Vabariigi Valitsus — Analüüsimeetodid saasteainete sisalduse määramiseks loomses toidutoormes ja toidus — RT I, 13, 88

Määrus kehtestatakse «Toiduseaduse» (RT I 1999, 30, 415; 2002, 13, 81; 61, 375; 63, 387; 102, 603) § 49 lõike 4 alusel. 1. peatükk ÜLDSÄTTED § 1. Reguleerimisala (1) Määrusega kehtestatakse nõuded kontrollproovide (edaspidi proovid) analüüsimeetoditele ning analüüsitulemuste hindamisele, mida kasutatakse gruppidesse A ja B liigitatavate saasteainete sisalduse määramiseks loomses toidutoormes ja toidus (edaspidi loomne toit). (2) Grupp A – anaboolset toimet omavad «Ravimiseaduse» (RT I 1996, 3, 56; 49, 954; 1997, 93, 1564; 1998, 36/37, 554; 1999, 58, 608; 2001, 53, 308; 2002, 18, 97; 53, 336; 62, 377; 63, 387; 82, 480; 2003, 26, 156; 88, 591) § 5 lõike 52 punkti 2 alusel kehtestatud põllumajandusloomade suhtes kasutamiseks keelatud biostimulaatorite, hormoonpreparaatide ja muude ainete nimekirjas loetletud ained: 1) A. 1 – stilbeenid, stilbeeni derivaadid, nende soolad ja estrid; 2) A. 2 – türeostaatikumid; 3) A. 3 – steroidid; 4) A. 4 – resortsüülhappe laktoonid, sealhulgas zeranool; 5) A. 5 – β-antagonistid; 6) A. 6 – muud «Ravimiseaduse» § 5 lõike 52 punkti 2 alusel kehtestatud põllumajandusloomade suhtes kasutamiseks keelatud biostimulaatorite, hormoonpreparaatide ja muude ainete nimekirjas toodud ained. (3) Grupp B – veterinaarravimid ja muud saasteained: 1) B. 1 – antibakteriaalsed ained, sealhulgas sulfoonamiidid, kvinoloonid; 2) B. 2 – muud veterinaarravimid; 3) B. 3 – muud mujal nimetamata saasteained ning keskkonna saasteained. (4) Lõikes 3 nimetatud muud veterinaarravimid on: 1) B. 2 (a) – antihelmintikumid; 2) B. 2 (b) – antikoksidiaalid, sealhulgas nitroimidasool; 3) B. 2 (c) – karbamaadid ja püretroidid; 4) B. 2 (d) – sedatiivid; 5) B. 2 (e) – mittesteroidsed põletikuvastased vahendid (NSAID); 6) B. 2 (f) – teised farmakoloogiliselt aktiivsed ained. (5) Lõikes 3 nimetatud muud mujal nimetamata saasteained ning keskkonna saasteained on: 1) B. 3 (a) – kloororgaanilised ühendid, sealhulgas PCB; 2) B. 3 (b) – fosfororgaanilised ühendid; 3) B. 3 (c) – keemilised elemendid; 4) B. 3 (d) – mükotoksiinid; 5) B. 3 (e) – värvained; 6) B. 3 (f) – muud ained. (6) Määrust kohaldatakse järelevalveametnike poolt järelevalve käigus võetavate proovide analüüsimise korral selleks volitatud laboratooriumis. (7) Loomsest toidust võetud proovide analüüsimise korral järgitakse Vabariigi Valitsuse 2. novembri 1999. a määrusega nr 330 kinnitatud «Järelevalve käigus kontrollproovide võtmise ja analüüsimise korda» (RT I 1999, 84, 767; 2003, 12, 60). 2. peatükk NÕUDED ANALÜÜSIMEETODITELE § 2. Analüüsimeetodid (1) Järelevalve käigus võetud proove analüüsitakse meetoditega, mis on dokumenteeritud katsejuhendites, soovitatavalt vastavalt standardile ISO 78-2:19992. (2) Analüüsimeetodid peavad vastama käesoleva määruse lisas toodud nõuetele. (3) Analüüsimeetodite valideerimisel tuleb järgida käesoleva määruse lisas kirjeldatud valideerimisprotseduure. (4) Saasteainete puhul, mille kohta ei ole kehtestatud piirnormi, peavad analüüsimeetodid vastama minimaalsetele nõutavatele suutlikkusepiiridele. § 3. Analüüsitulemuste kvaliteedi tagamine Analüüsitulemuste kvaliteedi tagamiseks peavad laboratooriumid järgima standardi EVS-EN ISO/IEC 17025:2000 peatükis 5.9 kirjeldatud protseduure. 3. peatükk NÕUDED ANALÜÜSITULEMUSTE HINDAMISELE § 4. Analüüsitulemuste hindamine (1) Analüüsitulemus loetakse nõuetele mittevastavaks, kui analüüsi tulemus ületab analüüdi kinnitava meetodi otsustuspiiri. (2) Kui saasteaine kohta on kehtestatud piirnorm, on otsustuspiiriks kontsentratsioon, millest ülalpool võib statistilise tõenäosusega 1-α öelda, et piirnorm on tõepoolest ületatud. (3) Kui saasteaine kohta ei ole piirnormi kehtestatud, on otsustuspiiriks madalaim kontsentratsioon, mille puhul meetod suudab statistilise tõenäosusega 1-α tuvastada analüüdi olemasolu. (4) Paragrahvi 1 lõikes 2 loetletud saasteinete puhul võib α-viga olla 1% või vähem. Kõigi teiste saasteainete puhul võib α-viga olla 5% või vähem. 4. peatükk RAKENDUSSÄTTED § 5. Määruse rakendamine (1) Kuni 1. septembrini 2004. a võib § 1 lõikes 2 toodud saasteainete määramiseks kasutada analüüsimeetodeid, mis ei vasta käesoleva määruse lisas analüüsimeetoditele esitatud nõuetele. (2) Kuni 1. septembrini 2007. a võib § 1 lõigetes 3–5 toodud saasteainete määramiseks kasutada analüüsimeetodeid, mis ei vasta käesoleva määruse lisas analüüsimeetoditele esitatud nõuetele. _______________ 1 2002/657/EÜ (EÜT L 221, 17.08.2002, lk 8–36) 2 Standardite kohta annavad eestikeelset teavet referentlaboratooriumid Peaminister Juhan PARTS Põllumajandusminister Tiit TAMMSAAR Riigisekretär Heiki LOOT Vabariigi Valitsuse 27. veebruari 2004. a määruse nr 56 «Analüüsimeetodid saasteainete sisalduse määramiseks loomses toidutoormes ja toidus» lisa ANALÜÜSIMEETODID SAASTEAINETE SISALDUSE MÄÄRAMISEKS LOOMSES TOIDUS I. ÜLDSÄTTED 1. Kasutusala Käesolevas lisas kirjeldatavaid nõudeid kohaldatakse loomses toidus saasteainete sisalduse määramiseks võetud proovide analüüsimeetodite ja analüüsitulemuste hindamise suhtes. 2. Terminid Järelevalve käigus võetavate proovide laboratooriumides analüüsimise korral ja käesolevas lisas kasutatakse termineid järgmises tähenduses: 2.1. mõõtetäpsus (accuracy) on katse tulemuse ja tunnustatud etalonväärtuse lähedusaste. See määratakse kindlaks mõõtetulemuste tõesuse (trueness) ja kordustäpsuse (precision) kaudu; 2.2. α-viga (alpha error) on tõenäosus, et uuritud proov vastab nõuetele, isegi kui analüüsil on saadud nõuetele mittevastav mõõtetulemus (valepositiivne tulemus); 2.3. analüüt (analyte) on aine või sellest analüüsi käigus tekkiv derivaat, mis tuleb avastada, identifitseerida või kvantitatiivselt määrata; 2.4. β-viga (beta error) on tõenäosus, et uuritud proov tõepoolest ei vasta nõuetele, isegi kui on saadud nõuetele vastav mõõtetulemus (valenegatiivne otsus); 2.5. süstemaatiline viga (bias) on eeldatava katsetulemuse ja tunnustatud etalonväärtuse erinevus; 2.6. kalibreerimisstandard (calibration standard) on analüüdi määramisel kasutatav kindla koostisega aine või vahend, mis iseloomustab huvipakkuva aine hulka nii, et see on seostatav etalonväärtusega; 2.7. sertifitseeritud etalonaine (certified reference material, CRM) on materjal, mis sisaldab kindlaksmääratud hulga analüüti; 2.8. ko-kromatograafia (co-chromatography) on meetod, mille puhul uuritav ekstrakt jagatakse kaheks, üks osa ekstraktist kromatografeeritakse kohe, teisele osale lisatakse enne kromatografeerimist mõõdetava analüüdi standardit, mille hulk on lähedane eeldatavale analüüdi sisaldusele ekstraktis. Meetodi eesmärgiks on parandada analüüdi identifitseerimist, eriti juhtudel, kui pole võimalik kasutada sobivat sisestandardit; 2.9. ühisuuring (collaborative study) on sama proovi analüüsimine erinevates laboratooriumides sama meetodiga, et kindlaks määrata meetodi suutlikkusenäitajaid. Ühisuuring kajastab juhuslikke ja süstemaatilisi mõõtevigu; 2.10. kinnitav meetod (confirmatory method) on meetod, mis annab täielikku või täiendavat teavet saasteaine üheseks identifitseerimiseks ja vajaduse korral kvantitatiivseks määramiseks huvipakkuval kontsentratsioonil; 2.11. otsustuspiir (decision limit, CCα) on piir, millest alates ülespoole võib veatõenäosusega α väita, et proov ei vasta nõuetele; 2.12. avastamisvõime (detection capability, CCβ) on väikseim aine kogus, mida võib veatõenäosusega β proovis avastada, identifitseerida ja kvantitatiivselt määrata. Kui saasteaine kohta ei ole piirnormi kehtestatud, on avastamisvõimeks madalaim kontsentratsioon, mille puhul on antud meetodiga võimalik tõeselt statistilise usaldatavusega 1-β avastada saastunud proove. Saasteaine piirnormi olemasolu korral on avastamisvõimeks kontsentratsioon, mille puhul on antud meetodiga võimalik statistilise usaldatavusega 1-β tuvastada piirnormile vastavat või sellest allapoole jäävat saasteaine sisaldust; 2.13. rikastatud proovimaterjal (fortified sample material) on proov, millele on lisatud teadaolev hulk määratavat analüüti; 2.14. laboratooriumidevaheline uuring (interlaboratory study, interlaboratory comparison) on sama proovi eelnevalt määratud tingimuste kohane analüüsimise korraldamine, sooritamine ja hindamine analüüsimeetodi pädevuse hindamiseks vähemalt kahes laboratooriumis. Uuringu eesmärgist lähtuvalt võib selle liigitada koostööuuringuks või pädevusuuringuks; 2.15. sisestandard (internal standard, IS) on algselt proovis mittesisalduv aine, mille füüsikalis-keemilised omadused on määratavale analüüdile võimalikult sarnased ning mida lisatakse igasse proovi ja igasse kalibreerimisstandardisse; 2.16. laboratoorne proov (laboratory sample) on laboratooriumisse saatmiseks ettevalmistatud ja analüüsimiseks ettenähtud proov; 2.17. huvipakkuv kontsentratsioon (level of interest) on aine või analüüdi kontsentratsioon proovis, mis on piisav piirnormile vastavuse kontrollimiseks; 2.18. minimaalne nõutav suutlikkusepiir (minimum required performance limit, MRLP) on proovis leiduva analüüdi miinimumsisaldus, mida peab olema võimalik avastada ja kinnitada antud meetodi abil. Selle eesmärgiks on ühtlustada meetodite analüütilist suutlikkust selliste saasteainete puhul, mille kohta ei ole kehtestatud piirnormi; 2.19. suutlikkusenäitajad (performance characteristics) on meetodi funktsionaalset kvaliteeti iseloomustavad suurused. Selleks võivad olla näiteks spetsiifilisus (specificity), mõõtetäpsus (accuracy), tõesus (trueness), kordustäpsus (precision), korduvus (repeatability), avastamisvõime (detection capability) ja mõjutuskindlus (ruggedness); 2.20. suutlikkusekriteeriumid (performance criteria) on suutlikkusenäitajatele esitatavad nõuded, mille alusel otsustatakse meetodi sobivuse ja tulemuste usaldatavuse üle; 2.21. lubatud piirsisaldus (permitted limit) on õigusaktiga kehtestatud saaste- või muu aine piirnorm; 2.22. kordustäpsus (precision) on eelnevalt määratud tingimustel sooritatud sõltumatute katsete tulemuste lähedusaste. Kordustäpsuse määra väljendatakse tavaliselt hajuvusena (imprecision), mis arvutatakse katsetulemuste standardhälbena. Suurem standardhälve näitab väiksemat kordustäpsust; 2.23. pädevusuuring (proficiency study) on sama proovi analüüsimine erinevates laboratooriumides tingimusel, et laboratooriumid kasutavad selleks tavapäraselt kasutuselolevaid meetodeid. Uuringute läbiviimisel on soovitatav arvestada juhendite ISO 43-1:1997 ja 43-2:19971 nõudeid ja kasutada uuringutulemusi meetodite korratavuse hindamiseks; 2.24. kvalitatiivne meetod (qualitative method) on analüüsimeetod, mis identifitseerib aine selle keemiliste, bioloogiliste või füüsikaliste omaduste põhjal; 2.25. kvantitatiivne meetod (quantitative method) on analüüsimeetod, mis määrab aine hulga või massiosa nii, et see on väljendatav sobivates ühikutes arvväärtusena; 2.26. tühiproovi analüüs (reagent blank determination) on täieliku analüüsikäigu rakendamine ilma uuritava analüüdi ja maatriksita või proovi asemel ekvivalentse hulga sobiva lahusti kasutamisega; 2.27. saagis (recovery) on analüüsi käigus aine tõelisest kontsentratsioonist tagasisaadud osa protsent. See määratakse valideerimise käigus kas sertifitseeritud etalonaine või selle puudumisel lisandkatse põhjal; 2.28. etalonaine (reference material) on seadmete kalibreerimiseks või mõõtemeetodi kontrollimiseks kasutatav aine, mille üks või mitu omadust on kinnitatud valideeritud meetodiga; 2.29. korduvus (repeatability) on kordustäpsus korduvustingimustel; 2.30. korduvustingimused (repeatability conditions) on tingimused, mille puhul sõltumatud katsetulemused saadakse samas laboratooriumis sama meetodi, katseseadmete ja identse katsematerjaliga ning sama katsetegija poolt; 2.31. korratavus (reproducibility) on kordustäpsus korratavustingimustel; 2.32. korratavustingimused (reproducibility conditions) on tingimused, kus katsetulemused saadakse sama meetodi ja identse katsematerjaliga erinevates laboratooriumides, erinevate katsetegijate poolt erinevaid katseseadmeid kasutades; 2.33. mõjutuskindlus (ruggedness) on analüüsimeetodi tundlikkus muudatustele katsetingimustes, mida võib väljendada näiteks proovimaterjali, analüütide, säilitustingimuste, (välis)keskkonna ja proovi ettevalmistustingimuste loeteluna, mille puhul võib meetodit kohaldada esitataval kujul või väheoluliste muudatustega. Katsetingimuste kirjelduse juures tuleb ära näidata kõik tingimused ja mõjurid, näiteks reaktiivide stabiilsus, proovi koostis, pH, temperatuur, mis võivad analüüsitulemust mõjutada; 2.34. sõelmeetod (screening method) on meetod, mida kasutatakse aine või ainete klassi avastamiseks huvipakkuva kontsentratsiooni tasemel. Neil meetoditel on hea jõudlus ja neid kasutatakse suure hulga eeldatavalt mittevastavate proovide eraldamiseks. Need meetodid peavad välistama valenegatiivsed tulemused; 2.35. laboratooriumisisene valideerimine (single laboratory study, in-house validation) on meetodi analüütiline uuring ühes laboratooriumis, kusjuures kasutatakse sama või erinevat katsematerjali erinevatel tingimustel kindlaksmääratud ajavahemike järel; 2.36. spetsiifilisus (specificity) on meetodi võime eristada mõõdetavat analüüti teistest ainetest. See näitaja on valdavalt kirjeldatava mõõtmismeetodi omadus, kuid võib muutuda ka olenevalt analüüsitavast ühendiklassist või maatriksist; 2.37. lisamismeetod (standard addition) on analüüs, mille puhul uuritav proov jaotatakse kaheks või rohkemaks osaks. Üht osa analüüsitakse tavalisel viisil, teisele osale lisatakse teadaolev hulk analüüdistandardit. Lisatava analüüdistandardi kogus peab olema 2–5 korda suurem proovis hinnanguliselt leiduva analüüdi hulgast. Selle meetodi eesmärgiks on analüüdisisalduse määramine, arvestades meetodi saagist; 2.38. analüüdistandard (standard analyte) on teadaoleva ja sertifitseeritud sisaldusega ning puhtusastmega analüüt, mida saab analüüsil kasutada võrdlusainena; 2.39. aine (substance) on teadaoleva või piiritletud koostisega materjal koos selle derivaatidega; 2.40. katsekogus (test portion) on uuritavast proovist võetud materjali kogus, millega analüüs läbi viiakse; 2.41. uuritav proov (test sample) on proov, mis on valmistatud laboratoorsest proovist ja millest võetakse katsekogused; 2.42. tõesus (trueness) on suurest katseseeriast saadud tulemuste keskväärtuse ja tunnustatud etalonväärtuse lähedusaste. Tõesust väljendatakse tavaliselt hälbena (bias); 2.43. ühikud (units) on standardis ISO 31-0:19921 ja Vabariigi Valitsuse 29. juuni 1999. a määruses nr 212 «Kohustuslike mõõtühikute ja nende kasutusalade kinnitamine» (RT I 1999, 58, 612; 2002, 22, 127) kirjeldatud ühikud; 2.44. valideerimine on meetodile esitatavate erinõuete konkreetsetes tingimustes täitmise kontrollimine ja kinnitamine ning selle kohta tõendite esitamine; 2.45. laboratooriumisisene korratavus (within-laboratory reproducibility) on kordustäpsus, mis on saadud ühes ja samas laboratooriumis piisavalt pikkade ajavahemike järel eelnevalt kindlaksmääratud tingimustes, mis on seotud meetodi, katsematerjali, operaatorite või keskkonnaga. 3. Lühendid Käesolevas lisas kasutatakse lühendeid järgmises tähenduses: 3.1. AAS – aatomabsorptsioonspektromeetria (atomic absorption spectrometry); 3.2. AES – aatomemissioonspektromeetria (atomic emission spectrometry); 3.3. B – seotud fraktsioon immunoanalüüside puhul (bound fraction); 3.4. CI – keemiline ionisatsioon (chemical ionisation); 3.5. CRM – sertifitseeritud etalonaine (certified reference material); 3.6. CV – variatsioonikoefitsient (coefficient of variation); 3.7. 2-D – kahedimensiooniline (two-dimensional); 3.8. DAD – dioodrividetekteerimine (diode array detection); 3.9. DPASV – diferentsiaalimpulssanoodinversioonvoltamperomeetria (differential pulse anodic stripping voltametry); 3.10. ECD – elektronhaardedetekteerimine (electron capture detection); 3.11. EI – elektronlöökionisatsioon (electron impact ionisation); 3.12. GC – gaaskromatograafia (gas chromatography); 3.13. HPLC – kõrgrõhuvedelikkromatograafia (high performance liquid chromatography); 3.14. HPTLC – kõrgefektiivne õhukese kihi kromatograafia (high performance thin layer chromatography); 3.15. HR(MS) – kõrglahutavusega mass-spektromeetria (high resolution (mass spectrometry)); 3.16. ICP-AES – induktiivseotud plasmat kasutav aatomemissioonspektromeetria (inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry); 3.17. ICP-MS – induktiivseotud plasmat kasutav mass-spektromeetria (inductively coupled plasma-mass spectrometry); 3.18. IR – infrapuna- (infrared); 3.19. ISO – Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (International Standard Organisation); 3.20. LC – vedelikkromatograafia (liquid chromatography); 3.21. LR(MS) – madallahutavusega mass-spektromeetria (low-resolution (mass spectrometry)); 3.22. MRPL – minimaalne nõutav suutlikkusepiir (minimum required performance limit); 3.23. MS – mass-spektromeetria (mass spectrometry); 3.24. m/z – massi ja laengu suhe (mass/charge ratio); 3.25. Rf – liikumine solvendifrondi suhtes õhukese kihi kromatograafias (relative migration to the solvent front); 3.26. RSDL – labori suhtelised standardhälbed (relative standard deviations of the laboratory); 3.27. SRM – valitud reaktsiooni jälgimine (selected reaction monitoring); 3.28. SIM – valitud ioonide jälgimine (selected ion monitoring); 3.29. TLC – õhukese kihi kromatograafia (thin layer chromatography); 3.30. UV – ultraviolettvalgus (ultra violet light); 3.31. VIS – nähtav valgus (visible light). 4. Proovide võtmine ja analüüsimiseks ettevalmistamine 4.1. Proovid tuleb võtta ja analüüsimiseks ette valmistada viisil, mis tagab maksimaalsed võimalused aine avastamiseks. 4.2. Proovide käsitsemine peab välistama proovi juhusliku saastumise või analüüdikao võimaluse. 5. Saagis 5.1. Kui analüüsimisel kasutatakse saagisel põhinevat fikseeritud parandustegurit, määratakse saagis iga uuritava proovipartii jaoks. Kui saagis jääb ettenähtud piiridesse, võib fikseeritud parandustegurit kasutada. Muudel juhtudel kasutatakse parandustegurina konkreetse partii jaoks leitud saagist. 5.2. Kui analüüsimise käigus tuleb kasutada määratava aine spetsiifilist saagist uuritavas proovis, tuleb proovis leiduva analüüdi saagise määramiseks kasutada alapunktides 49.1–49.6 kirjeldatud lisamismeetodit või sisestandardit. 6. Spetsiifilisus 6.1. Meetodi puhul tuleb hinnata spetsiifilisust. Selleks uuritakse antud katsetingimustel: 6.1.1. millises ulatuses on võimalik eristada analüüti teistest ainetest; 6.1.2. maatriksi koostisosadest tekkida võivaid häireid. 6.2. Mõõtmist segavate asjaolude, näiteks uuritava analüüdi homoloogide, analoogide ja laguproduktide mõju või muu sarnase vältimiseks või ületamiseks tuleb rakendada kohaseid abinõusid. II. SÕELMEETODID 7. Nõuded sõelmeetodile 7.1. Sõelmeetodina võib kasutada meetodit, mille puhul on täidetud järgmised tingimused: 7.1.1. meetod on valideeritud ja valideerimise kohta on koostatud dokumentaalne tõendusmaterjal; 7.1.2. valenegatiivsete tulemuste protsent huvipakkuva sisalduse tasemel on väiksem kui 5% (β-viga). 7.2. Kui sõelmeetodiga analüüsitu põhjal kahtlustatakse mittevastavat tulemust, tuleb see tõestada kinnitava meetodiga. III. KINNITUSMEETODID ORGAANILISTE JÄÄKIDE JA SAASTEAINETE MÄÄRAMISEKS 8. Üldnõuded orgaaniliste jääkide ja saasteainete kinnitusmeetodile 8.1. Orgaaniliste jääkide ja saasteainete puhul kasutatavad kinnitusmeetodid peavad andma teavet analüüdi keemilise struktuuri kohta. Kui sama vastuse annab rohkem kui üks ühend, ei suuda meetod neid eristada. Seetõttu ei sobi kinnitusmeetoditeks ainult kromatograafilisel analüüsil põhinevad meetodid, millele ei lisandu spektomeetriline detekteerimine. 8.2. Kui üksikmeetodil ei ole piisavat spetsiifilisust, tuleb see saavutada sobivate puhastusmeetodite, kromatograafilise lahutamise ja spektromeetrilise detekteerimise kombineerimisega. 8.3. Orgaaniliste jääkide või saasteainete määramiseks sobivad tabelis 1 kirjeldatud kinnitusmeetodid või nende kombinatsioonid. Tabel 1. Orgaaniliste jääkide ja saasteainete määramiseks sobivad kinnitusmeetodid Mõõtmismeetod Saasteaine vastavalt selle määruse §-le 1 Piirangud LC või GC mass-spektromeetrilise detekteerimisega Grupid A ja B Ainult juhtudel, kui sellele järgneb «on-line» või «off-line» kromatograafiline lahutamine Ainult juhtudel, kui kasutatakse täieliku skaneerimise tehnikat või tehnikaid või vähemalt kolme (grupi B puhul) või nelja (grupi A puhul) identifitseerimispalli juhtudel, kus tehnika ei võimalda täielikku mass-spektrit LC või GC infrapunadetektoriga (IR) detekteerimisel Grupid A ja B Tuleb täita IR spektromeetria spetsiifilisi neeldumise nõudeid LC täislaotusel DAD-ga Grupp B Tuleb täita UV spektromeetria spetsiifilisi neeldumise nõudeid LC fluorestsentsdetektoriga Grupp B Ainult loomulikult fluorestseerivate molekulide ja pärast muundamist või derivatiseerimist fluorestseerivate molekulide avastamiseks 2–D TLC täislaotusega UV/VIS Grupp B Kohustuslik on kahedimensiooniline HPLC ja ko-kromatograafia GC elektronhaardedetektoriga Grupp B Ainult kahe erineva polaarsusega kolonni kasutamisel LC immunogramm Grupp B Ainult kahe erineva kromatograafilise süsteemi või teise sõltumatu detekteerimismeetodi kasutamisel LC-UV/VIS (üks lainepikkus) Grupp B Ainult kahe erineva kromatograafilise süsteemi või teise sõltumatu detekteerimismeetodi kasutamisel 8.4. Kui meetodis kasutatakse sisestandardit, tuleb see lisada uuritavale kogusele ekstraheerimise alguses. Võimaluse korral kasutatakse püsivaid isotoopmärgistusega analüüdi vorme või analüüdile sarnase struktuuriga ühendeid. Isotoopmärgistusega analüüdi vormid on eriti sobivad mass-spektromeetriliseks detekteerimiseks. 8.5. Kui sobivat sisestandardit ei ole võimalik kasutada, tuleb analüüdi identifitseeringut kinnitada ko-kromatograafiaga. Sel juhul peab tekkima vaid üks piik, mille kõrguse või pindala suurenemine on vastavuses lisatud analüüdi hulgaga. Gaas- või vedelikkromatograafia puhul peab piigi laius poolel maksimumkõrgusel olema 90–110% alglaiusest ja retentsiooniajad peavad olema 5%-lise kõikumisega identsed. Õhukese kihi kromatograafia meetodite puhul intensiivistatakse ainult eeldatavat analüüdilaiku, kusjuures ei tohi tekkida uut laiku ega visuaalse pildi muutust. 8.6. Võimaluse korral tuleb üheaegselt proovipartii analüüsimisega kasutada võrdlus- või rikastatud materjale, mis sisaldavad teadaolevat analüüdikogust lubatud piirsisalduse või otsustuspiiri lähedal (edaspidi mittevastav proov), nõuetele vastavat proovi ja tühiproovi. Soovitatav ekstraktide analüüsiseadmesse sisestamise järjekord on järgmine: tühiproov, nõuetele vastav proov, uuritav proov või uuritavad proovid, nõuetele vastav proov, nõuetele mittevastav proov. Kõrvalekalle sellest järjekorrast tuleb põhjendatult dokumenteerida. 9. Erinõuded kvantitatiivsetele analüüsimeetoditele 9.1. Sertifitseeritud etalonaine korduvanalüüside puhul on eksperimentaalselt määratud ja saagisega parandatud massiosade korral sertifitseeritud väärtusest hajumise piirid järgmised: Tabel 2. Kvantitatiivsete meetodite minimaalne tõesus Massiosa Piir =1 µg/kg –50% kuni +20% >1 µg/kg kuni 10 µg/kg –30% kuni +10% ³ 10 µg/kg –20% kuni +10% 9.2. Kui sertifitseeritud etalonained puuduvad, võib mõõtmiste tõesust hinnata puhtale maatriksile lisatud teadaoleva hulga analüüdi saagise alusel. Keskmise saagisega parandatud andmeid saab kasutada ainult siis, kui need jäävad tabelis 2 toodud piiridesse. 9.3. Laboratooriumidevaheline variatsioonikoefitsient (CV) rikastatud või etalonaine korduval analüüsil ei tohi korratavustingimuste korral ületada Horwitzi võrrandiga arvutatud väärtust. Võrrand on järgmine: CV = 2 (1 – 0,5 log C), kus C on massiosa, mida väljendatakse 10 astendajana, näiteks 1 mg/kg = 10–3. Näited on esitatud tabelis 3. Tabel 3. Kvantitatiivsete meetodite korratavuse variatsioonikoefitsientide näited sõltuvalt analüüdi massiosast Massiosa Korratavuse CV, % 1 µg/kg Kui massiosa on väiksem kui 100 µg/kg, annab Horwitzi võrrand lubamatult suure tulemuse. Seetõttu peavad väiksemate kui 100 µg/kg sisalduste puhul variatsioonikoefitsiendid olema nii väikesed kui võimalik 10 µg/kg 100 µg/kg 23 1000 µg/kg (1 mg/kg) 16 9.4. Korratavustingimustel läbiviidavate analüüside puhul on laboratooriumisisene variatsioonikoefitsient tavaliselt pool kuni kaks kolmandikku alapunkti 9.3 tabelis 3 toodud väärtustest. Laboratooriumisisestel korratavustingimustel läbiviidavate analüüside puhul ei tohi laboratooriumisisene variatsioonikoefitsient olla suurem kui korratavuse variatsioonikoefitsient. 9.5. Lubatud piirsisaldusega ainete puhul ei tohi laboratooriumisisene variatsioonikoefitsient olla suurem kui korratavuse variatsioonikoefitsient kontsentratsioonil, mis võrdub poolega lubatud piirsisaldusest. 10. Nõuded mass-spektromeetrilisele detekteerimisele 10.1. Mass-spektromeetria meetod sobib kinnitusmeetodiks ainult juhul, kui sellele eelneb vahetu (on-line) või autonoomne (off-line) kromatograafiline lahutamine. 10.2. GC-MS protseduuride puhul tuleb kromatograafiline lahutamine läbi viia kapillaarkolonnidega ja LC-MS protseduuride puhul selleks sobivate vedelikkromatograafia kolonnidega. 10.3. Uuritava analüüdi minimaalne retentsiooniaeg peab olema vähemalt kaks korda pikem kolonni surnud ruumalale vastavast retentsiooniajast. Uuritavas koguses sisalduva analüüdi retentsiooniaeg või suhteline retentsiooniaeg peab vastama kalibreerimisstandardile ja mahtuma etteantud retentsiooniaknasse. Retentsiooniaken peab olema kooskõlas kromatograafilise süsteemi lahutusvõimega. Analüüdi ja sisestandardi kromatograafilise retentsiooniaja suhe ehk analüüdi suhteline retentsiooniaeg peab vastama kalibreerimislahusega saadud retentiooniajale, kusjuures GC puhul on lubatud viga ±0,5% ja LC puhul ±2,5%. 10.4. Mass-spektromeetriline detekteerimine viiakse läbi järgmisi meetodeid kasutades: 10.4.1. MS meetodid, nagu kogu massispektri registreerimine (täislaotus, full scan) või valitud ioonide jälgimine (SIM); 10.4.2. MS-MSn meetodid, nagu valitud reaktsiooni jälgimine (SRM); 10.4.3. muud sobivate ionisatsiooniviisidega kombineeritud MS või MSn meetodid. 10.5. Kõrglahutavusega mass-spektromeetria (HRMS) puhul peab tüüpiline lahutavus olema suurem kui 10 000 kogu massipiirkonna ulatuses 10% piigi kõrgusest. 10.6. Kui mass-spektromeetria viiakse läbi täislaotusspektri registreerimisega, on nõutav kõigi mõõdetavate diagnostiliste ioonide, nagu molekulaariooni, molekulaariooni iseloomulike aduktide, iseloomulike ioonfragmentide ja isotoopioonide esinemine suhtelise intensiivsusega, mis on suurem 10% kalibreerimisstandardi võrdlusspektrist. 10.7. Kui mass-spektromeetria viiakse läbi fragmenteerimise ehk valitud ioonide jälgimisega, tuleb molekulaarioon võimaluse korral valida dignostiliste ioonide, nagu molekulaariooni, molekulaariooni iseloomulike aduktide, iseloomulike ioonfragmentide ja kõigi isotoopioonide hulgast. Valitud diagnostilised ioonid ei tohi soovitavalt pärineda ühest ja samast molekuliosast. Signaali ja müra suhe peab iga diagnostilise iooni puhul olema $3:1. 10.8. Kui mass-spektromeetria viiakse läbi täislaotusspektri registreerimise ja valitud ioonide jälgimisega, peab detekteeritud ioonide suhteline intensiivsus, mida väljendatakse protsentides kõige intensiivsemast ioonist või üleminekust, vastama samades tingimustes saadud võrreldava kontsentratsiooniga kalibreerimisstandardi (standardlahus või rikastatud proov) intensiivsusele tabelis 4 toodud kõikumisega. Tabel 4. Ioonide suhtelise intensiivsuse maksimaalselt lubatud kõikumine mass-spektromeetriliste meetodite kasutamisel Suhteline intensiivsus, % põhipiigist EI-GC-MS, suhteline CI-GC-MS, GC-MSn, LC-MS, LC-MSn, suhteline >50% ±10% ±20% >20% kuni 50% ±15% ±25% >10% kuni 20% ±20% ±30% =10% ±50% ±50% 10.9. Mass-spektromeetriliste andmete interpreteerimiseks kasutatakse ioonide suhtelisi intensiivsusi (intensiivsuste suhteid). Olenevalt sellest, milliseid ioone kasutatakse analüüsil, kasutatakse kas spektris sisalduvate diagnostiliste ioonide intensiivsuste suhteid või prekursor- ja produktioonide intensiivsuste suhteid või mõlemat varianti koos. Intensiivsuste suhted saadakse spektrite võrdlemise teel või üksikute masside aegsignaalide integreerimise teel. Kui rakendatakse foonikorrektsiooni, tuleb seda teha kogu proovipartii ulatuses alapunktis 8.6 kirjeldatud viisil ning asjakohane teave selgelt esitada. 10.10. Kui üksiku mass-spektri mõõtmisega registreeritakse täislaotusspekter, peab esinema vähemalt 4 iooni, mille intensiivsus on ³10% põhipiigi omast. Molekulaarioonid võetakse arvesse, kui need esinevad etalonspektris ³10% intensiivsusega. Vähemalt 4 iooni peavad mahtuma tabelis 4 toodud ioonide suhtelise intensiivsuse maksimaalselt lubatud kõikumise piiridesse. Otsinguks võib kasutada spektrite elektronkatalooge. Sel juhul peab uuritavate proovide ja kalibreerimislahuse massispektri sobivus ületama kriitilise sobivusteguri. Kriitiline sobivustegur määratakse iga analüüdi jaoks valideerimise käigus alapunktis 10.11 kirjeldatud kriteeriumidele vastavate spektrite põhjal. Lisaks tuleb kontrollida detektorist ja proovi maatriksist tingitud spektrimuutlikkust. 10.11. Kui massiosakesi muudetakse teisiti kui täislaotusmeetoditega, tuleb andmete tõlgendamiseks kasutada identifitseerimispallide süsteemi. Grupi A nimekirjas loetletud saasteainete kinnitamiseks nõutakse vähemalt 4 identifitseerimispalli ja grupi B nimekirjas loetletud saasteainete puhul vähemalt 3 identifitseerimispalli. Põhiliste mass-spektromeetria meetoditega teenitavad identifitseerimispallid on toodud tabelis 5. Kinnitamiseks vajalike pallide saamiseks ja identifitseerimispallide summa arvutamiseks peavad olema täidetud järgmised kriteeriumid: 10.11.1. tuleb mõõta vähemalt üks ioonsuhe; 10.11.2. kõik asjakohased ioonsuhted peavad vastama eespool kirjeldatud tingimustele; 10.11.3. minimaalse arvu identifitseerimispallide saamiseks võib kombineerida maksimaalselt kolme meetodit. Tabel 5. Detekteeritavate massiosakeste klassid ja identifitseerimispallid MS meetod Identifitseerimispallid Madallahutavusega mass-spektromeetria (LR) 1,0 LR-MSn prekursorioon 1,0 LR-MSn üleminekusaadused 1,5 HRMS 2,0 HR-MSn prekursorioon 2,0 HR-MSn üleminekusaadused 2,5 10.12. Tabeli 5 puhul lähtutakse järgmisest: 10.12.1. iga iooni loetakse ainult üks kord; 10.12.2. elektronlööki kasutavad GC-MS meetodid loetakse erinevaks keemilist ionisatsiooni kasutavatest GC-MS meetoditest; 10.12.3. identifitseerimispallide hulga suurendamiseks võib erinevaid analüüte kasutada vaid juhul, kui nende derivaatide reaktsioonimehhanism on erinev; 10.12.4. grupi A nimekirjas loetletud saasteainete puhul saab teenida lisaks maksimaalselt ühe identifitseerimispalli asjasse puutuvate nõuete täitmisel järgmiste meetodite kasutamisel: HPLC koos täislaotusega dioodrivispektrofotomeetriaga (DAD), HPLC fluorestsentsdetektoriga, HPLC immunogrammiga, kahedimensiooniline TLC koos spektromeetrilise detekteerimisega; 10.12.5. üleminekusaaduste hulka arvatakse nii tütar- kui ka tütretütarsaadused. 10.13. Tabelis 6 esitatakse näited meetodite kombineerimisega saadavatest identifitseerimispallidest, kusjuures identifitseerimispallide arv n on täisarv. Tabel 6. Näited meetodite kombineerimisega saadavatest identifitseerimispallidest Meetod Ioonide arv Identifitseerimispallide arv GC-MS (EI või CI) N N GC-MS (EI ja CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4 GC-MS (EI või CI) 2 derivaati 2 (derivaat A) + 2 (derivaat B) 4 LC-MS N N GC-MS-MS 1 prekursor ja 2 tütart 4 LC-MS-MS 1 prekursor ja 2 tütart 4 GC-MS-MS 2 prekursoriooni, igal 1 tütar 5 LC-MS-MS 2 prekursoriooni, igal 1 tütar 5 LC-MS-MS-MS 1 prekursor, 1 tütar ja 2 tütretütart 5,5 HRMS N 2n GC-MS ja LC-MS 2+2 4 GC-MS ja HRMS 2+1 4 11. Nõuded infrapunadetektoriga kromatograafilisele meetodile 11.1. Infrapunadetekteerimise nõuetekohased piigid on kalibreerimisstandardi neeldumismaksimumid, mis vastavad järgmistele nõuetele: 11.1.1. neeldumismaksimum peab olema lainepikkusvahemikus 4000–500 cm–1; 11.1.2. neeldumisintensiivsus ei tohi olla väiksem kui molaarne erineeldumine, mis piigi põhijoone suhtes on 40, või suhteline neeldumine, mis moodustab 12,5% kõige intensiivsema piigi neeldumisest vahemikus 4000–500 cm–1, kui mõlemad on mõõdetud nullneeldumise suhtes ning moodustavad 5% kõige intensiivsema piigi neeldumisest vahemikus 4000–500 cm–1, kui mõlemad on mõõdetud piigi põhijoone suhtes. 11.2. Kuigi teoreetilisest aspektist lähtudes tuleb nõuetekohase piigi määramisel eelistada molaarset erineeldumist, on seda praktikas lihtsam määrata suhtelise erineeldumise kaudu. 11.3. Määratakse analüüdi infrapunaspektri selliste piikide arv, mille sagedus vastab kalibreerimisstandardi spektri nõuetekohasele piigile piirides ±1 cm–1. 11.4. Infrapunaspektri andmete tõlgendamiseks peab neeldumine esinema analüüdi spektri kõigis piirkondades, mis vastavad kalibreerimisstandardi võrdlusspektri nõuetele vastavatele piikidele. 11.5. Kalibreerimisstandardi infrapunaspektris peab olema vähemalt 6 nõuetele vastavat piiki. Vastasel korral ei saa sellist spektrit võrdluseks kasutada. 11.6. Analüüdi infrapunaspektrist leitud nõuetele vastavate piikide protsent peab olema vähemalt 50. Kui nõuetekohasele piigile ei ole täpset vastet, peab analüüdi spektri vastav osa olema vastavuses sobiva piigiga. 11.7. Protseduuri kohaldatakse ainult selliste neeldumispiikide suhtes, mille intensiivsus ületab vähemalt kolm korda müraamplituudi. 12. Nõuded teiste detekteerimisviisidega kromatograafilisele lahutamisele 12.1. Kromatograafilise lahutamise käigus tuleb võimaluse korral kasutada sisestandardit. Eelistatult peab standard olema analüüdiga sarnane ja sellele lähedase retentsiooniajaga. 12.2. Analüüt peab samade katsetingimuste korral elueeruma vastavale kalibreerimisstandardile tüüpilise retentsiooniajaga. Vähim analüüdi lubatav retentsiooniaeg peab olema kaks korda suurem kolonni surnud ruumalale vastavast retentsiooniajast. 12.3. Analüüdi ja sisestandardi retentsiooniaja suhe ehk analüüdi suhteline retentsiooniaeg peab vastama sobivas maatriksis kalibreerimisstandardiga saadule piirides ±2,5%. 13. Nõuded täislaotusega UV–VIS detekteerimisele 13.1. LC-le esitatavad suutlikkusekriteeriumid peavad olema täidetud. 13.2. Analüüdi spektri neeldumismaksimumid peavad olema kalibreerimisstandardi neeldumismaksimumidega ühel lainepikkusel detekteeriva süsteemi lahutusvõimega määratud piirides. Dioodrividetekteerimise korral on see tavaliselt ±2 nm. 13.3. Lainepikkustel üle 220 nm ei tohi analüüdi spekter nähtavalt erineda kalibreerimisstandardi spektrist neis osades, kus suhteline neeldumine on 10% või rohkem. See kriteerium on täidetud, kui on olemas samad maksimumid ja kahe spektri vahelised erinevused üheski punktis ei ületa 10% kalibreerimisstandardi neeldumisest. 13.4. Juhul kui tehakse otsinguid elektroonilistes andmebaasides, tuleb proovi ja kalibreerimisstandardi võrdlemisel ületada kriitiline sobivustegur. Sobivustegur määratakse valideerimise käigus igale analüüdile selliste spektrite põhjal, mis vastavad alapunktides 13.2 ja 13.3 kirjeldatud kriteeriumidele. Samuti tuleb kontrollida detektorist ja proovi maatriksist tingitud spektrimuutlikkust. 14. Suutlikkusekriteeriumid fluorimeetrilisele detekteerimisele 14.1. Vedelikkromatograafiale esitatavad suutlikkusekriteeriumid peavad olema täidetud. 14.2. Öeldu kehtib loomulikult fluorestseeruvate ja transformatsiooni või derivatsiooni käigus fluorestsentsi omandavate molekulide kohta. Ergastus- ja kiirguslainepikkused ning kromatografeerimistingimused valitakse sellised, et tühiproovi ekstraktis olevate ühendite segav mõju oleks minimaalne. 14.3. Analüüdipiik ja selle lähim neeldumismaksimum peavad teineteisest asetsema vähemalt ühe täispiigi kaugusel mõõdetuna 10% juures analüüdipiigi kõrgusest. 15. Suutlikkusekriteeriumid analüüdi vedelikkromatograafilisele immunogrammiga määramisele 15.1. LC immunogramm ei ole iseseisvalt kinnitusmeetodiks sobiv. 15.2. LC-le esitatavad kriteeriumid peavad olema täidetud. 15.3. Eelnevalt määratletud kvaliteedikontrolli parameetrid, näiteks mittespetsiifiline sidumine, suhteline sidumine proovide puhul ja tühiproovi neeldumine peavad jääma analüüsi valideerimisel saadud piiridesse. 15.4. Immunogramm tuleb moodustada vähemalt viiest fraktsioonist. 15.5. Iga fraktsiooni laius peab olema vähem kui pool piiki. 15.6. Analüüdi maksimaalse sisaldusega fraktsioon peab olema sama kahtlusaluse proovi, mittevastava proovi ja standardi jaoks. 16. Analüüdi määramine vedelikkromatograafia ja ühel lainepikkusel UV/VIS detekteerimisega 16.1. Ühel lainepikkusel UV/VIS detekteerimisega LC ei ole iseseisvalt kinnitusmeetodiks sobiv. 16.2. Analüüdipiik ja sellele lähim neeldumismaksimum peavad asetsema teineteisest vähemalt ühe täispiigi kaugusel, mõõdetuna 10% juures analüüdipiigi maksimaalsest kõrgusest. 17. Suutlikkusekriteeriumid ja muud nõuded täislaotusega UV/VIS detekteerimisega kahedimensioonilisele õhukese kihi kromatograafiale 17.1. 2–D HPTLC ja ko-kromatograafia on kohustuslikud. 17.2. Analüüdi ja standardi Rf väärtuste kokkulangevus peab olema ±5% piires. 17.3. Analüüdilaigu ja standardi laikude välimused peavad olema ühesugused. 17.4. Sama värvi laikude puhul peab lähima laigu keskkoha ja analüüdilaigu keskkoha vahel olema vähemalt pool laikude läbimõõtude summast. 17.5. Analüüdi ja standardi spektrid ei tohi visuaalselt erineda viisil, mis on kirjeldatud täislaotusega UV/VIS detekteerimise puhul. 17.6. Kui kasutatakse otsinguid ja kokkulangevusi elektroonilistest andmebaasidest, tuleb proovi ja kalibreerimisstandardi võrdlemisel ületada kriitiline sobivustegur. See tegur määratakse valideerimise käigus igale analüüdile selliste spektrite põhjal, mis vastavad alapunktides 17.2–17.5 kirjeldatud kriteeriumidele. Samuti tuleb kontrollida detektorist ja proovi maatriksist tingitud spektrimuutlikkust. 18. Suutlikkusekriteeriumid ja muud nõuded elektronhaardedetektoriga (ECD) gaasikromatograafiale 18.1. Sisestandardit kasutatakse juhul, kui on olemas sisestandardiks sobiv materjal. Eelistatult peab standard olema analüüdiga sarnane ja sellele lähedase retentsiooniajaga. 18.2. Analüüt peab samade katsetingimuste korral elueeruma vastavale kalibreerimisstandardile tüüpilise retentsiooniajaga. Vähim analüüdi lubatav retentsiooniaeg peab olema kaks korda suurem kolonni surnud ruumalale vastavast retentsiooniajast. 18.3. Analüüdi ja sisestandardi retentsiooniaja suhe ehk analüüdi suhteline retentsiooniaeg peab vastama sobivas maatriksis kalibreerimisstandardiga saadule piirides ±0,5%. 18.4. Analüüdipiik ja sellele lähim piik peavad teineteisest asetsema vähemalt ühe täispiigi kaugusel, mõõdetuna 10% juures analüüdipiigi maksimaalsest kõrgusest. 18.5. Lisateabe saamiseks võib kasutada ko-kromotograafiat. IV. KINNITUSMEETODID KEEMILISTE ELEMENTIDE MÄÄRAMISEKS 19. Üldnõuded keemiliste elementide kinnitusmeetodile 19.1. Keemiliste elementide puhul peavad kinnitusmeetodid võimaldama nii ühemõttelist identifitseerimist kui ka täpse hulga määramist huvipakkuval kontsentratsioonil, näiteks elemendile iseloomuliku neeldumis- või kiirguslainepikkuse, aatommassi või muude sellele ainuomaste füüsikalis-keemiliste omaduste põhjal. 19.2. Keemiliste elementide identifitseerimiseks sobivad tabelis 7 kirjeldatud meetodid või meetodite kombinatsioonid. Tabel 7. Keemilistele elementidele sobivad kinnitusmeetodid Meetod Mõõdetav parameeter Diferentsiaalimpulssanoodinversioonvoltamperomeetria elektriline signaal Aatomabsorptsioonspektromeetria: leegiga neeldumine hüdriidigenereerimisega neeldumine külmauruga neeldumine elektrokeemilise atomiseerimisega grafiitküvetis neeldumine Aatomemissioonspektromeetria: induktiivsidestatud plasma kiirguse intensiivsus Mass-spektromeetria: induktiivsidestatud plasma massi ja laengu suhe 19.3. Võimaluse korral tuleb üheaegselt proovipartii analüüsimisega kasutada etalonainet või rikastatud proovi, mis sisaldab teadaolevat analüüdikogust lubatud piirsisalduse või otsustuspiiri lähedal (nõuetele mittevastav proov), nõuetele vastavat proovi ja tühiproovi. Soovitatav ekstraktide analüüsiseadmesse sisestamise järjekord on järgmine: tühiproov, nõuetele vastav proov, uuritav proov või uuritavad proovid, nõuetele vastav proov, nõuetele mittevastav proov. Kõrvalekalle sellest järjekorrast tuleb põhjendatult dokumenteerida. 19.4. Üldjuhul on enamiku analüüsimeetodite jaoks vajalik orgaanilise maatriksi täielik lagunemine enne analüüsitava lahuse valmistamist. Selleks kasutatakse mikrolainemineralisatsiooni menetlust, mis vähendab analüüdi kadu ja saastumisohtu. Mineraliseerimiseks tuleb kasutada saastevabasid kõrgekvaliteedilisi teflonanumaid. Kui kasutatakse teisi märg- või kuivmineraliseerimise meetodeid, tuleb võimalike saastumis- või kaonähtude puudumine dokumenteerida. Mineraliseerimise asemel võib teatud asjaoludel kasutada näiteks ekstraheerimist või teisi lahutamismeetodeid, mis kindlatel tingimustel eraldavad analüüdid maatriksist või kontsentreerivad neid. 19.5. Välisel või lisamismeetodil põhineval kalibreerimisel ei tohi ületada meetodi jaoks ettenähtud tööpiirkonda. Välise kalibreerimise puhul on oluline, et kalibreerimisstandardi kontsentratsioon oleks võimalikult lähedal proovilahuse kontsentratsioonile. Kui analüüsi asjaolud seda nõuavad, tuleb kasutada foonikorrektsiooni. 20. Erinõuded kvantitatiivsete meetodite tõesusele ja kordustäpsusele 20.1. Sertifitseeritud etalonaine korduval elementanalüüsil ei tohi katseliselt määratud keskmine sisaldus hälbida sertifitseeritud väärtusest rohkem kui ±10%. 20.2. Kui alapunktis 20.1 nimetatud sertifitseeritud etalonaineid ei ole võimalik kasutada, võib mõõtmise tõesust hinnata tundmatule proovile teadaoleva elemendihulga lisamise saagise abil. Erinevalt analüüdist ei ole lisatav element maatriksiga keemiliselt seotud, mistõttu sel viisil saadud tulemused on vähem usaldatavad kui etalonmaterjalidega saadud tulemused. Saagise tulemused on aktsepteeritavad, kui erinevus sihtväärtusest jääb ±10% piiridesse. 20.3. Korduvanalüüside puhul, mis viiakse läbi laboratooriumisiseste korratavustingimuste kohaselt, ei tohi laboratooriumisisene variatsioonikoefitsient (CV) ületada tabelis 8 toodud suurusi. Tabel 8. Kvantitatiivsete meetodite variatsioonikoefitsient sõltuvalt elemendi massiosast Massiosa Korratavuse CV, % ³10 µg/kg kuni 100 µg/kg 20 >100 µg/kg kuni 1000 µg/kg 15 ³1000 µg/kg 10 21. Erinõuded diferentsiaalimpulss-anoodinversioonvoltamperomeetriale (DPASV) 21.1. DPASV puhul on suurima tähtsusega proovides oleva orgaanilise aine lagundamine enne analüüsi. 21.2. Voltamperogrammis ei tohi olla orgaanilise aine olemasolust tingitud laiu signaale. 21.3. DPAVS puhul võivad maatriksi anorgaanilised koostisosad mõjutada piigi kõrgust, seetõttu tuleb aine hulga määramiseks kasutada lisamismeetodit. 21.4. Meetodile tuleb lisada proovilahuse tüüpiliste voltamperogrammide näidised. 22. Erinõuded aatomabsorptsioonspektromeetriale (AAS) 22.1. AAS meetod on peamiselt monoelementne, seetõttu tuleb katsetingimuste optimeerimisel lähtuda konkreetsest määratavast elemendist. 22.2. Võimaluse korral tuleb tulemusi kontrollida kvantitatiivselt ja kvalitatiivselt alternatiivsetele neeldumisjoontele põhinedes, kusjuures ideaalvariandis valitakse kaks erinevat joont. 22.3. Kalibreerimisstandard tuleb valmistada lahusemaatriksis, mis on võimalikult lähedane proovi mõõtelahusele, näiteks happekontsentratsiooni või modifikaatori osas. 22.4. Tühineeldumise minimeerimiseks peavad kõik reaktiivid olema võimalikult suure puhtusastmega. 22.5. Proovi aurustamise ja atomiseerimise viisi järgi jaotatakse AAS meetodid leek- või grafiitküvetiga meetoditeks ning neile kehtivad järgmised erinõuded: 22.5.1. leek-AAS puhul tuleb mõõteseade häälestada iga elemendi jaoks eraldi, kontrollides seejuures eriti gaasisegu koostist ja voolukiirust. Foonineeldumisest tingitud häire vältimiseks tuleb kasutada pidevkorrektsiooni. Tundmatute maatriksite puhul kontrollitakse foonikorrektsiooni vajalikkust; 22.5.2. grafiitküvetiga AAS puhul ultraväikeste kogustega töötamisel tuleb proovide ja standardite käsitsemisel kasutada kõrgpuhtaid reaktiive, deioniseeritud vett ja inertsest plastikust anumaid, et vältida sageli mõõtetäpsust mõjutavat võimalikku laboratoorset saastumist. Mõõteseade häälestatakse iga elemendi jaoks eraldi, kontrollides seejuures eriti eeltöötlemise ja atomiseerimise tingimusi (aeg ja temperatuur) ning maatriksi modifitseerimist. Isotermilised atomiseerimistingimused, näiteks ristkuumutusega sisseehitatud Lvovi platvormiga grafiitküvett, vähendavad maatriksi mõju analüüdi atomiseerimisele. Maatriksi modifitseerimise ja Zeemani foonikorrektsiooni ühendamisel võib kvantitatiivse määramise läbi viia standardvesilahustest saadud kalibreerimiskõverate põhjal. 23. Erinõuded hüdriidigenereerimisega aatomabsorptsioonspektromeetriale 23.1. Arseeni, vismutit, germaaniumi, pliid, antimoni, seleeni, tina ja telluuriumi sisaldavad orgaanilised ühendid võivad olla väga stabiilsed ning nõuda elemendihulga korrektseks määramiseks oksüdatiivset lagundamist. Selleks soovitatakse mikrolainemineraliseerimist või tugevalt oksüdatiivsetes tingimustes kõrgrõhutuhastamist. Seejuures on väga oluline elementide täielik ja korratav muundumine hüdriidideks. 23.2. Arseenvesiniku moodustumine NaBH4 sisaldavas soolhappe lahuses sõltub arseeni oksüdatsiooniastmest: As (III) on lühem ja As (V) pikem moodustumisaeg. 23.3. Vähendamaks voolsisestusmeetodiga (flow-injection analysis) As (V) määramisel tundlikkuse kadu, mis on põhjustatud selle süsteemi lühikesest reaktsiooniajast, tuleb As (V) redutseerida pärast oksüdeerivat mineraliseerimist As (III)-ks. Selleks otstarbeks sobivad kaaliumjodiid, askorbiinhape ja tsüsteiin. Tühiproovid, kalibreerimislahused ja proovilahused tuleb töödelda samal viisil. 23.4. Tsüklilise süsteemi (batch system) kasutamine võimaldab täpsust kahjustamata määrata mõlemaid arseenierimeid. 23.5. As (V) hüdriidi hilisema moodustumise tõttu tuleb kalibreerimisel kasutada piigi pindala integreerimist. 23.6. Analüüsimiseks tuleb instrumentaalseadistus optimeerida. Eriti tähtis on kontrollida gaasivoolu, mis kannab hüdriidi atomisaatorisse. 24. Erinõuded külmauru-aatomabsorptsioonspektromeetriale 24.1. Külmaurumeetodit kasutatakse ainult elavhõbeda määramiseks. 24.2. Vaba elavhõbeda lenduvus- ja neeldumiskadude tõttu tuleb kogu analüüsi vältel olla väga hoolas. Samuti tuleb vältida reaktiividest või keskkonnast tingitud saastumist. 24.3. Elavhõbedat sisaldavate orgaaniliste ühendite puhul tuleb korrektse elavhõbedasisalduse leidmiseks kasutada oksüdeerivat lagundamist, milleks sobivad mikrolainetöötlusega või kõrgtuhastamisega suletud süsteemid. Erilist hoolt nõuab elavhõbedaga kontaktis olnud nõude ja seadmete puhastamine. 24.4. Võimaluse korral tuleb kasutada voolsisestusmeetodit. Madalamate otsustuspiiride korral soovitatakse elavhõbeda adsorbeerimist kullal või plaatinal, millele järgneb dermodesorptsioon. Seejuures tuleb vältida adsorberi või mõõtraku niiskumist, sest see segab mõõtmist. 25. Erinõuded induktiivsidestusega plasmat kasutavale aatomemissioonspektromeetriale (ICP-AES) 25.1. Induktiivsidestusega plasmat kasutav aatomemissioonspektromeetria on multimeetod, mis võimaldab mitmete elementide üheaegset määramist. 25.2. ICP-AES kasutamiseks tuleb proovid orgaanilise maatriksi lagundamiseks kõigepealt mineraliseerida. Selleks tuleb kasutada mikrolainetöötlusega või kõrgtuhastamisega suletud süsteeme. 25.3. Usaldusväärse analüüsitulemuse saamisel on tähtis osa seadme kalibreerimisel ja elemendi ning lainepikkuse valikul. Lineaarsete kalibreerimiskõverate puhul piisab seadme kalibreerimiseks tavaliselt neljast erinevast kontsentratsioonist, sest ICP-AES-i puhul on kalibreerimiskõverad lineaarsed nelja kuni kuue suurusjärgu võrra erinevates kontsentratsioonide vahemikus. 25.4. Tavatingimustes tuleb ICP-AES-i seadme kalibreerimine läbi viia mitut elementi sisaldava standardiga, mis valmistatakse mõõtelahusega samas kontsentratsioonis happesse. Lineaarse kõvera puhul tuleb kontrollida elementide kontsentratsioone. 25.5. Analüüdist pärineva emissiooni mõõtmiseks kasutatav lainepikkus peab vastama määratavate elementide kontsentratsioonile. Kui analüüdi kontsentratsioon langeb kiirgusjoone tööpiirkonnast välja, tuleb kasutada teist kiirgusjoont. Kõigepealt valitakse kõige tundlikum häireteta kiirgusjoon, seejärel vähemtundlik. Avastamispiiril või selle läheduses töötamisel on parimaks valikuks tavaliselt vastava analüüdi kõige tundlikum joon. 25.6. ICP-AES-i puhul tekitavad suuri raskusi spektri- ja foonihäired, milleks võivad olla näiteks fooni lihtnihe (simple backround shift), fooni kaldnihe (sloping backround shift), otsene spektraalülekate (direct spectral overlap) ja fooni liitnihe (complex backround shift). Igaühel neist on omad põhjused ja kõrvaldamisviisid. Maatriksist sõltuvalt tuleb rakendada häirete korrigeerimist ja tööparameetrite optimeerimist. Mõningaid häireid saab vältida maatriksi lahjendamise või kohendamisega. Iga uuritava katsepartii raames tuleb lisaks uuritavatele proovidele teha samades tingimustes tühikatseid ning uurida rikastatud etalonaineid, mis sisaldavad teadaoleval hulgal määratavat analüüti. Triivi määramiseks kontrollitakse standardit näiteks iga 10 mõõtmise tagant. Kõik reaktiivid ja plasmagaas peavad olema kõrgeima võimaliku puhtusastmega. 26. Erinõuded induktiivsidestusega plasmat kasutavale mass-spektromeetriale (ICP-MS) 26.1. Keskmise aatommassiga mikroelementide, nagu kroomi, vase ja nikli määramine võib olla tugevasti häiritud teiste isobaariliste või polüatomaarsete ioonide poolt. Selle vältimiseks peab lahutusvõime olema vähemalt 7000–8000. 26.2. Mass-spektromeetriliste meetoditega seotud raskusteks on seadmetriiv, maatriksiefektid ja molekulaarioonidest tingitud häired (m/z80). Seadmetriivi ja maatriksiefektide korrigeerimiseks on vaja mitut sisestandardit, mis katavad sama massipiirkonna, kus asuvad määratavad elemendid. 26.3. Enne ICP-MS-st mõõtmist on vaja orgaanilised ühendid täielikult lagundada. Nii nagu AAS-i puhul, viiakse lenduvad elemendid, näiteks jood, pärast suletud anumates mineraliseerimist püsivale kujule. 26.4. Kõige tõsisemad häired tekivad molekulaarioonide kombinatsioonist argooni (plasmagaas), vesiniku, süsiniku, lämmastiku ja hapnikuga (lahustamiseks kasutatavad happed, plasmasaaste ja kaasatud atmosfäärigaasid) ja proovimaatriksiga. Häirete vältimiseks on nõutav täielik mineraliseerimine, foonimõõtmine, lahustamiseks kasutatavate hapete (näiteks lämmastikhape) ning analüüsitavate masside sobilik valik, millega mõnikord kaasneb madalam küllastatus ehk avastamispiir. 26.5. Määratavate elementide jaoks välistatakse häired spetsiifiliste analüüsitavate masside valimisega, rakendades ka isotoopsuhte kinnitamist. Iga mõõtmise jaoks tuleb teha sisestandardeid kasutades Fano tegureid arvestav signaalikontroll. V. VALIDEERIMINE 27. Üldnõuded valideerimisele 27.1. Valideerimine peab tõestama, et analüüsimeetod vastab asjaomaste suutlikkusenäitajate kriteeriumidele. Analüüsimeetodi suutlikkusekriteeriumidele vastamise tõestamiseks võib kasutada ka teisi viise, kui tagatakse, et saavutatakse samasugune teabe hulk ja kvaliteet. 27.2. Sõltuvalt kontrolli eesmärgist rakendatakse eri tüüpi meetodeid. Tabelis 9 kirjeldatakse, milliseid suutlikkusenäitajaid erinevate meetodite puhul määratakse. Tabel 9. Analüüsimeetodite liigitus määratavate suutlikkusenäitajate alusel Avastamispiir, CCβ Otsustuspiir, CCα Tõesus/ Saagis Kordustäpsus Selektiivsus/ Spetsiifilisus Rakendatavus/ Mõjutuskindlus/ Stabiilsus Kvalitatiivsed meetodid S + + + K + + + + Kvantitatiivsed meetodid S + + + + K + + + + + + «S» – sõelmeetod, «K» – kinnitusmeetod, «+» – määramine on kohustuslik 27.3. Üldjuhul viiakse valideerimine läbi laboratooriumidevahelise uuringu käigus vastavalt Codex Alimentariuse, ISO või IUPAC-i nõuetele või tuginedes alternatiivmeetoditele, nagu laboratooriumisisene uuring ja valideerimine. 28. Laboratooriumisisene uuring ja valideerimine 28.1. Kui valideerimiseks kasutatakse laboratooriumisisest uuringut või valideerimist, võib lähtuda modulaarsest esitusest, mis koosneb kasutatavast valideerimismudelist sõltumatute ühtsete suutlikkusenäitajate kogumist ja valideerimismudelist sõltuvatest ehk spetsiifilistest toimingutest. 28.2. Valideerimismudelist sõltumatud ja sõltuvad suutlikkusenäitajad on toodud tabelis 10. Tabel 10. Mudelist sõltumatud ja sõltuvad suutlikkusenäitajad Valideerimine Mudelist sõltumatud suutlikkusenäitajad Mudelist sõltuvad suutlikkusenäitajad Ühtsed suutlikkusenäitajad (selle lisa punktid 29–34) Tavaline valideerimine (punktid 35–42) Laborisisene valideerimine (punktid 43–47) Spetsiifilisus Tõesus Mõjutuskindlus: väikesed muutused Saagis Korduvus Laboratooriumisisene korratavus Korratavus Otsustuspiir, CCα Avastamisvõime, CCβ Kalibreerimiskõverad Mõjutuskindlus: suured muutused Saagis Korduvus Laboratooriumisisene korratavus Korratavus Otsustuspiir, CCα Avastamisvõime, CCβ Kalibreerimiskõverad Mõjutuskindlus 29. Mudelist sõltumatud suutlikkusenäitajad 29.1. Valitud valideerimisviisist olenemata tuleb määrata järgmised suutlikkusenäitajad: spetsiifilisus, tõesus, rakendatavus ja mõjutuskindlus, stabiilsus ning kalibreerimiskõverad. 29.2. Tööhulga vähendamiseks võib erinevate näitajate määramiseks katseid kombineerida, kasutades seejuures hoolikalt kavandatud ja statistiliselt korrektset lähenemisviisi. 30. Spetsiifilisus 30.1. Analüüsimeetodite puhul on oluline nende võime eristada analüüti isomeeridest, metaboliitidest, laguproduktidest, endogeensetest ainetest, maatriksikomponentidest ja muudest lähedastest ainetest. Võimalike häirivate mõjude kontrollimiseks on vaja kahte meetodit. 30.2. Võimalike mõjutajate avastamiseks ja nende mõju hindamiseks valitakse potentsiaalselt segavad ained ja uuritakse tühiproove järgnevalt: 30.2.1. valitakse rida keemiliselt lähedasi ühendeid, nagu metaboliidid, derivaadid või muud analüüti mõjutavaid ained, mille esinemine proovis koos huvipakkuva ühendiga on tõenäoline; 30.2.2. esinduslikkuse saavutamiseks analüüsitakse vajalik arv tühiproove (n ³ 20) ja kontrollitakse analüüdi eeldatavas eluaeerimisalas iga häirivat mõju, nagu signaalid, piigid ja ioonjäljed; 30.2.3. esinduslik arv tühiproove rikastatakse analüüdi avastamist või identifitseerimist eeldatavalt häirivate ainete teatud kontsentratsioonidega; 30.2.4. pärast analüüsimist hinnatakse, kas segava ühendi või ühendite olemasolu takistab analüüdi identifitseerimist, mõjutab analüüdi kvantitatiivset määramist või võib viia vääridentifitseerimiseni. 31. Tõesus 31.1. Tõesus (trueness) on mõõtetäpuse (accuracy) üks komponent, mida saab määrata ainult sertifitseeritud etalonaine (CRM) abil. Sertifitseeritud etalonaineid tuleb kasutada igal võimalikul juhul. 31.2. Üksikasjalik tõesuse määramise kirjeldus on toodud standardis ISO 5725-4:19941, mille kohaselt võib näiteks toimida järgmiselt: 31.2.1. analüüsitakse kuut CRM-i kordusproovi vastavalt meetodi tööjuhendile; 31.2.2. määratakse analüüdi kontsentratsioon iga CRM-i proovi jaoks; 31.2.3. arvutatakse nende kontsentratsioonide keskväärtus, standardhälve ja variatsioonikoefitsient (%); 31.2.4. arvutatakse tõesus, jagades analüüsil saadud keskmise kontsentratsiooni väärtuse sertifitseeritud kontsentratsiooni väärtusega ja korrutades tulemuse 100-ga, et väljendada tulemus protsendina. 31.3. Tõesus arvutatakse järgmise valemi järgi

31.4. Kui CRM-i ei ole võimalik kasutada, tuleb tõesuse asemel määrata saagis alapunktides 36.1–36.3 kirjeldatu kohaselt. 32. Rakendatavus ja mõjutuskindlus väikeste muudatuste puhul 32.1. Rakendatavuse ja mõjutuskindluse määramiseks uuritakse laboratooriumis sihilikult tekitatud väikeste muudatuste mõju analüüsimisele. 32.2. Esmalt viiakse läbi analüüsieelsed uuringud, et määrata analüüsitulemusi mõjutavad eeltöötluse, puhastamise ja analüüsiprotsesside tegurid. Nendeks võivad olla näiteks analüütiku, reaktiivide, lahustite, standardite, prooviekstraktide allika ja vanuse, kuumutuskiiruse, temperatuuri, pH ja muude laboratooriumis esineda võivate asjaoludega seotud tegurid. Nimetatud tegureid tuleb muuta ulatuses, mis vastab laboratooriumidevahelisele hälbele. 32.3. Rakendatavuse ja mõjutuskindluse määramiseks väikeste muudatuste puhul võib toimida järgmiselt: 32.3.1. määratakse võimalikud muudatusi mõjutavad tegurid; 32.3.2. muudetakse veidi iga tegurit; 32.3.3. viiakse läbi Youdeni meetodil põhinev mõjutuskindluse katse. Siinkohal võib kasutada ka teisi selleks sobivaid meetodeid, kuid Youdeni meetod võimaldab vähendada aja- ja töökulu. Youdeni meetod põhineb murdfaktoriaalsel katseplaanil ja sellega ei saa määrata teguritevahelisi mõjusid; 32.3.4. kui leitakse mõõtetulemust oluliselt mõjutav tegur, tehakse selle teguri vastuvõetavate piiride väljaselgitamiseks katseid; 32.3.5. mõõtetulemust oluliselt mõjutavad tegurid tuleb meetodi kirjelduses selgelt ära näidata. 32.4. Rakendatavuse ja mõjutuskindluse määramisel ei ole eesmärgiks tegurite muutmine ühekaupa, vaid mitmete muudatuste üheaegne tekitamine ja nende ajas jälgimine. Võimalik katseskeem on esitatud tabelis 11. Tabel 11. Mõjutuskindluse uuringute katseskeem Teguri väärtus F Määramiste kombinatsioon 1 2 3 4 5 6 7 8 A/a A A A A a a a a B/b B B b B B B b b C/c C c C c C c C c D/d D D d d d d D D E/e E e E e e E e E F/f F f f F F f f F G/g G g g G g G G g Saadud tulemus R S T U V W X Y Z 32.5. Tabelis 11 esitatud katseskeemi puhul lähtutakse järgmisest: 32.5.1. A, B, C, D, E, F ja G on näiteks seitsme erineva teguri nimiväärtused, mille mõningane muutmine eeldatavalt mõjutab mõõtetulemusi; 32.5.2. muudetud väärtused tähistatakse väiketähtedega: a, b, c, d, e, f ja g; 32.5.3. muutuste tulemusena tekib 27 ehk 128 võimalikku olekukombinatsiooni. Nende hulgast on võimalik valida 8 kombinatsioonist koosnev alamhulk selliselt, et väikesed ja suured tähed on tasakaalus; 32.5.4. valitud tegurite A–G kombinatsioonist tehakse kaheksa määramist ja tulemused esitatakse tabeli viimasel real; 32.5.5. mõjutuskindluse arvutusnäited on toodud alapunktides 48.1– 48.4. 33. Stabiilsus 33.1. Analüüdi või proovimaatriksi osade ebapiisav stabiilsus proovi säilitamisel või analüüsimisel võib põhjustada olulisi hälbeid analüüsitulemustes. Samuti tuleb kontrollida kalibreerimisstandardi stabiilsust lahuses. 33.2. Tavaliselt saab analüüdi stabiilsust erinevatel säilitamistingimustel hästi iseloomustada ja nende tingimuste jälgimine on osa laboratooriumi tavapärasest akrediteerimissüsteemist. Kui säilitamistingimused ei ole teada, määratakse stabiilsus alapunktides 33.3 ja 33.4 kirjeldatud näidete kohaselt. 33.3. Kui uuritakse analüüdi stabiilsust lahuses, toimitakse järgmiselt: 33.3.1. valmistatakse värsked analüüdi alglahused ja lahjendatakse vastavalt juhisele, et saada igal valitud kontsentratsioonil küllaldane hulk osi, näiteks 40. Kontsentratsioonid on minimaalse suutlikkusepiiri lähedal nende saasteainete jaoks, millele ei ole kehtestatud lubatud piirsisaldust, ning lubatud piirsisalduse lähedal teiste saasteainete jaoks; 33.3.2. valmistatakse nii need analüüdilahused, mida kasutatakse proovi rikastamiseks, kui ka lõppmääramisel kasutatavad lahused ning vajadusel ka teised vajalikud lahused, näiteks derivatiseeritud standardid; 33.3.3. mõõdetakse analüüdi sisaldus värskelt valmistatud lahuses vastavalt katsejuhisele; 33.3.4. võrdsed alikvoodid jaotatakse sobilikesse anumatesse, anumad märgistatakse ja säilitatakse vastavalt tabelis 12 esitatud skeemile; Tabel 12. Lahuses analüüdi stabiilsuse määramise skeem –20 °C –4 °C +20 °C Pimedas 10 osa 10 osa 10 osa Valges 10 osa 33.3.5. valida võib ühe-, kahe-, kolme- või neljanädalase või vajadusel pikema säilitusaja, näiteks kuni avastamisel või kvantinfitseerimisel esimeste lagunemisnähtude tekkeni. Maksimaalne säilitusaeg ja optimaalsed säilitustingimused dokumenteeritakse; 33.3.6. analüüdi kontsentratsiooni arvutamiseks igas osalahuses võetakse värskelt valmistatud analüüdilahuse kontsentratsioon võrdeks 100%-ga. Järelejäänud analüüdi kontsentratsioon arvutatakse järgmise valemi kohaselt

kus Ci on kontsentratsioon ajahetkel, Cvärske on värske lahuse kontsentratsioon. 33.4. Kui uuritakse analüüdi stabiilsust maatriksis, toimitakse järgmiselt: 33.4.1. võimaluse korral kasutatakse analüüdiga elusrikastatud proove (incurred samples). Kui sellist materjali ei ole võimalik kasutada, kasutatakse analüüdiga rikastatud maatriksit; 33.4.2. elusrikastatud materjali puhul saab kontsentratsiooni määrata kuni see on veel värske. Edaspidi võetakse materjalist osaproovid ühe, kahe, nelja ja kahekümne nädala möödumisel ja määratakse neis analüüdi kontsentratsioon. Kudesid säilitatakse vähemalt –20 °C juures või vajadusel madalamal temperatuuril; 33.4.3. kui elusrikastatud materjali ei ole võimalik kasutada, võetakse natuke analüüti mittesisaldavat proovi, mis homogeniseeritakse. Materjal jagatakse viieks osaks ja iga osa rikastatakse analüüdiga, mis on eelistatult valmistatud väikeses hulgas lahuses. Üks osa analüüsitakse kohe, teisi säilitatakse vähemalt –20 °C juures või vajadusel madalamal temperatuuril. Neid osasid analüüsitakse ühe, kahe, nelja ja kahekümne nädala möödudes. 34. Kalibreerimiskõverad 34.1. Kui ainehulga määramisel kasutatakse kalibreerimiskõveraid, toimitakse nende konstrueerimisel järgmiselt: 34.1.1. võimaluse korral kasutatakse vähemalt viit kontsentratsiooni, kaasa arvatud 0-kontsentratsioon; 34.1.2. kirjeldatakse kalibreerimiskõvera tööpiirkonda; 34.1.3. esitatakse kalibreerimiskõvera matemaatiline võrrand ja sobitusandmed (goodness-of-fit data); 34.1.4. kirjeldatakse kalibreerimiskõvera parameetrite lubatavaid piire. 34.2. Kui on vajalik standardlahusel põhinev seeriaviisiline kalibreerimine, näidatakse seeriast seeriasse muutuvate kalibreerimiskõvera parameetrite lubatavuse piirid. 35. Valideerimise tavaprotseduurid 35.1. Parameetrite arvutamine tavameetodite kohaselt nõuab mitmete üksikkatsete teostamist. Iga suurema muutuse jaoks tuleb kirjeldada kõiki suutlikkusenäitajad nii, nagu näiteks punktis 32 kirjeldatud rakendatavuse ja mõjutuskindluse puhul. 35.2. Kui eelnevalt on kõrvaldatud või välistatud võimalikud segavad asjaolud, saab multimeetodite korral samaaegselt määrata paljusid analüüte. 35.3. Paljusid suutlikkusenäitajaid saab määrata sarnasel viisil. Seetõttu võib töökoormuse vähendamiseks uuringuid kombineerida, näiteks korduvust ja laboratooriumisisest korratavust spetsiifilisusega või tühiproovide analüüsi otsustuspiiri määramise ja spetsiifilisuse uuringutega. 36. Saagis 36.1. Kui sertifitseeritud materjale ei ole võimalik kasutada, võib saagise määrata rikastatud tühimaatriksit kasutades, järgides näiteks järgmist skeemi: 36.1.1. võetakse 18 osa tühiproovina kasutatavat materjali, mis rikastatakse määratava analüüdiga kontsentratsioonidel, mis on vastavalt 0,5, 1 ja 2 korda suuremad lubatavast piirsisaldusest või 1, 1,5 ja 2 korda suuremad minimaalsest nõutavast suutlikkusepiirist. Igal kontsentratsioonil viiakse analüüs läbi vähemalt kuuel korral; 36.1.2. proovid analüüsitakse ja igas proovis arvutatakse kontsentratsioon; 36.1.3. saagis arvutatakse iga proovi jaoks järgmise valemi kohaselt

36.1.4. arvutatakse saagise keskväärtus ja variatsioonikoefitsient, lähtudes igal kontsentratsioonil saadud kuuest tulemusest. 36.2. Alapunktis 36.1 toodud saagise määramise tavameetod on üks alapunktides 49.1–49.6 kirjeldatud lisamismeetodi variantidest juhul, kui on täidetud järgmised tingimused: 36.2.1. proovi käsitatakse tühiproovina (mitte analüüsitava proovina); 36.2.2. lähtutakse sellest, et kahe uuritava portsjoni jaoks on nominaalsisaldus2 (yield) ja saagis3 (recovery) sarnased; 36.2.3. uuritavate proovide massid ja lahuste ruumalad on võrdsed; 36.2.4. kalibreerimisstandardi hulk, mis lisatakse teisele uuritavale portsjonile ehk lisandproovile on Xlisa, kusjuures Xlisa = ρ x VA 36.2.5. kui x1 on tühiproovi ja x2 lisandproovi portsjonist mõõdetud suurus, siis on

36.3. Kui üks alapunktides 36.2.1–36.2.5 nimetatud tingimustest ei ole täidetud, tuleb saagise leidmiseks rakendada alapunktides 49.1–49.6 toodud lisamismeetodi protseduuri. 37. Korduvus 37.1. Korduvuse uurimiseks valmistatakse ette ühesuguse maatriksiga proovid, mida on rikastatud kontsentratsioonidel 1, 1,5 ja 2 korda rohkem minimaalsest suutlikkusepiirist või 0,5, 1 ja 2 korda rohkem lubatud piirsisaldusest. Igal kontsentratsioonil viiakse analüüs läbi vähemalt kuuel korral. 37.2. Neid samme korratakse vähemalt kaks korda, kasutades erinevaid operaatoreid ja võimaluse korral erinevaid reaktiivi- ja lahustipartiisid, ruumitemperatuure, seadmeid ja muid keskkonnatingimusi. 37.3. Proove analüüsitakse ja arvutatakse iga proovi kontsentratsioon, mille põhjal leitakse rikastatud proovide kontsentratsioonide keskväärtus, standardhälve ja variatsioonikoefitsient (%). 38. Laboratooriumisisene korratavus 38.1. Laboratooriumisisese korratavuse uurimiseks valmistatakse ette ühesuguse või erineva maatriksiga proovid, mida on rikastatud kontsentratsioonidel 1, 1,5 ja 2 korda rohkem minimaalsest suutlikkusepiirist või 0,5, 1 ja 2 korda rohkem lubatud piirsisaldusest. Igal kontsentratsioonil viiakse analüüs läbi vähemalt kuuel korral. 38.2. Edasi toimitakse alapunktides 37.2 ja 37.3 kirjeldatud viisil. 39. Korratavus Kui tuleb kontrollida korratavust, peavad laboratooriumid võimaluse korral osalema standardile ISO 5725-2:19941 vastavates ühisuuringutes. 40. Otsustuspiir 40.1. Otsustuspiiri (CCα) määramisel lähtutakse identifitseerimise või identifitseerimise ja hulga määramise nõuetest vastavalt punktides 4–26 kirjeldatule. 40.2. Kui saasteainele ei ole kehtestatud lubatud piirsisaldust, saab CCα määrata järgmistel viisidel: 40.2.1. kalibreerimiskõvera abil vastavalt standardile ISO 11843:19971, mida siinkohal tähistatakse põhioleku muutuja kriitilise väärtusena (critical value of the net state variable). Sel juhul kasutatakse tühiproovi, mis on rikastatud väikseimal nõutud suutlikkusetasemel ja sellest ülespoole võrdsete kontsentratsioonitasemete tagant. Proovid analüüsitakse ja pärast identifitseerimist koostatakse saadud signaali ja sellele vastava kontsentratsiooni graafik. Otsustuspiiriks on graafiku lõikepunkt Y-teljega, millele on lisatud 2,33 laboratooriumisisese korratavuse standardhälvet. See meetod on rakendatav ainult kvantitatiivsete uuringute puhul (α=1%); 40.2.2. analüüsides vähemalt 20 tühiproovi iga maatriksi kohta, et oleks võimalik signaali ja müra suhte arvutamine eeldatavas analüüdi väljumise ajaaknas. Otsustuspiiriks loetakse kontsentratsioon, mille puhul signaal on müratasemest kolm korda suurem. See meetod sobib nii kvalitatiivsete kui ka kvantitatiivsete uuringute tegemiseks. 40.3. Kui saasteainele on kehtestatud lubatud piirsisaldus, saab CCα määrata kahel järgmisel viisil: 40.3.1. kas kalibreerimiskõvera abil vastavalt standardile ISO 11843:19971, mida siinkohal tähistatakse põhioleku muutuja kriitilise väärtusena (critical value of the net state varable). Sel juhul kasutatakse tühiproovi, mis on rikastatud lubatud piirsisalduse piirkonnas võrdsete kontsentratsioonivahemike tagant. Proove analüüsitakse ja pärast ainete identifitseerimist koostatakse saadud signaali ja sellele vastava kontsentratsiooni graafik. Otsustuspiiriks (α=5%) on kontsentratsioon, mis vastab lubatud piirsisaldusele liidetud 1,64-kordsele laboratooriumisisesele korratavusele; 40.3.2. analüüsides vähemalt 20 tühiproovi iga maatriksi kohta, kus analüüdi hulk on lubatud piirsisalduse tasemel. Otsustuspiiriks (α=5%) on kontsentratsioon, mis vastab lubatud piirsisaldusele liidetud 1,64-kordsele laboratooriumisisesele standardveale. 40.4. Otsustuspiiri määramisel tuleb järgida standardi EVS-EN ISO/IEC 17025:2000 punktis 5.9 katse- ja kalibreerimistulemuste kvaliteedi tagamiseks kehtestatud nõudeid. Analüütiliste piiride graafilise esitamise näited on toodud alapunktides 47.1–47.2. 41. Avastamisvõime 41.1. Avastamisvõime (CCβ) määratakse vastavalt sõelmeetodile, identifitseerimisele või identifitseerimisele ja kvantinfitseerimisele punktides 4–26 kehtestatud nõuetele. 41.2. Kui saasteainele ei ole kehtestatud lubatud piirsisaldust, saab CCβ määrata järgmistel viisidel: 41.2.1. kalibreerimiskõvera abil vastavalt standardile ISO 11843:19971, mida siinkohal tähistatakse põhioleku muutuja väikseima avastatava väärtusena (minimum detectable value of the net state variable). Sel juhul kasutatakse esinduslikku tühiproovi, mis on rikastatud väikseimal nõutud suutlikkusetasemel ja sellest ülespoole võrdsete kontsentratsioonivahemike tagant. Proove analüüsitakse ja pärast analüüdi või analüütide identifitseerimist arvutatakse otsustuspiiril mõõdetud keskmise analüüdisisalduse standardhälve. Avastamisvõimeks (β=5%) loetakse otsustuspiiriks olev kontsentratsioon, millele on liidetud otsustuspiirile vastava sisalduse mõõtmisel saadud laboratooriumisisese korratavuse standardhälbe 1,64-kordne väärtus; 41.2.2. analüüsides vähemalt 20 otsustuspiiril rikastatud tühiproovi iga maatriksi kohta. Proovid analüüsitakse ja analüüt või analüüdid identifitseeritakse. Avastamisvõimeks (β=5%) loetakse otsustuspiiriks olev kontsentratsioon, millele on liidetud vastava sisalduse mõõtmisel saadud laboratooriumisisese korratavuse standardhälbe 1,64-kordne väärtus; 41.2.3. kui kvantitatiivsed andmed puuduvad, määratakse CCβ otsustuspiiril või sellest ülespoole rikastatud tühiproovide analüüsimisega. Sel juhul on kontsentratsioonide tase, mille puhul valenegatiivsete tulemuste protsent jääb =5%, võrdne meetodi avastamisvõimega. Usaldusväärse tulemuse saamiseks tuleb ühe kontsentratsioonitaseme kohta läbi viia vähemalt 20 määramist. 41.3. Kui saasteainele on kehtestatud lubatud piirsisaldus, saab CCβ määrata järgmistel viisidel: 41.3.1. kalibreerimiskõvera abil vastavalt standardile ISO 11843:19971, mida siinkohal tähistatakse põhioleku muutuja väikseima avastatava väärtusena (minimum detectable value of the net state varable). Sel juhul kasutatakse esinduslikku tühiproovi, mis on rikastatud lubatud piirsisalduse piirkonnas võrdsete kontsentratsioonivahemike tagant. Proovid analüüsitakse ja pärast analüüdi või analüütide identifitseerimist arvutatakse otsustuspiiril mõõdetud keskmise analüüdi sisalduse standardhälve. Avastamisvõimeks (β=5%) loetakse otsustuspiiriks olev kontsentratsioon, millele on liidetud otsustuspiirile vastava sisalduse mõõtmisel saadud laboratooriumisisese korratavuse standardhälbe 1,64-kordne väärtus; 41.3.2. analüüsides vähemalt 20 otsustuspiiril rikastatud tühiproovi iga maatriksi kohta. Avastamisvõimeks (β=5%) loetakse otsustuspiiriks olev kontsentratsioon, millele on liidetud vastava sisalduse mõõtmisel saadud standardhälbe 1,64-kordne väärtus. 41.4. Analüütiliste piiride graafilise esitamise näited on toodud alapunktis 47.1–47.2. 42. Mõjutuskindlus ulatuslike muudatuste korral 42.1. Analüüsimeetodit tuleb kontrollida erinevates katsetingimustes, näiteks erinevate prooviliikide, -maatriksite või proovivõtutingimuste puhul. 42.2. Tekitatud muutused peavad olema ulatuslikud ja selle hindamiseks sobib näiteks Youdeni meetod. 42.3. Iga ulatusliku muudatuse jaoks, mis mõjutab nähtavalt analüüsitulemust, määratakse suutlikkusenäitajad. 43. Valideerimine vastavalt alternatiivmudelitele 43.1. Kui rakendatakse alternatiivseid valideerimisprotseduure, tuleb valideerimisprotokolli märkida aluseks võetud mudel ja strateegia koos vastavate nõuete, eelduste ja valemitega või vähemalt viidetega, kust neid leida. 43.2. Kui alternatiivse mudelina rakendatakse näiteks laboratooriumisisest valideerimist, määratakse suutlikkusenäitajad selliselt, et sama protseduuri raames on võimalik läbi viia valideerimine ka ulatuslike muudatuste puhul, mis nõuab valideerimiseks katseplaani koostamist. 44. Katseplaan 44.1. Katseplaan koostatakse sõltuvalt uuritavate liikide ja tegurite hulgast. 44.2. Valideerimisprotseduuri esimeseks sammuks on tulevikus analüüsitavate proovikogumite väljaselgitamine, et valida välja kõige tähtsamad liigid ja need tegurid, mis mõjutaksid mõõtetulemusi kõige enam. Seejärel valitakse sõltuvalt analüüsi eesmärgist kontsentratsioonide huvipakkuv tase. 44.3. Katseplaani võib koostada järgmise näite põhjal: 44.3.1. valideeritava analüüsimeetodiga saab üheaegselt määrata mitut analüüti; 44.3.2. identifitseeritakse peamise ehk juhtteguri kaks variatsiooni A ja B. Juhttegurid moodustavad tegurite kombineerimistasemete alused ja nendeks võivad olla näiteks liigid või maatriks. Üldjuhul on juhttegureid võimalik varieerida rohkem kui kahel tasemel, kuid siis suureneb tehtavate analüüside arv. Selles näites varieeritakse juhttegurit kahel tasemel, st arvestatakse kahe erineva liigi A ja B olemasolu; 44.3.3. tabelites 13 ja 14 on toodud valideerimise jaoks oluliste tegurite näidisloetelu ja -katseplaan, kusjuures tegureid varieeritakse kahel tasemel ja seda tähistatakse vastavalt märkidega «+» või «–»; Tabel 13. Valideerimise jaoks oluliste tegurite näidisloetelu Looma sugu Tegur 1 Tõug Tegur 2 Veotingimused Tegur 3 Säilitustingimused Tegur 4 Proovi värskus Tegur 5 Nuumamistingimused Tegur 6 Erinevate kogemustega operaatorid Tegur 7 Tabel 14. Näidiskatseplaan Liik Tegur 1 Tegur 2 Tegur 3 Tegur 4 Tegur 5 Tegur 6 Tegur 7 Proovi number A + + + + – + – 1 A + + – – + – – 2 A + – + – – – + 3 A + – – + + + + 4 A – + + – + + + 5 A – + – + – – + 6 A – – + + + – – 7 A – – – – – + – 8 B + + + + + – + 9 B + + – – – + + 10 B + – + – + + – 11 B + – – + – – – 12 B – + + – – – – 13 B – + – + + + – 14 B – – + + – + + 15 B – – – – + – + 16 44.3.4. tabelis 14 esitatud näidiskatseplaani kohaselt tuleb igale proovile ehk teguritaseme kombinatsioonile teha lisamisi neljal erineval huvipakkuva sisaldusega kontsentratsioonil, ja igal tasemel analüüsitakse üks tühiproov, siis tuleb valideerimiskatses teha 5 x 16=80 analüüsi. Nende analüüside põhjal saab arvutada saagise, korduvuse (sir) ja laboratooriumisisese korratavuse (siR) iga kontsentratsioonitaseme jaoks, otsustuspiiri (CCα), avastamisvõime (CCβ), suutlikkusekõvera (power curve) (β-vea suuruse sõltuvust kontsentratsioonist on selgitatud alapunktides 45.1–45.3), mõjutuskindluse ulatuslike muutuste suhtes, 16 proovil põhinevat kalibreerimiskõverat, üldise kalibreerimiskõvera, üldise kalibreerimiskõvera ennustusvahemiku, maatriksist tingitud hälbed (smat), analüüsi käigust tingitud hälbed (srun) ning üksikute tegurite mõju analüüsitulemustele. Mõjutuskindlust väikeste muutuste suhtes saab määrata vastavalt alapunktides 32.1–32.5 kirjeldatule. 44.4. Kuna tabelis 14 toodud katseplaani puhul uuritakse lisaks üksiktegurite mõjule ka teguritevahelisi kombinatsioone, siis võib alapunktis 44.3.4 nimetatud suutlikkusenäitajate põhjal hinnata meetodi suutlikkusetaset. Samuti võib selle katseplaani alusel otsustada, millise valitud teguritest võib üldisest kalibreerimiskõverast välja jätta, kui see erineb oluliselt teiste tegurite standardhälvetest. 45. Suutlikkusekõver 45.1. Suutlikkusekõver annab teavet meetodi avastamisvõime kohta valitud kontsentratsioonivahemikus, näidates β-vea tekkimise riski antud meetodi kasutamisel. 45.2. Suutlikkusekõvera põhjal saab arvutada meetodiklasside (sõeluuring, kinnitusmeetod) või -tüüpide (kvalitatiivne või kvantitatiivne) avastamisvõime näiteks 5% β-vea või teiste β-vigade jaoks. 45.3. Joonisel 1 on näidatud meetodi avastamisvõime (CCβ) graafiline leidmine. Selle konkreetse meetodi puhul on kontsentratsioonil 0,5 µg/kg valenegatiivse otsuse tegemise oht 5%. Kontsentratsioonil 0,55 µg/kg väheneb valenegatiivse otsuse tegemise oht 1%-ni.

Joonis 1. Veakõver 46. Korratavus 46.1. Meetodi korratavuse määramine ühes laboratooriumis tehtud uuringute ehk laboratooriumisisese valideerimisega nõuab korduvat osalemist ISO juhenditele 43-1:1997 ja 43-2:19971 vastavas pädevuskatses. Laboratooriumid võivad meetodid ise valida tingimusel, et neid kasutatakse tavatingimustes. 46.2. Meetodi korratavust saab hinnata laboratooriumi standardhälbega. 47. Näited analüütiliste piiride graafiliseks esitamiseks 47.1. Joonisel 2 on toodud analüütiliste piiride graafilise esitamise näide selliste saasteainete jaoks, mille kohta ei ole kehtestatud piirnormi. Joonisel 2 kasutatakse lühendeid järgmises tähenduses: 47.1.1.

– tühiproovi «keskmine» kontsentratsioon; 47.1.2.

– saastatud proovi keskmine mõõtetulemus; 47.1.3. SB – tühiproovi standardhälve, mis on määratud laboratooriumisisestel korratavustingimustel; 47.1.4. SS – saastatud proovi standardhälve, mis on määratud laboratooriumisisestel korratavustingimustel; 47.1.5. α – valepositiivsete tulemuste osahulk; 47.1.6. β – valenegatiivsete tulemuste tõenäosus; 47.1.7. CCα – tulemus antud α-vea ja 50% β-vea korral; 47.1.8. CCβ – tulemus väga väikese α-vea ja β-vea korral.

Joonis 2. Analüütiliste piiride esitamine saasteainete jaoks, millele ei ole kehtestatud piirnormi 47.2. Joonisel 3 on toodud analüütiliste piiride graafilise esitamise näide selliste saasteainete jaoks, mille kohta on kehtestatud piirnorm. Joonisel 3 kasutatakse lühendeid järgmises tähenduses: 47.2.1.

– tühiproovi «keskmine» kontsentratsioon; 47.2.2.

– keskmine kontsentratsioon proovis, mis sisaldab analüüti lubatava piirsisalduse tasemel; 47.2.3.

– saastatud proovi keskmine kontsentratsioon; 47.2.4. SPL – lubatud piirsisaldusel analüüti sisaldava proovi standardhälve, mis on määratud laboratooriumisisestel korratavustingimustel; 47.2.5. SS – saastatud proovi standardhälve, mis on määratud laboratooriumisisestel korratavustingimustel; 47.2.6. α – valepositiivsete tulemuste osahulk; 47.2.7. β – valenegatiivsete tulemuste tõenäosus; 47.2.8. CCα – tulemus antud α-vea ja 50% β-vea korral; 47.2.9. CCβ – tulemus väga väikese α-vea ja β-vea korral.

Joonis 3. Analüütiliste piiride esitamine saasteainete jaoks, millele on kehtestatud piirnorm 48. Näide mõjutuskindluse määramisest väikeste muutuste puhul vastavalt Youdeni meetodile 48.1. Mõjutuskindluse uurimiseks võrreldakse omavahel suur- ja väiketähtedega tähistatud keskmisi järgmiste valemite järgi

Kui teguril on mõju, on erinevus oluliselt suurem kui muude tegurite puhul. 48.2. Mõjutuskindlad meetodid ei tohi olla mõjutatavad peaaegu kindlalt esinevatest laboratooriumidevahelistest tingimuste muutumisest. 48.3. Suurte erinevuste puudumisel on kõige realistlikum mõõta juhuslikku viga seitsme erinevuse põhjal. Selleks tehakse arvutused järgmiste valemite järgi: 48.3.1. erinevused (Di)

48.3.2. erinevuste ruudud

48.3.3. erinevuste (Di) standardhälve (SDi)

48.4. Kui SDi on oluliselt suurem kui laboratooriumisisestel korratavustingimustel läbiviidud meetodi standardhälve, võib sellest järeldada, et kõigil teguritel on tulemusele mõju, isegi kui üksikteguri puhul ei ole mõju märkimisväärne. Sellisel juhul ei ole meetod valitud muutuste suhtes piisavalt mõjutuskindel. 49. Näited lisamismeetodi kasutamiseks 49.1. Uuritav proov analüüdisisaldusega T jagatakse kaheks uuritavaks osaks 1 ja 2 massidega vastavalt m1 ja m2. Teisele katsekogusele lisatakse mahus VA analüüdilahust kontsentratsiooniga ρA. 49.2. Pärast ekstraheerimist ja puhastamist saadakse kaks uuritavate katsekoguste ekstrakti mahtudega vastavalt V1 ja V2. 49.3. Analüüdi saagiseks on oletatavasti rc. Mõlemat ekstrakti uuritakse mõõtemeetodiga, mille tundlikkus on b ning mis annab tulemusteks vastavalt x1 ja x2. 49.4. Eeldades, et rc ja b on nii algses proovis kui ka rikastatud proovis ühesugused, saab analüüdi sisalduse T arvutada järgmise valemi järgi

49.5. Meetodiga saab määrata saagist rc. Lisaks alapunktides 49.1–49.4 kirjeldatud analüüsile lisatakse osale esimese katsekoguse ekstraktist mahuga V3 teadaolev hulk ρbVb analüüti ja analüüsimisel saadakse analüüsitulemus x3. Saagis arvutatakse järgmise valemi järgi

49.6. Meetodiga saab määrata tundlikkust, mis arvutatakse järgmise valemi järgi

_______________ 1 Standardite ja juhendite kohta annavad eestikeelset teavet referentlaboratooriumid 2 Nominaalsisaldus (yield) on proovis sisalduva analüüdi massiosa, mis esineb lõpplahuses 3 Saagis (recovery) on siinkohal proovile lisatud massiosa, mis esineb lõpplahuses. Käesolevas lisas eeldatakse, et nominaalsisaldus ja saagis on võrdsed ning seetõttu kasutatakse ainult terminit «saagis» Põllumajandusminister Tiit TAMMSAAR