. Ekstrakti edasine töötlemine Lisada 5 ml naatriumkloriidi lahust saadud lõppekstraktile. Ekstraheerida jaotuslehtris 3 korda, iga kord 2 ml kloroformiga 1 minuti jooksul. Valada kogutud kloroformi ekstraktid läbi ligikaudu 1g naatriumsulfaadi 10-ml katseklaasi. Võib kasutada väikest lehtrit (läbimõõt 4 cm), mille kitsenduses on tükike ligikaudu 1 g naatriumsulfaadiga kaetud puuvillavatti. Pesta naatriumsulfaadi kihti mõne ml kloroformiga ja koguda pesemiseks kasutatud kloroform samasse katseklaasi. Aurutada kloroformi ekstrakt kuivaks samas katseklaasis, kasutades kuumutusplokki, ja siis lahustada uuesti 1 ml kloroformis. 6.2. Ettevalmistused derivatiivseks ja õhukesekihikromatograafiaks vt aflatoksiin B1 ühemõõtmelise õhukesekihikromatograafilise määramise metoodika punkt 5.6.2. 7. Tulemuste arvutamine Arvutada proovis oleva aflatoksiin B1 sisaldus (µg/kg), kasutades valemit

kus: m -- aflatoksiin B1 kogus (ng), mida näitab proovi B 1 piik ja mis arvutatakse järgmiselt

P (proov) -- proovis oleva aflatoksiin B1 piigi pindala; P(st1) -- aflatoksiin B1 piigi pindala, mis on saadud etaloni eelnevast süstimisest; P(st2) -- aflatoksiin B1 piigi pindala, mis on saadud etaloni järgnevast süstimisest; r(st) -- süstitud aflatoksiin B1 kogus (ng) etalonis; Vm -- süstitud prooviekstrakti ruumala (ml); Vekstr. -- prooviekstrakti lõppruumala (ml), arvesse võttes kõiki tehtud lahjendusi; M -- proovi mass (g); Vf -- Florisili padrunisse viidud filtraadi ruumala (ml); Vc -- proovi ekstraheerimiseks kasutatud kloroformi ruumala (ml). Kui analüüsi läbiviimisel järgitakse käesolevat eeskirja, taandub valem järgmiseks: aflatoksiin B1 sisaldus µg/kg = 20 m. 7.1. Tulemuste arvutusi võib teha ka piigi kõrguse mõõtmise teel. 8. Märkused 8.1. Korratavus ja reprodutseeritavus Rahvusvahelisel tasemel korraldatud ühisuurimus(14) segasöötade kohta andis tulemused korratavuse ja reprodutseeritavuse kohta, mis on esitatud tabelis 1. Kasutatavat terminit «korratavus» ® defineeritakse kui suurimat suhet, mis ei ole 95%-lise tõenäosuse juures statistiliselt tõenäoline (võrreldakse sama proovi kaht määramistulemust, mis on tehtud samas laboris samades tingimustes). Terminit «reprodutseeritavus» ® defineeritakse samamoodi, võrreldes kahe labori tulemusi. Vastavalt ISO 3534 -- 1977, 2.35(15) ja komisjoni otsusele 89/610/EEC(16) on r ja R antud tabelis 1 ka variatsiooniteguritena. Tabel 1 r (korratavus) ja R (reprodutseeritavus) väljendatud suhetena ja vastavate variatsiooniteguritena (15 labori andmed). Tase r R CVr(*) CVR (µg / kg) (%) (%) 8&14 1,4 1,7 11 18 (*) CV -- variatsioonitegur 8.2. Kloroformi stabiliseerimine Florisili padruni adsorptsiooniomadused võivad muutuda, kui kasutatakse muid stabilisaatoreid kui etanool. Kontrollida vastavalt punktile 8.3, juhul kui kirjeldatud kloroform pole kättesaadav. 8.3. Täpsus Meetodi rakendamise õigsust kontrollitakse vastavustunnistusega etalonmaterjalide korduvate analüüside abil. Kui etalonmaterjalid pole kättesaadavad, tuleb meetodi teostatavust kontrollida regenereeruvuse määramise teel, kus kasutatakse määratava komponendi teatud kindla sisaldusega proove. Kõrvalekalle tegeliku väärtuse keskmisest, väljendatuna protsentides tegelikust väärtusest, ei tohi väljuda --20% kuni +10% piiridest. 9. Metoodikat puudutav märkus Rasvatustamine Proovid, mis sisaldavad rohkem kui 5% rasvu, tuleb pärast punktis 5.1 näidatud ettevalmistusi rasvatustada petrooleetriga (keemistemperatuuri vahemik 40--60 °C). Niisugustel juhtudel tuleb analüüsi tulemused väljendada rasvatustamata proovi massi kohta. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 38 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Halofuginooni määramise metoodika [DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hüdroksü-2-piperidüül)atsetonüül]kinasoliin-4-(3H)- üks hüdrobromiid] 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika on halofuginooni määramiseks söötades. Määratav miinimum on 1 mg/kg. 2. Põhimõte Pärast kuuma veega töötlemist ekstraheeritakse halofuginoon vaba alusena etüülatsetaadi lahusesse ja eraldatakse seejärel hüdrokloriidina happe vesilahusesse. Ekstrakt puhastatakse ioonvahetuskromatograafia abil. Halofuginooni sisaldus määratakse kõrgsurve vedelikkromatograafia (KSVK) abil, kasutades UV-detektorit. 3. Reaktiivid 3.1. Atsetonitriil, puhas KSVK jaoks. 3.2. Amberlite XAD-2 vaik. 3.3. Ammoniumatsetaat. 3.4. Etüülatsetaat. 3.5. Jää-äädikhape. 3.6. Halofuginooni standardaine: (DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hüdroksü-2-piperidüül)atsetonüül]-kinasoliin-4-(3H)-üks hüdrobromiid, E 764). 3.6.1. Halofuginooni lähtestandardlahus, 100 µg/ml Kaaluda 0,1 mg täpsusega 50 mg halofuginooni, viia 500-ml mõõtekolbi, lahustada ammooniumatsetaadi puhverlahuses ja täita kolb puhverlahusega märgini ning segada. Lahus säilib 5 °C juures muutumatuna kolm nädalat, kui seda hoitakse pimedas. 3.6.2. Kalibreerimislahused Viia 100-ml mõõtekolbidesse vastavalt 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ja 6,0 ml lähtestandardlahust, täita kolvid liikuva faasiga märgini ja segada. Nende lahuste halofuginooni kontsentratsioonid on vastavalt 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ja 6,0 µg/ml. Need lahused tuleb enne kasutamist värskelt valmistada. 3.7. Vesinikkloriidhape (tihedus 20 °C juures ligikaudu 1,16 g/ml). 3.8. Metanool. 3.9. Hõbenitraat. 3.10. Naatriumaskorbaat. 3.11. Naatriumkarbonaat. 3.12. Naatriumkloriid. 3.13. EDTA (dinaatriumetüleendiaminotetraatsetaat). 3.14. Vesi, puhas KSVK jaoks. 3.15. Naatriumkarbonaadi lahus, 10 g/100 ml. 3.16. Naatriumkloriidiga küllastatud naatriumkarbonaadi lahus, 5 g/100 ml Lahustada 50 g naatriumkarbonaati vees, lahjendada 1 liitrini ja lisada naatriumkloriidi, kuni lahus on küllastunud. 3.17. Vesinikkloriidhape, ligikaudu 0,1M Lahjendada 10 ml HCl veega 1 liitrini. 3.18. Ammooniumatsetaadi puhverlahus, ligikaudu 0,25M Lahustada 19,3 g ammooniumatsetaati ja 30 ml jää-äädikhapet vees ja lahjendada 1 liitrini. 3.19. Amberlite XAD-2 vaigu ettevalmistamine Pesta küllaldane kogus Amberlite XAD-2 veega kuni kloriidioonid on eemaldatud. Kloriidioonide eemaldamist kontrollida filtraadis hõbenitraadi lahusega. Pesta vaiku 50 ml metanooliga, valada metanool ära ja hoida vaiku värske metanooli all. 3.20. Hõbenitraadi lahus, ligikaudu 0,1M Lahustada 0,17 g hõbenitraati 10 ml vees. 3.21. KSVK liikuv faas Segada 500 ml atsetonitriili 300 ml ammooniumatsetaadi puhverlahusega ja 1200 ml veega. Reguleerida pH väärtuseni 4,3, kasutades äädikhapet. Filtreerida läbi 0,22-µm filtri ja degaseerida lahus (nt 10 minutit ultraheliga). Lahus säilib muutumatuna ühe kuu, kui seda hoitakse suletud nõus pimedas. 4. Vahendid 4.1. Ultrahelivann. 4.2. Rootorauruti. 4.3. Tsentrifuug. 4.4. KSVK-seadmed erinevatel lainepikkustel registreeriva ultraviolettdetektoriga või dioodaheldetektoriga. 4.4.1. Vedelikkromatograafi kolonn, 300 mm 4 mm, C 18, 10 µm täidis või sellega analoogne kolonn. 4.5. Klaaskolonn (300 mm 10 mm) poorse filterpõhja ja kraaniga. 4.6. Klaaskiudfiltrid, läbimõõt 150 mm. 4.7. Membraanfiltrid, 0,45 µm. 4.8. Membraanfiltrid, 0,22 µm. 5. Analüüsi käik Halofuginoon on vaba alusena leeliselistes ja etüülatsetaadi lahustes ebapüsiv, mistõttu ei või halofuginooni jääda etüülatsetaadi lahusesse üle 30 minuti. 5.1. Üldised märkused 5.1.1. Analüüsida tühiproov ja teha kindlaks, et selles ei ole ei halofuginooni ega segavaid aineid. 5.1.2. Regenereeruvuse kindlakstegemiseks teha kontrollkatse tühiprooviga, millele on lisatud selline kogus halofuginooni nagu seda tavaliselt sisaldab proov. Selleks lisada 300 µl lähtestandardlahust 10 g tühiproovile, segada ja oodata 10 minutit enne kui ekstraheerida. 5.2. Ekstraheerimine Kaaluda 0,1 g täpsusega 10 g ettevalmistatud proovi, viia 200-ml tsentrifuugiklaasi, lisada 0,5 g naatriumaskorbaati, 0,5 g EDTA ja 20 ml vett ning segada. Asetada klaas 5 minutiks veevanni (80 °C). Pärast jahutamist toatemperatuurini lisada 20 ml naatriumkarbonaadi lahust ja segada. Lisada kohe 100 ml etüülatsetaati ja loksutada käes tugevasti 15 sekundit. Seejärel asetada klaas kolmeks minutiks ultrahelivanni ja panna stopper tööle. Tsentrifuugida kaks minutit ja filtreerida etüülatsetaadifaas läbi klaaskiudfiltri 500-ml jaotuslehtrisse. Korrata proovi ekstraheerimist teise portsjoni 100 ml etüülatsetaadiga. Pesta kogutud ekstrakte üks minut 50 ml naatriumkloriidiga küllastatud naatriumkarbonaadi lahusega ning valada veekiht ära. Ekstraheerida orgaanilist kihti 1 minut 50 ml vesinikkloriidhappega. Viia alumine happekiht 250-ml jaotuslehtrisse. Ekstraheerida orgaanilist kihti uuesti 1,5 minutit uue koguse 50 ml vesinikkloriidhappega ja lisada see esimesele ekstraktile. Pesta kogutud happeekstrakte, loksutades ligikaudu 10 sekundit 10 ml etüülatsetaadiga. Kanda happeekstrakt kvantitatiivselt 250-ml ümarkolbi ja valada orgaaniline faas ära. Aurutada kogu ülejäänud etüülatsetaat happelahusest, kasutades rootoraurutit. Veevanni temperatuur ei tohi ületada 40 °C. Ligikaudu 25 mbar vaakumi abil kõrvaldatakse kõik etüülatsetaadi jäägid 5 minuti jooksul 38 °C juures. 5.3. Puhastamine 5.3.1. Amberliidikolonni ettevalmistamine Iga proovi ekstrakti jaoks valmistatakse ette Amberlite XAD-2 kolonn. Viia 10 g ettevalmistatud Amberlite XAD-2 klaaskolonni, milles on metanool. Asetada vaigule väike tropp klaasvilla. Lasta metanool kolonnist läbi voolata ja pesta vaiku 100 ml veega, peatades voolu, kui vedelik jõuab vaiguni. Lasta kolonnil tasakaalustuda 10 minutit enne kasutamist. Mitte lasta kolonni kuivaks voolata. 5.3.2. Proovi puhastamine Viia ekstrakt kvantitatiivselt ettevalmistatud amberliidikolonni ja elueerida, valades eluaadi ära. Elueerimiskiirus ei tohi ületada 20 ml/min. Loputada ümarkolbi 20 ml vesinikkloriidhappega ja kasutada seda vaigukolonni pesemiseks. Puhuda suruõhu abil järelejäänud happelahus kolonnist välja. Valada pesuveed ära. Lisada 100 ml metanooli kolonni ja lasta 5--10 ml elueeruda, kogudes eluaadi 250-ml ümarkolbi. Lasta järelejäänud metanoolil 10 minutit vaiguga tasakaalustuda ja jätkata elueerimist kiirusega, mis ei ületa 20 ml/min, kogudes eluaadi samasse ümarkolbi. Aurutada metanool rootoraurutis, veevanni temperatuur ei tohi ületada 40 °C. Viia jääk kvantitatiivselt 10-ml mõõtekolbi, kasutades liikuvat faasi. Täita kolb liikuva faasiga märgini ja segada. Lahuse alikvootne osa filtreerida läbi membraanfiltri. Hoida lahus KSVK määramiseks. 5.4. KSVK määramine 5.4.1. Parameetrid Käesolevas punktis on toodud orienteeruvad määramise tingimused (võib kasutada ka teisi tingimusi, kui nad annavad samasuguseid tulemusi): -- vedelikkromatograafi kolonn; -- KSVK liikuv faas; -- voolu kiirus 1,5--2 ml/min; -- detekteerimise lainepikkus 243 nm; -- süstitav ruumala 40--100 µl. Kontrollida kromatograafilise süsteemi stabiilsust, süstides 3,0 µg/ml sisaldavat kalibreerimislahust mitu korda, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused (või pindalad) ja retentsiooniajad. 5.4.2. Kalibreerimisgraafik Süstida igat kalibreerimislahust mitu korda ja mõõta piigi kõrgused (pindalad) iga kontsentratsiooni puhul. Koostada kalibreerimisgraafik, mis näitab piigi kõrguse või pindala sõltuvust halofuginooni sisaldusest (ordinaatteljel keskmised piigi kõrgused või pindalad, abtsissteljel halofuginooni kontsentratsioonid µg/ml). 5.4.3. Proovi lahus Süstida prooviekstrakti mitu korda, kasutades sama ruumala, mis kalibreerimislahuste puhul ja määrata halofuginooni piikide keskmine kõrgus (või pindala). 6. Tulemuste arvutamine Määrata proovilahuse kontsentratsioon µg/ml proovilahuse halofuginooni piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi vastavalt kalibreerimisgraafikule. Halofuginooni sisaldus w (mg/kg) proovis antakse järgmise valemiga

kus: C -- halofuginooni kontsentratsioon proovilahuses µg/ml, m -- proovi mass grammides. 7. Tulemuste kehtivuse kontroll 7.1. Identsus Analüüsiga määratava halofuginooni identsust saab kinnitada kokromatograafiaga või kasutades dioodaheldetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6,0 µg/ml sisaldava kalibreerimislahuse spektreid. 7.1.1. Kokromatograafia Prooviekstrakti halofuginooni kontsentratsiooni suurendatakse, lisades kalibreerimislahust sobivas koguses. Lisatud halofuginoonikogus peab olema lähedane prooviekstrakti analüüsil leitud halofuginooni sisaldusele. Peab kasvama ainult halofuginooni piigi kõrgus, arvestades nii lisatud kogust kui ekstrakti lahjendust. Piigi poollaius ei tohi muutuda rohkem kui ± 10% võrreldes selle esialgse väärtusega. 7.1.2. Dioodaheldetektori kasutamine Tulemusi hinnatakse vastavalt järgmistele kriteeriumidele: 7.1.2.1. Proovi ja standardi kromatogrammi piigi tipus registreeritud neeldumisspektrite maksimumide lainepikkused peavad langema kokku detekteerimissüsteemi lahutusvõimega määratud piirides. Dioodaheldetektori puhul on see tavaliselt ± 2 nm piirides. 7.1.2.2. 225 ja 300 nm vahel ei tohi kromatogrammi piigi tipus registreeritud proovi ja standardi spektrid teineteisest erineda nende spektriosade puhul, mis jäävad 10--100% suhtelise neeldumise piirkonda. Kriteerium on täidetud, kui samad maksimumid on olemas ja kui üheski vaadeldud punktis spektritevaheline hälve ei ületa 15% standardi neeldumisest. 7.1.2.3. 225 ja 300 nm vahel ei tohi prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduvas osas, tipus ja allapoole suunduvas osas registreeritud spektrid erineda üksteisest nende spektriosade puhul, mis jäävad 10--100% suhtelise neeldumise piirkonda. See kriteerium on täidetud, kui samad maksimumid on olemas ja kui üheski vaadeldud punktis spektritevaheline hälve ei ületa 15% tipu neeldumisspektrist. Kui üks nendest kriteeriumidest ei ole täidetud, ei ole ka otsitava halofuginooni olemasolu tõestatud. 8. Korratavus Erinevus kahe paralleelse sama prooviga läbiviidud määramise tulemuste vahel ei tohi ületada 0,5 mg/kg, kui halofuginoonisisaldused on kuni 3 mg/kg. 9. Regenereeruvus Tühiproovile lisatud halofuginooni regenereeruvus peab olema vähemalt 80%. 10. Ühisuurimise tulemused Korraldati ühisuurimus, mille käigus kaheksas laboratooriumis analüüsiti kolme proovi. Tulemused Proov A (pimekatse) Proov B (peenestatud) Proov C (graanulid) algul kahe kuu pärast algul kahe kuu pärast keskmine (mg/kg) ei leitud 2,80 2,42 2,89 2,45 SR -- 0,45 0,43 0,40 0,42 CVR -- 16 18 14 17 reg. 6 74 88 75 SR -- reprodutseeritavuse standardhälve; CVR -- variatsioonitegur (%); reg. -- regenereeruvus (%). Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 39 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Robenidiini määramise metoodika [1,3-bis[(4-klorobensülideen) amino]guanidiinhüdrokloriid] 1. Eesmärk ja ulatus Käesolev metoodika on robenidiini määramiseks söötades, määratav miinimum on 5 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse hapestatud metanooliga. Ekstrakt kuivatatakse ja selle alikvootne osa puhastatakse alumiiniumoksiidi kolonnis. Robenidiin elueeritakse kolonnist metanooliga, kontsentreeritakse ja viiakse liikuva faasiga sobiva mahuni. Robenidiinisisaldus määratakse kõrgsurve vedelikkromatograafia (KSVK) abil, kasutades UV detektorit. 3. Reaktiivid 3.1. Metanool 3.2. Hapestatud metanool Viia 4,0 ml vesinikkloriidhapet (tihedus 1,18 g/ml) 500-ml mõõtekolbi, täita kolb metanooliga (3.1) märgini ja segada. Lahus tuleb enne kasutamist värskelt valmistada. 3.3. Atsetonitriil, puhas KSVK jaoks. 3.4. Molekulaarsõel Tüüp 3A, 8--12 mesh'i(17) osakest (1,6--2,5-mm osakesed, kristalne alumosilikaat, pooride läbimõõt 0,3 mm). 3.5. Alumiiniumoksiid: happelise aktiivsuse aste I kolonnkromatograafia jaoks Viia 100 g alumiiniumoksiidi sobivasse anumasse ja lisada 2,0 ml vett. Sulgeda ja loksutada ligikaudu 20 minutit. Hoida hästisuletud anumas. 3.6. Kaaliumdivesinikfosfaadi lahus, C = 0,025 mol/l Lahustada 3,40 g kaaliumdivesinikfosfaati vees (puhas KSVK jaoks) 1000-ml mõõtekolvis, täita kolb veega märgini ja segada. 3.7. Dinaatriumvesinikfosfaadi lahus, C = 0,025 mol/l Lahustada 3,55 g veevaba dinaatriumvesinikfosfaati (või 4,45 g dihüdraati või 8,95 g dodekahüdraati) vees (puhas KSVK jaoks) 1000-ml mõõtekolvis, täita kolb veega märgini ja segada. 3.8. KSVK liikuv faas Segada järgmised reaktiivid: -- 650 ml atsetonitriili; -- 250 ml vett (puhas KSVK jaoks); -- 50 ml kaaliumdivesinikfosfaadi lahust; -- 50 ml dinaatriumvesinikfosfaadi lahust. Filtreerida läbi 0,22-µm filtri ja degaseerida lahus (nt ultrahelivannis 10 minuti jooksul). 3.9. Standardaine Puhas robenidiin: 1,3-bis[(4-klorobensülideen)amino]guanidiinhüdrokloriid, E 750. 3.9.1. Robenidiini lähtestandardlahus: 300 µg/ml Kaaluda 0,1 mg täpsusega 30 mg robenidiini standardainet. Lahustada hapestatud metanoolis 100-ml mõõtekolvis, täita kolb sama lahustiga märgini ja segada. Mähkida pudel alumiiniumfooliumi ning hoida pimedas kohas. 3.9.2. Robenidiini keskmine standardlahus: 12 µg/ml Viia 10,0 ml lähtestandardlahust 250-ml mõõtekolbi, täita kolb liikuva faasiga märgini ja segada. Mähkida pudel alumiiniumfooliumi ja hoida pimedas kohas. 3.9.3. Kalibreerimislahused Viia 50-ml mõõtekolbidesse vastavalt 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 ja 25,0 ml keskmist standardlahust. Täita kolvid liikuva faasiga märgini ja segada. Lahuste robenidiini sisaldused on vastavalt 1,2; 2,4; 3,6; 4,8 ja 6,0 µg/ml. Lahused tuleb enne kasutamist värskelt valmistada. 4. Vahendid 4.1. Klaaskolonn Valmistatud kollasest klaasist, varustatud kraaniga, sisemine läbimõõt 10--15 mm, pikkus 250 mm, maht ligikaudu 150 ml. 4.2. Mehhaaniline loksuti. 4.3. Rootorauruti. 4.4. KSVK-seadmed erinevatel lainepikkustel registreeriva ultraviolettdetektoriga või dioodaheldetektoriga, mis töötab vahemikus 250--400 nm. 4.4.1. Vedelikkromatograafia kolonn: 300 mm 4 mm, C18, 10 µm täidis või selle analoog. 4.5. Klaaskiudfilterpaber (Whatman GF/A või selle analoog). 4.6. Membraanfiltrid, 0,22 µm. 4.7. Membraanfiltrid, 0.45 µm. 5. Analüüsi käik Robenidiin on valgustundlik. Kõikide operatsioonide puhul tuleb kasutada kollasest klaasist laboratooriuminõusid. 5.1. Üldised märkused 5.1.1. Analüüsida tühiproovi, et selles ei oleks robenidiini ega teisi segavaid aineid. 5.1.2. Regenereeruvuse kindlakstegemiseks teha kontrollkatse tühiprooviga, millele on lisatud selline kogus robenidiini, nagu seda tavaliselt sisaldab proov. Et lisada robenidiini tasemel 60 mg/kg, viia 3,0 ml lähtestandardlahust 250-ml koonilisse kolbi. Aurutada lahust lämmastiku voolus kuni ligikaudu 0,5 ml-ni. Lisada 15 g tühiproovi, segada ja oodata 10 minutit enne ekstraheerimist. 5.2. Ekstraheerimine Kaaluda 0,01 g täpsusega ligikaudu 15 g ettevalmistatud proovi. Proov panna 250-ml koonilisse kolbi ja lisada 100,0 ml hapestatud metanooli, sulgeda kolb ja loksutada tunni aja jooksul loksutil. Filtreerida lahus läbi klaaskiudfilterpaberi ja koguda kogu filtraat 150-ml koonilisse kolbi. Lisada 7,5 g molekulaarsõela, sulgeda ja loksutada viis minutit. Filtreerida kohe läbi klaaskiudfilterpaberi. Hoida lahust puhastamisetapi jaoks. 5.3. Puhastamine 5.3.1. Alumiiniumoksiidi kolonni ettevalmistamine Paigutada väike klaasvatist tropp klaaskolonni põhja ja suruda kokku, kasutades klaaspulka. Kaaluda 11,0 g ettevalmistatud alumiiniumoksiidi ja viia kolonni. Hoolitseda tuleks selle eest, et kokkupuutumine õhuga oleks selles etapis minimaalne. Koputada kergelt vastu kolonni alumist osa, et alumiiniumoksiid paigutuks ühtlaselt. 5.3.2. Proovi puhastamine Pipeteerida kolonni 5,0 ml etapis ettevalmistatud prooviekstrakti. Asetada pipeti ots tihedalt kolonni seina vastu ja lasta lahusel absorbeeruda alumiiniumoksiidi. Elueerida robenidiin kolonnist, kasutades 100 ml metanooli voolu kiirusel 2--3 ml/min ja koguda eluaat 250-ml ümarkolbi. Aurutada metanoolilahus kuivaks vähendatud rõhul temperatuuril 40 °C, kasutades rootoraurutit. Lahustada jääk uuesti 3--4 ml liikuvas faasis ja viia kvantitatiivselt 10-ml mõõtekolbi. Loputada kolbi mitme 1- kuni 2-ml liikuva faasi portsjoniga ning viia need loputusvedelikud mõõtekolbi. Viia kolb sama lahustiga märgini ja segada. Filtreerida lahuse alikvootne osa läbi 0,45-µm membraanfiltri. Hoida seda lahust KSVK määramise jaoks. 5.4. KSVK määramine 5.4.1. Parameetrid -- vedelikkromatograafia kolonn; -- KSVK liikuv faas; -- voolu kiirus 1,5--2 ml/min; -- detekteerimine lainepikkusel 317 nm; -- süstitav maht 20--50 µl. Kontrollida kromatograafilise süsteemi stabiilsust, süstides 3,6 µg/ml sisaldavat kalibreerimislahust mitu korda, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused ja retentsiooniajad. 5.4.2. Kalibreerimisgraafik Süstida iga kalibreerimislahust mitu korda ja mõõta iga kontsentratsiooni puhul piigi kõrgused (pindalad). Koostada kalibreerimisgraafik, mis näitab piigi kõrguse (pindala) sõltuvust robenidiini sisaldusest (ordinaatteljel keskmine piigi kõrgus või pindala, abstsissteljel robenidiini kontsentratsioon µg/ml). 5.4.3. Proovilahus Süstida prooviekstrakti mitu korda, kasutades sama mahtu nagu kalibreerimislahuste jaoks, ja määrata robenidiini piikide keskmine kõrgus (pindala). 6. Tulemuste arvutamine Proovilahuse robenidiini piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi määrata proovilahuse kontsentratsioon µg/ml, kasutades kalibreerimisgraafikut. Robenidiini sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemiga

kus: C -- robenidiini kontsentratsioon proovilahuses µg/ml, m -- proovi mass grammides. 7. Tulemuste kehtivuse kontroll 7.1. Identsus Analüüsiga määratava robenidiini identsust saab kinnitada kokromatograafiaga või kasutades dioodaheldetektorit, mille juures võrreldakse prooviekstrakti ja 6 µg/ml sisaldava kalibreerimislahuse spektreid. 7.1.1. Kokromatograafia Prooviekstrakti robenidiini kontsentratsiooni suurendatakse, lisades kalibreerimislahust sobivas koguses. Lisatud robenidiini kogus peab olema lähedane prooviekstrakti analüüsil leitud robenidiini kogusele. Peab kasvama ainult robenidiini piigi kõrgus, võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust. Piigi poollaius ei või erineda selle esialgsest väärtusest rohkem kui 10%. 7.1.2. Dioodaheldetektori kasutamine Tulemusi hinnatakse kooskõlas järgmiste kriteeriumidega: 7.1.2.1. analüüsitava proovi ja standardi neeldumisspektrite maksimumide lainepikkused, mis on registreeritud kromatogrammi piigi tipus, peavad langema kokku detekteerimissüsteemi lahutusvõime poolt määratud piires. Dioodaheldetektori puhul on see tavaliselt ligikaudu 2 nm; 7.1.2.2. 250 ja 400 nm vahel ei tohi kromatogrammi piigi tipus registreeritud proovi ja standardi spektrid teineteisest erineda nende spektriosade puhul, mis jäävad 10--100% suhtelise neeldumise piirkonda. See kriteerium on täidetud, kui samad maksimumid on olemas ja kui üheski vaadeldud punktis spektritevaheline hälve ei ületa 15% standardi neeldumisest; 7.1.2.3. 250 ja 400 nm vahel ei tohi prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduvas osas, tipus ja allapoole suunduvas osas registreeritud spektrid erineda üksteisest nende spektriosade puhul, mis jäävad 10--100% suhtelise neeldumise piirkonda. See kriteerium on täidetud, kui samad maksimumid on olemas ja kui üheski vaadeldud punktis spektritevaheline hälve ei ületa 15% tipu neeldumisspektrist. Kui üks nendest kriteeriumidest ei ole täidetud, ei ole ka analüüsiga määratava robenidiini olemasolu kinnitatud. 8. Korratavus Sama proovi kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10% suuremast tulemusest robenidiinisisalduste puhul, mis on suuremad kui 15 mg/kg. 9. Regenereeruvus Tühiproovile lisatud robenidiini regenereeruvus peaks olema vähemalt 85%. 10. Ühisuurimuse tulemused 12 laboratooriumi analüüsisid nelja lindude ja küülikute sööda proovi jahu või graanulite kujul. Iga proovi puhul tehti kaks paralleelanalüüsi. Tulemused on antud järgnevas tabelis: Linnud Küülikud Jahu Graanul Jahu Graanul Keskmine (mg/kg) 27,00 27,99 43,6 40,1 Sr (mg/kg) 1,46 1,26 1,44 1,66 CVr (%) 5,4 4,5 3,3 4,1 Sr (mg/kg) 4,36 3,36 4,61 3,91 CVR (%) 16,1 12,0 10,6 9,7 Regenereeruvus (%) 90,0 93,3 87,2 80,2 Sr -- korratavuse standardhälve; CVr -- korratavuse variatsioonitegur; SR -- reprodutseeritavuse standardhälve; CVR -- reprodutseeritavuse variatsioonitegur. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 40 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Metüülbensokaadi määramise metoodika (7-bensüüloksü-6-butüül-3-metoksükarbonüül-4-kinoloon) 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika on metüülbensokaadi määramiseks söötades. Määratav miinimum on 1 mg/kg. 2. Põhimõte Metüülbensokaat ekstraheeritakse proovist metaansulfoonhappe metanooli lahusega. Ekstrakt puhastatakse diklorometaaniga ioonvahetuskromatograafiliselt ja seejärel uuesti diklorometaaniga. Metüülbensokaadi sisaldus määratakse kõrgsurve vedelikkromatograafia (KSVK) abil, kasutades UV detektorit. 3. Reaktiivid 3.1. Diklorometaan. 3.2. Metanool, puhas KSVK jaoks. 3.3. KSVK-liikuv faas: metanooli ja vee (puhas KSVK jaoks) segu mahuvahekorras 75/25 Filtreerida läbi 0,22-µm filtri ja degaseerida lahus (nt ultrahelivannis 10 minuti jooksul). 3.4. Metaansulfoonhappe lahus, 2% Lahjendada 20,0 ml metaansulfoonhapet metanooliga 1000 ml-ni. 3.5. Vesinikkloriidhappe lahus, 10% Lahjendada 100 ml vesinikkloriidhapet (tihedus 1,18 g/ml) veega 1000 ml-ni. 3.6. Kationiit Amberlite CG-120 (Na-vormis), 100--200 mesh'i Kationiit töödeldakse enne kasutamist: valmistada 100 g kationiidi suspensioon 500 ml vesinikkloriidhappe lahuses ja kuumutada kuumal plaadil keemiseni, pidevalt segades. Lasta jahtuda ja dekanteerida hape. Filtreerida läbi filterpaberi, kasutades vaakumit. Pesta kationiiti kaks korda 500-ml veeportsjonitega ja seejärel 250 ml metanooliga. Loputada kationiiti veel ühe 250-ml metanooliportsjoniga ja kuivatada temast õhku läbi imedes (kasutades veejoa vaakumpumpa). Hoida kuivatatud kationiit korgiga suletud purgis. 3.7. Standardaine: puhas metüülbensokaat (7-bensüüloksü-6-butüül-3-metoksükarbonüül-4-kinoloon). 3.7.1. Metüülbensokaadi lähtestandardlahus: 500 µg/ml Kaaluda 0,1 mg täpsusega 50 mg standardainet, lahustada metaansulfoonhappe lahuses 100-ml mõõtekolvis, täita kolb märgini ja segada. 3.7.2. Metüülbensokaadi keskmine standardlahus: 50 µg/ml Viia 5,0 ml metüülbensokaadi lähtestandardlahust 50-ml mõõtekolbi, täita kolb metanooliga märgini ja sega. 3.7.3. Kalibreerimislahused Viia vastavalt 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ja 5,0 ml metüülbensokaadi keskmist standardlahust 25-ml mõõtekolbidesse. Täita kolvid liikuva faasiga märgini ja segada. Lahuste metüülbensokaadi kontsentratsioonid on vastavalt 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 ja 10,0 µg/ml. Lahused tuleb enne kasutamist värskelt valmistada. 4. Vahendid 4.1. Loksuti. 4.2. Rootorauruti. 4.3. Klaaskolonn (250 mm 15 mm), mis on varustatud kraaniga ja mille maht on ligikaudu 200 ml. 4.4. KSVK-seadmed erinevatel lainepikkustel registreeriva ultraviolettdetektori või dioodahel-detektoriga. 4.4.1. Vedelikkromatograafia kolonn: 300 mm 4 mm, C-18, 10 µm täidis või selle analoog. 4.5. Membraanfiltrid, 0,22 µm. 4.6. Membraanfiltrid, 0,45 µm. 5. Analüüsi käik 5.1. Üldised märkused 5.1.1. Analüüsida tühiproovi ning kontrollida, et selles ei ole metüülbensokaati ega teisi segavaid aineid. 5.1.2. Määrata regenereeruvus, analüüsides tühiproovi, millele on lisatud selline kogus metüülbensokaati, mis on sarnane proovis olevaga. Lisada metüülbensokaati tasemel 15 mg/kg ning 600 µl lähtestandardlahust 20 g tühiproovile, segada ja oodata 10 minutit enne ekstraheerimise juurde asumist. 5.2. Ekstraheerimine Kaaluda 0,01 g täpsusega ligikaudu 20 g ettevalmistatud proovi ja viia 250-ml koonilisse kolbi. Lisada 100,0 ml metaansulfoonhappe lahust ja loksutada mehhaaniliselt 30 minutit. Filtreerida lahus läbi filterpaberi ja hoida filtraat alles vedelik-vedelik ekstraktsiooni jaoks. 5.3. Puhastamine vedelik-vedelik ekstraktsiooniga Viia 500-ml jaotuslehtrisse, mis sisaldab 100 ml vesinikkloriidhappe lahust ning 25,0 ml punktis 5.2 saadud filtraati. Lisada lehtrisse 100 ml diklorometaani ja loksutada üks minut. Lasta kihtidel eralduda ning viia alumine (diklorometaani) kiht 500-ml ümarkolbi. Korrata veefaasi ekstraheerimist veel kahe 40-ml portsjoni diklorometaaniga ja ühendada need esimese ekstraktiga ümarkolvis. Aurutada diklorometaani ekstrakt rootoraurutis kuivaks temperatuuril 40 °C, kasutades vaakumit. Lahustada jääk 20--25 ml metanoolis, sulgeda kolb ja hoida kogu ekstrakt ioonvahetuskromatograafia jaoks. 5.4. Ioonvahetuskromatograafia 5.4.1. Katioonvahetuskolonni ettevalmistamine Asetada klaasvatitropp klaaskolonni põhja. Valmistada 5,0 g töödeldud kationiidi suspensioon 50 ml-s vesinikkloriidhappes, valada klaaskolonni ja lasta settida. Lasta liigsel happel läbi kolonni voolata, kuni happe nivoo on jõudnud kationiidi ülemise pinnani. Pesta kolonni veega, kuni väljavoolav pesuvesi on lakmuse suhtes neutraalne. Viia 50 ml metanooli kolonni ja lasta läbi kolonni voolata, kuni metanooli nivoo on jõudnud kationiidi pinnani. 5.4.2. Kolonnkromatograafia Viia pipeti abil ettevaatlikult punktis 5.3 saadud ekstrakt kolonni. Loputada ümarkolbi kahe portsjoni 5--10 ml metanooliga ja viia need pesuvedelikud kolonni. Lasta ekstraktil läbi kolonni voolata, kuni ekstrakti nivoo on jõudnud kationiidi pinnani ja pesta kolonni 50 ml metanooliga, kindlustades, et voolu kiirus ei ületa 5 ml minutis. Kallata väljavoolanud vedelik ära. Elueerida metüülbensokaat kolonnist, kasutades 150 ml metaansulfoonhapet ja koguda kolonni eluaat 250-ml koonilisse kolbi. 5.5. Puhastamine vedelik-vedelik ekstraktsiooniga Viige punktis 5.4.2 saadud eluaat 1-liitrilisse jaotuslehtrisse. Loputada koonilist kolbi 5--10 ml metanooliga ja lisada loputusvedelikud samasse jaotuslehtrisse. Lisada 300 ml vesinikkloriidhappe lahust ja 130 ml diklorometaani. Loksutada 1 minut ja lasta faasidel eralduda. Viia alumine (diklorometaani) kiht 500-ml ümarkolbi. Korrata veefaasi ekstraheerimist veel kahe 70-ml portsjoni diklorometaaniga ja ühendada need ekstraktid esimesega ümarkolvis. Aurutada diklorometaani ekstrakt rootoraurutis kuivaks temperatuuril 40 °C, kasutades vaakumit. Lahustada jääk kolvis ligikaudu 5 ml metanooliga ja viia lahus kvantitatiivselt 10-ml mõõtekolbi. Loputada ümarkolb veel kahe portsjoni 1--2 ml metanooliga ja viia need mõõtekolbi. Täita kolb metanooliga märgini ja segada. Filtreerida lahuse alikvootne osa läbi membraanfiltri. Hoida lahus KSVK-määramise jaoks. 5.6. KSVK-määramine 5.6.1. Parameetrid: -- vedelikkromatograafia kolonn; -- KSVK liikuv faas: metanooli-vee segu; -- voolu kiirus 1--1,5 ml/min; -- detekteerimine lainepikkusel 265 nm; -- süstitav maht 20--50 µl. Kontrollida kromatograafilise süsteemi stabiilsust, süstides 4 µg/ml sisaldavat kalibreerimislahust mitu korda, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused ja retentsiooniajad. 5.6.2. Kalibreerimisgraafik Süstida iga kalibreerimislahust mitu korda ja mõõta iga kontsentratsiooni puhul piigi kõrgused (pindalad). Koostada kalibreerimisgraafik, mis näitab piigi kõrguse (pindala) sõltuvust metüülbensokaadi sisaldusest (ordinaatteljel keskmine piigi kõrgus või pindala, abstsissteljel metüülbensokaadi kontsentratsioon µg/ml). 5.6.3. Proovilahus Süstida prooviekstrakti mitu korda, kasutades sama mahtu nagu kalibreerimislahuste puhul ning määrata metüülbensokaadi piigi keskmine kõrgus (pindala). 6. Tulemuste arvutamine Määrata proovilahuse kontsentratsioon µg/ml proovilahuse metüülbensokaadi piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi, kasutades kalibreerimisgraafikut. Proovi metüülbensokaadi sisaldus w (mg/kg) arvutatakse järgmise valemiga

kus: C -- proovilahuse metüülbensokaadi kontsentratsioon µg/ml, m -- proovi mass grammides. 7. Tulemuste kehtivuse kontroll 7.1. Identsus Analüüsiga määratava metüülbensokaadi identsust saab kinnitada kokromatograafiaga või kasutades dioodaheldetektorit, mille juures võrreldakse prooviekstrakti ja 10 µg/ml sisaldava kalibreerimislahuse spektreid. 7.1.1. Kokromatograafia Prooviekstrakti metüülbensokaadi kontsentratsiooni suurendatakse, lisades keskmist standardlahust sobivas koguses. Lisatud metüülbensokaadi kogus peab olema lähedane prooviekstrakti analüüsil leitud metüülbensokaadi kogusele. Peab kasvama ainult metüülbensokaadi piigi kõrgus, võttes arvesse nii lisatud kogust kui ekstrakti lahjendust. Piigi poollaius ei või erineda selle esialgsest väärtusest rohkem kui 10%. 7.1.2. Dioodaheldetektori kasutamine Tulemusi hinnatakse vastavalt järgmistele kriteeriumidele: 7.1.2.1. analüüsitava proovi ja standardi neeldumisspektrite maksimumide lainepikkused, mis on registreeritud kromatogrammi piigi tipus, peavad langema kokku detekteerimissüsteemi lahutusvõime poolt määratud piires. Dioodaheldetektori puhul on see tavaliselt ligikaudu 2 nm. 7.1.2.2. 220 ja 350 nm vahel ei tohi kromatogrammi piigi tipus registreeritud proovi ja standardi spektrid teineteisest erineda nendes spektriosades, mis jäävad 10--100% suhtelise neeldumise piirkonda. Nõutav kriteerium on täidetud, kui samad maksimumid on olemas ja kui üheski vaadeldud punktis hälve kahe spektri vahel ei ületa 15% standardi neeldumisest. 7.1.2.3. 220 ja 350 nm vahel ei tohi sama prooviekstrakti kromatogrammi piigi ülespoole suunduva osa, tipu ja allapoole suunduva osa spektrid üksteisest erineda spektri nendes osades, mis on 10--100% suhtelise neeldumise piirkonnas. Kriteerium on täidetud, kui samad maksimumid on olemas ja kui üheski vaadeldud punktis hälve spektrite vahel ei ületa 15% tipu neeldumisspektrist. Kui kas või üks kriteerium ei ole täidetud, ei ole analüüsiga määratava metüülbensokaadi olemasolu kinnitatud. 8. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10% suuremast tulemusest metüülbensokaadi sisalduste puhul 4--20 mg/kg. 9. Regenereeruvus Tühiproovile lisatud metüülbensokaadi regenereeruvus peaks olema vähemalt 90%. 10. Ühisuurimuse tulemused Laboratooriumis analüüsiti viit proovi. Iga proovi puhul tehti kaks paralleelanalüüsi. Tulemused: Tühiproov Jahu 1 Graanul 1 Jahu 2 Graanul 2 Keskmine (mg/kg) ei leitud 4,50 4,50 8,90 8,70 Sr (mg/kg) -- 0,30 0,20 0,60 0,50 CVr (%) -- 6,70 4,40 6,70 5,70 Sr (mg/kg) -- 0,40 0,50 0,90 1,00 CVR (%) -- 8,90 11,10 10,10 11,50 Regenereeruvus -- 92,00 93,00 92,00 89,00 Sr -- korratavuse standardhälve; CVr -- korratavuse variatsioonitegur; SR -- reprodutseeritavuse standardhälve; CVR -- reprodutseeritavuse variatsioonitegur. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 41 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Bukinolaadi määramise metoodika (etüül-4-hüdroksü-6,7-diisobutoksü-3-kinoliin karboksülaat) 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata bukinolaadi kogust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimum on 10 mg/kg. Dekokinaat segab määramist. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse kloroformiga, ekstrakt aurutatakse kuivaks, jääk lahustatakse kloroformis ja lahusega viiakse läbi õhukesekihikromatograafia. Bukinolaat elueeritakse etanooliga ja määratakse spektrofotofluoromeetriliselt, võrreldes standardlahustega. 3. Reaktiivid 3.1. Kloroform (AR). 3.2. 96% (mahu%) etanool (AR). 3.3. Kloroformi ja etanooli segu mahuvahekorras 10/1. 3.4. 80% (mahu%) etanool (AR). 3.5. Silikageel G õhukesekihikromatograafia jaoks. 3.6. Standardaine: puhas bukinolaat. 3.7. Standardlahused 3.7.1. standardlahus, mis sisaldab 0,2 mg bukinolaati ml kohta: kaaluda 50 mg standardainet 0,1 mg täpsusega. Lahustada kloroformis 250-ml mõõtekolvis, soojendades veevannis 50 °C juures. Jätta toatemperatuurini jahtuma, täita kolb kloroformiga märgini ja segada. 3.7.2. Tööstandardlahused: Viia lahuse alikvootsed osad 5, 10, 15, 20 ja 25 ml mõõtekolbidesse mahuga 25 ml. Täita kolvid kloroformiga märgini ja segada. Valmistada vahetult enne kasutamist. Saadud lahused sisaldavad vastavalt 0,04; 0,08; 0,12; 0,16 ja 0,20 mg bukinolaati ml kohta. 4. Vahendid 4.1. 50- ja 250-ml lihvkorkidega koonilised kolvid. 4.2. Loksuti. 4.3. Tsentrifuug, lihvkorkidega 15-ml tsentrifuugikatseklaasidega. 4.4. Veevann 50 °C. 4.5. Seade õhukesekihikromatograafia jaoks. 4.6. Klaasplaadid õhukesekihikromatograafia jaoks, 200 200 mm, mis on ette valmistatud järgmiselt. Paigutada plaatidele ühtlane 0,5 mm paksune silikageeli G kiht ja lasta õhu käes 15 minutit kuivada. Hoida plaate kuivatuskapis kaks tundi ja viia eksikaatorisse, mis sisaldab silikageeli. Valmis plaadid on sobivad, kui nad annavad tulemusi, mis on sarnased nendele, mida saadakse eespool kirjeldatud viisil ette valmistatud plaatide puhul. 4.7. 0,50-ml mikropipetid. 4.8. Tsoonikollektor õhukesekihikromatograafia jaoks. 4.9. Lühilaineultraviolettlamp. 4.10. Spektrofotofluoromeeter ksenoonlambi ja kahe monokromaatoriga. 4.11. Kuivatuskapp, mis on varustatud ventilaatoriga ja reguleeritud temperatuurile 100 °C. 4.12. Vaakumrootorauruti 250-ml kolviga. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ettevalmistamine Jahvatada proov nii, et see läheb tervikuna läbi 1-mm avadega sõela (kooskõlas soovitusega ISO R 565). 5.2. Ekstraheerimine Kaaluda 1mg täpsusega selline kogus hoolikalt peenestatud ja homogeenset proovi, mis sisaldab ligikaudu 1,25 mg bukinolaati. Viia proov 250-ml koonilisse kolbi ja lisada 100 ml kloroform. Segada, sulgeda kolb korgiga ja loksutada loksutit kasutades üks tund. Dekanteerida, filtreerida ja valada ära esimesed milliliitrid filtraati. Viia 80 ml selget filtraati 150-ml lihviga katseklaasi või 250-ml kolbi, mis ühendatakse vaakumrootoraurutiga. Aurutada veevannil peaaegu kuivaks, lahustada õline jääk, kasutades korduvalt mõnd milliliitrit kloroformi ja viia vedelikud kvantitatiivselt 10-ml mõõtekolbi, kasutades kitsa jalaga lehtrit. Täita kolb kloroformiga märgini ja segada. Kui lahus ei ole selge, tsentrifuugida kolm minutit 3000 p/min juures, kasutades korgiga suletud tsentrifuugikatseklaasi. 5.3. Õhukesekihikromatograafia Mikropipetti kasutades kanda laiguna õhukesekihikromatograafia plaadile 2-cm intervallidega punktis 5.2 saadud ekstrakti ja viia tööstandardlahuse 0,25-ml kogused. Kromatografeerida kloroformiga, kuni lahusti front on jõudnud peaaegu plaadi ülemise ääreni, seejärel kuivatada õhuvoolu abil. Jätkata kromatografeerimist kloroformi-etanooli seguga, kuni lahusti front on liikunud ligi 12 cm. Lasta lahustitel aurustuda. Asetada kromatogramm ultraviolettvalguse kätte ja nõela kasutades märkida bukinolaadilaigu piir (Rf väärtus 0,4--0,6). 5.4. Elueerimine Koguda tsoonikollektorit kasutades igast märgitud tsoonist silikageel ja paigutada tsentrifuugikatseklaasidesse. Lisada igasse katseklaasi 10 ml etanooli, loksutada 20 minutit, seejärel tsentrifuugida viis minutit 3000 p/min juures. Dekanteerida selged lahused 50 ml koonilistesse kolbidesse. 5.5. Fluorestsentsi mõõtmised Seada spektrofotofluoromeetri skaala kõige kontsentreerituma standardlahuse eluaadi abil näidule 100, valides ergastamiseks sellise lainepikkuse 200 ja 280 nm vahel, mis annab kõige intensiivsema fluorestsentskiirguse lainepikkusega 375 nm. Nendes tingimustes mõõta teiste eluaatide fluorestsents. Saadud väärtustest määrata bukinolaadi kogus (A) mg-des proovi eluaadi 10 ml-s. 6. Tulemuste arvutamine Bukinolaadisisaldus mg-des proovi kg kohta antakse valemiga

kus: A -- bukinolaadi kogus milligrammides, mis on määratud spektrofluoromeetrilise mõõtmisega; P -- analüüsitava proovi mass grammides. 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 50% suuremast tulemusest, kui bukinolaadisisaldus on 10--20 mg/kg; -- 10 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 20--100 mg/kg; -- 10% suuremast tulemusest, kui sisaldused on 100--5000 mg/kg; -- 500 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 5000--10 000 mg/kg; -- 5% suuremast tulemusest, kui sisaldused on suuremad kui 10 000 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 42 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Amprooliumi määramise metoodika [1,4-amino-2-propüül-5-pürimidüülmetüül-2-pikoliiniumkloriidhüdrokloriid ] 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata amprooliumi kogust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimum on 40 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse lahjendatud metanooliga. Ekstrakt puhastatakse alumiiniumoksiidi kolonnil ja töödeldakse 2,7-dihüdroksünaftaleeni, kaaliumheksatsüanoferraat(III), kaaliumtsüaniidi ja naatriumhüdroksiidi metanoolilahusega, mille tagajärjel moodustub punase värvusega kompleksühend. Amproolium määratakse spektrofotomeetriga 530 nm juures. 3. Reaktiivid 3.1. Metanool (AR). 3.2. Lahjendatud metanool: segada metanool veega mahuvahekorras 2/1. 3.3. 0,2% (mass/ruumala) kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3 [Fe(CN)6] (AR) lahus. See lahus on stabiilne kaks nädalat. 3.4. 1% kaaliumtsüaniidi (AR) lahus (mass/ruumala). See lahus on stabiilne kaks nädalat. 3.5. 1,125% naatriumhüdroksiidi (AR) lahus (mass/ruumala). 3.6. Naatriumhüdroksiidi metanoolilahus: lahjendada 15 ml lahust 200 ml-ni metanooliga. 3.7. 0,0025% 2,7-dihüdroksünaftaleeni lahus (mass/ruumala): lahustada 25 mg 2,7-dihüdrokcünaftaleeni (AR) metanoolis ja viia metanooliga 1000 ml-ni. 3.8. Värvusreaktiiv: viia 90 ml 2,7-dihüdroksünaftaleeni lahust 250-ml koonilisse kolbi, lisada 5 ml kaaliumheksatsüanoferraat(III) lahust ja segada hästi. Seejärel lisada 5 ml kaaliumtsüaniidi lahust, sulgeda kolb korgiga ja segada hästi. Jätta 30--35 minutiks seisma, lisada 100 ml naatriumhüdroksiidi metanoolilahust, segada ja filtreerida läbi filtertiigli. Kasutada reaktiivi filtreerimise järel 75 minuti jooksul. 3.9. Alumiiniumoksiid kolonnkromatograafia jaoks. Enne kasutamist segada 100 g alumiiniumoksiidi 500 ml vees 30 minutit, filtreerida segu, pesta alumiiniumoksiidi filtril 3 korda 50 ml metanooliga, kuivatades iga kord vaakumi abil, jätta ööseks seisma ja seejärel kuivatada 2 tundi 100 °C juures vaakumkuivatuskapis. Asetada eksikaatorisse jahtuma. Kontrollida aktiivsust, analüüsides standardlahuse kindlat kogust, alustades punktist 5.2. Amprooliumi regenereeruvus peab olema 100% ± 4%. 3.10. Standardaine: puhas amproolium, mis vastab järgmistele omadustele: -- sulamispunkt (lagunemine) 248 °C; -- molaarne neeldumistegur nii 265 kui 235 nm juures destilleeritud vees 11,0 103. 3.11. Standardlahus: kaaluda 50 mg standardainet 0,1 mg täpsusega. Lahustada lahjendatud metanoolis 500 ml mõõtekolvis, täita kolb sama lahustiga märgini ja homogeniseerida. Viia 10,0 ml seda lahust mõõtekolbi mahuga 50 ml ja täita kolb lahjendatud metanooliga märgini ning segada hästi. 1 ml saadud lahust sisaldab 20 µg amprooliumi. 4. Vahendid 4.1. 50-, 250- ja 500-ml lihvkorkidega koonilised kolvid. 4.2. Loksuti. 4.3. Filtertiigel. Poorsus G3, läbimõõt 60 mm. 4.4. Klaaskolonn kromatograafia jaoks (siseläbimõõt 9 mm, pikkus 400--500 mm). 4.5. Tsentrifuug ja lihvkorkidega 25-ml tsentrifuugikatseklaasid. 4.6. Spektrofotomeeter 10-mm küvettidega. 5. Analüüsi käik 5.1. Ekstraheerimine ja puhastamine 5.1.1. Söödad ja premiksid Kaaluda 1mg täpsusega 10 g hoolikalt peenestatud ja homogeniseeritud proovi. Premiksite puhul kaaluda 1 mg täpsusega 3--6 g. Viia analüüsitav proov 250-ml koonilisse kolbi ja lisada täpselt 100 ml lahjendatud metanooli. Loksutada 60 minutit ja filtreerida. Lahjendada vajadusel lahjendatud metanooliga, et saada lahus, mis sisaldab 5--15 µg amprooliumi ml kohta. Asetada tükk puuvillvatti kromatografeerimiskolonni alumisse otsa ja suruda sellele peale 5 g alumiiniumoksiidi ning seejärel valada kolonni 25,0 ml ekstrakti. Lasta vedelikul voolata läbi kolonni, valada ära esimesed 5 ml ja koguda ülejäänud 12 ml gradueeritud katseklaasi. 5.1.2. Kontsentraadid Kaaluda 1 mg täpsusega 0,5 g hoolikalt peenestatud ja homogeniseeritud proovi, viia see 500-ml koonilisse kolbi, lisada 250 ml lahjendatud metanooli, loksutada või segada 60 minutit ja filtreerida. Lahjendada mõõtekolvis 5,0 ml filtraati lahjendatud metanooliga 200 ml-ni. 5.2. Värvuse tekkimine ja optilise tiheduse mõõtmine Viia 5,0 ml punktides 5.1.1 või 5.1.2 saadud lahust tsentrifuugikatseklaasi A. Viia 5,0 ml lahjendatud metanooli tsentrifuugikatseklaasi B. Lisada igasse katseklaasi 10,0 ml värvusreaktiivi, sulgeda katseklaasid korkidega, segada ja jätta 18 minutiks seisma. Seejärel tsentrifuugida 3 minutit ja valada lahused A ja B 50-ml koonilistesse kolbidesse. Mõõta kohe lahuse A optiline tihedus 530 nm juures spektrofotomeetriga, kasutades lahust B võrdluslahusena. Määrata amprooliumi kogus, kasutades kalibreerimisgraafikut. 5.3. Kalibreerimisgraafik Pipeteerida tsentrifuugikatseklaasidesse vastavalt 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ja 5,0 ml standardlahust. Viia esimese nelja katseklaasi mahud lahjendatud metanooliga 5,0 ml-ni. Lisada kõikidesse viide katseklaasi 10,0 ml värvusreaktiivi, sulgeda korkidega, segada ja jätta 18 minutiks seisma. Seejärel tsentrifuugida 3 minutit ja valada lahused 50-ml koonilistesse kolbidesse. Mõõta kohe lahuste optilised tihedused 530 nm juures spektrofotomeetriga, kasutades võrdluslahusena 5 ml lahjendatud metanooli ja 10 ml värvusreaktiivi segu. Koostada kalibreerimisgraafik, mis näitab lahuse optilise tiheduse sõltuvust amprooliumi sisaldusest (ordinaatteljel optilise tiheduse väärtused, abstsissteljel amprooliumi kogused mg-des). 6. Tulemuste arvutamine 6.1. Söödad ja premiksid Amprooliumisisaldus mg-des proovi kg kohta antakse valemiga

kus: A -- amprooliumi kogus (mg), määratud fotomeetrilise mõõtmisega; W -- analüüsitava proovi mass (g); F -- lahjendustegur (leitud punktis 5.1.1). 6.2. Kontsentraadid Amprooliumisisalduse protsent proovis arvutatakse järgmise valemi abil

kus: A -- amprooliumi kogus (mg), määratud fotomeetrilise mõõtmisega; W -- analüüsitava proovi mass (g). 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 10 mg/kg absoluutväärtuses amprooliumikoguste puhul, mis on väiksemad kui 100 mg/kg; -- 10% suhtelises väärtuses, kui sisaldused on 100--5000 mg/kg; -- 500 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 5000--10 000 mg/kg; -- 5% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on üle 10 000 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 43 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Etopabaadi määramise metoodika [metüül-4-atsetamido-2-etoksübensoaat] 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata etopabaadi kogust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimum on 2 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse lahjendatud metanooliga. Lahus hapestatakse ja ekstraheeritakse kloroformiga. Kloroformiekstrakt pestakse leeliselise lahusega ja seejärel veega. Puhastatud ekstrakt kontsentreeritakse, etopabaat hüdrolüüsitakse lahjendatud vesinikkloriidhappega. Moodustunud aminoderivaat diasoteeritakse ja lastakse reageerida 2-aminoetüül-1-naftüülamiiniga. Värviline kompleksühend ekstraheeritakse butanooliga ja lahuse optiline tihedus mõõdetakse 555 nm juures. 3. Reaktiivid 3.1. Metanool (AR). 3.2. 50% (mahu%) metanool: segada metanooli ja vett mahuvahekorras 1/1. 3.3. Vesinikkloriidhape (AR), tihedus 1,19 g/ml. 3.4. Lahjendatud vesinikkloriidhape: lahjendada 10,0 ml vesinikkloriidhapet veega 100 ml-ni. 3.5. Ligikaudu 0,3N vesinikkloriidhape: lahjendada 25 ml vesinikkloriidhapet veega 1000 ml-ni. 3.6. Kloroform (AR) 3.7. 4% (mass/ruumala) naatriumkarbonaadi lahus: lahustada 40,0 g veevaba naatriumkarbonaati (AR) vees ja viia veega 1000 ml-ni. 3.8. 0,2% (mass/ruumala) naatriumnitriti lahus: lahustada 100 mg naatriumnitritit (AR) vees 50-ml mõõtekolvis ja täita mõõtekolb veega märgini. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.9. 1,0% (mass/ruumala) ammooniumsulfamaadi lahus: lahustada 500 mg ammooniumsulfamaati (AR) vees 50-ml mõõtekolvis ja täita mõõtekolb veega märgini. Valmista vahetult enne kasutamist. 3.10. 0,2% (mass/ruumala) 2-aminoetüül-1-naftüülamiini lahus: lahustada 100 mg 2-aminoetüül-1-naftüülamiini (AR) vees 50-ml mõõtekolvis ja täita mõõtekolb veega märgini. Valmistage vahetult enne kasutamist. 3.11. Veevaba naatriumkloriid (AR). 3.12. N-butanool (AR). 3.13. Standardaine: puhas etopabaat. 3.14. Standardlahused: 3.14.1. lahus, mis sisaldab 0,040 mg etopabaati ml kohta: kaaluda 40 mg standardainet 0,1 mg täpsusega. Lahustada metanoolis 100-ml mõõtekolvis; täita kolb sama lahustiga märgini ja segada. Lahus on stabiilne kuu aega. 3.14.2. Lahus, mis sisaldab 0,016 mg etopabaati 20 ml kohta: viia 5,0 ml lahust 250-ml mõõtekolbi, täita kolb metanooliga märgini ja segada hästi. Valmistada vahetult enne kasutamist. 4. Vahendid 4.1. 250-ml lihvkorkidega koonilised kolvid. 4.2. 100-ml lihvkorkidega jaotuslehtrid. 4.3. Loksuti. 4.4. Vaakumrootorauruti 250-ml kolbidega. 4.5. Veevann. 4.6. Tsentrifuug ja lihvkorkidega 50-ml ja 15-ml tsentrifuugikatseklaasid. 4.7. Õhkjahuti klaaslihviga. 4.8. Spektrofotomeeter 10-mm küvettidega. 5. Analüüsi käik 5.1. Ekstraheerimine Kaaluda 1 mg täpsusega selline kogus hoolikalt peenestatud ja homogeniseeritud proovi, mis sisaldab ligi 80 µg etopabaati. Viia analüüsitav proov 250-ml koonilisse kolbi ja lisada 100,0 ml lahjendatud metanooli. Segada, sulgeda kolb korgiga ja loksutada 1 tund loksutil. Dekanteerida, filtreerida ja valada filtraadi esimesed milliliitrid ära. 5.2. Puhastamine Kõik operatsioonid tuleb teha kiiresti! Viia 20,0 ml selget ekstrakti 100-ml jaotuslehtrisse, lisada 5,0 ml lahjendatud vesinikkloriidhapet ja 20,0 ml kloroformi. Loksutada ettevaatlikult, seejärel tugevasti 3 minutit. Jätta seisma faaside eraldumiseni ja koguda kloroformifaas teise 100-ml jaotuslehtrisse. Ekstraheerida happefaas veel kaks korda 20,0 ml kloroformiga. Koguda kloroformiekstraktid samuti teise jaotuslehtrisse ja valada happefaas ära. Lisada kogutud kloroformilahusele 10 ml naatriumkarbonaadi lahust, loksutada 3 minutit ja jätta seisma kuni faasid eralduvad. Koguda kloroformifaas kolmandasse 100-ml jaotuslehtrisse ja valada ära veefaas. Lisada kloroformilahusele 10 ml naatriumkarbonaadi lahust, loksutada kolm minutit ja jätta seisma faaside eraldumiseni. Koguda kloroformifaas neljandasse 100-ml jaotuslehtrisse, pesta kaks korda järjest 25,0 ml veega kummalgi korral, eraldada veefaasid ja koguda kloroformiekstrakt kvantitatiivselt vaakumrootorauruti 250-ml kolbi. Koguda veefaasid ühte jaotuslehtrisse; loputada iga tühja lehtrit mõne milliliitri kloroformiga; loksutada veefaasi sellesama mõne milliliitri kloroformiga, mida kasutati lehtrite loputamiseks, lasta faasidel eralduda ja lisada kloroformifaas kolbi kogutud kloroformiekstraktile. 5.3. Hüdrolüüs Aurutada kloroformiekstrakt 2 ml-ni temperatuuril 50 °C veevannil vaakumrootorauruti abil. Lahustada jääk 2--3 ml metanoolis ja viia lahus kvantitatiivselt üle 50-ml tsentrifuugikatseklaasi kahe 10 ml ja ühe 5 ml portsjoni 0,3N vesinikkloriidhappe abil. Paigaldada õhkjahuti, lisada mõned klaaskuulid, loksutada hästi, asetada katseklaas keevasse veevanni ja hoida seal 45 minutit. Seejärel jahutada külma vee voolus. 5.4. Värvuse tekkimine ja optilise tiheduse mõõtmine Lisada 1,0 ml naatriumnitriti lahust, segada ja jätta 2 minutiks seisma. Lisada 1,0 ml ammooniumsulfamaadi lahust, loksutada ja jätta 2 minutiks seisma. Lisada 1,0 ml 2-aminoetüül-1-naftüülamiini lahust, segada ja jätta 10 minutiks seisma. Lisada 5,0 g naatriumkloriidi ja 10,0 ml n-butanooli, loksutada tugevasti kuni naatriumkloriid on täielikult lahustunud. Võtta pealejääv butanoolilahus pipeti abil ära ja viia see 15-ml tsentrifuugikatseklaasi ning tsentrifuugida. Seejärel mõõtta optiline tihedus EA spektrofotomeetriga 555 nm juures, kasutades n-butanooli võrdluslahusena. 5.5. Kontrollkatse Viia läbi kontrollkatse, kasutades sama analüüsi käiku 20,0 ml lahjendatud metanooli puhul, alustades punktist 5.2. Mõõta optiline tihedus FB 555 nm juures, kasutades n-butanooli võrdluslahusena. 5.6. Standardkatse Viia läbi standardkatse, kasutades sama analüüsi käiku 20,0 ml standardlahuse puhul, alustades punktist 5.2. Mõõta optiline tihedus E C 555 nm juures, kasutades n-butanooli võrdluslahusena. 6. Tulemuste arvutamine Etopabaadi kogus mg-des proovi kg kohta arvutatakse valemiga

kus: EA -- proovilahuse optiline tihedus; EB -- kontrollkatse lahuse optiline tihedus; EC -- standardkatse lahuse optiline tihedus; W -- analüüsitava proovi mass (g). 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 20% suhtelises väärtuses, kui etopabaadisisaldus on väiksem kui 7,5 mg/kg; -- 1,5 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 7,5--10 mg/kg; -- 15% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on suuremad kui 10 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 44 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Dinitolmiidi (DOT) määramise metoodika [3,5-dinitro-o-toluamiid] 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata dinitolmiidi (DOT) kogust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Nitrofuraani derivaadid võivad segada. Määratav miinimum on 40 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse atsetonitriiliga. Ekstrakt puhastatakse alumiiniumoksiidil ja filtreeritakse. Filtraadi alikvootne osa aurutatakse kuivaks. Jääk lahustatakse dimetüülformamiidis ja töödeldakse etüleendiamiiniga, mille tagajärjel moodustub punase värvusega kompleksühend. Dinitolmiid määratakse spektrofotomeetriga 560 nm juures. 3. Reaktiivd 3.1. 85% (mahu%) atsetonitriil: segada 850 ml puhast atsetonitriili ja 150 ml vett. Enne kasutamist destilleerida segu ja koguda fraktsioon, mis keeb 75 °C ja 77 °C vahel. 3.2. Alumiiniumoksiid kolonnkromatograafia jaoks. Kuumutada 750 °C juures vähemalt 2 tundi, jahutada eksikaatoris ja hoida lihvkorgiga pruunist klaasist purgis. Enne kasutamist niisutada järgmiselt: asetada pruunist klaasist purki 10 g alumiiniumoksiidi ja 0,7 ml vett, sulgeda korgiga, kuumutada 5 minutit keevas veevannis, loksutades tugevasti. Loksutamist jätkates jätta jahtuma. Kontrollida aktiivsust, analüüsides punktist 5.1 alustades kindlat kogust standardlahust. Dinitolmiidi regenereeruvus peab olema 100% ± 2%. 3.3. 95% (mahu%) N,N-dimetüülformamiid: segada 95,0 ml N,N-dimetüülformamiidi (AR) ja 5,0 ml vett. 3.4. Etüleendiamiin (AR), maksimaalne veesisaldus: 2,0%. 3.5. Standardaine: puhas 3,5-dinitro-o-toluamiid, mis vastab järgmistele omadustele: -- sulamispunkt 177 °C; -- molaarne neeldumistegur 248 nm juures atsetonitriilis 13,1 10 3; -- 266 nm juures N,N-dimetüülformamiidis 10,1 10 3. 3.6. Standardlahus: kaaluda 0,1 mg täpsusega 40 mg standardainet, lahustada atsetonitriiliga 200-ml mõõtekolvis, täita kolb sama lahustiga märgini ja segada. Viia 20,0 ml saadud lahust 100-ml mõõtekolbi, täita kolb atsetonitriiliga märgini ja segada. 1 ml seda lahust sisaldab 40 µg dinitolmiidi. 4. Vahendid 4.1. 250-ml lihvkorgiga kooniline kolb. 4.2. Püstjahuti klaaslihviga. 4.3. Filtertiigel, poorsus G 3, läbimõõt 60 mm. 4.4. Vaakumfilter (nagu Witti aparaat). 4.5. Veevann, seatud temperatuurile 50 °C. 4.6. Spektrofotomeeter 10-mm küvettidega. 5. Analüüsi käik 5.1. Ekstraheerimine ja puhastamine Kaaluda 1 mg täpsusega 10 g hoolikalt peenestatud ja homogeniseeritud proovi. Kontsentraatide ja premiksite puhul kaaluda 1 mg täpsusega 1 g proovi. Viia analüüsitav proov 250-ml koonilisse kolbi ja lisada 65 ml atsetonitriili. Segada, paigaldada kolvile püstjahuti ja kuumutada veevannil 30 minutit, loksutades pidevalt. Jahutada külma vee voolu all. Lisada 20 g alumiiniumoksiidi, loksutada 3 minutit, jätta settima. Asetada 100-ml mõõtekolb vaakumfiltrisse, paigaldada filtertiigel ja filtreerida lahus vaakumit kasutades. Seejärel viia ülejäänud tahke aine mõne ml atsetonitriili abil tiiglisse ja filtreerida jääk kuivaks, kasutades vaakumit. Vabastada vaakum, suspendeerida tahke aine veel kord mõnes ml atsetonitriilis ja filtreerida uuesti vaakumit kasutades. Korrata viimaseid operatsioone kuni filtraadi maht suureneb umbes 95 ml-ni. Viia filtraadi maht atsetonitriiliga 100 ml-ni ja segada. Vajadusel lahjendada selle lahuse alikvootne osa atsetonitriiliga, et saada lahust, mis sisaldab 5--15 µg dinitolmiidi ml kohta. 5.2. Värvuse tekkimine ja optilise tiheduse mõõtmine Pipeteerida kolme 50-ml keeduklaasi A, B ja C vastavalt 4,0 ml punktis 5.1 saadud lahust. Lisada ainult keeduklaasi C 1,0 ml standardlahust. Viia kolm keeduklaasi veevannile, mis on asetatud hästi ventileeritavasse tõmbekappi, ja aurutada kuiva õhu voolus kuivaks. Jahutada kõik keeduklaasid toatemperatuurini. Lisada 10,0 ml N,N-dimetüülformamiidi keeduklaasi A ja 2,0 ml keeduklaasidesse B ja C, segada veidi kuni jääk lahustub täielikult. Seejärel lisada 8,0 ml etüleendiamiini keeduklaasidesse B ja C ning segada. Täpselt 5 minutit pärast etüleendiamiini lisamist mõõta kolme lahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga 560 nm juures, kasutades N,N-dimetüülformamiidi võrdluslahusena. 6. Tulemuste arvutamine Dinitolmiidisisaldus mg-des proovi kg kohta antakse valemiga

kus: EA -- lahuse A (pimekatse) optiline tihedus; EB -- lahuse B (proov) optiline tihedus; EC -- lahuse C (sisestandard) optiline tihedus; W -- analüüsitava proovi mass grammides; F -- lahjendustegur (leitud punktis 5.1). 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 10 mg/kg absoluutväärtuses dinitolmiidisisalduste puhul, mis on väiksemad kui 100 mg/kg; -- 10% suhtelises väärtuses, kui sisaldused on 100--5000 mg/kg; -- 500 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 5000--10 000 mg/kg; -- 5% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on üle 10 000 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 45 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Nikarbasiini määramise metoodika [4.4'-dinitrokarbaniliidi ja 2-hüdroksü-4,6-dimetüülpürimidiini ekvimolekulaarne segu] 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata nikarbasiini kogust söötades, kontsentraatides ja premiksites, mis ei sisalda rohkem kui 5% rohujahu. Nitrofuraani derivaadid atsetüleenheptiin ja karbadoks võivad segada. Määratav miinimum on 20 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse N,N-dimetüülformamiidiga. Ekstrakt puhastatakse kromatograafiliselt alumiiniumoksiidi kolonnil; nikarbasiin elueeritakse etanooliga. Eluaati töödeldakse naatriumhüdroksiidi etanoolilahusega, mille tagajärjel lahus värvub kollaseks. Nikarbasiin määratakse spektrofotomeetriga 430 nm juures. 3. Reaktiivid 3.1. N,N-dimetüülformamiid (AR). 3.2. Alumiiniumoksiid kolonnkromatograafia jaoks. Kuumutada 750 °C juures vähemalt 2 tundi, jahutada eksikaatoris ja hoida lihvkorgiga pruunist klaasist purgis. Enne kasutamist kontrollida aktiivsust, analüüsides kindlat kogust standardlahust, alustades punktist 5.2. Nikarbasiini regenereeruvus peab olema 100% ± 2%. 3.3. 95% (mahu%) etanool. 3.4. 80% (mahu%) etanool. 3.5. 50% (mass/ruumala) naatriumhüdroksiidi (AR) lahus. 3.6. 1% (mass/ruumala) naatriumhüdroksiidi etanoolilahus: viia 1 ml naatriumhüdroksiidi lahust 50-ml mõõtekolbi; täita kolb 80% etanooliga märgini. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.7. Standardaine: puhas nikarbasiin, molaarne neeldumistegur 362 nm juures N,N-dimetüülformamiidis 37,8 103. 3.8. Standardlahused: 3.8.1. Lahus, mis sisaldab 1,25 mg nikarbasiini ml kohta: kaaluda 0,1 mg täpsusega 125 mg standardainet. Lahustada 75 ml N,N-dimetüülformamiidis 100-ml mõõtekolvis kergelt kuumutades. Lasta jahtuda, täita kolb sama lahustiga märgini ja segada. Hoida valgusest eemal. 3.8.2. Lahus, mis sisaldab 0,125 mg nikarbasiini ml kohta: viia 10,0 ml lahust 100-ml mõõtekolbi, täita kolb N,N-dimetüülformamiidiga märgini ja segada. 3.8.3. Lahus, mis sisaldab 0,025 mg nikarbasiini ml kohta: viia 20,0 ml lahust 100-ml mõõtekolbi, täita kolb N,N-dimetüülformamiidiga märgini ja segada. 4. Vahendid 4.1. 250-ml lihvkorgiga kooniline kolb. 4.2. Püstjahuti klaaslihviga. 4.3. Keev veevann. 4.4. Tsentrifuug 120-ml tsentrifuugikatseklaasidega. 4.5. Klaaskolonn kromatograafia jaoks (siseläbimõõt 25 mm, pikkus 300 mm). 4.6. Spektrofotomeeter 10-mm küvettidega. 4.7. Bürett, 1/10-ml jaotistega. 5. Analüüsi käik 5.1. Ekstraheerimine Kaaluda 1 mg täpsusega 10 g hoolikalt peenestatud ja homogeniseeritud proovi. Kontsentraatide ja premiksite puhul kaaluda 1 mg täpsusega 1 g proovi. Viia analüüsitav proov 250-ml koonilisse kolbi ja lisada täpselt 100 ml N,N-dimetüülformamiidi. Segada, paigaldada püstjahuti kolvile ja kuumutada veevannil 15 minutit, aeg-ajalt loksutades. Jahutada külma vee voolus. Seejärel kallata proovi peal olev lahus tsentrifuugikatseklaasi ja tsentrifuugida umbes 3 minutit. Kui vaja, lahjendada 25,0 ml proovi peal olevat lahust N,N-dimetüülformamiidiga, et saada lahus, mis sisaldab 2,0--10 µg nikarbasiini ml kohta. 5.2. Kromatografeerimine Viia kromatograafi kolonni 30 g alumiiniumoksiidist N,N-dimetüülformamiidis valmistatud suspensiooni. Lasta vedelikul läbi kolonni voolata, kuni selle nivoo on jõudnud 1 cm kõrgusele alumiiniumoksiidi sambast. Seejärel viia kolonni 25,0 ml punktis 5.1. saadud ekstrakti. Lasta vedelikul läbi voolata, kuni selle nivoo on jõudnud alumiiniumoksiidi sambani. Pesta kolonni kolme 10-ml portsjoni N,N-dimetüülformamiidiga. Seejärel elueerida 70 ml 95% etanooliga. Eemaldada esimesed 10 ml eluaati ja koguda ülejäänu kokku, jaotades seda järgmiselt: -- üks 5-ml portsjon (a); -- üks 50-ml portsjon (b) mõõtekolbi; -- üks 5-ml portsjon (c). Kontrollida, et portsjonid (a) ja (c) ei muutu kollaseks, kui lisatakse naatriumhüdroksiidi etanoolilahust. Jätkata analüüsi portsjoniga (b), nagu näidatud punktis 5.3. 5.3. Värvuse tekkimine ja optilise tiheduse mõõtmine Pipeteerida 20,0 ml portsjon (b) eluaati kahte eraldi 25-ml mõõtekolbi A ja B. Lisada kolbi A 50 ml naatriumhüdroksiidi etanoolilahust ja kolbi B 5,0 ml 95% etanooli. Segada hästi. Järgmise viie minuti jooksul mõõta mõlema lahuse optiline tihedus 430 nm juures, kasutades võrdluslahusena 20,0 ml 95% etanooli ja 5,0 ml naatriumhüdroksiidi etanoolilahuse segu. Lahutada lahuse B optilise tiheduse väärtus lahuse A omast. Sellest väärtusest lähtudes määrata nikarbasiini kogus, kasutades kalibreerimisgraafikut. 5.4. Kalibreerimisgraafik Kromatografeerida 25,0 ml standardlahust, nagu näidatud punktis 5.2. Valada eluaadi portsjon (b) gradueeritud büretti ja mõõta seda mõõtekolbidesse mahuga 25 ml vastavalt 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 ja 10,0 ml (vastavad 0,025; 0,050; 0,075; 0,100 ja 0,125 mg nikarbasiinile). Igasse kolbi lisada 5,0 ml naatriumhüdroksiidi etanoolilahust, täita kolb 95% etanooliga märgini ja segada hästi. Järgmise viie minuti jooksul mõõta lahuste optiline tihedus 430 nm juures, kasutades võrdluslahusena 20,0 ml 95% etanooli ja 5,0 ml naatriumhüdroksiidi etanoolilahuse segu. Koostada kalibreerimisgraafik, mis näitab lahuse optilise tiheduse sõltuvust nikarbasiini sisaldusest (ordinaatteljel optilise tiheduse väärtused ja abstsissteljel nikarbasiini kogused mg-des). 6. Tulemuste arvutamine Nikarbasiinisisaldus mg-des proovi kg kohta antakse valemiga

kus: A -- nikarbasiini kogus (mg), määratud fotomeetrilise mõõtmisega; W -- analüüsitava proovi mass (g); F -- lahjendustegur (leitud punktis 5.1). 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 10 mg/kg absoluutväärtuses, kui nikarbasiinisisaldused on alla 100 mg/kg. -- 10% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on 100--5000 mg/kg; -- 500 mg/kg absoluutväärtuses sisalduste puhul, mis on 5000--10 000 mg/kg; -- 5% suhtelises väärtuses sisalduste puhul, mis on üle 10 000 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 46 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Sulfakinoksaliini määramise metoodika [(2,4-aminobenseensulfoonamido) kinoksaliin] 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sulfakinoksaliini kogust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimum on 20 mg/kg. Muud sulfoonamiidid ja arsaniilhape segavad määramist. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse dimetüülformamiidi ja kloroformiga. Sulfakinoksaliin hüdrolüüsitakse leeliselises keskkonnas. Pärast neutraliseerimist diasoteeritakse moodustunud aminoderivaat ja lastakse sellel reageerida N-2-aminoetüül-1-naftüülamiiniga. Lahuse optiline tihedus mõõdetakse 545 nm juures. 3. Reaktiivid 3.1. N,N-dimetüülformamiid (AR). 3.2. Kloroform (AR). 3.3. Absoluutne etanool. 3.4. Leeliseline soolalahus: lahustada 10 g naatriumhüdroksiidi (AR) ja 25 g naatriumkloriidi (AR) vees. Viia veega 500 ml-ni ja segada. 3.5. Kontsentreeritud vesinikkloriidhape (AR), tihedus 1,18 g/ml. 3.6. 0,1% (mass/ruumala) naatriumnitriti lahus: lahustada 100 mg naatriumnitritit (AR) vees, viia veega 100 ml-ni ja segada. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.7. 0,5% (mass/ruumala) ammooniumsulfamaadi lahus: lahusta 500 mg ammooniumsulfamaati (AR) vees, viia veega 100 ml-ni ja segada. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.8. 0,1% (mass/ruumala) N-2-aminoetüül-1-naftüülamiindihüdrokloriidi lahus: lahustada 100 mg N-2-aminoetüül-1-naftüülamiindihüdrokloriidi (AR) 0,1% (mahu%) vesinikkloriidhappes (AR), viia sama happega 100 ml-ni ja segada. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.9. Standardaine: puhas sulfakinoksaliin. 3.10. Standardlahus: kaaluda 250 mg standardainet 0,1 mg täpsusega. Lahustada 50 ml naatriumhüdroksiidi lahuses (25 ml 0,1N naatriumhüdroksiidi (AR) lahust + 25 ml vett) 500-ml mõõtekolvis, täita kolb veega märgini ja segada. Pipeteerida 5 ml seda lahust 100-ml mõõtekolbi, täita kolb veega märgini ja segada. 1 ml saadud lahust sisaldab 25 µg sulfakinoksaliini. 4. Vahendid 4.1. 250-ml lihvkorkidega koonilised kolvid. 4.2. Loksuti. 4.3. Klaasfilterlehter (poorsus 3, läbimõõt 80 mm) koos filtreerimiskolviga. 4.4. 250-ml jaotuslehtrid. 4.5. 50-, 100-, 250- ja 500-ml mõõtekolvid. 4.6. Katseklaasid, 150 mm 25 mm. 4.7. Auruvann. 4.8. Spektrofotomeeter 20-mm küvettidega. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ettevalmistamine Jahvatada proov nii, et see läheb täielikult läbi 1-mm avadega sõela (kooskõlas soovitusega ISO R 565). 5.2. Ekstraheerimine Kaaluda 1 mg täpsusega hoolikalt peenestatud ja homogeenset proovi, mis sisaldab 0,25--1,25 mg sulfakinoksaliini. Viia analüüsitav proov 250-ml koonilisse kolbi ja lisada 20 ml N,N-dimetüülformamiidi. Segada ja kuumutada kolbi auruvannil 20 minutit. Jätta külma vee voolu alla jahtuma. Lisada 60 ml kloroformi, sulgeda kolb korgiga ja loksutada 30 minutit loksutil. Filtreerida vedelik läbi klaasfilterlehtri, kasutades kerget vaakumit. Loputada filtreerimiskolbi nelja 5 ml kloroformiportsjoniga ja filtreerida loputusvedelikud läbi lehtri. Viia filtraat jaotuslehtrisse, loputada filtreerimiskolbi ligi 15 ml kloroformiga ja viia loputusvedelik jaotuslehtrisse. 5.3. Hüdrolüüs Lisada jaotuslehtrisse 50 ml leeliselist soolalahust ja 5 ml etanooli. Emulsiooni tekkimist vältides segada kihid põhjalikult kas lehtri aeglase ümberpööramisega 20 korda või pöörates seda jala ja korgi horisontaaltelje ümber. Lasta kihtidel eralduda (eraldumine on tavaliselt lõppenud ligi 15 minuti pärast). Viia ülemine kiht (veekiht) 250-ml mõõtekolbi. Korrata kloroformikihi ekstraheerimist veel kolme 50 ml leeliselise soolalahuse portsjoniga, lisades iga vesiekstrakti mõõtekolvi sisule. Täita kolb veega märgini ja segada. Viia 25 ml lahust 50-ml mõõtekolbi, lisada 5 ml vesinikkloriidhapet, täita kolb veega märgini ja segada. Filtreerida, kui vajalik, valades ära esimese 15 ml filtraati. Viia 10 ml lahuse alikvootsed osad kahte katseklaasi A ja B. 5.4. Värvuse tekkimine ja optilise tiheduse mõõtmine Lisada igasse katseklaasi 2 ml naatriumnitriti lahust, segada ja jätta kolmeks minutiks seisma. Lisada 2 ml ammooniumsulfamaadi lahust, segada ja jätta kaheks minutiks seisma. Lisada 1 ml N-2-aminoetüül-1-naftüülamiindihüdrokloriidi lahust katseklaasi A ja 1 ml vett katseklaasi B. Segada iga katseklaasi sisu põhjalikult. Veejoapumba abil tekitada katseklaasides läbi kummühenduste kerge vaakum, et eemaldada lahustunud lämmastik. 10 minuti pärast mõõta lahuste optilised tihedused EA ja EB spektrofotomeetri abil 545 nm juures, kasutades vett võrdluslahusena. Väärtustest EA -- EB määrata proovilahuses olemasoleva sulfakinoksaliini kogus (A) varem koostatud kalibreerimisgraafiku alusel. 5.5. Kalibreerimisgraafik Viia 100-ml mõõtekolbidesse 2, 4, 6, 8 ja 10 ml standardlahust, mis vastavad 50, 100, 150, 200 ja 250 µg sulfakinoksaliinile. Lisada 8 ml vesinikkloriidhapet igasse kolbi, täita kolvid veega märgini ja segada. Pipeteerida 10 ml iga lahust (vastab 5, 10, 15, 20 ja 25 µg sulfakinoksaliinile) katseklaasidesse. Viia läbi värvuse tekkimise reaktsioon, nagu näidatud punkti 5.4 esimeses lõigus. Mõõta optilised tihedused 545 nm juures, kasutades vett võrdluslahusena. Koostada kalibreerimisgraafik, mis näitab lahuse optilise tiheduse sõltuvust sulfakinoksaliini sisaldusest (ordinaatteljel optilise tiheduse väärtused, abstsissteljel sulfakinoksaliini kogused mikrogrammides). 6. Tulemuste arvutamine Sulfakinoksaliini sisaldus mg-des proovi kg kohta antakse valemiga

kus: A -- sulfakinoksaliini kogus mikrogrammides, mis on määratud fotomeetrilise mõõtmisega; P -- analüüsitava proovi mass grammides. 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 10 mg/kg absoluutväärtuses sulfakinoksaliinisisalduste puhul vahemikus 20--100 mg/kg; -- 10% suuremast tulemusest, kui sisaldused on 100--5000 mg/kg; -- 500 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 5000--10 000 mg/kg; -- 5% suuremast tulemusest sisalduste puhul, mis on üle 10 000 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 47 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Furasolidooni määramise metoodika [(3-(5-nitrofurfurülideenamino)-oksasolidiin-2-üks)] 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata furasolidooni kogust söötades, kontsentraatides ja premiksites. Määratav miinimum on 10 mg/kg. 2. Põhimõte Furasolidoon ekstraheeritakse atsetooniga pärast proovi eelnevat ekstraheerimist petrooleetriga, et eemaldada rasva. Ekstrakt puhastatakse kromatograafiliselt alumiiniumoksiidi kolonnil ja furasolidoon elueeritakse atsetooniga. Atsetooni eluaat aurutatakse kuivaks ja jääk lahustatakse pentanoolis. Furasolidoon ekstraheeritakse seejärel pentanoolist karbamiidi vesilahusega ja ekstrakti optiline tihedus mõõdetakse 375 nm juures. 3. Reaktiivid 3.1. Atsetoon (AR) 3.2. Alumiiniumoksiid kromatograafia jaoks, neutraalne, 100--240 mesh'i, valmistatakse ette järgmiselt: segada 500 g alumiiniumoksiidi ühe liitri kuuma destilleeritud veega ja dekanteerida pealejääv vedelik. Korrata seda protseduuri kaks korda ja lõpuks filtreerida, kasutades Büchneri lehtrit. Kuivatada alumiiniumoksiid 105 °C juures konstantse kaaluni. 3.3. Pentüülatsetaat (AR) 3.4. Pentanool (AR) (isomeeride segu sisaldav reaktiiv on vastuvõetav). 3.5. Petrooleeter, keemistemperatuuri vahemik 40--60 °C. 3.6. Karbamiidilahus. Segada 90 g karbamiidi (AR) 100 ml veega, soojendada kergelt, et kindlustada täielik lahustumine. 3.7. Standardaine: puhas furasolidoon. 3.8. Standardlahus: kaaluda 25 mg standardainet 0,1 mg täpsusega, lahustada atsetoonis 250-ml mõõtekolvis, täita kolb atsetooniga märgini ja segada. 1 ml seda lahust sisaldab 100 µg furasolidooni. 4. Vahendid 4.1. Kollasest klaasist 100- ja 250-ml mõõtekolvid. 4.2. Kollasest klaasist 100-ml jaotuslehtrid. 4.3. Sobiv ekstraheerimisaparaat, nt Soxhlet või Twisselmann. 4.4. Ekstraheerimishülsid, 25 80 mm või 28 100 mm. 4.5. Klaaskolonnid kromatograafia jaoks, siseläbimõõt 10 mm, pikkus 300 mm. 4.6. Veevann. 4.7. Spektrofotomeeter 10-mm küvettidega. 5. Analüüsi käik Kõik protseduurid tuleb läbi viia vähendatud valguse juures. 5.1. Proovi ettevalmistamine Jahvatada proov nii, et see läheb täielikult läbi 1-mm avadega sõela (kooskõlas soovitusega ISO R 565). 5.2. Ekstraheerimine Kaaluda 1 mg täpsusega 5--20 g hoolikalt peenestatud ja homogeenset proovi (ei sisalda rohkem kui 1 mg furasolidooni) ekstraheerimishülssi ja viia see ekstraheerimisaparaati. Ekstraheerida petrooleetriga, kindlustades Soxhleti aparaadi puhul 13--17 lahusti tsüklit; kui kasutatakse muid ekstraheerimisaparaate, kulutatakse sellele etapile vähem kui 30 minutit. Eemaldada hülss aparaadist, valada ära lahusti jääk ja kuivatada hülss ning ekstraheeritud sööt sooja õhu voolus. Asetada kuivatatud hülss ja selle sisu puhtasse ekstraheerimisaparaati ja ekstraheerida atsetooniga, võimaldades Soxhleti aparaadi puhul vähemalt 25 lahusti tsüklit. Täieliku ekstraheerimise saavutamiseks tuleb iga aparaadi puhul ette määrata täpsed tingimused. Aurutada atsetooniekstrakt keeval veevannil mahuni 5--10 ml ja jahutada toatemperatuurini. 5.3. Kromatografeerimine Asetada kromatografeerimiskolonni alumisse otsa klaasvatitükk ja suruda see sobiva pulgaga 2--3 mm paksuseks. Valmistada atsetooniga alumiiniumoksiidi suspensioon, valada kolonni ja lasta settida. Valmistatud sammas peab olema ligi 200 mm kõrge. Lasta atsetoonikihil valguda allapoole kuni samba pealmise kihini. Viia punktis 5.2 saadud atsetooniekstrakt kolvist kolonni, loputada kolbi mitu korda atsetooniga ja viia vedelik kolonni. Asetada sobiv kolb kolonni alla ja elueerida furasolidoon atsetooniga. Atsetoonikogus, sealhulgas ka see, mida kasutatakse loputamiseks, peab olema ligi 150 ml. 5.4. Ekstraheerimine ja optilise tiheduse mõõtmine Aurutada atsetoonieluaat keeval veevannil kuivaks. (Atsetooni kondensatsiooni tõttu alumiiniumoksiidil võib jääda väike kogus diatsetoonalkoholi, kuid see ei sega järgmisi ekstraheerimisi.) Lahustada jääk 10 ml pentanoolis ja viia lahus jaotuslehtrisse. Korrata protsessi, kasutades 10 ml pentüülatsetaati loputusvedelikuna. Lõpuks loputada nõu, mis sisaldas ekstraktijääki, 10 ml karbamiidilahusega, lisada see jaotuslehtrisse ja loksutada üsna intensiivselt kaks minutit. Lasta faasidel kolm kuni neli minutit eralduda, enne kui viiakse vesiekstrakti 100-ml mõõtekolbi. Korrata loputamis- ja ekstraheerimisetappe nelja järgmise 10 ml karbamiidilahusega ja viia vesiekstraktid mõõtekolbi. Täita mõõtekolb karbamiidilahusega märgini ja segada. Mõõta lahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga 375 nm juures, kasutades karbamiidilahust võrdluslahusena. Määrata furasolidooni kogus, kasutades kalibreerimisgraafikut. 5.5. Kalibreerimisgraafik Valmistada neli kromatograafilist kolonni nagu kirjeldatud punkti 5.3 esimeses lõigus. Pipeteerida eraldi kolonnidesse standardlahust vastavalt 2,5; 5; 7,5 ja 10 ml. Pesta iga kolonni 150 ml atsetooniga ja jätkata vastavalt lõigule 5.4. Koostada kalibreerimisgraafik, mis näitab lahuse optilise tiheduse sõltuvust furasolidooni sisaldusest (ordinaatteljel optilise tiheduse väärtused, abstsissteljel furasolidooni kogused mikrogrammides). 6. Tulemuste arvutamine Furasolidoonisisaldus mg-des proovi kg kohta antakse valemiga

kus: A -- furasolidooni kogus mikrogrammides, mis on määratud fotomeetrilise mõõtmisega; P -- analüüsitava proovi mass grammides. 7. Korratavus Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 50% suuremast tulemusest, kui furasolidoonisisaldus on 10--20 mg/kg; -- 10 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 20--100 mg/kg; -- 10% suuremast tulemusest, kui sisaldused on 100--5000 mg/kg; -- 500 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 5000--10 000 mg/kg; -- 5% suuremast tulemusest, kui sisaldused on üle 10 000 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 48 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Tetratsükliini rühma antibiootikumide avastamise ja identifitseerimise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab avastada ja identifitseerida tetratsükliini rühma antibiootikume söötades, mis sisaldavad vähemalt 0,1 mg/kg antibiootikume, samuti kontsentraatides ja eelsegudes. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse metanooli ja vesinikkloriidhappe seguga. Ekstrakti ja võrdluslahuseid uuritakse tõusevpaberkromatograafia abil. Antibiootikumid avastatakse ja identifitseeritakse, võrreldes nende R f väärtusi standardainete omadega, kas fluorestsentsi abil ultraviolettvalguses (suur antibiootikumisisaldus) või bioautograafiliselt, B. cereus'ega inokuleeritud agarsöötmel. 3. Reaktiivid ja sööde 3.1. Puhverlahus, pH 3,5: -- sidrunhapemonohüdraat (AR) 10,256 g; -- dinaatriumvesinikfosfaat Na2HPO4 2H 2O (AR) 7,45 g; -- atsetoon (AR) 300 ml; -- vesi kuni 1000 ml. 3.2. Fosfaatpuhverlahus, pH 5,5: -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 (AR) 130,86 g; -- dinaatriumvesinikfosfaat Na2HPO4 2H 2O (AR) 6,947 g; -- vesi kuni 1000 ml. 3.3. Eluent I: puhta nitrometaani/puhta kloroformi/1,3-dikloropropaan2-ol segu mahuvahekorras 20/10/1,5. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.4. Eluent II: puhta nitrometaani/puhta kloroformi/2-pikoliini segu mahuvahekorras 20/10/3. Valmistada vahetult enne kasutamist. 3.5. Puhta metanooli/vesinikkloriidhappe (tihedus 1,19 g/ml) segu mahuvahekorras 98/2. 3.6. Vesinikkloriidhape 0,1N. 3.7. Ammoniaagi vesilahus, tihedus 0,91 g/ml. 3.8. Standardained: kloortetratsükliin, oksütetratsükliin, tetratsükliin, mille aktiivsus väljendatakse hüdrokloriidvormi kohta. 3.9. Mikroorganism B. cereus ATCC nr 11.778 Tüvikultuuri säilitamine, spoorsuspensiooni valmistamine ja söötme inokuleerimine: järgida juhiseid, mis on antud kloortetratsükliini, oksütetratsükliini ja tetratsükliini difusiooni teel agarsöötmel määramismetoodika punktides 3.1 ja 3.2. 3.10. Sööde(18): -- glükoos 1 g; -- trüptiline peptoon 10 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- pärmiekstrakt 3 g; -- agar 20 g; -- vesi kuni 1000 ml. Vahetult enne kasutamist reguleerida pH väärtuseni 5,8. 3.11. 2,3,5-trifenüültetrasooliumkloriidi 0,1% (mass/ruumala) lahus ja 5% (mass/ruumala) glükoosilahus. 4. Vahendid 4.1. Tõusevpaberkromatograafia vahendid (paberi kõrgus 25 cm). Schleicheri ja Schuelli paber (2040 b või 2043 b) või nendega samaväärne paber. 4.2. Tsentrifuug. 4.3. Inkubaator, mis on seatud temperatuurile 30 °C. 4.4. Ultraviolettlamp fluorestsentsi kindlakstegemiseks. 4.5. Klaasplaadid ligikaudu 20 30 cm bioautograafia jaoks. 5. Standardlahused 5.1. Lähtelahused Valmistada standardainetest vesinikkloriidhappe abil kloortetratsükliin-HCl, oksütetratsükliin-HCl ja tetratsükliin-HCl lahused kontsentratsioonidega 500 µg/ml. 5.2. Võrdluslahused ultraviolettvalguse abil avastamiseks Lahjendada lahused fosfaatpuhverlahusega, et saada lahused, mille kloortetratsükliin-HCl, oksütetratsükliin-HCl ja tetratsükliin-HCl lahused kontsentratsioonidega 100 µg/ml. 5.3. Võrdluslahused bioautograafiliseks avastamiseks Lahjendada lahused fosfaatpuhverlahusega, et saada lahused, mille kloortetratsükliin-HCl, oksütetratsükliin-HCl ja tetratsükliin-HCl lahused kontsentratsioonidega 5 µg/ml. Suspendeerida proov segus ja tsentrifuugida. Koguda sademe peal olev vedelik ning kasutada seda või vajaduse korral lahjendada seguga, et saada antibiootikumi kontsentratsioonid ligikaudu 100 µg/ml ja 5 µg/ml. 6. Ekstraheerimine Kui eeldatav antibiootikumisisaldus on väiksem kui 10 mg/kg, võib kasutada kas homogeniseeritud proovi või sõelumisel saadud kõige peenemat fraktsiooni, sest antibiootikume leitakse põhiliselt selles fraktsioonis. 7. Avastamine ja identifitseerimine 7.1. Kromatograafia abil Kasta paber puhverlahusesse pH väärtusega 3,5. Eemaldada liigne vedelik, vajutades paberit kahe kuiva filterpaberilehe vahel. Seejärel paigutada paberile á 0,01 ml võrdluslahuseid ja ekstrakti. Hea eralduse saamiseks peab paber olema õige niiskusesisaldusega; vajaduse korral lasta vähe aega kuivada. Elueerida tõusevpaberkromatograafia abil. Bioautograafiliseks avastamiseks kasutada eluenti I ja ultraviolettvalguse abil avastamiseks eluenti II. Kui lahusti front on liikunud 15--20 cm (umbes 1 tund 30 minutit), lõpetada kromatografeerimine ja kuivatada paber. 7.2. Avastamine ultraviolettkiirguse abil Kui antibiootikumide sisaldus on suurem kui 1 µg/cm2 kohta, on pärast kromatogrammi töötlemist ammoniaagiaurudega ultraviolettlambiga kiiritamisel näha kuldkollased fluorestseeruvad laigud. 7.3. Bioautograafiline avastamine Valada sööde, kuhu on eelnevalt inokuleeritud B. cereus , klaasplaatidele ja asetada paber söötmele. Pärast 5-minutist kontakti eemaldada paber ning asetada see söötme teise punkti, kuhu see jääb inkubatsiooni ajaks. Inkubeerida üleöö temperatuuril 30 °C. Kui esineb tetratsükliini rühma antibiootikume, ilmuvad hägusesse söötmesse heledad inhibitsioonitsoonid. Kromatogrammi fikseerimiseks aurustatakse lahus paberil pärast inkubeerimist. 7.4. Identifitseerimine Tetratsükliini rühma antibiootikumide suhtelised Rf väärtused on antud allpool (need väärtused võivad olenevalt paberi kvaliteedist ja niiskusesisaldusest veidi varieeruda): -- kloortetratsükliin (CTC) 0,60; -- tetratsükliin (TC) 0,40; -- oksütetratsükliin (OTC) 0,20; -- 4-epi-CTC 0,15; -- 4-epi-TC 0,13; -- 4-epi-OTC 0,10. «epi» ühendite antibiootiline aktiivsus on normaalühendite omast väiksem. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 49 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Kloortetratsükliini, oksütetratsükliini ja tetratsükliini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata kloortetratsükliini (CTC), oksütetratsükliini (OTC) ja tetratsükliini (TC) sisaldust söötades, kontsentraatides ja premiksites, kus seda on olemas üle 5 mg/kg. Sisaldust alla 5 mg/kg võib hinnata graafilise interpolatsiooni abil. 2. Põhimõte 50 mg/kg või väiksema sisalduse puhul ekstraheeritakse proov lahjendatud formamiidiga. Üle 50 mg/kg sisalduse puhul ekstraheeritakse proov atsetooni, vee ja vesinikkloriidhappe seguga CTC määramiseks ning metanooli ja vesinikkloriidhappe seguga OTC ja TC määramiseks. Seejärel ekstraktid lahjendatakse ning määratakse nende antibiootiline aktiivsus, mõõtes CTC, OTC või TC difusiooni agarsöötmel, kuhu on külvatud B. cereus. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt on proportsionaalne antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga. 3. Mikroorganism: B. cereus, ATCC NR 11.778 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida söötmest võetud metüleensinise- ja boorhappevabasse längagariga katseklaasi B. cereus. Inkubeerige üleöö temperatuuril umbes 30 °C. Hoida kultuuri külmkapis ja inokuleerida längagarit sellega uuesti iga 14 päeva järel. 3.2. Spoorsuspensiooni valmistamine Koguda längagariga katseklaasist baktereid, kasutades 2--3 ml füsioloogilist lahust. See suspensioon külvake metüleensinise ja boorhappevabasse, 300 ml söödet sisaldavasse Roux pudelisse, milles agarikontsentratsioon on 3--4%. Inkubeerida 3--5 päeva temperatuuril 28--300C, seejärel koguda spoorid 15 ml-sse etanooli pärast seda, kui sporulatsiooni on mikroskoobi abil kontrollitud ja segada. See suspensioon säilib külmkapis viis kuud või kauem. Viia läbi eelkatsed plaatidel, kus on analüüsi põhisööde, teha kindlaks inokulumi kogus, mis annab kasutatava antibiootikumi erinevate kontsentratsioonide puhul suurimad võimalikud inhibitsioonitsoonid, mis on veel selged. Tavaliselt on see kogus 0,2--0,3 ml 1000 ml kohta. Sööde inokuleeritakse temperatuuril 50--60°C. 4. Sööde ja reaktiivid 4.1. Analüüsi põhisööde(19): -- glükoos 1 g; -- trüptiline peptoon 10 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- pärmiekstrakt 3 g; -- agar, vastavalt kvaliteedile 10--20 g; -- «Tween 80» 1 ml; -- fosfaatpuhverlahus, pH 5,5 (4.2) 10 ml; -- 5% (mass/ruumala) boorhappelahus 15 ml; -- metüleensinise 0,5% etanoolilahus 4 ml; -- vesi kuni 1000 ml. Enne kasutamist reguleerida pH väärtuseni 5,8. 4.2. Fosfaatpuhverlahus, pH 5,5: -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4(AR) 130,86 g; -- dinaatriumvesinikfosfaat Na2HPO4 2H 2O (AR) 6,947 g; -- vesi kuni 1000 ml. 4.3. Fosfaatpuhverlahus, pH 5,5; lahjendatud 1/10. 4.4. Fosfaatpuhverlahus, pH 8: -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 (AR) 1,407 g; -- dinaatriumvesinikfosfaat Na2HPO4 2H 2O (AR) 57,539 g; -- vesi kuni 1000 ml. 4.5. Steriilne füsiloogiline lahus. 4.6. 20% (mahu%) etanool. 4.7. Vesinikkloriidhape 0,1N. 4.8. 70% (mahu%) formamiid: valmistada enne kasutamist ning reguleerida väävelhappe (ligikaudu 2N) abil pH väärtuseni 4,5. 4.9. Puhta atsetooni/vee/vesinikkloriidhappe (tihedus 1,19 g/ml)) segu mahuvahekorras 65/33/2. 4.10. Puhta metanooli/vesinikkloriidhappe (tihedus 1,19 g/ml) segu mahuvahekorras 98/2. 4.11. Standardained: kloortetratsükliin, oksütetratsükliin, tetratsükliin, mille aktiivsus väljendatakse hüdrokloriidvormi kohta. 5. Standardlahused 5.1. Kloortetratsükliin Valmistada standardainest vesinikkloriidhappe abil lähtelahus, mille kontsentratsioon vastab 500 µg/ml kloortetratsükliin-HCl. See lahus säilib külmkapis ühe nädala. Sellest lähtelahusest valmistada tööstandardlahus S8 , mille kontsentratsioon vastab 0,2 µg/ml kloortetratsükliin-HCl. Lahjendamisel kasutatakse fosfaatpuhverlahust pH väärtusega 5,5, lahjendatud 1/10, millele on lisatud 0,01% amidomusta(20). Seejärel valmistada järjestikuste lahjendustega (1/1), kasutades puhverlahust, järgmiste kontsentratsioonidega lahused: -- S4 0,1 µg/ml; -- S2 0,05 µg/ml; -- S1 0,025 µg/ml. 5.2. Oksütetratsükliin Toimides vastavalt punktis 5.1 kirjeldatule valmistada lähtelahusest, mille kontsentratsioon vastab 400 µg/ml oksütetratsükliin-HCl, tööstandardlahus S8, mis sisaldab 1,6 µg/ml oksütetratsükliin-HCl ning järgmiste kontsentratsioonidega lahused: S4 0,8 µg/ml; S2 0,4 µg/ml; S1 0,2 µg/ml. 5.3. Tetratsükliin Toimides vastavalt punktis 5.1 kirjeldatule valmistada lähtelahusest, mille kontsentratsioon vastab 500 µg/ml tetratsükliin-HCl, tööstandardlahus S8, mis sisaldab 1,0 µg/ml tetratsükliin-HCl ning järgmiste kontsentratsioonidega lahused: S4 0,5 µg/ml; S2 0,25 µg/ml; S1 0,125 µg/mg. 6. Ekstraheerimine 6.1. Sisalduste puhul 50 mg/kg või vähem Lisada analüüsitavale proovile formamiidi koguses, mis on näidatud allpool olevas tabelis. Loksutada 30 minutit loksutil. Seejärel lahjendada kohe fosfaatpuhverlahusega vastavalt allpool olevas tabelis osutatule, et saada kontsentratsioon U8. Selle lahuse formamiidikontsentratsioon ei tohi ületada 40%. Tsentrifuugida või dekanteerida, et saada selge lahus. Seejärel valmistada järjestikuste lahjendustega (1/1) kontsentratsioonid U 4, U2 ja U1, kasutades fosfaatpuhverlahust. Viia 20 ml ekstrakti mõõtekolbi mahuga 100 ml ja täita kolb puhverlahusega märgini. Viia 4 ml ekstrakti mõõtekolbi mahuga 100 ml ja täita kolb puhverlahusega märgini. Antibiootikum CTC OTC TC Eeldatav sisaldus, mg/kg 10 50 10 50 10 50 Analüüsitav proov, g 10 10 24 9,6 20 10 Formamiidi (4.8) ruumala, ml 100 100 80 100 80 100 Fosfaatpuhverlahuse (4.3) ruumala, ml lahj. 1:5 (a) lahj. 1:25 (b) 70 200 120 lahj. 1:5 (a) U8 kontsentratsioon, µg/ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0 6.2. Sisaldused suuremad kui 50 mg/kg 6.2.1. Kloortetratsükliin Lisada analüüsitavale proovile, mis olenevalt selle eeldatavast antibiootikumisisaldusest või valmistaja garantiist kaalub 2--10 g, selle mahust 20 korda rohkem segu. Loksutada 30 minutit loksutil. Ekstraheerimise ajal peab pH jääma alla 3; vajaduse korral reguleerida uuesti pH väärtuseni 3 (kasutades mineraalühendite tarvis 10% äädikhapet). Võtta ekstrakti alikvootne osa ning reguleerida fosfaatpuhverlahuse (pH 8) abil pH väärtuseni 5,5 broomkresoolrohelise juuresolekul (muutub kollasest siniseks). Lahjendada fosfaatpuhverlahusega (pH 5,5, lahjendatud 1/10), et saada kontsentratsioon U8 (vt punkti 6.1). Seejärel valmistada järjestikuste lahjendustega (1/1) kontsentratsioonid U4, U2 ja U1, kasutades fosfaatpuhverlahust. 6.2.2. Oksütetratsükliin ja tetratsükliin Toimida vastavalt punktis 6.2.1 kirjeldatule, kasutades punktis 4.9 toodud segu asemel punktis 4.10 toodud segu. 7. Analüüsi käik 7.1. Söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi põhisöötmesse spoorsuspensioon temperatuuril 50--60 °C. 7.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel, kasutades nelja kontsentratsiooniga standardlahuseid (S8, S4, S 2, S1) ja nelja kontsentratsiooniga ekstrakte (U8, U4, U2 , U1). Need neli ekstrakti ja neli standardlahust tuleb paigutada igale plaadile. Valida plaadid, mis on piisavalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, ning et nende keskpunktide vahele jääks vähemalt 30 mm. Eelistatavalt tuleb katse läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, millele on pandud alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm. Valada plaatidele inokuleeritud söötme selline kogus, et saada ühtlane, umbes 2 mm paksune kiht. Teha söötmesse augud ja asetada nendesse täpselt mõõdetud analüüsitavate ja standardlahuste kogused (0,10--0,15 ml augu kohta olenevalt augu läbimõõdust). Paigutada iga kontsentratsiooniga lahust vähemalt neli korda, nii et iga määramine kujutab endast 32 inhibitsioonitsooni hindamist. 7.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate umbes 18 tundi temperatuuril 28--30 °C. 8. Tulemuste hindamine Mõõta inhibitsioonitsoonide läbimõõt, eelistatavalt projektsiooni abil. Kanda poollogaritmilisele paberile kontsentratsioonide logaritmid ja neile vastavad inhibitsioonitsoonide läbimõõdud. Jälgida standardlahuse ja ekstrakti jooni, mis saadakse graafikul vastavaid punkte ühendades. Segavate tegurite puudumise korral on need kaks joont paralleelsed. Suhtelise aktiivsuse logaritm arvutatakse järgmise valemi abil

Tegelik aktiivsus = eeldatav aktiivsus suhteline aktiivsus. 9. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10% (suhteline väärtus). Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 50 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Kloortetratsükliini, oksütetratsükliini ja tetratsükliini turbidimeetrilise määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata kloortetratsükliini (CTC), oksütetratsükliini (OTC) ja tetratsükliini (TC) sisaldust söötades, kui nende kontsentratsioonid on suuremad kui 1 g/kg tingimusel, et puudub ekstrakte hägustavate muude ainete segav mõju. Meetod on kiirem kui difusioon agaril. 2. Põhimõte CTC määramiseks ekstraheeritakse proovi atsetooni, vee ja vesinikkloriidhappe seguga; OTC ja TC määramiseks ekstraheeritakse proovi metanooli ja vesinikkloriidhappe seguga. Seejärel lahjendatakse ekstraktid ning määratakse nende antibiootiline mõju, mõõtes valguse läbilaskvust söötmes, millesse on külvatud Staphylococcus aureus ning millele on lisatud vastavat antibiootikumi. Valguse läbilaskvus sõltub antibiootikumi kontsentratsioonist. 3. Mikroorganism: Staphylococcus aureus K 141 (21) 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida S. aureus söötmest võetud längagariga katseklaasi, millesse on lisatud 1,5--3% agarit (olenevalt kvaliteedist). Inkubeerida üleöö temperatuuril 37 °C. Hoida kultuuri külmkapis ja inokuleerida längagarit sellega uuesti iga nelja nädala järel. Samal ajal valmistada ette subkultuurid laboratoorseks kasutamiseks. 3.2. Inokulumi ettevalmistamine 24 tundi enne kasutamist inokuleerida längagarit uuesti subkultuuriga ja inkubeerida üleöö temperatuuril 37 °C. Suspendeerida kogu agarikatseklaasis sisalduv kultuur umbes 2 ml põhisöötmes, seejärel viia suspensioon steriilsetes tingimustes umbes 100 ml-sse samasse põhisöötmesse. Inkubeerida veevannis temperatuuril 37 °C, kuni mikroobitüve kasv läheb üle oma logaritmilisse faasi (1,5--2 t). 4. Sööde ja reaktiivid 4.1. Analüüsi põhisööde(22) -- peptoon 5 g; -- pärmiekstrakt 1,5 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- naatriumkloriid 3,5 g; -- glükoos 1,0 g; -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 (AR) 1,32 g; -- dikaaliumvesinikfosfaat K2HPO4 (AR) 3,68 g; -- vesi kuni 1000 ml. Steriliseerimisjärgne pH väärtus 6,8--7,0. 4.2. Fosfaatpuhverlahus, pH 4,5: -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 (AR) 13,6 g; -- vesi kuni 1000 ml. 4.3. Vesinikkloriidhape 0,1N. 4.4. Puhta atsetooni/vee/vesinikkloriidhappe (tihedus 1,19 g/ml) segu mahuvahekorras 65/33/2. 4.5. Puhta metanooli/vesinikkloriidhappe (tihedus 1,19 g/ml) segu mahuvahekorras 98/2. 4.6. Formaldehüüdi ligikaudu 10% (mass/ruumala) lahus. 4.7. Standardained: kloortetratsükliin (CTC), oksütetratükliin (OTC), tetratsükliin (TC), mille aktiivsus väljendatakse hüdrokloriidvormi kohta. 5. Standardlahus Kasutades vesinikkloriidhapet valmistada standardainetest lähtelahused, mille kontsentratsioonid vastavad 400--500 µg/ml kloortetratsükliin-HCl (CTC-HCl), oksütetratsükliin-HCl (OTC-HCl) või tetratsükliin-HCl (TC-HCl). Need lahused säilivad külmkapis ühe nädala. 6. Ekstraheerimine 6.1. Kloortetratsükliin Paigutada 1--2 g analüüsitavat proovi mõõtekolbi mahuga 200 või 250 ml. Lisada ligikaudu 100 ml segu ja loksutada 30 minutit loksutil. Täita kolb fosfaatpuhverlahusega (pH 4,5) märgini. Segada ja jätta selginema. 6.2. Oksütetratsükliin ja tetratsükliin Paigutada 1--2 g analüüsitavat proovi mõõtekolbi mahuga 200 või 250 ml. Lisada ligikaudu 100 ml segu ja loksutada 30 minutit loksutil. Täita kolb fosfaatpuhverlahusega (pH 4,5) märgini. Segada ja jätta selginema. 7. Analüüsi käik 7.1. Standardseeriate ja ekstrakti ettevalmistamine Lahjendada standardlahus ja ekstrakt fosfaatpuhverlahusega (pH 4,5), et saada kontsentratsioonide seeria. Iga määramise tarvis koostatakse vastava kontsentratsiooni kohta kalibreerimisgraafik, mis võimaldab interpoleerida vähemalt kaks väärtust, mis on seotud ekstraktiga. Lahjendused tuleb valida vastavalt tüvikultuuri kasvatamise tingimustele, mis võivad eri laboratooriumides olla erinevad. Üldiselt on analüüsi käik järgmine: 7.1.1. Kloortetratsükliin Lahjendada standardlahus fosfaatpuhverlahusega, et saada tööstandardlahus, mille kontsentratsioon vastab 0,2 µg/ml CTC-HCl. Seejärel valmistada katseklaasides fosfaatpuhverlahuse abil vastavalt järgmises tabelis toodule kuus lahjendust, iga lahjendus dublikaadis. Tööstandardlahus, ml Fosfaatpuhverlahus (4.2), ml CTC-HCl kontsentratsioon (µg/ml) 0,7 0,3 0,14 0,6 0,4 0,12 0,55 0,45 0,11 0,45 0,55 0,09 0,4 0,6 0,08 0,3 0,7 0,06 Lahjendada ekstrakt fosfaatpuhverlahusega, et saada eeldatav CTC-HCl kontsentratsioon 0,12 µg/ml. Paigutada kahte katseklaasi á 1 ml ja kahte teise katseklaasi á 0,75 ml (= 0,09 µg) lahust. Lisada kahte viimasesse katseklaasi fosfaatpuhverlahust kuni 1 ml-ni. 7.1.2. Oksütetratsükliin ja tetratsükliin Lahjendada standardlahus fosfaatpuhverlahusega, et saada tööstandardlahus, mille kontsentratsioon vastab 0,6 µg/ml OTC-HCl või TC-HCl. Seejärel valmistada katseklaasides fosfaatpuhverlahuse abil vastavalt järgmises tabelis toodule seitse lahjendust, iga lahjendus dublikaadis. Tööstandardlahus, ml Fosfaatpuhverlahus (4.2), ml OTC-HCl või TC-HCl kontsentratsioon (µg/ml) 0,9 0,1 0,54 0,8 0,2 0,48 0,7 0,3 0,42 0,6 0,4 0,36 0,4 0,6 0,24 0,3 0,7 0,18 0,2 0,8 0,12 Lahjendada ekstrakt fosfaatpuhverlahusega, et saada eeldatav OTC-HCl või TC-HCl kontsentratsioon 0,48 µg/ml. Paigutada kahte katseklaasi á 1 ml ja kahte teise katseklaasi á 0,5 ml (= 0,24 µg) seda lahust. Lisada kahte viimasesse katseklaasi fosfaatpuhverlahust kuni 1 ml-ni. 7.2. Söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi põhisöötmesse inokulum, et saada fotomeetriga lainepikkusel 590 nm 85% valguse läbilaskvus 5-cm küvetis või 92% valguse läbilaskvus 2-cm küvetis, kusjuures aparaat on seatud 100% läbilaskvusele inokuleerimata põhisöötme puhul. 7.3. Külvamine Paigutada igasse katseklaasi 9 ml inokuleeritud söödet. Katseklaasid tuleb täita puhastes, kuid mitte tingimata steriilsetes tingimustes. 7.4. Inkubeerimine Inkubeerimine peab toimuma veevannis, mis hoitakse segades ühtlasel temperatuuril 37 ± 0,1 °C. Valitud inkubeerimisaeg (tavaliselt 2,5--3 t) peab võimaldama täpseks mõõtmiseks sobivate valguse läbilaskvusgraafikute saamist. Seejärel tõkestada edasine kasv, süstides igasse katseklaasi kiiresti 1 ml formaldehüüdilahust. 7.5. Kasvu mõõtmine Mõõta valguse läbilaskvus fotomeetriga lainepikkusel 590 nm, seades aparaadi läbilaskvuse näidule 100% kõige selgema standardlahuse puhul (vastab suurimale antibiootikumisisaldusele). Et eri katseklaasides ilmnevad väikesed hägususe erinevused, tuleb kasutada vähemalt 2-cm ja eelistatavalt 5-cm küvette. 8. Tulemuste hindamine Koostada millimeetripaberil kalibreerimisgraafik, kandes sinna antibiootikumi kontsentratsioonid ja neile vastavad valguse läbilaskvuse väärtused. Interpoleerida sellel graafikul ekstrakti valguse läbilaskvuse väärtused. Arvutada proovi antibiootikumisisaldus. 9. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10% (suhteline väärtus). Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 51 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Oleandomütsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab ka tetratsükliinide esinemise korral määrata söötade, kontsentraatide ja premiksite oleandomütsiinisisalduse, kui sisaldus on suurem kui 0,5 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse tri-(hüdroksümetüülamino)-metaani lahjendatud metanoolilahusega. Pärast tsentrifuugimist lahjendatakse ekstrakti ja tehakse kindlaks selle antibiootiline aktiivsus, mõõtes oleandomütsiini difusiooni agarsöötmel, kuhu on külvatud B. cereus. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt on proportsionaalne antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga. 3. Mikroorganism: B. cereus K 250 TR (23) (tetratsükliinide suhtes resistentne) 3.1. Inokuleerida B. cereus söötmest võetud längagariga katseklaasi, kuhu on lisatud 5 ml lahust, mis sisaldab 100 µg oksütetratsükliini. Inkubeerida üleöö temperatuuril umbes 30 °C. Hoida kultuuri külmkapis ja inokuleerida längagarit sellega uuesti iga nelja nädala järel. 3.2. Spoorsuspensiooni valmistamine Koguda längagariga katseklaasist baktereid, kasutades umbes 3 ml füsioloogilist lahust. Suspensioon külvata 300 ml söödet sisaldavasse Roux pudelisse, milles agarikontsentratsioon on 3--4%. Inkubeerida 3--5 päeva temperatuuril 28--30 °C, seejärel koguda spoorid 15 ml-sse etanooli pärast seda, kui olete sporulatsiooni mikroskoobi abil kontrollinud ja segada. Suspensioon säilib külmkapis viis kuud või kauem. Viies läbi eelkatsed plaatidel, kus on analüüsi põhisööde, teha kindlaks inokulumi kogus, mis annab kasutatava oleandomütsiini erinevate kontsentratsioonide puhul suurimad võimalikud inhibitsioonitsoonid, mis on veel selged. Tavaliselt on see kogus 0,1--0,2 ml 1000 ml kohta. Sööde inokuleeritakse temperatuuril 60 °C. 4. Söötmed ja reaktiivid 4.1. Tüvikultuuri säilitussööde(24): -- glükoos 1 g; -- trüptiline peptoon 10 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- pärmiekstrakt 3 g; -- agar, vastavalt kvaliteedile 10--20 g; -- vesi kuni 1000 ml. Reguleerida pH väärtuseni 6,5 vahetult enne kasutamist. 4.2. Analüüsi põhisööde(2) Sööde, mille pH on reguleeritud väärtuseni 8,8. 4.3. Steriilne füsioloogiline lahus. 4.4. 20% (mahu%) etanool. 4.5. Puhas metanool. 4.6. Tri-(hüdroksümetüülamino)-metaani (AR) 0,5% (mass/ruumala) lahus. 4.7. Ekstraheerimislahus: -- puhas metanool 50 ml; -- vesi 50 ml; -- tri-(hüdroksümetüülamino)-metaan (AR) 0,5 g. 4.8. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega oleandomütsiin. 5. Standardlahus Lahustada 5 ml metanoolis veidi standardainet ja lahjendada punktis 4.6 toodud lahusega, et saada oleandomütsiini kontsentratsioon 100 µg/ml. Sellest lähtelahusest valmistada 0,1 µg/ml oleandomütsiini sisaldav tööstandardlahus S8, lahjendades punktis 4.6 toodud lahusega. Seejärel valmistada järjestikuste lahjendustega (1/1), kasutades punktis 4.6 toodud lahust, järgmiste kontsentratsioonidega lahused: -- S4 0,05 µg/ml; -- S2 0,025 µg/ml; -- S1 0,0125 µg/ml. 6. Ekstraheerimine Võtta analüüsitavat proovi, olenevalt selle eeldatavast oleandomütsiinisisaldusest 2--10 g, lisada 100 ml ekstraheerimislahust ja loksutada 30 minutit loksutil. Tsentrifuugida, võtta ekstrakti alikvootne osa ja lahjendada punktis 4.6 toodud lahusega, et saada eeldatav oleandomütsiini kontsentratsioon 0,1 µg/ml (= U8). Seejärel valmistada järjestikuste lahjendustega (1/1) kontsentratsioonid U4 , U2 ja U1, kasutades punktis 4.6 toodud lahust. 7. Analüüsi käik 7.1. Söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi põhisöötmesse spoorsuspensioon temperatuuril 60 °C. 7.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel, kasutades nelja kontsentratsiooniga standardlahuseid (S8, S4, S 2, S1) ja nelja kontsentratsiooniga ekstrakte (U8, U4, U2, U1). Need neli ekstrakti ja standardlahust tuleb paigutada igale plaadile. Valida plaadid, mis on piisavalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, ning et nende keskpunktide vahele jääks vähemalt 30 mm. Eelistatavalt tuleb katse läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, mille pinnal on täiesti ühetasane 200-mm läbimõõduga ja 20 mm kõrge alumiinium- või plastikrõngas. Valada plaatidele teatav kogus inokuleeritud söödet, et saada umbes 2 mm paksune kiht. Teha söötmesse augud ja asetada nendesse täpselt mõõdetud analüüsitavate ja standardlahuste kogused (0,10--0,15 ml augu kohta vastavalt augu läbimõõdule). Paigutada iga kontsentratsiooniga lahust vähemalt neli korda, nii et iga määramine kujutab endast 32 inhibitsioonitsooni hindamist. 7.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate umbes 18 tundi temperatuuril 28--30 °C. 8. Tulemuste arvutamine Mõõta inhibitsioonitsoonide läbimõõt, eelistatavalt projektsiooni abil. Kanda poollogaritmilisele paberile kontsentratsioonide logaritmid ja neile vastavad inhibitsioonitsoonide läbimõõdud. Jälgida standardlahuse ja ekstrakti jooni, mille saate graafikul vastavaid punkte ühendades. Segavate tegurite puudumise korral on need kaks joont paralleelsed. Suhtelise aktiivsuse logaritm arvutatakse järgmise valemi abil

Tegelik aktiivsus = eeldatav aktiivsus suhteline aktiivsus. 9. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10% (suhteline väärtus). Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 52 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Tülosiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata söötade, kontsentraatide ja premiksite tülosiinisisalduse, kui sisalduc on suurem kui 2 mg/kg. 2. Põhimõte Proovi töödeldakse fosfaatpuhverlahusega pH väärtusega 8, mis on eelnevalt kuumutatud temperatuurini 80 °C ning ekstraheeritakse seejärel metanooliga. Pärast tsentrifuugimist lahjendatakse ekstrakt ja tehakse kindlaks selle antibiootiline aktiivsus, mõõtes tülosiini difusiooni agarsöötmel, kuhu on külvatud Sarcina lutea. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt on proportsionaalne antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga. 3. Mikroorganism: Sarcina lutea ATCC NR 9341 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida Sarcina lutea söötmest võetud längagariga katseklaasi; reguleerida pH väärtuseni 7,0. Inkubeerida üleöö temperatuuril umbes 35 °C. Hoida kultuuri külmkapis ja inokuleerida agarit sellega uuesti igal kuul. 3.2. Baktersuspensiooni valmistamine Koguda hiljuti ettevalmistatud längagariga katseklaasist baktereid, kasutades 2--3 ml füsioloogilist lahust. Suspensioon külvake 250 ml põhisöödet sisaldavasse Roux pudelisse. Enne suspensiooni külvamist tuleb söötme pH reguleerida väärtuseni 7,0. Inkubeerida 24 tundi temperatuuril 35 °C, seejärel koguda bakterid 25 ml füsioloogilisse lahusesse. Segada ja lahjendada suspensioon, et saada lainepikkusel 650 nm valguse läbilaskvus umbes 75 %. Külmkapis säilitamise korral võib seda suspensiooni kasutada ühe nädala. Viies läbi eelkatsed plaatidel, kus on analüüsi põhisööde, teha kindlaks inokulumi kogus, mis annab kasutatava tülosiini erinevate kontsentratsioonide puhul suurimad võimalikud inhibitsioonitsoonid, mis on veel selged. Sööde inokuleeritakse temperatuuril 48--50 °C. 4. Söötmed ja reaktiivid 4.1. Analüüsi põhisööde(25): -- glükoos 1 g; -- trüptiline peptoon 10 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- pärmiekstrakt 3 g; -- agar, vastavalt kvaliteedile 10--20 g; -- vesi kuni 1000 ml. Vahetult enne kasutamist reguleerida pH väärtuseni 7,0 tüvikultuuri säilitamiseks ja baktersuspensiooni valmistamiseks ning pH väärtuseni 8,0 analüüsi jaoks. 4.2. Fosfaatpuhverlahus pH 8: -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 (AR) 0,523 g; -- dikaaliumvesinikfosfaat K2HPO4 (AR) 16,730 g; -- vesi kuni 1000 ml. 4.3. Fosfaatpuhverlahuc pH 7: -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 (AR) 5,5 g; -- dikaaliumvesinikfosfaat K2HPO4 (AR) 13,6 g; -- vesi kuni 1000 ml. 4.4. Steriilne füsioloogiline lahus. 4.5. Puhas metanool. 4.6. 40% (mahu%) metanool. 4.7. Fosfaatpuhverlahuse puhta metanooli segu mahuvahekorras 60/40. 4.8. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega tülosiin. 5. Standardlahused Kuivatada standardainet vaakumkuivatuskapis (rõhk 5 mm Hg) kolm tundi temperatuuril 60 °C. Kaaluda 10--50 mg, lahustada mõõtekolvis 5 ml metanoolis ja lahjendada lahus fosfaatpuhverlahusega pH 7, et saada tülosiini lähtelahus kontsentratsiooniga 1000 µg/ml. Valmistada sellest lähtelahusest 2 µg/ml tülosiini sisaldav tööstandardlahus S8, lahjendades punktis 4.7 toodud seguga. Seejärel valmistada järjestikuste lahjendustega (1/1), kasutades punktis 4.7 toodud segu, järgmiste kontsentratsioonidega lahused: -- S4 1 µg/ml; -- S2 0,5 µg/ml; -- S1 0,25 µg/ml. 6. Ekstraheerimine Kontsentraatide analüüsiks võtta 10-grammine proov, premiksite ja söötade jaoks 20-grammine proov. Lisada 60 ml fosfaatpuhverlahust pH 8, mis on eelnevalt kuumutatud temperatuurini 80 °C, ja segada 2 minutit (kodumikser, Ultra-Turrax vms). Jätta 10 minutiks seisma, lisada 40 ml metanooli ja segada 5 minutit. Tsentrifuugida ekstrakt ja lahjendada selle alikvootne osa punktis 4.7 toodud seguga, et saada eeldatav tülosiini kontsentratsioon 2 µg/ml (= U 8). Seejärel valmistada järjestikuste lahjendustega (1/1), kasutades punktis 4.7 toodud segu, kontsentratsioonid U4, U 2 ja U1. Sisalduste puhul, mis on väiksemad kui 10 mg/kg, aurutada ekstrakt kuivaks rootoraurutis temperatuuril 35 °C ning lahustada jääk 40% metanoolis. 7. Analüüsi käik 7.1. Söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi põhisöötmesse (reguleerida pH väärtuseni 8,0) baktersuspensiooni temperatuuril 48--50 °C. 7.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel, kasutades nelja kontsentratsiooniga standardlahuseid (S8, S4, S 2,, S1) ja nelja kontsentratsiooniga ekstrakte (U8 , U4, U2, U1). Need neli ekstrakti ja neli standardlahust tuleb paigutada igale plaadile. Valida plaadid, mis on piisavalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, nii et nende keskpunktide vahele jääks vähemalt 30 mm. Eelistatavalt tuleb katse läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, mille pinnal on täiesti ühetasane 200-mm läbimõõduga ja 20 mm kõrge alumiinium- või plastikrõngas. Valada plaatidele teatav kogus inokuleeritud söödet, et saada umbes 2 mm paksune kiht. Teha söötmesse augud ja paigutada nendesse täpselt mõõdetud analüüsitavate ja standardlahuste kogused (0,10--0,15 ml augu kohta vastavalt augu läbimõõdule). Paigutada iga kontsentratsiooniga lahust vähemalt neli korda, nii et iga määramine kujutab endast 32 inhibitsioonitsooni hindamist. 7.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate üleöö temperatuuril 35--37 °C. 8. Tulemuste arvutamine Mõõta inhibitsioonitsoonide läbimõõt, eelistatavalt projektsiooni abil. Kanda poollogaritmilisele paberile kontsentratsioonide logaritmid ja neile vastavad inhibitsioonitsoonide läbimõõdud. Jälgida standardlahuse ja ekstrakti jooni, mille saab graafikul vastavaid punkte ühendades. Segavate tegurite puudumise korral on need kaks joont paralleelsed. Suhtelise aktiivsuse logaritm arvutatakse järgmise valemi abil

Tegelik aktiivsus = eeldatav aktiivsus suhteline aktiivsus. 9. Korratavus Ühe ja sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10% (suhteline väärtus). Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 53 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Virginiamütsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata söötade ja premiksite virginiamütsiinisisalduse. Määratav miinimum on 2 mg/kg (26). 2. Põhimõte Proovi ekstraheeritakse Tween 80 metanoolilahusega. Ekstrakt dekanteeritakse või tsentrifuugitakse ja lahjendatakse. Selle antibiootiline aktiivsus tehakse kindlaks, mõõtes virginiamütsiini difusiooni agarsöötmel, millesse on inokuleeritud Micrococcus luteus. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt on proportsionaalselt sõltuv antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmist kõigi kasutatud antibiootikumi kontsentratsioonide piirkonnas. 3. Mikroorganism: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553) 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida Micrococcus luteus söötmest võetud längagariga katseklaasidesse ning inkubeerida 24 tundi 30 °C juures. Hoida kultuuri külmkapis temperatuuril umbes 4 °C. Inokuleerida uuesti iga kahe nädala järel. 3.2. Baktersuspensiooni(27) ettevalmistamine Koguda hiljuti ettevalmistatud punktis 3.1 toodud agarikatseklaasist baktereid, kasutades 2--3 ml naatriumkloriidilahust. See suspensioon külvata 250 ml söödet sisaldavasse Roux pudelisse ja inkubeerida 18--20 tundi temperatuuril 30 °C. Koguda bakterid 25 ml naatriumkloriidi lahusesse ning segada. Lahjendada suspensioon naatriumkloriidi lahusega vahekorras 1/10. Suspensiooni valguse läbilaskvus peab olema umbes 75% naatriumkloriidi lahuse läbilaskvusest, mõõdetuna lainepikkusel 650 nm, kasutades küvette kihi paksusega 1 cm. See suspensiooni säilib ühe nädala temperatuuril umbes 4 °C. 4. Söötmed ja reaktiivid 4.1 Tüvikultuuri säilitussööde ja analüüsi sööde (28): -- lihapeptoon 6,0 g; -- trüptoon 4,0 g; -- pärmiekstrakt 3,0 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- glükoos 1,0 g; -- agar 10,0--20,0 g; -- vesi kuni 1000 ml. pH 6,5 (pärast steriliseerimist). 4.2. Fosfaatpuhverlahus, pH 6: -- dikaaliumvesinikfosfaat K2HPO4 (AR) 2,0 g; -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 (AR) 8,0 g; -- vesi kuni 1000 ml. 4.3. Naatriumkloriidi 0,8% (mass/ruumala) lahus: lahustada 8 g naatriumkloriidi (AR) vees ja lahjendada mahuni 1000 ml, steriliseerida. 4.4. Metanool. 4.5. Fosfaatpuhverlahuse ja metanooli segu mahuvahekorras 80/20. 4.6. Tween 80 0,5 % (mass/ruumala) metanoolilahus: lahustada 5 g Tween 80 metanoolis ja lahjendada metanooli abil mahuni 1000 ml. 4.7. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega virginiamütsiin. 5. Standardlahused Lahustada täpselt kaalutud kogus standardainet metanoolis ning lahjendada metanooli abil, et saada lähtelahus, mis sisaldab 1000 µg virginiamütsiini ml kohta. Hoituna korgiga suletud kolvis temperatuuril 4 °C, püsib see lahus kuni viis päeva. Sellest lähtelahusest valmistada punktis 4.5 toodud segu abil järjestikku lahjendades järgmised lahused: -- S8 1 µg/ml; -- S4 0,5 µg/ml; -- S2 0,25 µg/ml; -- S1 0,125 µg/ml. 6. Ekstrakti ja analüüsitavate lahuste valmistamine 6.1. Ekstraheerimine 6.1.1. Tooted, mille virginiamütsiinisisaldus on kuni 100 mg/kg Kaaluda 50 g proovi, lisada 200 ml lahust ja loksutada 30 minutit. Jätta selginema või tsentrifuugida, võtta 20 ml proovi peal olevat lahust ja aurutada rootoraurutis kuni umbes 5 ml-ni temperatuuril, mis ei ületa 40 °C. Lahjendada jääk segu abil, et saada eeldatav virginiamütsiinisisaldus 1 µg/ml (= U8). 6.1.2. Tooted, mille virginiamütsiinisisaldus on suurem kui 100 mg/kg. Kaaluda proovi kogus, mis ei ületa 10,0 g ja mis sisaldab 1--50 mg virginiamütsiini, lisada 100 ml lahust ja loksutada 30 minutit. Jätta selginema või tsentrifuugida, seejärel lahjendada proovi peal olevat lahust punktis 4.5 toodud segu abil, et saada eeldatav virginiamütsiinisisaldus 1 µg/ml (= U8). 6.2. Analüüsitavad lahused Lahusest U8 valmistada punktis 4.5 toodud seguga järjestikku lahjendades (1/1) lahused U4 (eeldatav sisaldus 0,5 µg/ml), U 2 (eeldatav sisaldus 0,25 µg/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,125 µg/ml). 7. Analüüsi käik 7.1. Analüüsi söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi söötmesse baktersuspensioon temperatuuril umbes 50 °C. Tehes eelproove plaatidel söötmega määrata kindlaks baktersuspensiooni kogus, mida on vaja suurimate ja selgeimate inhibitsioonitsoonide saamiseks virginiamütsiini erinevate kontsentratsioonidega. 7.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel, kasutades nelja kontsentratsiooniga standardlahuseid (S8, S4, S 2 ja S1) ning nelja kontsentratsiooniga ekstrakte (U8 , U4, U2 ja U1). Need neli ekstrakti ja standardlahust tuleb tingimata paigutada igale plaadile. Selleks võtta plaadid, mis on piisavalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, ning et nende keskpunktide vahele jääks vähemalt 30 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, mille pinnal on 200-mm läbimõõduga ja 20 mm kõrge alumiinium- või plastikrõngas. Valada plaatidele teatav kogus söödet, mis on inokuleeritud vastavalt punktile 7.1, et saada kiht paksusega umbes 2 mm (200-mm läbimõõduga plaadi korral 60 ml). Lasta söötmel tasanduda, teha augud ning paigutada nendesse täpselt välja mõõdetud analüüsitavate ja standardlahuste kogused (0,10--0,15 ml augu kohta, sõltuvalt augu läbimõõdust). Paigutada iga kontsentratsiooniga lahust vähemalt neli korda, nii et iga määramine kujutab endast 32 inhibitsioonitsooni hindamist. 7.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate 16--18 tundi temperatuuril 30 ± 2 °C. 8. Hindamine Mõõta 0,1 mm täpsusega inhibitsioonitsoonide läbimõõt ja leida mõõtmistulemuste keskmised väärtused iga kontsentratsiooni jaoks. Koostada poollogaritmilisel millimeetripaberil graafik, mis näitab inhibitsioonitsoonide läbimõõdu sõltuvust vastavate kontsentratsioonide logaritmist. Visandada kõige sobivamad jooned nii standardlahuse kui ka ekstrakti puhul, näiteks nagu on tehtud allpool. Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse madalaima taseme (SL) (väikseima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil: (a) SL = (7s1 + 4s2 + s 4 -- 2s8) : 10. Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse kõrgeima taseme (SH) (suurima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil: (b) H = (7s8 + 4s4 + s 2 -- 2s1) : 10. Samamoodi arvutada välja «kõige sobivamad» punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) suhtes, asendades väärtused s1, s2, s4 ja s 8 samades valemites väärtustega u1, u2 , u4 ja u8. Märkida väljaarvutatud SL ja SH väärtused samale millimeetripaberile ning ühendada need punktid, et saada «kõige sobivam» joon standardlahuse jaoks. Samamoodi märkige UL ja UH, et saada «kõige sobivam» joon ekstrakti jaoks. Segavate tegurite puudumise korral peavad need jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooned lugeda paralleelseks, kui väärtused (SH-SL) ja (UH-UL) ei erine oma keskmisest väärtusest rohkem kui 10%. Kui selgub, et jooned ei ole paralleelsed, võib kas u1 ja s1 või u8 ja s8 kõrvale jätta ning arvutada SL, SH, UL ja UH alternatiivsete valemite abil, et saada alternatiivsed «kõige sobivamad» jooned: (a') SL = (5s1 + 2s2 -- s 4) : 6 või (5s2 + 2s4 -- s 8) : 6, (b') SH = (5s4 + 2s2 -- s 1) : 6 või (5s8 + 2s4 -- s 2) : 6 ning samamoodi ka UL ja UH jaoks. Rahuldatud peaksid olema samad paralleelsuse kriteeriumid. Lõpparuandesse tuleb märkida asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme taseme põhjal. Kui jooni peetakse paralleelseteks, arvutada välja suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) ühe järgmise valemi abil sõltuvalt sellest, kas paralleelsuse hindamiseks on kasutatud kolme või nelja taset. Nelja taseme korral: (a) log A = [(u1 + u2 + u 4 + u8 -- s1 -- s 2 -- s4 -- s8) 0, 602] : (u 4 + u8 + s4 + s 8 -- u1 -- u2 -- s1 -- s 2). Kolme taseme korral: (a) log A = [(u1 + u2 + u 4 -- s1 -- s2 -- s 4) 0,401] : (u4 + s4 -- u1 -- s1) või (d') log A = [(u2 + u4 + u 8 -- s2 -- s4 -- s 8) 0,401] : (u8 + s8 -- u 2 -- s2). Proovi ekstrakti aktiivsus = vastava standardi aktiivsus A. (u8 = s8 A). Kui leitakse, et suhteline aktiivsus on väljaspool piirkonda 0,5--2,0, korrata analüüsi, tehes vajalikud muudatused ekstrakti kontsentratsioonides, või kui see ei ole võimalik, siis standardlahuste kontsentratsioonides. Kui suhtelist aktiivsust ei ole võimalik reguleerida nõutud piirkonda, tuleb iga saadud tulemust pidada ligikaudseks ja see asjaolu tuleks lõpparuandes ära märkida. Kui jooni ei peeta paralleelseteks, korrata määramist. Kui paralleelsust ka siis ei saavutata, tuleb määramist pidada mitterahuldavaks. Väljendada tulemus virginiamütsiini milligrammides sööda kilogrammi kohta. 9. Korratavus Ühe ja sama prooviga ning ühe ja sama analüütiku poolt läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada: -- 2 mg/kg absoluutväärtuses, kui virginiamütsiinisisaldus on väiksem kui 10 mg/kg; -- 20% suurimast väärtusest, kui sisaldus on 10--25 mg/kg; -- 5 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldus on 25--50 mg/kg; -- 10% suurimast väärtusest sisalduste puhul, mis on suuremad kui 50 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 54 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Tsinkbatsitratsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda, kontsentraadi või eelsegu tsinkbatsitratsiinisisalduse. Määratav miinimum on 5 mg/kg (29). 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse pH 2 juures metanooli, vee ja vesinikkloriidhappe seguga ning naatriumsulfiidi lahusega. Naatriumsulfiidi on vaja lisada selleks, et sadestada lahustuvad vasesoolad, mis võivad analüüsi segada. Ekstrakti pH reguleeritakse väärtuseni 6,5. Ekstrakt kontsentreeritakse (vajaduse korral) ja lahjendatakse. Selle antibiootiline aktiivsus määratakse, mõõtes tsinkbatsitratsiini difusiooni agarsöötmel, millesse on inokuleeritud Micrococcus luteus (flavus). Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt on võrdeliselt sõltuv antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmist kõigi kasutatud antibiootikumi kontsentratsioonide ulatuses. 3. Mikroorganism: Micrococcus luteus (flavus ) ATCC 10240 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida Micrococcus luteus (flavus) söötmest võetud längagariga katseklaasi ja inkubeerida 24 tundi temperatuuril 30 °C. Hoida külmkapis temperatuuril umbes 4 °C. Inokuleerida uuesti iga kahe nädala järel. 3.2. Baktersuspensiooni(30) valmistamine Koguda bakterid ettevalmistatud agarist 2--3 ml naatriumkloriidi lahuse abil. See suspensioon inokuleerida 250 ml söötmesse Roux pudelis ja inkubeerida 18--20 tundi temperatuuril 30 °C. Koguda bakterid 25 ml naatriumkloriidi lahuse abil ja segada. Lahjendada suspensioon naatriumkloriidi lahuse abil vahekorras 1/10. Suspensiooni valguse läbilaskvus peab olema ligikaudu 75% naatriumkloriidi lahuse läbilaskvusest, mõõdetuna lainepikkusel 650 nm 1-cm küvetis. Suspensioon säilib ühe nädala temperatuuril umbes 4 °C. 4. Söötmed ja reaktiivid 4.1. Tüvikultuuri säilitussööde(31): -- lihapeptoon 6,0 g; -- trüptoon 4,0 g; -- pärmiekstrakt 3,0 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- glükoos 1,0 g; -- agar 10,0--20,0 g; -- vesi 1000 ml. pH 6,5--6,6 (pärast steriliseerimist). 4.2. Analüüsi sööde(1): -- trüptoon 10,0 g; -- pärmiekstrakt 3,0 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- glükoos 1,0 g; -- agar 10,0--20,0 g; -- tween 80 1 ml; -- vesi 1000 ml. pH 6,5 (pärast steriliseerimist). 4.3. Naatriumkloriidi 0,8% (mass/ruumala) lahus: lahustada 8 g naatriumkloriidi vees ja lahjendada kuni 1000 ml-ni; steriliseerida. 4.4. Metanooli, vee ja vesinikkloriidhappe segu mahuvahekorras 80/17,5/2,5. 4.5. Fosfaatpuhverlahus, pH 6,5: -- dikaaliumvesinikfosfaat K2HPO4 22,15 g; -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 27,85 g; -- vesi kuni 1000 ml-ni. 4.6. Vesinikkloriidhape (tihedus 1,18--1,19 g/ml). 4.7. Vesinikkloriidhape 0,1M. 4.8. Naatriumhüdroksiidi 1M lahus. 4.9. Naatriumsulfiidi ligikaudu 0,5M lahus. 4.10. Broomkresoolpurpuri 0,04% (mass/ruumala) lahus: lahustada 0,1 g broomkresoolpurpurit 18,5 ml 0,01M naatriumhüdroksiidi lahuses. Viia lahuse maht vee lisamisel 250 ml-ni ja segada. 4.11. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega (RÜ) tsinkbatsitratsiin. 5. Standardlahused Kaaluda standardse tsinkbatsitratsiini kogus, mis vastab 1050 RÜ-le (vastavalt näidatud aktiivsusele). Lisada 5 ml 0,1M vesinikkloriidhapet ja jätta 15 minutiks seisma. Lisada 30 ml vett, reguleerida ligikaudu 4 ml fosfaatpuhverlahuse abil pH väärtuseni 4,5, viia lahuse maht vee lisamisel kuni 50 ml-ni ja segada hoolikalt (1ml = 21 RÜ). Sellest lahusest valmistada fosfaatpuhverlahuse abil, järjestikuse lahjendamise teel järgmised lahused: -- S8 0,42 RÜ/ml; -- S4 0,21 RÜ/ml; -- S2 0,105 RÜ/ml; -- S1 0,0525 RÜ/ml. 6. Ekstrakti ja analüüsitavate lahuste valmistamine 6.1. Ekstraheerimine 6.1.1. Premiksid ja mineraalsöödad Kaaluda 2,0--5,0 g proovi, lisada 29,0 ml segu ja 1,0 ml naatriumsulfiidi lahust ja loksutada läbi. Kontrollida, et pH oleks ligikaudu 2. Loksutada 10 minutit, lisada 30 ml fosfaatpuhverlahust ja loksutada 15 minutit ning tsentrifuugida. Võtta sobiv alikvootne osa sademe peal olevat lahust ning reguleerida 1M naatriumhüdroksiidi lahuse abil pH väärtuseni 6,5, kasutades pH-meetrit või broomkresoolpurpuri lahust indikaatorina. Lahjendada fosfaatpuhverlahuse abil, et saada eeldatav tsinkbatsitratsiini sisaldus 0,42 RÜ/ml (= U 8). 6.1.2. Proteiinikontsentraadid Kaaluda 10,0 g proovi, lisada 49,0 ml segu ja 1,0 ml naatriumsulfiidi lahust ning loksutada läbi. Kontrollida, et pH oleks ligikaudu 2. Loksutada 10 minutit, lisada 50 ml fosfaatpuhverlahust ja loksutada 15 minutit ning tsentrifuugida. Võtta sobiv alikvootne osa sademe peal olevat lahust ning reguleerida 1M naatriumhüdroksiidi lahuse abil pH väärtuseni 6,5, kasutades pH-meetrit või broomkresoolpurpuri lahust indikaatorina. Aurutada umbes poole mahuni rootoraurutis temperatuuril, mis ei ületa 35 °C. Lahjendada fosfaatpuhverlahuse abil, et saada eeldatav tsinkbatsitratsiinisisaldus 0,42 RÜ/ml (= U8 ). 6.1.3. Muud söödad Kaaluda 10,0 g proovi (20,0 g, kui eeldatav tsinkbatsitratsiinisisaldus on 5 mg/kg). Lisada segu, mis koosneb 24,0 ml punktis 4.4 toodud segust ja 1,0 ml naatriumsulfiidi lahusest ning segada 10 minutit. Lisada 25 ml fosfaatpuhverlahust, loksutada 15 minutit ja tsentrifuugida. Võtta 20 ml sademe peal olevat lahust ning reguleerida 1M naatriumhüdroksiidi lahuse abil pH väärtuseni 6,5, kasutades pH-meetrit või broomkresoolpurpuri lahust indikaatorina. Aurutada kuni ligikaudu 4 ml-ni rootoraurutis temperatuuril, mis ei ületa 35 °C. Lahjendada jääk fosfaatpuhverlahuse abil, et saada eeldatav tsinkbatsitratsiinisisaldus 0,42 RÜ/ml (= U 8). 6.2. Analüüsitavad lahused Lahusest U8 valmistada lahused U4 (eeldatav sisaldus 0,21 RÜ/ml), U2 (eeldatav sisaldus 0,105 RÜ/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,0525 RÜ/ml), lahjendades järjestikku (1/1) fosfaatpuhverlahusega. 7. Analüüsi käik 7.1. Analüüsi söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi söötmesse baktersuspensioon temperatuuril umbes 50 °C. Tehes eelproove plaatidel analüüsi söötmega määrata kindlaks baktersuspensiooni kogus, mida on vaja suurimate ja selgeimate inhibitsioonitsoonide saamiseks tsinkbatsitratsiini erinevate kontsentratsioonidega. 7.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel nelja kontsentratsiooniga standardlahusega (S8, S4, S2 ja S1 ) ning nelja kontsentratsiooniga analüüsitava lahusega (U8 , U4, U2 ja U1). Need neli ekstrakti ja standardlahust tuleb tingimata paigutada igale plaadile. Selleks võtta plaadid, mis on piisavalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, nii et nende keskpunktide vahele jääks vähemalt 30 mm. Analüüsi võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, mille pinnal on 200-mm läbimõõduga ja 20 mm kõrge alumiinium- või plastikrõngas. Valada plaatidele teatav kogus söödet, mis on inokuleeritud vastavalt punktile 7.1, et saada kiht paksusega umbes 2 mm (200-mm läbimõõduga plaadi korral 60 ml). Lasta söötmel tasanduda, teha augud ning paigutada nendesse täpselt välja mõõdetud mahuga analüüsi- ja standardlahused (0,10--0,15 ml augu kohta, sõltuvalt augu läbimõõdust). Paigutada iga kontsentratsiooniga lahust vähemalt neli korda, nii et iga määramine kujutab endast 32 inhibitsioonitsooni hindamist. 7.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate 16--18 tundi temperatuuril 30 °C ± 2 °C. 8. Hindamine Mõõta 0,1 mm täpsusega inhibitsioonitsoonide läbimõõt ja leida mõõtmistulemuste keskmised väärtused iga kontsentratsiooni jaoks. Koostada poollogaritmilisel millimeetripaberil graafik, mis näitab inhibitsioonitsoonide läbimõõdu sõltuvust vastavate kontsentratsioonide logaritmist. Visandada kõige sobivamad jooned nii standardlahuse kui ka ekstrakti puhul. Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse madalaima taseme (SL) (väikseima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse kõrgeima taseme (SH) (suurima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Samamoodi arvutada välja «kõige sobivamad» punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades väärtused s1, s2, s4 ja s8 samades valemites väärtustega u1, u2, u 4, ja u8. Märkida väljaarvutatud SL ja SH väärtused samale millimeetripaberile ning ühendada need punktid, et saada «kõige sobivam» joon standardlahuse jaoks. Samamoodi märkida UL ja UH, et saada «kõige sobivam» joon ekstrakti jaoks. Segavate tegurite puudumise korral peavad need jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooned lugeda paralleelseks, kui väärtused (SH-SL) ja (UH-UL) ei erine oma keskmisest väärtusest rohkem kui 10%. Kui selgub, et jooned ei ole paralleelsed, võib kas u1 ja s1 või u8 ja s8 kõrvale jätta ning arvutada SL, SH, UL ja UH alternatiivsete valemite abil, et saada alternatiivsed «kõige sobivamad» jooned

ning samamoodi ka UL ja UH jaoks. Rahuldatud peaksid olema samad paralleelsuse kriteeriumid. Lõpparuandesse tuleks märkida asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme taseme põhjal. Kui jooni peetakse paralleelseteks, arvutatakse välja suhtelise aktiivsuse (A) logaritm (logA) ühe järgmise valemi abil sõltuvalt sellest, kas paralleelsuse hindamiseks on kasutatud kolme või nelja taset. Nelja taseme korral

Kolme taseme korral

või

Proovi ekstrakti aktiivsus = vastava standardi aktiivsus A. (U8 = S8 A) Kui leitakse, et suhteline aktiivsus on väljaspool piirkonda 0,5--2,0, korrata analüüsi, tehes vajalikud muudatused ekstrakti kontsentratsioonides või kui see ei ole võimalik, siis standardlahuste kontsentratsioonides. Kui suhtelist aktiivsust ei ole võimalik reguleerida nõutavasse piirkonda, tuleb iga saadud tulemust pidada ligikaudseks ja see asjaolu tuleb lõpparuandes ära märkida. Kui jooni ei peeta paralleelseteks, korrata määramist. Kui paralleelsust ka siis ei saavutata, tuleb määramist pidada mitterahuldavaks. Väljendada tulemus tsinkbatsitratsiini milligrammides sööda kilogrammi kohta. 9. Korratavus Ühe ja sama prooviga ning ühe ja sama analüütiku poolt läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 2 mg/kg absoluutväärtuses, kui tsinkbatsitratsiinisisaldus on väiksem kui 10 mg/kg; -- 20% suurimast väärtusest, kui sisaldus on 10--25 mg/kg; -- 5 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldus on 25--50 mg/kg; -- 10% suurimast väärtusest, kui sisaldus on suurem kui 50 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 55 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Flavofosfolipooli difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika võimaldab määrata sööda, kontsentraadi või premiksi flavofosfolipooli sisalduse. Määratav miinimum on 1 mg/kg. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse lahjendatud metanooliga, kuumutades püstjahutiga kolvis. Pärast tsentrifuugimist proov puhastatakse (vajaduse korral), töödeldes seda ioonivahetusvaikudega, ja lahjendatakse. Selle antibiootiline aktiivsus määratakse, mõõtes flavofosfolipooli difusiooni agarsöötmel, millesse on inokuleeritud Staphylococcus aureus. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt on võrdelises sõltuvuses antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmist kõigi kasutatud antibiootikumi kontsentratsioonide ulatuses. 3. Mikroorganism: Staphylococcus aureus 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida Staphylococcus aureus ATCC 6538 P söötmest võetud längagarisse. Inkubeerida 24 tundi temperatuuril 37 °C. Hoida külmkapis temperatuuril umbes 4 °C ning inokuleerida uuesti agarisse iga kuu järel. 3.2. Baktersuspensiooni(32) valmistamine Panna kõrvale kaks katseklaasi tüvikultuuriga ja inokuleerida neid uuesti igal nädalal. Inkubeerida 24 tundi temperatuuril 37 °C ja hoida külmkapis temperatuuril umbes 4 °C. 24 tundi enne proovi analüüsi inokuleerida selle baktersuspensiooniga kaks kuni neli katseklaasi, mis sisaldavad söödet. Inkubeerida 16--18 tundi temperatuuril 37 °C ja seejärel suspendeerida naatriumkloriidi lahuses. Suspensiooni valguse läbilaskvus peab olema ligikaudu 40% naatriumkloriidi lahuse läbilaskvusest, mõõdetuna lainepikkusel 578 nm 1-cm küvetis. 4. Söötmed ja reaktiivid 4.1. Tüvikultuuri säilitussööde(33): -- lihapeptoon 6,0 g; -- trüptoon 4,0 g; -- pärmiekstrakt 3,0 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- glükoos 1,0 g, -- agar 15,0 g; -- vesi 1000 ml. pH 6,5 (pärast steriliseerimist). 4.2. Analüüsi sööde 4.2.1. Aluskiht(34): -- lihapeptoon 6,0 g; -- pärmiekstrakt 3,0 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- agar 10,0 g; -- vesi 1000 ml. pH 6,5 (pärast steriliseerimist). 4.2.2. Külvikiht Nagu punktis 4.1, kuid lisatakse 2,0 g silikoonset vahutamisvastast emulsiooni(35). 4.3. Naatriumkloriidi 0,4% (mass/ruumala) lahus: lahustada 4 g naatriumkloriidi (AR) vees ja lahjendada mahuni 1000 ml; steriliseerida. 4.4. Metanool, puhas. 4.5. Metanool 50% (mahu%): lahjendada 500 ml metanooli 500 ml veega. 4.6. Metanool 80% (mahu%): lahjendada 800 ml metanooli 200 ml veega. 4.7. Tris (hüdroksümetüül) aminometaan (AR). 4.8. Kaaliumkloriidi 1,5% (mass/ruumala) metanoolilahus: lahustada 1,5 g kaaliumkloriidi (AR) 20 ml vees, lisada metanooli mahuni 100 ml. 4.9. Kationiit: Dowex 50W 8, 20--50 mesh, Na-vorm (kat. Serva nr 41600) või sellega samaväärne. 4.10. Anioniit: Dowex 1 2, 50--100 mesh, Cl-vorm (kat. Serva nr 41010) või sellega samaväärne. Enne kasutamist hoida 12--14 tundi 80% metanoolis. 4.11. Klaasvill. 4.12. pH indikaatorpaber (pH 6,6--8,1). 4.13. Askorbiinhape. 4.14. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega flavofosfolipool. 5. Vahendid 5.1. Klaaskolonn kromatograafia jaoks, siseläbimõõt 9 mm, pikkus 150--200 mm, varustatud kraaniga alumise otsa kitsamas osas ning lihviga (tilklehtri ühendamiseks) ülemises otsas. 5.2. Kraaniga tilklehter mahuga 250 ml, millel lihv ühendamiseks klaaskolonniga. 5.3. 250-ml kooniline lihviga kolb. 5.4. Lihviga püstjahuti. 6. Standardlahused Lahustada täpselt kaalutud kogus standardainet 50% metanoolis ja lahjendada, et saada lähtelahus, mis sisaldab 100 µg flavofosfolipooli ml kohta. Korgiga suletud kolvis säilib lahus temperatuuril 4 °C kuni kaks kuud. Lähtelahusest valmistada, lahjendades järjestikku 50% metanooliga, järgmised lahused: -- S8 0,2 µg/ml; -- S4 0,1 µg/ml; -- S2 0,05 µg/ml; -- S1 0,025 µg/ml. 7. Ekstrakti valmistamine 7.1. Ekstraheerimine 7.1.1. Kontsentraadid, premiksid ja mineraalsöödad Kaaluda 2,0--5,0 g proovi ning lisada ligikaudu 150 mg askorbiinhapet. Segada koonilises kolvis 150 ml 50% metanooliga ning reguleerida pH väärtuseni 8,1--8,2, kasutades selleks ligikaudu 400 mg tris(hüdroksümetüül)aminometaani. Kontrollida pH indikaatorpaberiga. Jätta 15 minutiks seisma, seejärel reguleerida tris(hüdroksümetüül)aminometaani abil uuesti pH väärtuseni 8,1--8,2 ning keeta 10 minutit püstjahutiga. Samal ajal pidevalt segada. Jätta jahtuma, tsentrifuugida segu ja dekanteerida ekstrakt. 7.1.2. Muud söödad Kaaluda 5,0--30,0 g proovi, mis sisaldab vähemalt 30 µg flavofosfolipooli. Segada koonilises kolvis 150 ml 50% metanooliga ning reguleerida pH väärtuseni 8,1--8,2, kasutades selleks ligikaudu 400 mg tris(hüdroksümetüül)aminometaani. Kontrollida pH indikaatorpaberiga. Jätta 15 minutiks seisma, seejärel reguleerida tris(hüdroksümetüül)aminometaani abil uuesti pH väärtuseni 8,1--8,2 ning keeta 10 minutit püstjahutiga, samal ajal pidevalt segades. Jätta jahtuma, tsentrifuugida segu ja dekanteerida ekstrakt. 7.2. Puhastamine (selle etapi võib kontsentraatide, premiksite ja mineraalsöötade puhul ära jätta) Segada 110 ml ekstrakti 11 g kationiidiga, keeta üks minut püstjahutiga, samal ajal pidevalt segades. Eraldada kationiit tsentrifuugimise või filtreerimise teel. Segada 100 ml ekstrakti 150 ml metanooliga ning hoida lahust 12--15 tundi temperatuuril 4 °C. Filtreerida helbeline mass välja külmalt. Paigutada klaaskolonni põhja klaasvillast tropp, valada kolonni 5 ml anioniiti ning pesta kolonni 100 ml 80% metanooliga. Lehtri abil viia kolonni vähemalt 100 ml filtraati, mis eeldatavasti sisaldab 16 µg flavofosfolipooli (200 ml 30 g söödaproovi kohta sisalduse puhul 1 mg/kg). Vajaduse korral lahjendada filtraati enne kolonni viimist 80% metanooli abil, et saada eeldatav flavofosfolipoolisisaldus 16 µg/100 ml. Reguleerida voolukiirus nii, et see oleks ligikaudu 2 ml minutis. Väljavoolanud vedelik valada ära. Seejärel pesta kolonni 50 ml 80% metanooliga ja valada väljavoolanud vedelik ära. Elueerida flavofosfolipool kaaliumkloriidi metanoolilahusega, hoides voolu kiirusel ligikaudu 2 ml minutis. Koguda 50 ml eluaati mõõtekolbi, lisada 30 ml vett ja segada. Selle lahuse flavofosfolipoolisisaldus peab olema 0,2 µg/ml (= U8). 7.3. Analüüsitavad lahused Vajaduse korral (s.o kui puhastamise etapp on ära jäetud) lahjendada vastavalt punktile 7.1.1 saadud ekstrakt 50% metanooliga, et saada eeldatav flavofosfolipoolisisaldus 0,2 µg/ml (= U8 ). Lahusest U8 valmistada lahused U4 (eeldatav sisaldus 0,1 µg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 0,05 µg/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,025 µg/ml), lahjendades järjestikku (1/1) 50% metanooli abil. 8. Analüüsi käik 8.1. Analüüsi söötme inokuleerimine Inokuleerida punktis 4.2.2 toodud analüüsi söötmesse baktersuspensioon temperatuuril umbes 50 °C. Tehes eelproove plaatidel analüüsi söötmega määrata kindlaks baktersuspensiooni kogus, mida on vaja suurimate ja selgeimate inhibitsioonitsoonide saamiseks flavofosfolipooli erinevate kontsentratsioonidega (umbes 30 ml/l). 8.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel nelja kontsentratsiooniga standardlahusega (S8, S4, S2 ja S1 ) ning nelja kontsentratsiooniga analüüsitava lahusega (U8 , U4, U2 ja U1). Need neli ekstrakti ja standardlahust tuleb tingimata paigutada igale plaadile. Selleks võtta plaadid, mis on piisavalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, nii et nende keskpunktide vahele jääks vähemalt 30 mm. Analüüsi võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, mille pinnal on 200-mm läbimõõduga ja 20 mm kõrge alumiinium- või plastikrõngas. Valada plaatidele teatav kogus punktis 4.2.1 toodud söödet, et saada kiht paksusega umbes 1,5 mm (200-mm läbimõõduga plaadi korral 45 ml). Lasta söötmel tasanduda ja seejärel valada üle teatava koguse punktis 4.2.2 toodud söötmega, mis on inokuleeritud vastavalt punktile 8.1, et saada kiht paksusega 1 mm (200-mm läbimõõduga plaadi korral 30 ml). Lasta söötmel jälle tasanduda, teha augud ning paigutada nendesse täpselt välja mõõdetud mahuga analüüsi- ja standardlahused (0,10--0,15 ml augu kohta, sõltuvalt augu läbimõõdust). Paigutada iga kontsentratsiooni vähemalt neli korda, nii et iga määramine toimub 32 inhibitsioonitsooni hindamise alusel. 8.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate 16--18 tundi temperatuuril 28--30 °C. 9. Hindamine Mõõta 0,1 mm täpsusega inhibitsioonitsoonide läbimõõt ja leida mõõtmistulemuste keskmised väärtused iga kontsentratsiooni jaoks. Koostada poollogaritmilisel millimeetripaberil graafik, mis näitab inhibitsioonitsoonide läbimõõdu sõltuvust vastavate kontsentratsioonide logaritmist. Visandada kõige sobivamad jooned nii standardlahuse kui ka ekstrakti puhul, näiteks nagu on tehtud allpool. Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse madalaima taseme (SL) (väikseima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse kõrgeima taseme (SH) (suurima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Samamoodi arvutada välja «kõige sobivamad» punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades väärtused s1, s2, s4 ja s 8 samades valemites väärtustega u1, u2 , u4 ja u8. Märkida väljaarvutatud SL ja SH väärtused samale millimeetripaberile ning ühendada need punktid, et saada «kõige sobivam» joon standardlahuse jaoks. Samamoodi märkige UL ja UH, et saada «kõige sobivam» joon ekstrakti jaoks. Segavate tegurite puudumise korral peavad need jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooned lugeda paralleelseteks, kui väärtused (SH-SL) ja (UH-UL) ei erine oma keskmisest väärtusest rohkem kui 10%. Kui selgub, et jooned ei ole paralleelsed, võib kas u1 ja s1 või u8 ja s8 kõrvale jätta ning arvutada SL, SH, UL ja UH alternatiivsete valemite abil, et saada alternatiivsed «kõige sobivamad» jooned

ning analoogiliselt ka UL ja UH jaoks. Ka alternatiivseid kõige sobivamaid jooni tuleb kontrollida paralleelsuse suhtes, nagu eespool on näidatud. Lõpparuandesse tuleb märkida asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme taseme põhjal. Kui jooni peetakse paralleelseteks, arvutada välja suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) ühe järgmise valemi abil: Nelja taseme korral

Kolme taseme korral

või

Tegelik aktiivsus = eeldatav aktiivsus suhteline aktiivsus. Kui jooni peetakse mitteparalleelseteks, korrata määramist. Kui paralleelsust ka sel juhul ei saavutata, arvutada valemi (c) abil suhtelise aktiivsuse logaritm (log A). Saadud tulemust tuleb siiski pidada ligikaudseks ja see asjaolu tuleks lõpparuandes ära märkida. 10. Korratavus Ühe ja sama prooviga ning ühe ja sama analüütiku poolt läbi viidud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 0,5 mg/kg absoluutväärtuses, kui flavofosfolipoolisisaldus on 1--2 mg/kg; -- 25% suurimast väärtusest, kui sisaldus on suurem kui 2 mg/kg ja kuni 10 mg/kg; -- 20% suurimast väärtusest, kui sisaldus on suurem kui 10 mg/kg ja kuni 25 mg/kg; -- 5 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldus on suurem kui 25 mg/kg ja kuni 50 mg/kg; -- 10% suurimast väärtusest, kui sisaldus on suurem kui 50 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 56 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Avopartsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika on avopartsiini määramiseks söötades ja premiksites. Määratav miinimum on 2 mg/kg. Polüeeterantibiootikumide olemasolu võib määramist segada. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse atsetooni, vee ja vesinikkloriidhappe seguga. Ekstrakti antibiootiline aktiivsus määratakse, mõõtes avopartsiini difusiooni agarsöötmel, mida on inokuleeritud Bacillus subtilis'ega. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt on võrdeliselt sõltuv antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmist kõigi kasutatud antibiootikumi kontsentratsioonide piirkonnas. 3. Mikroorganism: Bacillus subtilis ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida söödet sisaldavatesse längagariga katseklaasidesse Bacillus subtilis't ja inkubeerida järgmise päevani temperatuuril 30 °C. Hoida kultuuri külmutuskapis ligi 4 °C juures. Inokuleerida uuesti iga kuu. 3.2. Spoorsuspensiooni(36) valmistamine Koguda hiljuti ettevalmistatud agarilt spoore 2--3 ml steriilse vee abil. Kasutada seda suspensiooni Roux pudelis oleva 300 ml söötme inokuleerimiseks ja inkubeerida kolm kuni viis päeva 30 °C juures. Koguda spoore 15 ml-sse 20% etanooli pärast seda, kui mikroskoobi all on kontrollitud sporulatsiooni ja segada hästi. Seda suspensiooni võib hoida vähemalt viis kuud ligi 4 °C juures. 4. Söötmed ja reaktiivid 4.1. Sööde(37): -- peptoon 6,0 g; -- trüptoon 4,0 g; -- pärmiekstrakt 3,0 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- glükoos 1,0 g; -- agar 15,0 g; -- vesi 1000 ml. pH 6,5 (pärast steriliseerimist). 4.2. Etanool 20% (mahu%): lahjendada 200 ml etanooli 800 ml veega. 4.3. Vesinikkloriidhape, tihedus 1,18--1,19 g/ml. 4.4. Naatriumhüdroksiidi lahus, 2M. 4.5. Fosfaatpuhverlahus, 0,1M: -- kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4, 13,6 g; -- lisada vett kuni 1000 ml-ni. Reguleerida pH väärtuseni 4,5. 4.6. Atsetooni/vee/vesinikkloriidhappe segu mahuvahekorras 65/32,5/2,5. 4.7. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega avopartsiinsulfaat. 5. Standardlahused Lahustada ligi 10-mg standardaine täpselt kaalutud kogus fosfaatpuhverlahuses ja lahjendada sellesama puhverlahusega, et saada lähtelahus, mis sisaldab 100 µg avopartsiini milliliitri kohta. Korgiga suletud kolvis 4 °C juures on see lahus stabiilne kuni seitse päeva. 5.1. Premiksite jaoks Lähtelahusest valmistada järjestikuse puhverlahusega lahjendamise teel järgmised lahused: -- S8 4,0 µg/ml; -- S4 2,0 µg/ml; -- S2 1,0 µg/ml; -- S1 0,5 µg/ml. 5.2. Söötade jaoks Lähtelahusest valmistada järjestikuse puhverlahusega lahjendamise teel järgmised lahused: -- S8 2,0 µg/ml; -- S4 1,0 µg/ml; -- S2 0,5 µg/ml; -- S1 0,25 µg/ml. 6. Ekstrakti ja proovilahuse valmistamine 6.1. Premiksid Kaaluda 10 mg täpsusega selline kogus proovi, mis sisaldaks 10--100 mg avopartsiini. Viia proov 100-ml mõõtekolbi, milles on 60 ml punktis 4.6 toodud segu ja loksutada 15 minutit mehhaanilisel loksutil. Kontrollida pH ja viia vesinikkloriidhappega, kui vaja, kuni pH 2. Täita kolb seguga märgini ja segada hästi. Filtreerida osa lahust läbi sobiva filterpaberi (nt Whatman nr 1), valades ära esimesed 5 ml filtraati. Võtta lahuse alikvootne osa ja viia selle pH naatriumhüdroksiidi lahusega väärtuseni 4,5. Lahjendada seda lahust puhverlahusega, et saada eeldatav avopartsiini kontsentratsioon 4 µg/ml (= U8). Sellest lahusest valmistada lahused U4 (eeldatav sisaldus 2 µg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 1 µg/ml) ja U 1 (eeldatav sisaldus 0,5 µg/ml) järjestikuse puhverlahusega lahjendamise (1/1) teel. 6.2. Söödad Kaaluda 50 g proovi, lisada 100 ml punktis 4.6 toodud segu ja loksutada 30 minutit mehhaanilisel loksutil. Tsentrifuugida selge ekstrakti saamiseks (kasutades korgiga suletud tsentrifuugiklaase), võtta alikvootne osa selget ekstrakti (vt tabel allpool) ja viia pH naatriumhüdroksiidi lahusega väärtuseni 4,5. Lahjendada seda alikvootset osa puhverlahusega, et saada U8 (vt tabel allpool). Sellest lahusest valmistada lahused U4 (eeldatav sisaldus 1 µg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 0,5 µg/ml) ja U 1 (eeldatav sisaldus 0,25 µg/ml), kasutades järjestikust lahjendamist (1/1) puhverlahusega. Eeldatav avopartsiini tase (sisaldus) (mg/kg) 5 7,5 10 15 20 40 Proovi mass g-des (± 0,1 g ) 50 50 50 50 50 50 Segu (4.6) ruumala (ml) 100 100 100 100 100 100 Selge ekstrakti ruumala (ml) 20 15 20 15 20 10 Lõplik ruumala (ml): U8 25 25 50 50 100 100 Eeldatav U8 kontsentratsioon (µg/ml) 2 2 2 2 2 2 7. Analüüsi käik 7.1. Analüüsi söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi söödet spoorsuspensiooniga 50--60 °C juures. Eelkatsetes analüüsi söötmega plaatidel määrata kindlaks vajaliku spoorsuspensiooni kogus, et saada erinevate avopartsiini kontsentratsioonidega suurimad ja selgeimad inhibitsioonitsoonid. 7.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel, kasutades nelja kontsentratsiooniga standardlahuseid (S8, S4, S 2, S1) ja nelja kontsentratsiooniga analüüsitavaid lahuseid (ekstrakte) (U8, U4, U2, U1 ). Need neli ekstrakti ja neli standardlahust tuleb kindlasti paigutada igale plaadile. Selleks valida plaadid, mis on küllalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, nii et nende keskpunktide vahele jääb vähemalt 30 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, millele on pandud alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm. Valada plaatidele teatav kogus söödet, mida on inokuleeritud nagu punktis 7.1, et saada umbes 2 mm paksune kiht (60 ml 200-mm läbimõõduga plaadi jaoks). Lasta söötmel tasanduda, teha augud ja paigutada nendesse täpselt mõõdetud analüüsitavate ja standardlahuste kogused (0,10--0,15 ml augu kohta vastavalt augu läbimõõdule). Paigutada iga kontsentratsiooniga lahust vähemalt neli korda, nii et iga määramine võimaldab hinnata 32 inhibitsioonitsooni. 7.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate 16--18 tundi 30 °C juures. 8. Hindamine Mõõta inhibitsioonitsoonide läbimõõt 0,1 mm täpsusega ja leida mõõtmistulemuste keskmised väärtused iga kontsentratsiooni jaoks. Koostada poollogaritmilisel millimeetripaberil graafik, mis näitab inhibitsioonitsoonide läbimõõdu sõltuvust vastavate kontsentratsioonide logaritmist. Visandada kõige sobivamad jooned nii standardlahuse kui ekstrakti jaoks vastavalt alljärgnevale näitele: Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse madalaima taseme (SL) (väikseima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse kõrgeima taseme (SH) (suurima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Analoogiliselt arvutada «kõige sobivamad» punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades väärtused s1, s2, s4 ja s8 eespoololevates valemites väärtustega u1, u2 , u4 ja u8(38). Märkida arvutatud SL ja SH väärtused samale millimeetripaberile ja ühendada need punktid, et saada standardlahuse puhul «kõige sobivam» joon. Analoogiliselt märkida UL ja UH ning ühendada need, et saada ekstrakti puhul «kõige sobivam» joon. Segavate tegurite puudumisel peavad jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni pidada paralleelseteks, kui väärtused (SH-SL) ja (UH-UL) ei erine rohkem kui 10% oma keskmisest väärtusest. Kui jooned ei ole paralleelsed, võib loobuda kas u1 ja s 1 või u8 ja s8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH, kasutades alternatiivseid valemeid, et saada alternatiivsed «kõige sobivamad» jooned.

ning analoogiliselt ka UL ja UH puhul. Alternatiivseid «kõige sobivamaid» jooni tuleb paralleelsuse suhtes kontrollida eespool kirjeldatule. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolmest tasemest, peab olema märgitud lõpparuandes. Kui jooni peetakse paralleelseteks, arvutada ühe järgnevalt antud valemi abil suhtelise aktiivsuse logaritm (log A): Nelja taseme puhul

Kolme taseme puhul

või

Tegelik aktiivsus = eeldatav aktiivsus suhteline aktiivsus. Kui leitakse, et suhteline aktiivsus on väljaspool piirkonda 0,5--2,0, korrata analüüsi, tehes vajalikud muudatused ekstrakti kontsentratsioonides, või kui see ei ole võimalik, standardlahuste kontsentratsioonides. Kui suhtelist aktiivsust ei saa reguleerida nõutud piirkonda, tuleb iga saadud tulemust pidada ligikaudseks ja seda tuleb lõpparuandes märkida. Kui jooni ei peeta paralleelseteks, korrata määramist. Kui ka siis ei saavutata paralleelsust, tuleb määramist pidada mitterahuldavaks. 9. Korratavus Sama analüütiku poolt sama prooviga läbi viidud kahe määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 2 mg/kg absoluutväärtuses, kui avopartsiini sisaldused on 2--10 mg/kg; -- 20% suurimast väärtusest, kui sisaldused on 10--25 mg/kg; -- 5 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 25--50 mg/kg; -- 10% suurimast väärtusest sisalduste puhul, mis on suuremad kui 50 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 57 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Monensiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika on monensiinnaatriumi määramiseks söötades ja premiksites. Määratav miinimum on 10 mg/kg(39). 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse 90% metanooliga. Ekstrakti analüüsitakse vastavalt proovi monensiinnaatriumi sisaldusele. Antibiootiline aktiivsus määratakse, mõõtes monensiinnaatriumi difusiooni agarsöötmel, mida on inokuleeritud Bacillus subtilis'ega. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide moodustumine. Nende tsoonide läbimõõt on võrdeliselt sõltuv antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmist kõigi kasutatud antibiootikumi kontsentratsioonide ulatuses. Analüüsitava süsteemi tundlikkus väheneb naatriumioonide esinemisel. 3. Mikroorganism: Bacillus subtilis ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida söödet sisaldavatesse längagariga katseklaasidesse Bacillus subtilis't ja inkubeerida järgmise päevani temperatuuril 30 °C. Hoida kultuuri külmutuskapis ligi 4 °C juures. Inokuleerida uuesti iga kuu. 3.2. Spoorsuspensiooni(40) valmistamine Koguda äsja ettevalmistatud längagarilt spoore 2--3 ml steriilse vee abil. Kasutada seda suspensiooni Roux pudelis oleva 300 ml söötme inokuleerimiseks ja inkubeerida kolm kuni viis päeva 30 °C juures. Koguda spoorid 15 ml-sse 20% etanooli pärast seda, kui mikroskoobi all on kontrollitud sporulatsiooni, ja segada hästi. Seda suspensiooni võib hoida vähemalt viis kuud ligi 4 °C juures. 4. Söötmed ja reaktiivid 4.1. Tüvikultuuri säilitussööde(41): -- trüptoon 10,0 g; -- pärmiekstrakt 3,0 g; -- lihapuljong 1,5 g; -- glükoos 1,0 g; -- agar (vastavalt kvaliteedile) 10,0--20,0 g; -- vesi 1000 ml. pH 6,5 (pärast steriliseerimist). 4.2. Analüüsi sööde: -- glükoos 10,0 g; -- pärmiekstrakt 2,5 g, -- dikaaliumvesinikfosfaat K2HPO4 0,69 g; -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 0,45 g; -- agar (vastavalt kvaliteedile) 10,0--20,0 g; -- vesi 1000 ml. pH 6 (pärast steriliseerimist). 4.3. Etanool 20% (mahu%): lahjendada 200 ml etanooli 800 ml veega. 4.4. Metanool, veevaba. 4.5. Metanool 90% (mahu%): lahjendada 900 ml metanooli 100 ml veega. 4.6. Metanool 50% (mahu%): lahjendada 500 ml metanooli 500 ml veega. 4.7. Alumiiniumoksiid, granuleeritud (alcoa F, 20 mesh'i; aktiveeritud alumiiniumoksiid UGI: F. Lancaster ja Co. või selle analoog). 4.8. Standardained: teadaoleva aktiivsusega monensiinnaatrium (nt Rahvusvahelisest Bioloogiliste Standardite Laboratooriumist, Kesk-Veterinaarlaboratooriumist, Weybridge, UK-Surrey KT 15 3 NB). 5. Vahendid 5.1. Vaakumrootorauruti, 250-ml ümarkolviga. 5.2. Klaaskolonn kromatografeerimiseks, siseläbimõõt 25 mm, pikkus 400 mm, lahtise otsaga, mille läbimõõt on 2 mm. 5.3. Klaaskolonn kromatografeerimiseks, siseläbimõõt 11 mm, pikkus ligikaudu 300 mm, lahtise otsaga, mille läbimõõt on 2 mm. 6. Standardlahused Lahustada täpselt kaalutud kogus standardainet metanoolis ja lahjendada, et saada lähtelahus, mis sisaldab 800 µg monensiinnaatriumi ml kohta. Korgiga suletud kolvis 4 °C juures on see lahus stabiilne kuni kaks nädalat. Sellest lähtelahusest valmistada järjestikuse 50% metanooliga lahjendamise teel järgmised lahused: -- S8 8,0 µg/ml; -- S4 4,0 µg/ml; -- S2 2,0 µg/ml; -- S1 1,0 µg/ml. 7. Ekstrakti valmistamine 7.1. Ekstraheerimine 7.1.1. Premiksid Kaaluda 2 g proovi, lisada 100 ml 90% metanooli, homogeniseerida ja tsentrifuugida mõned minutid. Lahjendada proovi peal olevat lahust 50% metanooliga, et saada eeldatav monensiinnaatriumi sisaldus 8 µg/ml (= U 8). 7.1.2. Söödad, milles monensiinnaatriumi sisaldus ei ole väiksem kui 50 mg/kg Kaaluda 10--20 g proovi, lisada 100 ml 90% metanooli, homogeniseerida 15 minutit ja lasta settida. Asetada väike tükk puuvillavatti klaaskolonni kitsasse otsa ja lisada alumiiniumoksiidi, kergelt torule koputades, kuni sammas tõuseb 75--80 mm kõrgusele. Dekanteerida ekstrakt alumiiniumoksiidi kolonni ja koguda filtraat kokku. Lahjendada 30 ml filtraati veega 50 ml-ni. Teha järjestikused lahjendused 50% metanooliga, et saada eeldatav monensiinnaatriumi sisaldus 8 µg/ml (= U8). 7.1.3. Söödad, mille monensiinnaatriumi sisaldus on väiksem kui 50 mg/kg (kuni 10 mg/kg) Kaaluda 10--20 g proovi, lisada 100 ml 90% metanooli ja homogeniseerida 15 minutit. Tsentrifuugida selgeks. Proovi puhul, mis sisaldab 20 mg/kg monensiinnaatriumi, võtta 40 ml proovi peal olevat vedelikku. Proovi puhul, mis sisaldab 10 mg/kg, võtta 80 ml ja aurutada vaakumi all vaakum-rootoraurutis kuivaks mitte kõrgemal temperatuuril kui 40 °C juures. Lahustada jääk 10 ml 90% metanoolis. Asetada puuvillavati tükk klaaskolonni kitsasse otsa ja kergelt torule koputades lisada alumiiniumoksiidi, kuni sammas on 75--80 mm kõrge. Dekanteerida jäägi metanoolilahus alumiiniumoksiidikolonni ja koguda filtraat kokku. Pesta kolonni 10 ml 90% metanooliga ja ühendada pesuvedelikud filtraadiga. Aurutada lahus vaakumi all rootoraurutis kuivaks temperatuuril, mis on madalam kui 40 °C. Lahustada jääk 10 ml veevabas metanoolis ja viia veega 20 ml-ni. Tsentrifuugida lahust vähemalt 4000 p/min vähemalt viie minuti jooksul. Teha järjestikused lahjendused 50% metanooliga, et saada eeldatav monensiinnaatriumi sisaldus 8 µg/ml (= U8 ). 7.2. Proovilahused Lahusest U8 valmistada lahused U4 (eeldatav sisaldus 4 µg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 2 µg/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 1 µg/ml) järjestikuse lahjendamisega (1/1) 50% metanooliga. 8. Analüüsi käik 8.1. Analüüsi söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi söödet spoorsuspensiooniga 50--60 °C juures. Eelkatsetes analüüsi söötmega plaatidel määrata kindlaks vajalik spoorsuspensiooni kogus, et saada erinevate monensiinnaatriumi kontsentratsioonidega suurimad ja selgeimad inhibitsioonitsoonid. 8.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel, kasutades nelja kontsentratsiooniga standardlahuseid (S8, S4, S 2, S1) ja nelja kontsentratsiooniga analüüsitavaid lahuseid (ekstrakte) (U8, U4, U2, U1 ). Need neli ekstrakti ja neli standardlahust tuleb kindlasti paigutada igale plaadile. Selleks valida plaadid, mis on küllalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, nii et nende keskpunktide vahele jääks vähemalt 30 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, millele on paigutatud alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm. Valada plaatidele teatav kogus söödet, mida on inokuleeritud nagu punktis 8.1, et saada umbes 2 mm paksune kiht (60 ml 200-mm läbimõõduga plaadi jaoks). Lasta söötmel tasanduda, teha augud ja asetada nendesse täpselt mõõdetud analüüsitavate ja standardlahuste kogused (0,10--0,15 ml augu kohta vastavalt augu läbimõõdule). Paigutada iga kontsentratsiooniga lahust vähemalt neli korda, nii et iga määramine võimaldab hinnata 32 inhibitsioonitsooni. 8.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate ligikaudu 18 tundi 35--37 °C juures. 9. Hindamine Mõõta inhibitsioonitsoonide läbimõõt 0,1 mm täpsusega ja leida mõõtmistulemuste keskmised väärtused iga kontsentratsiooni jaoks. Koostada poollogaritmilisel millimeetripaberil graafik, mis näitab inhibitsioonitsoonide läbimõõdu sõltuvust vastavate kontsentratsioonide logaritmist. Visandada kõige sobivamad jooned nii standardlahuse kui ekstrakti jaoks nagu allpoololeva näite puhul. Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse madalaima taseme (SL) (väikseima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse kõrgeima taseme (SH) (suurima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Samamoodi arvutada «kõige sobivamad» punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades väärtused s 1, s2, s4 ja s8 eespoololevates valemites väärtustega u1, u2, u4 ja u8(42). Märkida arvutatud SL ja SH väärtused samale millimeetripaberile ja ühendada need punktid, et saada standardlahuse puhul «kõige sobivam» joon. Samamoodi märkida UL ja UH väärtused ning ühendada need, et saada ekstrakti puhul «kõige sobivam» joon. Segavate tegurite puudumisel peavad jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni pidada paralleelseteks, kui väärtused (SH-SL) ja (UH-UL) ei erine rohkem kui 10% oma keskmisest väärtusest. Kui jooned ei ole paralleelsed, võib loobuda kas u1 ja s 1 või u8 ja s8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH, kasutades alternatiivseid valemeid, et saada alternatiivsed «kõige sobivamad» jooned

ning samamoodi ka UL ja UH puhul. Alternatiivseid «kõige sobivamaid» jooni tuleb paralleelsuse suhtes kontrollida nagu varem. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolmest tasemest, peab olema märgitud lõpparuandes. Kui jooni peetakse paralleelseteks, arvutada ühe järgnevalt antud valemi abil suhtelise aktiivsuse logaritm (logA). Nelja taseme puhul

Kolme taseme puhul

või

Tegelik aktiivsus = eeldatav aktiivsus suhteline aktiivsus. Kui leitakse, et suhteline aktiivsus on väljaspool piirkonda 0,5--2,0, korrata analüüsi, tehes vajalikud muudatused ekstrakti kontsentratsioonides, või kui see ei ole võimalik, standardlahuste kontsentratsioonides. Kui suhtelist aktiivsust ei saa reguleerida nõutud piirkonda, tuleb iga saadud tulemust pidada ligikaudseks ja seda tuleb lõpparuandes märkida. Kui jooni ei peeta paralleelseteks, korrata määramist. Kui ka siis ei saavutata paralleelsust, tuleb määramist pidada mitterahuldavaks. 10. Korratavus Sama analüütiku poolt sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: -- 20% suurimast väärtusest, kui monensiinnaatriumi sisaldused on 10--25 mg/kg; -- 5 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 25--50 mg/kg; -- 10% suurimast väärtusest sisalduste puhul, mis on üle 50 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 58 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Spiramütsiini difusiooni teel agarsöötmel määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika on spiramütsiini määramiseks söötades ja premiksites. Määratav miinimum on 1 mg/kg(43). 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse metanooli ja fosfaat-vesinikkarbonaatpuhverlahuse seguga pH 8 juures. Ekstrakt dekanteeritakse või tsentrifuugitakse ja lahjendatakse. Selle antibiootiline aktiivsus määratakse, mõõtes spiramütsiini difusiooni agarsöötmel, mida on inokuleeritud Micrococcus luteus'ega. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide moodustumine. Nende tsoonide diameeter on võrdeliselt sõltuv antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmist kõigi kasutatud antibiootikumi kontsentratsioonide piirkonnas. 3. Mikroorganism: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553) 3.1. Tüvikultuuri säilitamine Inokuleerida söödet sisaldavatesse längagariga katseklaasidesse Micrococcus luteus't ja inkubeerida 24 tundi 30 °C juures. Hoida kultuuri külmikus ligi 4 °C juures. Inokuleerida uuesti iga kahe nädala tagant. 3.2. Baktersuspensiooni valmistamine(44) Koguda baktereid äsja ettevalmistatud längagarilt 2--3 ml naatriumkloriidi lahusega. Kasutada seda suspensiooni Roux pudelis oleva 250 ml söötme inokuleerimiseks ja inkubeerida 18--20 tundi 30 °C juures. Koguda baktereid 25 ml naatriumkloriidi lahusesse ja segada. Lahjendada suspensiooni vahekorras 1/10 naatriumkloriidi lahusega. Suspensiooni valguse läbilaskvus peab olema ligi 75% naatriumkloriidi lahuse läbilaskvusest mõõdetuna 650 nm juures 1-cm küvetis. Seda suspensiooni võib hoida ühe nädala ligi 4 °C juures. 4. Söötmed ja reaktiivid 4.1. Tüvikultuuri säilitussööde(45): -- lihapeptoon 6,0 g; -- trüptoon 4,0 g; -- pärmiekstrakt 3,0 g, -- lihapuljong 1,5 g; -- glükoos 1,0 g; -- agar 10,0 -- 20,0 g; -- vesi 1000 ml. pH 6,5--6,6 (pärast steriliseerimist). 4.2. Analüüsi sööde(2): -- trüptoon 5,0 g; -- pärmiekstrakt 4,0 g; -- lihapuljong 3,0 g; -- agar 10,0 -- 20,0 g; -- vesi 1000 ml. pH 8,0 (pärast steriliseerimist). 4.3. Naatriumkloriidi lahus 0,8% (mass/ruumala) Lahustada 8 g naatriumkloriidi vees ja lahjendada 1000 ml-ni. Steriliseerida. 4.4. Fosfaat-vesinikkarbonaatpuhverlahus, pH 8,0: -- dikaaliumvesinikfosfaat K2HPO4 16,7 g; -- kaaliumdivesinikfosfaat KH2PO4 0,5 g; -- naatriumvesinikkarbonaat NaHCO3 20,0 g; -- vesi kuni 1000 ml. 4.5. Metanooli ja fosfaat-vesinikkarbonaatpuhverlahuse segu mahuvahekorras 50/50. 4.6. Standardaine. Teadaoleva aktiivsusega (RÜ) spiramütsiin. 5. Standardlahused Lahustada täpselt kaalutud kogus standardainet punktis 4.5 toodud segus ja lahjendada sama seguga, et saada lähtelahus, mis sisaldab 1000 RÜ spiramütsiini milliliitri kohta. Korgiga suletud kolvis 4 °C juures hoituna on lahus stabiilne viis päeva. Sellest lähtelahusest valmistada seguga järjestikuse lahjendamisega järgmised lahused: -- S8 1 RÜ/ml; -- S4 0,5 RÜ/ml; -- S2 0,25 RÜ/ml; -- S1 0,125 RÜ/ml. 6. Ekstrakti ja analüüsivate lahuste valmistamine 6.1. Ekstraheerimine Kaaluda 20,0 g proovi söötade puhul ja 1,0--20,0 g proovi premiksite puhul. Lisada 100 ml segu ja loksutada 30 minutit. Tsentrifuugida või dekanteerida ja lahjendada proovi peal olev lahus seguga, et saada eeldatav spiramütsiinisisaldus 1 RÜ/ml (= U8 ). Eeldatavate spiramütsiinisisalduste puhul, mis on väiksemad kui 2,5 mg/kg söödas, tuleb ekstraheerimine läbi viia järgmiselt. Kaaluda 20,0 g proovi. Lisada 100 ml segu ja loksutada 30 minutit. Tsentrifuugida mõned minutid, võtta 50 ml proovi peal olevat lahust ja aurutada kuni ligikaudu 4 ml-ni alandatud rõhu all rootoraurutis temperatuuril, mis ei ületa 40 °C. Lahjendada jääki punktis 4.5 toodud seguga, et saada eeldatav spiramütsiini sisaldus 1 RÜ/ml (= U 8). 6.2. Proovilahused Lahusest U8 valmistada lahused U4 (eeldatav sisaldus 0,5 RÜ/ml), U2 (eeldatav sisaldus 0,25 RÜ/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,125 RÜ/ml) järjestikuse lahjendamisega (1/1) punktis 4.5 toodud seguga. 7. Analüüsi käik 7.1. Analüüsi söötme inokuleerimine Inokuleerida analüüsi söödet baktersuspensiooniga ligi 50 °C juures. Eelnevate katsetega plaatidel analüüsi söötmega määrata vajalik baktersuspensiooni kogus, et saada erinevate spiramütsiini kontsentratsioonidega suurimad ja selgeimad inhibitsioonitsoonid. 7.2. Plaatide ettevalmistamine Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel, kasutades nelja kontsentratsiooniga standardlahuseid (S8, S4, S 2, S1) ja nelja kontsentratsiooniga analüüsitavaid lahuseid (U 8, U4, U2, U1). Neli ekstrakti ja neli standardlahust tuleb tingimata paigutada igale plaadile. Selleks valida plaadid, mis on piisavalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10--13 mm, nii et nende keskpunktide vahele jääks vähemalt 30 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, mille pinnal on 200-mm läbimõõduga ja 20 mm kõrge alumiinium- või plastikrõngas. Valada plaatidele teatav kogus söödet, mida on inokuleeritud vastavalt punktile 7.1, et saada ligikaudu 2 mm paksune kiht (60 ml 200-mm läbimõõduga plaadi kohta). Lasta söötmel tasanduda, teha augud ja paigutada nendesse täpselt mõõdetud analüüsitavate ja standardlahuste kogused (0,10--0,15 ml augu kohta vastavalt augu läbimõõdule). Paigutada iga kontsentratsiooniga lahust vähemalt neli korda, nii et igal määramisel hinnatakse 32 inhibitsioonitsooni. 7.3. Inkubeerimine Inkubeerida plaate 16--18 tundi 30 °C ± 2 °C juures. 8. Hindamine Mõõta inhibitsioonitsoonide läbimõõt 0,1 mm täpsusega ja leida mõõtmistulemuste keskmised väärtused iga kontsentratsiooni jaoks. Koostada poollogaritmilisel millimeetripaberil graafik, mis näitab inhibitsioonitsoonide läbimõõdu sõltuvust vastavate kontsentratsioonide logaritmist. Visandada kõige sobivamad jooned nii standardlahuse kui ka ekstrakti jaoks nagu allpoololeva näite puhul. Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse madalaima taseme (SL) (väikseima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Määrata «kõige sobivam» punkt standardlahuse kõrgeima taseme (SH) (suurima sisalduse) jaoks järgmise valemi abil

Samamoodi arvutada «kõige sobivamad» punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades väärtused s 1, s2, s4 ja s8 eespool olevates valemites väärtustega u1, u2, u4 ja u8 (46). Märkida arvutatud SL ja SH väärtused samale millimeetripaberile ja ühendada need punktid, et saada standardlahuse puhul «kõige sobivam» joon. Analoogiliselt märkida UL ja UH ning ühendada need, et saada ekstrakti puhul «kõige sobivam» joon. Segavate tegurite puudumisel peavad jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni pidada paralleelseteks, kui väärtused (SH-SL) ja (UH-UL) ei erine rohkem kui 10% oma keskmisest väärtusest. Kui jooned ei ole paralleelsed, võib loobuda kas u1 ja s 1 või u8 ja s8 ning arvutada SL, SH, UL ning UH, kasutades alternatiivseid valemeid, et saada alternatiivsed «kõige sobivamad» jooned.

ning analoogiliselt ka UL ja UH puhul. Täidetud peavad olema samad paralleelsuse kriteeriumid. Lõpparuandesse tuleb märkida asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme taseme põhjal. Kui jooni peetakse paralleelseteks, arvutada ühe järgnevalt antud valemi abil suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) olenevalt sellest, kas paralleelsuse hindamiseks on kasutatud kolme või nelja taset. Nelja taseme puhul

Kolme taseme puhul

või

Prooviekstrakti aktiivsus = vastava standardi aktiivsus A. (u8 = s8 A) Kui leitakse, et suhteline aktiivsus on väljaspool piirkonda 0,5--2,0, korrake analüüsi, tehes vajalikud muudatused ekstrakti kontsentratsioonides, või kui see ei ole võimalik, siis standardlahuste kontsentratsioonides. Kui suhtelist aktiivsust ei ole võimalik reguleerida nõutud piirkonda, tuleb iga saadud tulemust pidada ligikaudseks ning seda tuleks lõpparuandes märkida. Kui jooni ei peeta paralleelseteks, korrata määramist. Kui ka siis ei saavutata paralleelsust, tuleb määramist pidada mitterahuldavaks. Väljendada tulemus spiramütsiinialuse milligrammides sööda kilogrammi kohta. 9. Korratavus Sama analüütiku poolt sama prooviga läbi viidud kahe paralleelmääramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada: -- 2 mg/kg absoluutväärtuses spiramütsiinialuse sisalduste puhul kuni 10 mg/kg; -- 20% suurimast väärtusest, kui sisaldused on 10--25 mg/kg; -- 5 mg/kg absoluutväärtuses, kui sisaldused on 25--50 mg/kg; -- 10% suurimast väärtusest sisalduste puhul, mis on üle 50 mg/kg. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 59 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Aflatoksiinide määramise kvantitatiivne metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika eesmärgiks on määrata looduses elutsevate hallitusseente poolt produtseeritavaid aflatoksiine ja nende metaboliite. Metoodika võimaldab määrata aflatoksiine B1, B 2, G1, G2 söötades, teraviljades, pähklites, toiduainetes ja M1 piimas ning piimasaadustes. 2. Põhimõte Metoodika põhineb teatud kindlate toksiinide suhtes kõrget afiinsust omavate monoklonaalsete antikehade kasutamisel. Aflatoksiinid ekstraheeritakse proovist metanooli lahusega. Teatud kindla koguse saadud ekstrakti aflatest-kolonnist läbilaskmisel monoklonaalsed antikehad seovad endaga aflatoksiinide molekulid. Kolonnist uhutakse aflatoksiinid välja puhta metanooliga ja kasutades ilmutuslahust määratakse aflatoksiinide fluorestsents fluoromeetris. 3. Reaktiivid 3.1. NaCl. 3.2. Metanooli 80% vesilahus (80 ml metanooli + 20 ml dest. vett). Soovitav on kasutada ühe nädala jooksul pärast valmistamist. Kork sulgeda tihedalt. Lenduv lahus! 3.3. Aflatest ilmuti (developer), mis kontsentreerituna peab olema kollase värvusega. Töölahuseks (0,002%) lahjendada 5 ml kontsentreeritud ilmutit 45 ml destilleeritud veega. Iga päev valmistada värske töölahus. 3.4. Destilleeritud või deioniseeritud vesi. 4. Töövahendid ja aparatuur 4.1. Aflatest-afiinsuskolonnid Kolonnid jagunevad: -- aflatest 10 ­ kõrge afiinsus B1 ja B2 suhtes; -- aflatest P ­ kõrge afiinsus B1, B2 , G1, G2 ja M1 suhtes. 4.2. Fluoromeeter. 4.3. Mükotoksiinide kalibreerimisstandardid. 4.4. Aflatoksiinide tööstandardid. 4.5. Segaja koos segamisnõuga. 4.6. Küvetid. 4.7. Lehtrid. 4.8. Plasttopsid. 4.9. Pump (koos 10-ml süstlaga). 4.10. Mõõtsilinder, 100-ml, 1 tk. 4.11. Mõõtsilinder, 50-ml, 2 tk. 4.12. Pipetid: -- 1-ml, 2 tk; -- 2-ml, 2 tk. 4.13. Filterpaber. 4.14. Klaasmikrokiudfilterpaber. 4.15. Autopipett ilmutile, 1 tk. 5. Reaktiivide kontroll Kontroll toimub pärast fluoromeetri kalibreerimist. 5.1. Pipeteerida 2 ml metanooli küvetti. Tulemus peab olema 1. 5.2. Pipeteerida 2 ml dest. vett küvetti. Tulemus peab olema 1. 5.3. Pipeteerida 2 ml lahjendatud ilmutit küvetti. Tulemus peab olema 1. 5.4. Pipeteerida 1 ml metanooli ja lisada 1 ml ilmutit, segada hästi. Tulemus peab olema 1. 6. Ekstraktsioon 6.1. Kaaluda 50 g jahvatatud proovi ja panna see segamisnõusse. 6.2. Lisada 5 g soola (NaCl). 6.3. Lisada 100 ml 80% metanooli lahust. 6.4. Katta segamisnõu tihedalt kaanega ja segada suurel kiirusel 1 min. 6.5. Eemaldada kaas ning filtreerida ekstrakt läbi hariliku filterpaberi puhtasse plasttopsi. Filtraati peab olema vähemalt 20--25 ml. 6.6. Valada 10 ml saadud ekstrakti mõõtsilindrisse ja lahjendada dest. veega 50 ml-ni. Segada korralikult. 6.7. Filtreerida lahjendatud ekstrakt läbi klaasmikrokiudfilterpaberi puhtasse plasttopsi. 6.8. Filtreerimine viia läbi vahetult enne afiinsuskromatograafiat. 7. Aflatest afiinsuskromatograafia 7.1. Eemaldada Aflatest kolonni värviline kork ja lõigata ära 1/8 selle otsast. Kasutada seda ühenduseks süstla ja kolonni vahel. 7.2. Kolonni alla asetada tühi tops jääkide kogumiseks. 7.3. Tõmmata suure süstla pump ülemisse asendisse. 7.4. Valada väikesesse süstlasse 10 ml filtreeritud ekstrakti. Kinnitada suurest süstlast tuleva vooliku ots väikese süstla ülemisele avale. 7.5. Suruda ekstrakt läbi kolonni (1--2 tilka/sek), vajutades suure süstla pumpa. 7.6. Pesta kolonni 3 korda 10 ml dest. veega (voolukiirus 1--2 tilka/sek). 7.7. Viimast pesuvett (küvetti 2 ml) võib kontrolli mõttes vaadata fluoromeetris. Tulemus peab olema 0. 7.8. Pipeteerida 1,0 ml puhast metanooli väikesesse süstlasse, et uhtuda aflatoksiinid kolonnist välja. 7.9. Asetada kolonni alla puhas küvett. 7.10. Suruda uhtlahus läbi kolonni ning koguda eluaat küvetti. 7.11. Lisada küvetti 1,0 ml aflatest ilmutit (developer). Segada korralikult. 7.12. Asetada küvett kalibreeritud fluoromeetrisse. Tulemus ilmub 60 sekundi pärast aparaadi ekraanile ja näitab üldaflatoksiinide (olenevalt kasutatud kolonnist) sisaldust µg/kg (PPB) uuritavas proovis. 8. Märkused 8.1. Pärast iga katset pesta segamisnõu pehme pesuvahendi lahusega ja loputada korralikult. Sama nõue puudutab iga detaili, mida kasutatakse korduvalt. Katsete vahel uhtuda väike süstal üle metanooliga ning seejärel veega. 8.2. Vältida kõigi reagentide ja lahuste kontakti (metanool, vesi, ekstrakt, eluaat või ilmuti) kummi või pehme elastse plastikuga, sest viimased võivad anda fluorestsentsi ja seeläbi mõjutada lõpptulemust. 8.3. Iga katseseeria juures on vajalik teha vähemalt üks lisatud proov (kaalutud proovile lisada mükotoksiinide standardit) või kasutada referentsmaterjali enda töö kontrollimiseks. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 60 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Ohratoksiini määramise kvantitatiivne metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika eesmärgiks on määrata looduses elutsevate hallitusseente ( Aspergillus ochraceous, Penicillium veridicatum ja Penicillium cyclopium) poolt produtseeritavaid ohratoksiine teraviljades, maisis, maapähklites, kohvis ja jõusöödas. 2. Põhimõte Metoodika põhineb teatud kindlate toksiinide suhtes kõrget afiinsust omavate monoklonaalsete antikehade kasutamisel. Ohratoksiinid ekstraheeritakse proovist metanooli lahusega. Kindla koguse saadud ekstrakti ohratest-kolonnist läbilaskmisel monoklonaalsed antikehad seovad endaga ohratoksiinide molekulid. Kolonnist uhutakse ohratoksiinid välja NaOH lahusega ja ohratoksiinide fluorestsents määratakse fluoromeetris. 3. Reaktiivid 3.1. NaCl. 3.2. 80% metanooli vesilahus (80 ml metanooli + 20 ml vett). Soovitav on kasutada ühe nädala jooksul pärast valmistamist. Kork sulgeda tihedalt. Lenduv lahus! 3.3. Mükotoksiinide pesupuhverlahus (Mycotoxin wash buffer ) Vesi + NaCl + NaHCO3 + Tween-20 1 l + 25 g + 5 g + 0,1 ml Kasutades valmis kontsentreeritud puhverlahust: töölahuse saamiseks lahjendada 200 ml kontsentraati 800 ml dest. veega. Kasutusaeg 30 päeva. 3.4. Ohratoksiini uhtlahus (Ohratest eluting solution). 100 ml vett + 0,4 g NaOH = 0,1N NaOH. 3.5. Destilleeritud või deioniseeritud vesi. 4. Töövahendid ja aparatuur 4.1. Ohratest-afiinsuskolonnid. 4.2. Fluoromeeter. 4.3. Mükotoksiinide kalibreerimisstandardid. 4.4. Ohratoksiinide tööstandardid. 4.5. Segaja koos segamisnõuga. 4.6. Küvetid. 4.7. Lehtrid, plasttopsid. 4.8. Pump (koos 10-ml süstlaga). 4.9. 100-ml mõõtsilinder, 2 tk. 4.10. 50-ml mõõtsilinder, 2 tk. 4.11. Pipetid, 1,5-ml, 3 tk. 4.12. Filterpaber. 4.13. Klaasmikrokiudfilterpaber. 5. Reaktiivide kontroll Kontroll toimub pärast fluoromeetri kalibreerimist. 5.1. Pipeteerida 1,5 ml destilleeritud vett küvetti ning asetada fluoromeetrisse. Tulemus peab olema 1. 5.2. Pipeteerida 1,5 ml ohratoksiini uhtlahust küvetti. Tulemus peab olema 1. 5.3. Pipeteerida 1,5 ml pesupuhverlahust küvetti. Mõõtmistulemus peab olema 2. 6. Ekstraktsioon 6.1. Kaaluda 50 g jahvatatud proovi ja panna see segamisnõusse. 6.2. Lisada NaCl 5 g. 6.3. Lisada 100 ml 80% metanooli vesilahust. 6.4. Katta segamisnõu kaanega ja segada suurel kiirusel 1 min. 6.5. Eemaldada kaas ning filtreerida ekstrakt läbi hariliku filterpaberi puhtasse plasttopsi. Filtraati peab olema vähemalt 20--25 ml. 6.6. Valada saadud ekstrakti 10-ml mõõtsilindrisse ning lahjendada destilleeritud veega 50 ml-ni. Segada korralikult. Odra puhul toimub lahjendamine 2,5%-se soolalahusega (NaCl). 6.7. Filtreerida lahjendatud ekstrakt läbi klaaskiudmikrofilterpaberi puhtasse plasttopsi. Filtreerimine viiakse läbi vahetult enne afiinsuskromatograafiat. 7. Ohratest afiinsus-kromatograafia 7.1. Eemaldada Ohratest kolonni värviline kork ja lõigata ära 1/8 otsast. Kasutada seda ühenduseks süstla ja kolonni vahel. 7.2. Kolonni alla asetada tühi tops jääkide kogumiseks. 7.3. Tõmmata suure süstla pump ülemisse asendisse. 7.4. Valada väiksesse süstlasse 10,0 ml filtreeritud ekstrakti. Kinnitada suurest süstlast tuleva vooliku ots väikese süstla ülemisele avale. 7.5. Suruda ekstrakt läbi kolonni (1 tilk/sek), vajutades suure süstla pumpa. 7.6. Suruda 10 ml pesupuhverlahust (töölahust) läbi kolonni. Lubatav kiirus on 1--2 tilka/sek. 7.7. Uhtuda kolonni 3 korda 10 ml destilleeritud veega. Viimast pesuvett võib kontrolli mõttes vaadata fluoromeetris. Tulemus peab olema 0. 7.8. Pipeteerida 1,5 ml ohratoksiini uhtlahust väiksesse süstlasse. 7.9. Asetada kolonni alla puhas küvett. 7.10. Suruda uhtlahus läbi kolonni ning kogu eluaat küvetti. 7.11. Asetada küvett kalibreeritud fluoromeetrisse. Tulemus ilmub 60 sekundi pärast aparaadi ekraanile ja näitab ohratoksiini sisaldust µg/kg (PPB) uuritavas proovis. 8. Märkused 8.1. Pärast iga katset pesta segamisnõu pehme pesulahusega ja loputada korralikult. Sama nõue puudutab iga detaili, mida kasutatakse korduvalt. Katsete vahel uhtuda väike süstal üle metanooliga ning seejärel veega. Vältida kõigi reagentide ja lahuste kontakti (metanool, vesi, ekstrakt, eluaat või ilmuti) kummi või pehme elastse plastikuga, sest viimased võivad anda fluorestsentsi ja seeläbi mõjutada lõpptulemust. 8.2. Iga katseseeria juures on vajalik teha vähemalt üks lisatud proov (kaalutud proovile lisada ohratoksiini tööstandardit) või kasutada referentsmaterjali enda töö kontrollimiseks. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 61 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Zearalenooni määramise kvantitatiivne metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika eesmärgiks on määrata looduses elutsevate hallitusseente ( Fusarium graminearum, F. moniliforme) poolt produtseeritavat zearalenooni sisaldust teraviljades, maisis ja segasöötades. 2. Põhimõte Metoodika põhineb teatud kindlate toksiinide suhtes kõrget afiinsust omavate monoklonaalsete antikehade kasutamisel. Zearalenoon ekstraheeritakse proovist metanooli lahusega. Kindla koguse ekstrakti zearalatest-kolonnist läbilaskmisel monoklonaalsed antikehad seovad endaga zearalenooni molekulid. Kolonnist uhutakse zearalenoon välja puhta metanooliga. Ilmutuslahust kasutades määratakse zearalenooni fluorestsents fluoromeetris. 3. Reaktiivid 3.1. Destilleeritud või deioniseeritud vesi. 3.2. NaCl. 3.3. Puhas metanool. 3.4. Metanooli 80% vesilahus (80 ml metanooli + 20 ml destilleeritud vett). Vesilahust on soovitav kasutada ühe nädala jooksul pärast valmistamist. 3.5. Z-ilmuti (developer-Z) Iga ilmuti pudel sisaldab 2,5 g tahket alumiiniumkloriid-heksahüdraati, millest jätkub 50 katse jaoks. Enne kasutamist lahustada pudeli sisu 50 ml puhtas metanoolis. Lahust peab raputama (segama) mitmel korral vähemalt 1 tunni jooksul. Kontrollida, et kõik tahked osakesed on lahustunud! Pudelit hoida kindlalt suletuna, sest metanool on lenduv! 4. Töövahendid ja aparatuur 4.1. Zearalatest-afiinsuskolonnid. 4.2. Fluoromeeter. 4.3. Mükotoksiinide kalibreerimisstandardid. 4.4. Zearalenooni tööstandardid. 4.5. Segaja koos segamisnõuga. 4.6. Küvetid. 4.7. Lehtrid. 4.8. Plasttopsid. 4.9. Pump koos 10-ml väikese süstlaga. 4.10. Mõõtsilinder 50-ml ja 100-ml, á 2 tk. 4.11. Pipetid 1-ml ja 2-ml, á 2 tk. 4.12. Filterpaber. 4.13. Klaasmikrokiudfilterpaber. 5. Reagentide kontroll Kontroll toimub pärast fluoromeetri kalibreerimist. 5.1. Pipeteerida 2 ml dest. vett küvetti. Tulemus peab olema 1. 5.2. Pipeteerida 1 ml metanooli küvetti, lisada Z-ilmutit 1 ml. Tulemus peab olema 1. Kui eelnev tulemus on > 1, mõõda mõlemad komponendid (á 2 ml). Tulemused peavad olema 1. 5.3. Kui kontrollitavad lahused ei anna tõest tulemust, siis tuleb need ümber valada uude küvetti ning korrata mõõtmist. Kui lahused on ikka veel kõrgema näiduga 1­st, siis tuleb need ära visata ning valmistada uued. 5.4. Kui kõik kontrollitavad lahused annavad kõrgema tulemuse, tuleb kontrollida fluoromeetrit. Samuti on võimalik, et kasutatavad küvetid on defektsed. Sel juhul tuleb kasutusele võtta uus küvettide komplekt. 6. Ekstraktsioon 6.1. Kaaluda 50 g jahvatatud proovi ja panna see segamisnõusse. 6.2. Lisada 5 g soola (NaCl). 6.3. Lisada 100 ml 80% metanooli vesilahust. 6.4. Katta segamisnõu tihedalt kaanega ja segada suurel kiirusel 1 min. 6.5. Eemaldada kaas ning filtreerida ekstrakt läbi hariliku filterpaberi puhtasse plasttopsi. Filtraati peab olema vähemalt 20--25 ml. 6.6. Pipeteerida saadud ekstraktist 1 ml mõõtsilindrisse ning lahjendada 50 ml-ni. 6.7. Filtreerida lahjendatud ekstrakt läbi klaasmikrokiudfilterpaberi puhtasse plasttopsi. Filtreerimine viia läbi vahetult enne afiinsuskromatograafiat. 7. Zearalatest afiinsus-kromatograafia 7.1. Eemaldada Zearalatest kolonni värviline kork ja lõigata ära 1/8 selle otsast. Kasutada seda ühenduseks kolonni ja süstla vahel. 7.2. Kolonni alla asetada tühi tops jääkide kogumiseks. 7.3. Tõmmata suure süstla pump ülemisse asendisse. 7.4. Pipeteerida või valada väiksesse süstlasse: -- analüüsi jaoks, kus otsitava toksiini sisaldus võib olla vahemikus 2--100 PPM (mg/kg) ­ 1 ml filtreeritud ekstrakti; -- analüüsi jaoks, kus otsitava toksiini sisaldus võib olla vahemikus 0,2--10 PPM (mg/kg) ­ 10 ml filtreeritud ekstrakti. Seejärel kinnitada suurest süstlast tuleva vooliku ots väikese süstla ülemisele avale. 7.5. Suruda filtreeritud ekstrakt läbi kolonni (kiirusega 1 tilk/sek), vajutades suure süstla pumpa. 7.6. Pesta kolonni 2 korda 15 ml dest. veega (lubatud voolukiirus 1--2 tilka/sek). Viimast pesuvett (küvetti 2 ml) võib kontrolli mõttes vaadata fluoromeetris. Tulemus peab olema 0. 7.7. Asetada kolonni alla puhas küvett. 7.8. Pipeteerida (dispenseerige) 1,0 ml puhast metanooli süstlasse. 7.9. Suruda metanool läbi kolonni ning koguda eluaat küvetti. 7.10. Lisada küvetti 1,0 ml Z-ilmutit. Segada korralikult. 7.11. Asetada küvett kalibreeritud fluoromeetrisse. Tulemus ilmub 120 sekundi pärast ekraanile ja näitab zearalenooni sisaldust mg/kg (PPM) uuritavas proovis. 8. Märkused 8.1. Pärast iga katset pesta segamisnõu pehme pesuvahendi lahusega ja loputada korralikult. Sama nõue puudutab iga detaili, mida kasutatakse korduvalt. Katsete vahel uhtuda väike süstal üle metanooliga ning seejärel veega. Vältida kõigi reagentide ja lahuste kontakti (metanool, vesi, ekstrakt, eluaat või ilmuti) kummi või pehme elastse plastikuga, sest viimased võivad anda fluorestsentsi ja seeläbi mõjutada lõpptulemust. 8.2. Iga katseseeria juures on vajalik teha vähemalt üks lisatud proov (kaalutud proovile lisada zearalenooni tööstandardit) või kasutada referentsmaterjali enda töö kontrollimiseks. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI Lisa 62 Kinnitatud põllumajandusministri 28. detsembri 1998. a määrusega nr 46 Vomitoksiini (DON) määramise metoodika 1. Eesmärk ja ulatus Metoodika eesmärgiks on määrata looduses elutsevate hallitusseente ( Fusarium graminearum, Fusarium culmurum) poolt produtseeritavat vomitoksiini (DON) (deoxynivalenoli) sisaldust teraviljas, maisis, jõusöödas, toiduainetes ja segasöödas. 2. Põhimõte Metoodika põhineb analüüsitavast materjalist eraldatud toksiinide fluorestsentsi mõõtmisel. Vomitoksiin (DON) ekstraheeritakse proovist atsetonitriil­vee seguga. Puhastatud ekstraktis määramine toimub ÕKK abil, kus ÕKK plaadi töötlemine AlCl3 lahusega toob esile toksiini fluorestsentsi. Fluorestsentsi määratakse ultraviolettlambi all visuaalselt. 3. Reaktiivid 3.1. Aktiivsüsi. 3.2. Alumiiniumoksiid Al2O3. 3.3. Veevaba Na2SO4. 3.4. 20% AlCl3 etanoolis: 20 g AlCl3 6 H 2O lahustada 100 ml etanool­ vesi (1+1) lahuses. 3.5. Orgaanilised lahustid: atsetonitriil, isopropanool, etüülatsetaat, heksaan, atsetoon, etanool. 4. Töövahendid ja aparatuur 4.1. Veski. 4.2. Loksuti. 4.3. Rotadest. 4.4. ÕKK plaadid 15 15 cm, ALUGRAM SIL G/UV 254 (Macherey-Nagel). 4.5. Vomitoksiini (DON) tööstandardid. 4.6. Aktiveerida enne kasutamist 1 tund 105 °C juures kuivatuskapis. 4.7. UV-lamp. 4.8. Puhastuskolonn (klaaskolonn). 4.9. Mõõtsilinder 50-ml, 1 tk. 4.10. Mõõtsilinder 250-ml, 1 tk. 4.11. Koonilised kolvid. 5. Ekstraktsioon 5.1. 25 g peenestatud proovile lisada 20 ml destilleeritud vetd ning 105 ml atsetonitriili. 5.2. Loksutada 30 min. 5.3. Filtreerida. 5.4. 25 ml ekstrakti puhastada kolonnis: 0,75 g aktiivsütt + 0,75 g alumiiniumoksiidi, peale panna vatt. Mitte lasta kolonnil kuivada. Vomitoksiin (DON) elueerida kolonnist välja 10 ml atsetonitriil­vee seguga (84:16). 5.5. Kuivatada veevaba naatriumsulfaadiga. 5.6. Eluaat filtreerida 100 ml koonilisse kolbi. Filtrit pesta 5--10 ml isopropanooliga. 5.7. Eluaat ajada rotadestil kokku mahuni 5--7 ml, lisada 20 ml isopropanooli. 5.8. Ajada rotadestil kuivaks. 6. Õhukesekihikromatograafia (ÕKK) 6.1. Rotatsiooni jääk lahustada 200 µl etüülatsetaadis. 6.2. Proovi kanda ÕKK plaadile 5, 10 ja 20 µl (või kogu lahus). Vomitoksiini (DON) tööstandardit (20 ng DON/µ l) kanda samale plaadile vastavalt 1; 2,5; 10 ja 20 µl . 6.3. Voolutada plaati 10--12 cm kõrgusele. Plaadi voolutuslahuseks on heksaan: atsetoon (3:2). 6.4. Kuivatada plaati õhu käes 3--4 min. 6.5. Ilmutada 10% alumiiniumkloriidi lahusega etanoolis. 6.6. Kuivatada pritsitud plaati 105 °C juures kuivatuskapis 5--7 min. 6.7. Vaadata UV-lambi all. Vomitoksiini (DON) Rf = 0,6 (sinised fluorestseeruvad laigud). 7. Arvutus Vomitoksiin (DON) mg/kg = (V1 m)/(V2 M 1000), kus: V1 ­ 200 µl; V2 ­ plaadile kantud proovi kogus, µ l; M ­ 5 g; m ­ Vomitoksiini (DON) visuaalne sisaldus proovis, võrreldes standarditega, ng. 8. Märkused Iga katseseeria juures on vajalik teha vähemalt üks lisatud proov. Kaalutud proovile lisada vomitoksiini (DON) tööstandardit või kasutada referentsmaterjali enda töö kontrollimiseks. Majanduse asekantsler Toomas KEVVAI (1) Teravilja, peenjahu, tangude ja jämeda jahu kuivatamiseks peab kuivatuskapil olema selline termiline võimsus, et seatuna temperatuurile 131 C peab kapp saavutama selle temperatuuri vähemalt 45 minutit pärast seda, kui sellesse on korraga kuivama paigutatud maksimumarv proove. Ventilatsioon peab olema selline, et kui kapis on kaks tundi kuivatatud maksimumarv hariliku nisu proove, siis erinevad sellise kuivatamise tulemused pärast neljatunnist kuivatamist saadud tulemustest vähem kui 0,15%. (2) Lämmastikusisaldus määrata Kjeldahli poolmikrometoodikaga (teoreetiline lämmastikusisaldus 17,7%). (3) Kui õli või rasv peab pärast läbima kvaliteedi kontrolli, võtke pimsskivi tükikeste asemel klaashelmed. (4) Kui õli või rasv peab pärast läbima kvaliteedi kontrolli, võtke pimsskivi tükikeste asemel klaashelmed. (5) Mikroelementide määramisel on oluline vältida saastumist, eriti tsingi, vase ja rauaga. Seepärast ei või proovide ettevalmistamisel kasutatavad vahendid sisaldada neid metalle. Üldise saastumisohu vähendamiseks töötada tolmuvabas õhus, kasutada rangelt puhtaid vahendeid ja hoolikalt pestud klaasnõusid. Tsingi määramine on eriti tundlik mitut tüüpi saastumise suhtes, mis on tingitud näiteks klaasnõudest, reaktiividest, tolmust jms. (6) Värskes või kuivatatud rohusöödas sageli suures koguses sisalduv ränidioksiid eemaldada, kuna see seob mikroelemente. Selliste söötade proovide korral tuleb seepärast kasutada järgmist, muudetud analüüsi käiku. Toimida vastavalt punktile 5.1.1 kuni filtreerimiseni. Pesta lahustamatut jääki sisaldavat filterpaberit kaks korda keeva veega ning asetada see plaatinatiiglisse. Tuhastada muhvelahjus temperatuuril alla 550 C, kuni kogu süsinikku sisaldav aine on täiesti kadunud. Jätta jahtuma, lisada mõned tilgad vett ja seejärel 10--15 ml vesinikfluoriidhapet ning aurutada kuivaks temperatuuril umbes 150 C. Kui jääki jääb alles ränidioksiidi, lahustage see uuesti mõnes milliliitris vesinikfluoriidhappes ja aurutage kuivaks. Lisada viis tilka väävelhapet ja kuumutada, kuni valgeid aure enam ei eraldu. Pärast 5 ml 6N vesinikkloriidhappe ja ligikaudu 30 ml vee lisamist kuumutada, filtreerida lahus 250-ml mõõtekolbi ning täita kolb veega märgini (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5N). Seejärel jätkata määramist alates punktist 5.1.2.2. Loputada tiiglit kokku umbes 5 ml vesinikkloriidhappega ning viia see aeglaselt ja ettevaatlikult keeduklaasi (võib toimuda intensiivne reaktsioon, mis on tingitud CO2 moodustumisest). Lisada tilkhaaval ja loksutades vesinikkloriidhapet, kuni kihisemine on lakanud. Aurutada kuivaks, aeg-ajalt klaaspulgaga segades. Seejärel lisada jäägile 15 ml 6N vesinikkloriidhapet ja siis ligikaudu 120 ml vett. Segada klaaspulgaga ja katta keeduklaas uuriklaasiga, jättes klaaspulga keeduklaasi. Kuumutada aeglaselt keemiseni ja hoida keemistemperatuuril, kuni kogu tuhk on lahustunud. Filtreerida läbi tuhavaba filterpaberi ning koguda filtraat 250-ml mõõtekolbi. Pesta keeduklaas ja filter 5 ml kuuma 6N vesinikkloriidhappega ja kaks korda keeva veega. Täita mõõtekolb veega märgini (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5N). (7) Tuhastatava proovi mass arvutatakse välja sööda ligikaudse mikroelementide sisalduse põhjal vastavalt kasutatava spektrofotomeetri tundlikkusele. Teatavate madala mikroelementide sisaldusega söötade puhul võib olla vaja alustada 10--20 g prooviga ning valmistada lõplik lahus mahuga ainult 100 ml. (8) Tuhastada tuleb suletud ahjus, kuhu ei lasta sisse õhku ega hapnikku. (9) Püromeetri temperatuur ei tohi ületada 475 C. (10) 1 RÜ (rahvusvaheline ühik) = 0,3 µg retinooli. (11) Piimasöötade ja toodete puhul, millel on kalduvus paisuda või moodustada kämpe, kahekordistada punkti 5.2 esimeses ja teises lõigus näidatud reaktiivide koguseid. (12) Naatriumaskorbaati ei ole vaja lisada, kui hüdrolüüs viiakse läbi lämmastiku atmosfääris. 10 ml kaaliumhüdroksiidi lahust ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust. (13) Karotiinisisaldust võib määrata optilise tiheduse mõõtmisel 450 nm juures. (14) Egmond, H. P. van, Heisterkamp, S. H. and Paulsch, W. E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17--29. (15) ISO 3534--1977. (16) OJ No L 351, 2.12.1989, p 39. (17) Mesh -- avade (või osakeste) arv sõela 1 tollil (25,4 mm). Standardiks on võetud sõel 200 mesh'i, mille avad on 0,074 mm ja võrguniidi läbimõõt 0,056 mm (USA standard ASTM E 11-61). (18) Kasutada võib mis tahes kaubastatavat samalaadse koostisega ja samu tulemusi andvat söödet. (19) Kasutada võib mis tahes kaubastatavat samalaadse koostisega ja samu tulemusi andvat söödet. (20) Amidomusta kasutatakse selleks, et muuta nähtavaks standardlahuste inhibitsioonitsoonid (sinised ringid). (21) Mikroobitüvi, mille on isoleerinud LUFA Kielis, kasvab kiiremini kui S. aureus ATCC 6538 P. (22) Kasutada võib mis tahes kaubastatavat samalaadse koostisega ja samu tulemusi andvat söödet. (23) LUFA poolt Kielis isoleeritud mikroobitüvi. (24) Kasutada võib mis tahes kaubastatavat samalaadse koostisega ja samu tulemusi andvat söödet. (25) Kasutada võib mis tahes kaubastatavat samalaadse koostisega ja samu tulemusi andvat söödet. (26) 1 mg virginiamütsiini vastab 1000 UK ühikule. (27) Kasutada võib muid meetodeid tingimusel, kui on kindlaks tehtud, et need annavad samasugused baktersuspensioonid. (28) Kasutada võib iga kaubanduses saadaolevat söödet, mis on sarnase koostisega ja annab samasuguseid tulemusi. (29) 1 mg tsinkbatsitratsiini söödaühiku (kg) kohta võrdub 42 rahvusvahelise ühikuga (RÜ). (30) Lubatud on kasutada ka muid meetodeid, kui on kindlaks tehtud, et need annavad samasugused baktersuspensioonid. (31) Kasutada võib iga kaubanduslikult saadaolevat sarnase koostisega söödet, mis annab samasugused tulemused. (32) Lubatud on kasutada ka muid meetodeid, kui on kindlaks tehtud, et need annavad samasugused baktersuspensioonid. (33) Kasutada võib iga kaubanduslikult saadaolevat sarnase koostisega söödet, mis annab samasugused tulemused, näiteks oksoidset antibiootilist söödet 1 (CM 327), millele lisatakse oksoidagarit nr 3 (L 13). (34) Kasutada võib iga kaubanduslikult saadaolevat sarnase koostisega söödet, mis annab samasugused tulemused, näiteks oksoidset antibiootilist söödet 2 (CM 335), millele lisatakse oksoidagarit nr 3 (L 13). (35) Näiteks SE 2, mida tarnib Wacker Chemie GmbH, München. (36) Võib kasutada teisi meetodeid, kui on kindlaks tehtud, et need annavad samasuguseid spoorsuspensioone. (37) Võib kasutada iga kaubastatavat samalaadse koostisega söödet, mis annab samu tulemusi. (38) Väikesed tähed «s» ja «u» näitavad inhibitsioonitsoonide läbimõõte. (39) 1 mg monensiinnaatriumi vastab 1000 UK ühikule. (40) Võib kasutada muid meetodeid, kui on kindlaks tehtud, et need annavad samasuguseid spoorsuspensioone. (41) Võib kasutada igasuguseid samasuguse koostisega ja samu tulemusi andvaid kaubastatavaid söötmeid. (42) Väikesed tähed «s» ja «u» näitavad inhibitsioonitsoonide läbimõõte. (43) 1 mg spiramütsiinialust on ekvivalentne 3200 rahvusvahelisele ühikule RÜ (IU). (44) Võib kasutada muid meetodeid eeldusel, et on kindlaks tehtud, et need annavad sarnaseid baktersuspensioone. (45) Kasutada võib iga kaubastatavat söödet, millel on sarnane koostis ja mis annab samu tulemusi. (46) Väikesed tähed «s» ja «u» näitavad inhibitsioonitsoonide läbimõõte.