Vabariigi Valitsus — Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid — RT I, 28, 167

Määrus kehtestatakse « Toiduseaduse» (RT I 1999, 30, 415; 2002, 13, 81; 61, 375; 63, 387; 102, 603) § 49 lõike 4 alusel. 1. peatükk ÜLDSÄTTED §1. Reguleerimisala (1) Määrusega kehtestatakse järelevalve käigus kontrollproovide (edaspidi proovid) võtmise ja analüüsimise meetodid, mida kasutatakse toor- ja kuumtöödeldud piima nõuetekohasuse kontrollimiseks. (2) Määrust kohaldatakse Veterinaar- ja Toiduameti järelevalveametnike poolt järelevalve käigus võetavate proovide suhtes. (3) Toor- ja kuumtöödeldud piimast proovide võtmise ja proovide analüüsimise korral järgitakse Vabariigi Valitsuse 2. novembri 1999. a määrusega nr 330 kinnitatud «Järelevalve käigus kontrollproovide võtmise ja analüüsimise korra» (RT I 1999, 84, 767; 2003, 12, 60) nõudeid. 2. peatükk PROOVIDE VÕTMINE TOOR- JA KUUMTÖÖDELDUD PIIMA NÕUETEKOHASUSE KONTROLLIMISEKS §2. Proovide võtmise meetodid (1) Toor- ja kuumtöödeldud piimast võetakse proove lisas 1 toodud meetodite kohaselt. (2) Kui lisas 1 toodud meetodi abil ei ole võimalik proovi võtta, võib kasutada muud meetodit, mis tagab proovi esinduslikkuse. §3. Nõuded proovide võtmisel kasutatavate vahendite kohta (1) Proovide võtmisel kasutatavad vahendid (edaspidi proovivõtuvahendid) peavad olema valmistatud roostevabast terasest või mõnest muust piisava tugevusega materjalist ning olema proovivõtuks sobiva ehitusega. (2) Proovinõud ja sulgurid peavad olema klaasist, metallist või plastmassist. (3) Proovinõude ja muude proovivõtuvahendite valmistamiseks kasutatud materjalid ei tohi põhjustada proovis analüüsitulemusi mõjutavaid muutusi. (4) Proovivõtuvahendite pinnad peavad olema puhtad, kuivad, siledad, pragudeta ja ümarate nurkadega. (5) Segamisvahendid peavad võimaldama toor- ja kuumtöödeldud piima nõuetekohast segamist, põhjustamata rääsunud maitse tekkimist. (6) Proovivõtukulbil peab olema piisava pikkusega vars, mis võimaldab proovivõttu erineva sügavusega mahutitest. Proovivõtukulbi maht ei tohi olla väiksem kui 50 ml. (7) Kui proove võetakse mikrobioloogiliste näitajate analüüsimiseks, peavad proovivõtuvahendid lisaks käesolevas paragrahvis sätestatud nõuete kohasusele olema steriliseeritud. §4. Proovide vedamine ja säilitamine (1) Proovide veo ja säilitamise korral rakendatakse abinõusid, mis väldivad proovide saastumist võõrlõhnadega ja otsest kokkupuudet päikesevalgusega. Läbipaistvate proovinõude kasutamisel hoitakse proovi sisaldavaid nõusid pimedas. (2) Toorpiimast mikrobioloogiliste näitajate määramiseks võetud proove veetakse ja säilitatakse temperatuuril 0…4 ºC, kusjuures ajavahemik proovivõtust kuni analüüsimiseni ei tohi olla pikem kui 36 tundi. Kui ajavahemik proovivõtust kuni analüüsimiseni ei ole pikem kui 24 tundi, võib proove vedada ja säilitada temperatuuril 0…6 °C. (3) Pastöriseeritud piimast mikrobioloogiliste näitajate määramiseks võetud proove veetakse ja säilitatakse temperatuuril 0…4 °C, kusjuures ajavahemik proovivõtust kuni analüüsimiseni ei tohi olla pikem kui 24 tundi. (4) Kõrgkuumutatud (UHT) ja steriliseeritud piimast mikrobioloogiliste näitajate määramiseks võetud proove säilitatakse laboratooriumis jahutatult temperatuuril 0…6 °C, kusjuures ajavahemik proovivõtust kuni analüüsimiseni peab olema võimalikult lühike. 3. peatükk PROOVIDE ANALÜÜSIMINE TOOR- JA KUUMTÖÖDELDUD PIIMA NÕUETEKOHASUSE KONTROLLIMISEKS §5. Analüüsimise meetodite üldnõuded Toor- ja kuumtöödeldud piima analüüsimise meetodite üldnõuded on toodud lisas 2. §6. Analüüsimise meetodid (1) Toorpiima proove analüüsitakse lisas 2 toodud üldnõudeid järgides järgmiste meetoditega: 1) antibiootikumide ja sulfoonamiidide määramise meetod (lisa 3); 2) külmumistäpi määramise meetod (lisa 4); 3) mikroorganismide arvu määramine tassimeetodil temperatuuril 30 °C (lisa 5); 4) somaatiliste rakkude arvu määramine mikroskoobimeetodil (lisa 6); 5) somaatiliste rakkude arvu määramine fluoro-opto-elektroonilisel meetodil (lisa 7). (2) Pastöriseeritud piima proove analüüsitakse lisas 2 toodud üldnõudeid järgides järgmiste meetoditega: 1) antibiootikumide ja sulfoonamiidide määramise meetod (lisa 3); 2) külmumistäpi määramise meetod (lisa 4); 3) mikroorganismide arvu määramine tassimeetodil temperatuuril 30 °C (lisa 5); 4) mikroorganismide arvu määramine tassimeetodil temperatuuril 21 °C (lisa 8); 5) coli-laadsete bakterite arvu määramise meetod temperatuuril 30 °C (lisa 9); 6) patogeensete mikroorganismide määramise meetod (lisa 10); 7) fosfataasi aktiivsuse määramise meetod (lisa 11); 8) peroksidaasi aktiivsuse määramise meetod (lisa 12). (3) Kõrgkuumutatud (UHT) ja steriliseeritud piima proove analüüsitakse lisas 2 toodud üldnõudeid järgides järgmiste meetoditega: 1) antibiootikumide ja sulfoonamiidide määramise meetod (lisa 3); 2) külmumistäpi määramise meetod (lisa 4); 3) mikroorganismide arvu määramine tassimeetodil temperatuuril 30 °C (lisa 5). (4) Külmumistäpi määramise meetodi puhul kasutatava termistorkrüoskoobi ehituse näidis on toodud lisas 13. (5) Kui laboratooriumis ei ole lõigetes 1–3 sätestatud meetodite abil võimalik proovi analüüsida, võib kooskõlastatult järelevalveasutusega kasutada teisi meetodeid. 1 91/180/EMÜ (EÜT L 93, 13.04.1991, lk 1) Peaminister Siim KALLAS Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Riigisekretär Aino LEPIK von WIRÉN Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 1 TOOR- JA KUUMTÖÖDELDUD PIIMAST PROOVIDE VÕTMISE MEETODID 1. Proovide võtmise meetodite üldnõuded 1.1. Enne proovi võtmist tuleb toor- ja kuumtöödeldud piima (edaspidi piim) hoolikalt käsitsi või mehaaniliselt segada. 1.2. Proov tuleb võtta kohe pärast segamist, kui toimub veel piima rotatsioon. 1.3. Kui piimatankidest võetakse proove erinevateks analüüsideks, võetakse esimesena proov mikrobioloogiliseks analüüsiks. 1.4. Proovi kogus peab vastama teostatava analüüsi nõuetele. Proovinõud täidetakse peaaegu täismahus, et proovi oleks võimalik enne analüüsi tegemist segada. Proovinõude poolik täitmine põhjustab piimarasva destabilisatsiooni proovide vedamisel. 2. Proovide võtmine käsitsi 2.1. Proovivõtt piimakannust ja -nõust Piima kiireks segamiseks piimakannus või -nõus tuleb segistit selles üles-alla liigutada. Segamine peab tagama toote ühtlase segunemise, vältides koore kinnijäämist piimakannu või -nõu kaelale. 2.2. Proovivõtt jahutustankist ja -vannist Jahutustankis või -vannis tuleb piim enne proovi võtmist homogeensuse saavutamiseks käsitsi või mehaaniliselt segada. Kui piima kogus ei ole mehaaniliseks segamiseks piisav, tuleb piim segada käsitsi. 2.3. Proovivõtt kaaluvannist Piima kaaluvanni valamise ajal on vaja piima küllaldaselt segada. Piimarasva ühtlaseks jaotumiseks võib piima lisaks segada käsitsi või mehaaniliselt. 2.4. Proovivõtt mitmest anumast Kui see partii, millest proove võetakse, on mitmes piimakannus, -nõus, jahutustankis, -vannis või kaaluvannis, võetakse igast anumast esinduslik üksikproov, mille kogus märgitakse proovivõtu protokolli. Kui neid proove ei analüüsita üksikult, eraldatakse üksikproovist osaproov, mille kogus on võrdeline anumas oleva piimakogusega. Osaproovide hoolika segamise järel võetakse saadud piimakogusest partiid iseloomustav koondproov. 2.5. Proovivõtt suurest mahutist, veotsisternist ja säilitustankist 2.5.1. Suures mahutis, veotsisternis või säilitustankis (edaspidi mahuti) tuleb piim enne proovivõttu sobival meetodil segada. Piima võib segada mahutisse paigaldatud mehaanilise seguriga või teenindusluugi külge kinnitatud ja piima sisse ulatuva propeller- või tiguseguriga, mis käivitatakse elektrimootoriga. Piima segamiseks võib kasutada ringtsirkulatsiooni, mille puhul piim liigub ülekandevoolikust läbi mahalaadimispumba ja teenindusluugi mahutisse. Kui piima segatakse puhta suruõhuga, tuleb kasutada väikseimat õhusurvet ja -hulka, et vältida piimal rääsunud maitse tekkimist. 2.5.2. Piima segamise kestus mahutis peab olema võrdeline piima säilitusajaga selles mahutis. Proovivõtja peab enne proovi võtmist olema veendunud, et piima on piisavalt segatud. Segamine on piisav, kui kahe samadel tingimustel võetud proovi rasvasisalduste vahe on alla 0,1%. 2.5.3. Suure mahuti puhul, mille põhjas on väljalaskeava, võetakse proovid teenindusluugi kaudu. Kui proove võetakse väljalaskeava kaudu, tuleb proovi õigsuse kindlustamiseks enne proovivõttu lasta välja voolata piisav kogus piima. 2.6. Proovivõtt kuumtöödeldud piima müügipakendist 2.6.1. Prooviks on kuumtöödeldud piim kindlalt suletud müügipakendis. Müügipakend võetakse võimaluse korral kohe pärast piima kuumtöötlemist või ettevõtte külmlaost. Pastöriseeritud piimast võetakse proovid piima pastöriseerimise päeval. 2.6.2. Pastöriseeritud, kõrgkuumutatud (UHT) ja steriliseeritud piimast võetakse proove vastavalt teostatavate analüüside hulgale. 3. Proovide võtmine automaatselt või poolautomaatselt 3.1. Tsisternautodel kasutatakse automaatseid või poolautomaatseid toorpiima proovivõtuseadmeid. 3.2. Proovivõtuseadmeid kontrollitakse enne nende kasutuselevõttu ja seejärel kindlate ajavahemike järel. 3.3. Proovide võtmise meetodi sobivuse hindamisel tuleb määrata: 3.3.1. väikseim piimakogus, millest saab nõuetekohaselt proovi võtta; 3.3.2. väikseim proovikogus, mida saab nõuetekohaselt analüüsida; 3.3.3. jääkpiima ülekandumise määr, mis on seotud proovi väikseima hulgaga; 3.3.4. piima segamise kestus ja meetod, mis tagavad proovi esinduslikkuse; 3.3.5. milliseid analüüse tehakse ja millised ettevaatusabinõud võetakse kasutusele proovi esinduslikkuse tagamiseks. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 2 TOOR- JA KUUMTÖÖDELDUD PIIMA ANALÜÜSIMISE MEETODITE ÜLDNÕUDED 1. Reagendid 1.1. Lahuste ja lahjenduste valmistamiseks ning loputamiseks kasutatakse destilleeritud, deioniseeritud, demineraliseeritud või sama puhast vett. Mikrobioloogilisteks analüüsideks kasutatav vesi ei tohi sisaldada ühendeid, mis võivad mõjutada mikroorganismide kasvu analüüsi käigus. 1.2. Termineid «lahus» ja «lahjendus» kasutatakse vesilahuse ja -lahjenduse puhul, kui analüüsimeetodis ei ole teisiti määratud. 1.3. Kõik kemikaalid on analüütilise reagendi kvaliteediga, kui analüüsimeetodis ei ole teisiti määratud. 2. Seadmed ja vahendid 2.1. Toor- ja kuumtöödeldud piima analüüsimise meetodite puhul on analüüsimiseks kasutatavate seadmete ja vahenditena kirjeldatud ainult eri- ja osalise spetsifikatsiooniga seadmeid või vahendeid. 2.2. Analüütilised kaalud peavad võimaldama kaaluda kaalutist 0,1 mg täpsusega. 3. Klaasist vahendite steriliseerimine 3.1. Kuumaõhusterilisaatoris steriliseeritakse klaasist vahendeid temperatuuril 170…175 °C vähemalt üks tund. 3.2. Autoklaavis steriliseeritakse klaasist vahendeid temperatuuril 121±1 °C vähemalt 20 minutit. Autoklaavis tagatakse piisav auru läbivool. Kui steriliseerimiseks kasutatakse konteinereid, ei tohi neid tihedalt sulgeda ning kolbide ja pudelite korgid peavad olema avatud. Pärast steriliseerimist autoklaav avatakse ja steriliseeritud vahendid kuivatatakse jääksoojuses. 3.3. Pipetid steriliseeritakse kuumaõhusterilisaatoris. 4. Korduvus ja korratavus 4.1. Kui analüüsimise meetodi puhul on esitatud analüüsitulemuste kokkulangemise ehk korduvuse või korratavuse nõue, siis loetakse see nõue täidetuks, kui: 4.1.1. korduvustingimustel saadud kahe üksikanalüüsi tulemuste absoluutne erinevus on väiksem kui meetodis etteantud korduvuse ( r) väärtus; 4.1.2. korratavustingimustel saadud kahe üksikanalüüsi tulemuste absoluutne erinevus on väiksem kui meetodis etteantud korratavuse ( R) väärtus. 4.2. Korduvustingimused on tingimused, kus analüüsitulemused on saadud võimalikult lühikese ajavahemiku järel sama katsetegija poolt, kes kasutas analüüsimiseks sama proovimaterjali, meetodit, seadmeid ja vahendeid. 4.3. Korratavustingimused on tingimused, kus analüüsitulemused on saadud samast proovimaterjalist sama meetodit järgides, kuid muudetud mõõtetingimustel selliselt, et üksikanalüüsid on tehtud erinevate katsetegijate poolt, erinevaid seadmeid ja vahendeid kasutades erinevates laboratooriumides või pikema ajavahemiku möödudes. 4.4. Korduvuse ja korratavuse väärtused saadakse ja neid hinnatakse Vabariigi Valitsuse 2. novembri 1999. a määrusega nr 330 kinnitatud «Järelevalve käigus kontrollproovide võtmise ja analüüsimise korra» punktides 251 ja 252 kirjeldatud viisil. 5. Tulemuste esitamine 5.1. Katseprotokollis esitatakse tulemus, mis on vähemalt kahe selles meetodis esitatud korduvusega määratud väärtuse keskmine. Kui korduvuse nõue ei ole täidetud, korratakse analüüsi või tunnistatakse selle analüüsi tulemus kehtetuks. 5.2. Tulemus väljendatakse massiprotsendina, kui analüüsimeetodis ei ole määratud teisiti. 6. Katseprotokoll Katseprotokollis märgitakse analüüsimeetod ja saadud tulemus. Lisaks märgitakse analüüsimeetodi täpsustamata või lahtiseks jäetud üksikasjad ja tingimused, mis võisid saadud tulemust mõjutada. Katseprotokollis esitatakse kogu vajalik informatsioon proovi lõplikuks identifitseerimiseks. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 3 ANTIBIOOTIKUMIDE JA SULFOONAMIIDIDE MÄÄRAMISE MEETOD I. ÜLDSÄTTED 1. Kasutusala Meetod võimaldab määrata antibiootikume ja sulfoonamiide toor- ja kuumtöödeldud piimas. Meetod koosneb kahest osast: 1.1. proovide kvalitatiivne analüüsimine, mille käigus selekteeritakse analüüsimiseks võetud proovide hulgast antibiootikume ja sulfoonamiide sisaldavad proovid; 1.2. selekteeritud proovide edasine analüüsimine (edaspidi penitsilliini määramine) kvalitatiivse analüüsi tulemuste kinnitamiseks või ebaselgete tulemuste kontrollimiseks, penitsilliini identifitseerimiseks ja selle sisalduse määramiseks. 2. Seadmed ja vahendid: 2.1. termostaat, mis võimaldab hoida temperatuuri 64±1 °C; 2.2. veevann, mis võimaldab hoida temperatuuri 64±1 °C; 2.3. veevann, mis võimaldab hoida temperatuuri 80±1 °C; 2.4. statiiv katseklaasidele või ampullidele; 2.5. pipett, ühekordsete 0,1 ml otsakutega; 2.6. tangid või pintsetid; 2.7. kuumaõhusterilisaator, mis võimaldab hoida temperatuuri 170…175 °C; 2.8. autoklaav, mis võimaldab hoida temperatuuri 121±1 °C; 2.9. pH-meeter; 2.10. proovipudelid korkidega, mis ei jäta pudelikaelale pidurdusainete jääke; 2.11. Petri tassid, läbipaistvast värvusetust klaasist või steriilsest plastmassist, ühtlase paksuse ja sileda põhjaga, sisediameetriga vähemalt 140 mm; 2.12. pudelid mahuga 150 ml; 2.13. pipetid, klaasist või steriilsest sünteetilisest materjalist, suletud vatitopiga, nominaalmahuga 1 ml ja 10 ml; 2.14. klaasist spaatlid; 2.15. katseklaasid või ampullid, sisediameetriga 8 mm, suletavad korgi või sulguriga; 2.16. paberist diskid, pidurdusainetevabad, diameetriga 9–13 mm, võimelised imama ligikaudu 130 mg piima, eelistatult säilitatakse eksikaatoris; 2.17. klaasist vahendid steriliseeritakse lisa 2 punktis 3 kirjeldatud viisil. 3. Söötmed ja lahused 3.1. Söötmete koostiskomponendid peavad sobima bakterioloogiliseks analüüsiks. Kasutatav vesi peab olema klaasaparatuuris destilleeritud või demineraliseeritud või vähemalt sama puhtusastmega. Vesi ei tohi sisaldada testorganismi kasvu pidurdavaid aineid. 3.2. Toiteagari koostis: pärmiekstrakt 2 g; peptoon 5 g; lihaekstrakt 1 g; naatriumkloriid (NaCl) 5 g; agar 10–15 g; vesi 1000 ml. Toiteagari valmistamiseks lahustatakse selle koostiskomponendid vees ning saadud lahus kuumutatakse aeg-ajalt segades keemiseni. Toiteagari pH reguleeritakse selliselt, et see oleks pärast steriliseerimist 7,4±0,1 mõõdetuna temperatuuril 25 °C. Katseklaasidesse villitakse 10 ml ja pudelitesse 100 ml toiteagarit ja söödet steriliseeritakse temperatuuril 121±1 °C 15 minutit. 3.3. Agarsöötme koostis: naatriumkloriid 2 g; agar 15 g; vesi 1000 ml; trimetoprimi- või tetroksoprimilahus 10 ml. Agarsöötme valmistamiseks lahustatakse selle koostisosad, välja arvatud trimetoprim või tetroksoprim, vees ning saadud lahus kuumutatakse aeg-ajalt segades keemiseni. Seejärel lisatakse lahusele trimetoprimi- või tetroksoprimilahus ja saadud segu steriliseeritakse temperatuuril 121±1 °C 15 minutit. Agarsöötme pH reguleeritakse selliselt, et see oleks pärast steriliseerimist 7,0±0,1, mõõdetuna temperatuuril 25 °C. 3.4. Trimetoprimi- või tetroksoprimilahuse koostis: trimetoprim 5 mg; või tetroksoprim 30 mg; etanool, 96% 5 ml/30 ml; vesi, kuni 1000 ml. Lahuse valmistamiseks lahustatakse trimetoprim või tetroksoprim 5 ml või 30 ml etanoolis ja lahuse maht viiakse destilleeritud veega kuni 1000 ml-ni. 3.5. pH-indikaatoriga toitelahuse koostis: pärmiekstrakt 0,75 ml; glükoos 5,0 mg; lahustuv tärklis 8,0 mg; broomkresoolpunane (pH-indikaator) 0,025 g; vesi, kuni 50 ml. pH-indikaatoriga toitelahuse valmistamiseks lahustatakse selle koostiskomponendid vees, vajadusel soojendatakse ning steriliseeritakse filtreerimisega. Lahuse valmistamiseks võib kasutada valmissöödet selle kasutusjuhendi kohaselt. 3.6. Pidurdusainete määramiseks kasutatava söötme koostis: pärmiekstrakt 2,5 g; trüptoon 5 g; glükoos 1 g; trimetoprimi- või tetroksoprimilahus 10 ml; agar (sõltuvalt selle geelistavatest omadustest) 10–15 g; vesi 1000 ml. Söötme tahked koostiskomponendid lahustatakse vees lahust samal ajal kuumutades ja segades. Seejärel lisatakse trimetoprimi- või tetroksoprimilahus. Pärast trimetoprimi- või tetroksoprimilahuse lisamist reguleeritakse söötme pH selliselt, et see oleks pärast steriliseerimist 8,0±0,1, mõõdetuna temperatuuril 25 °C. Söödet steriliseeritakse temperatuuril 121±1 °C 15 minutit. 4. Penitsilliini standardlahused 4.1. Kõik penitsilliinilahused valmistatakse analüüsi tegemise päeval. 4.2. Penitsilliinilahus kontsentratsiooniga 60 µg/ml (100 RÜ/ml) valmistatakse kristallilise naatrium- või kaaliumbensüülpenitsilliini lahustamisega steriilses destilleeritud vees. Lahus valmistatakse korgiga suletavasse steriilsesse pudelisse. 4.3. Penitsilliini töölahuse valmistamiseks võetakse 1,25 ml penitsilliinilahust ja viiakse lahuse maht steriilse destilleeritud veega kuni 1000 ml-ni. Selliselt valmistatud töölahus sisaldab 0,075 µg/ml (0,125 RÜ/ml) penitsilliini. 4.4. Pidurdusainete kvalitatiivseks uurimiseks valmistatakse 75 ml penitsilliini standardlahust kontsentratsiooniga 0,004 µg/ml (0,0067 RÜ/ml) 71 ml pidurdusainetevaba piima segamisel 4 ml penitsilliini töölahusega. 4.5. Pidurdusainete kvantitatiivseks määramiseks valmistatakse penitsilliini standardlahus pidurdusainetevabas piimas järgmistes kontsentratsioonides: 4.5.1. 0,004 µg/ml (0,0067 RÜ/ml); 4.5.2. 0,006 µg/ml (0,01 RÜ/ml); 4.5.3. 0,03 µg/ml (0,05 RÜ/ml); 4.5.4. 0,06 µg/ml (0,1 RÜ/ml). 5. Penitsillinaasilahus 5.1. Penitsillinaasilahus valmistatakse piisava hulga penitsillinaasi (betalaktamaasi) lahustamisega steriilses destilleeritud vees. Lahuse kontsentratsioon peab olema 1000 RÜ penitsillinaasi ühes milliliitris. Penitsillinaasilahuse võib jaotada väiksemateks osadeks ja säilitada temperatuuril 0…5 °C kuni neli nädalat. 5.2. Analüüsi tegemisel lähtutakse eeldusest, et 10 ühikut penitsillinaasi on piisav 0,6 µg (1 RÜ) penitsilliini inaktiveerimiseks. Tundmatu aktiivsusega penitsillinaasi puhul tuleb enne analüüsi tegemist kontrollida, kas eelnimetatud eeldus on täidetud. Vastasel juhul muudetakse penitsillinaasilahuse kontsentratsiooni. 5.3. Penitsillinaasilahuse asemel võib analüüsimiseks kasutada penitsillinaasiga immutatud diske, kui need sisaldavad sobival hulgal penitsillinaasi. 6. Pidurdusainetevaba kontrollpiim 6.1. Pidurdusainetevaba kontrollpiim valmistatakse 10 g lõssipulbri lahustamisega 100 ml steriilses destilleeritud vees. Enne kontrollpiima valmistamist kontrollitakse lõssipulbrit pidurdusainete sisalduse suhtes. 6.2. Lõssipulbri asemel võib kasutada pidurdusainete suhtes eelnevalt kontrollitud värsket piima. Piim valatakse pudelitesse ja kuumutatakse temperatuuril 100 °C ühe tunni vältel. Selliselt töödeldud kontrollpiima võib säilitada temperatuuril 0…6 °C kuni üks nädal. 7. Testorganism 7.1. Testorganismina kasutatakse Bacillus stearothermophilus var. calidolactis tüve ATCC 10149, mis on identne C 953-ga. 7.2. Testorganismi säilitamiseks valmistatakse säilekultuur, mida hoitakse toiteagari pinnal. Agari infitseerimiseks võetakse külviaasaga testkultuur ja viirutatakse sellega toiteagari pinda. Testkultuuri külve inkubeeritakse temperatuuril 63±1 °C 48 tundi. Pärast inkubeerimist suletakse katseklaasid steriilse kummikorgiga. Sellisel meetodil valmistatud säilekultuuri võib säilitada külmkapis temperatuuril 0…5 °C mitme kuu vältel. 8. Testkultuuri (edaspidi spooride suspensioon) valmistamine 8.1. 20 ml toiteagarit viiakse aseptiliselt steriilsele Petri tassile ning jahutatakse seejärel toatemperatuurini. 8.2. Steriilse pipetiga viiakse 5 ml steriilset destilleeritud vett säilekultuuriga katseklaasi ja spoorid suspendeeritakse steriilse aasaga agarilt vette. Spooride suspensiooni säilitatakse temperatuuril 0…5 °C ning seda võib kasutada 36 tunni vältel. 8.3. Steriilse pipetiga viiakse 0,5 ml spooride suspensiooni toiteagariga Petri tassile. Spooride suspensioon levitatakse klaaspulgaga ühtlaselt üle terve söötme pinna ning külve inkubeeritakse temperatuuril 63±1 °C 16–18 tundi. Kui kasutatakse säilekultuuri või kultuuri, mis on vanem kui 36 tundi, tehakse eelnevalt vähemalt kaks vahekultuuri, mille külvidevaheline intervall ei ületa 36 tundi. 8.4. Steriilse pipetiga viiakse 10 ml destilleeritud vett testkultuuri sisaldavale Petri tassile. Testkultuuri spoorid suspendeeritakse pinnalt vette klaaspulgaga. Spooride suspensioon valatakse pudelisse, mis sisaldab 250 ml steriilset vett. Pudel suletakse ja seda raputatakse korralikult. Kultuure, mida kohe ümber ei külvata, säilitatakse külmkapis temperatuuril 0…6 °C. 8.5. Spooride suspensioon peab sisaldama ühes milliliitris 5 kuni 10 miljonit elujõulist kolooniat inkubeerimise korral temperatuuril 63±1 °C 16–18 tundi. Spooride suspensioon peab olema hajutatud ühtlaselt. Kui spooride suspensioon sisaldab helbeid või setet, siis ei tohi seda analüüsil edaspidi kasutada. Uus spooride suspensioon valmistatakse säilekultuurist. II. PROOVIDE KVALITATIIVNE ANALÜÜSIMINE 9. Põhimõte Proov ja toitained lisatakse agargeelile, mis sisaldab pH-indikaatorit ja testorganismi Bacillus stearothermophilus var. calidolactis ATCC 10149 spoore. Testorganismil on kõrge tundlikkus antibiootikumide ja sulfoonamiidide, sealhulgas eriti penitsilliini suhtes. Tavalistes kasvutingimustes produtseerib testorganism hapet, mille toimel muutub pH-indikaatori värvus punakaslillast kollaseks. Kui piim sisaldab ühendeid, mis pidurdavad testorganismi kasvu, jääb pH-indikaatori värvus punakaslillaks. 10. Tundlikkus Meetod võimaldab määrata kvalitatiivselt antibiootikume ja sulfoonamiide toor- ja kuumtöödeldud piimas, kui nende sisaldus analüüsitavas proovis ületab järgmisi sisaldusi: Antibiootikumi või sulfoonamiidi nimetus Meetodi tundlikkus, antibiootikumide ja sulfoonamiidide sisaldus Ühik Kõik negatiivsed Kõik positiivsed Bensüülpenitsilliin RÜ/ml 0,002 0,006 Ampitsilliin µg/ml 0,002 0,005 Kloksatsilliin µg/ml 0,015 0,035 Nafitsilliin µg/ml 0,006 0,011 Tetratsükliin µg/ml 0,10 0,40 Oksütetratsükliin µg/ml 0,20 0,45 Kloortetratsükliin µg/ml 0,15 0,50 Klooramfenikool µg/ml 7 15 Dihüdrostrepromütsiin µg/ml 4 13 Neomütsiin µg/ml 1 22 Kanamütsiin µg/ml 9 28 Batsitratsiin RÜ/ml 0,06 0,14 Erütromütsiin µg/ml 1 2,25 Rifamütsiin µg/ml 0,01 0,14 Diafenüülsulfoon µg/ml 0,01 0,1 Sulfametasiin (sulfadimidiin) µg/ml 0,5 1 11. Määratlus Analüüsitav proov sisaldab antibiootikume või sulfoonamiide, kui söötme värvus jääb muutumatuks. 12. Katseklaaside või ampullide ettevalmistamine 12.1. Agarsööde sulatatakse ja jahutatakse temperatuurini 55 °C. 12.2. Pudelisse või katseklaasi lisatakse üks osa värsket spooride suspensiooni viie osa agarsöötme kohta. Seejärel segu segatakse korralikult. 0,3 ml inokuleeritud söödet kantakse steriilsesse katseklaasi või ampulli. Arvutuste kohaselt annab selline söötme hulk katseklaasi või ampulli 5 mm söötme kihi. Seejärel katseklaasid või ampullid suletakse korgiga, sulguriga või otsi kokku sulatades. Katseklaasid või ampullid jäetakse jahtuma püstiasendisse ja lastakse söötmel tarduda ning seejärel jäetakse seisma veel vähemalt 12 tunniks. 12.3. Katseklaase või ampulle võib kasutada samal päeval, kuid neid võib säilitada temperatuuril 0…6 °C mitmeid kuid tingimusel, et nad jahutatakse kohe pärast valmistamist. 13. Töö käik 13.1. Proove analüüsitakse nii kiiresti kui võimalik, soovitavalt alates proovi võtmisest 24 tunni jooksul. Proove säilitatakse enne analüüsimist temperatuuril 0…5 °C. Kui proove analüüsitakse hiljem kui 24 tunni jooksul, tuleb proove hoida penitsilliini inaktiveerumise vähendamiseks sügavkülmikus temperatuuril –30…–15 °C. 13.2. Analüüsiks vajalik arv katseklaase või ampulle märgistatakse loetavalt veekindla markeriga, neilt eemaldatakse sulgurid või korgid. Katseklaasid või ampullid asetatakse sobivasse statiivi. 13.3. Katseklaasi või ampulli lisatakse 50 µl pH-indikaatoriga toitelahust. 13.4. Piim segatakse enne analüüsi korralikult. 0,1 ml proovi pipeteeritakse mikropipetiga vastavalt märgistatud katseklaasi või ampulli. Iga uue proovi pipeteerimisel kasutatakse uut pipetiotsakut. Sama korratakse 0,04 µg/ml (0,0067 RÜ/ml) penitsilliini standardlahuse ja pidurdusainetevaba kontrollpiimaga. 13.5. Katseklaasid või ampullid suletakse ning pannakse statiivi, statiiv asetatakse veevanni temperatuurile 63±1 °C vähemalt 2 tunniks ja 30–45 minutiks. 13.6. Pärast inkubeerimist võetakse statiiv veest välja ja hinnatakse söötme värvuse muutust. 14. Tulemuste hindamine 14.1. Söötme punakasvioletne värvus mõne proovi või pidurdusainetevaba kontrollpiima katseklaasis või ampullis viitab antibiootikumide või sulfoonamiidide esinemisele sellises kontsentratsioonis, mis on esitatud punkti 10 tabeli lahtris «kõik positiivsed». Penitsilliini standardlahusega katseklaasid või ampullid peavad jääma punakasvioletseks, et tõestada söötme piisavat tundlikkust. 14.2. Söötme osaline või ebaühtlane punakasvioletne värvus mõne proovi või pidurdusainetevaba kontrollpiima katseklaasis või ampullis viitab, et uuritavas proovis jääb antibiootikumide või sulfoonamiidide kontsentratsioon punkti 10 tabeli lahtrites «kõik positiivsed» ja «kõik negatiivsed» esitatud kontsentratsioonide vahele. 14.3. Söötme kollane värvus proovi või pidurdusainetevaba kontrollpiima katseklaasides või ampullides näitab, et nendes proovides ei ole aineid, mis pidurdavad testorganismi kasvu. 14.4. Kui punakaslilla värvus esineb kõikides analüüsitud katseklaasides või ampullides ja ka negatiivsel pidurdusainetevabal kontrollpiimal, viitab see eluvõimeliste spooride puudumisele söötmes ning kõik proovid tuleb uuesti analüüsida värskelt valmistatud testmaterjaliga. 15. Tulemuste kinnitamine 15.1. Tulemuste kinnitamiseks kontrollitakse kõik positiivsed proovid üle käesoleva lisa 3. peatükis kirjeldatud penitsilliini määramise meetodiga. 15.2. Kui proove ei analüüsita kohe, säilitatakse neid antibiootikumide degradatsiooni vältimiseks sügavkülmutatult. III. PENITSILLIINI MÄÄRAMINE 16. Põhimõte 16.1. Uuritava piimaga immutatud absorbeeriv disk asetatakse Bacillus stearothermophilus var calidolactis’ega külvatud agarsöötme pinnale. Testorganismi normaalse kasvu tulemusena muutub agar häguseks. Kui piimas on aineid, mis pidurdavad testorganismi kasvu, moodustuvad diski ümber selged tsoonid. Selge tsooni suurus sõltub eelkõige piimas sisalduva pidurdusaine liigist ja kontsentratsioonist. 16.2. Proov, mis andis eelnevalt kirjeldatud kvalitatiivse meetodiga positiivse või ebaselge tulemuse, identifitseeritakse selle meetodiga kui penitsilliin. 17. Tundlikkus Penitsilliini määramise meetodi tundlikkus on sama mis kvalitatiivse analüüsi puhul. 18. Määratlus 18.1. Proov sisaldab antibiootikume ja sulfoonamiide, kui kirjeldatud analüüsi käigus moodustuvad diski ümber vähemalt 2 mm selged pidurdustsoonid. 18.2. Kui proov, mis sisaldab antibiootikume ja sulfoonamiide ning millele on lisatud penitsillinaasi (betalaktamaase), ei anna diski ümber selget pidurdustsooni või moodustunud pidurdustsoon on väiksem kui ilma penitsillinaasita proovides, siis on uuritavas proovis pidurdusaineteks kas penitsilliin või penitsilliin ja mõni muu antibiootikum või sulfoonamiid. 18.3. Kui tsoon penitsillinaasi toimes ei inaktiveeru, siis proovis leiduv pidurdusaine ei ole penitsilliin, vaid mõni muu saasteaine. 18.4. Osa poolsünteetilisi penitsilliine, näiteks kloksatsilliin, ei inaktiveeru, inaktiveeruvad osaliselt või on täielikult resistentsed penitsillinaasi suhtes ning seetõttu ei saa neid selle meetodi järgi penitsilliinina identifitseerida. 19. Petri tasside ettevalmistamine 19.1. Pidurdusainete määramiseks kasutatav sööde sulatatakse ja jahutatakse temperatuurini 55 °C. 19.2. Pidurdusainete määramiseks lisatakse üks osa värskelt valmistatud spooride suspensiooni pudelisse nii mitmele söötmeosale, mis annavad sobiva kolooniate tiheduse inokuleeritud söötmel. Seejärel segatakse pudeli sisu korralikult. 19.3. Steriilsele Petri tassile kantakse kuni temperatuurini 55 °C kuumutatud inokuleeritud söödet. Petri tassile peab moodustuma 0,6–0,8 mm paksune kiht. Petri tassile sisediameetriga 140 mm kulub ligikaudu 15 ml söödet. 19.4. Petri tassid asetatakse jahedale puhtale horisontaalsele pinnale. Pinna horisontaalsust kontrollitakse loodiga. Petri tassidelt eemaldatakse kaaned ja lastakse agarsöötmel tarduda. Kui sööde on tardunud, pannakse kaaned Petri tassidele ning pööratakse Petri tassid ümber, et vähendada kondensaadi teket söötme pinnale. 19.5. Selliselt ettevalmistatud Petri tasse kasutatakse samal päeval, kuid neid võib hoida kuni kaks nädalat kinnises polüetüleenkotis temperatuuril kuni 5 °C. Petri tassid tuleb paigutada kottidesse ja külmkappi kohe pärast tasside ettevalmistamist. 19.6. Proovide identifitseerimiseks tuleb Petri tassi põhjad märgistada. 20. Proovi analüüsimiseks ettevalmistamine 20.1. Proove kuumutatakse temperatuuril 80±1 °C 10 minuti vältel, et inaktiveerida termolabiilsete mittespetsiifiliste pidurdusainete toime. 20.2. Kuumutatud proovid segatakse korralikult. 10 ml proovi kantakse sobilikku steriilsesse laia kaelaga pudelisse. Seejärel lisatakse pudelisse ligikaudu 0,4 ml penitsillinaasilahust ja segatakse korralikult. 21. Töö käik 21.1. Puhta kuiva pintseti abil kastetakse disk proovi. Piima ülejääk eemaldatakse diskilt seda õrnalt vastu proovipudeli seina koputades. Disk asetatakse Petri tassi ja surutakse pintsetiga õrnalt vastu söödet. 21.2. Erinevate proovide diskid peavad paiknema vähemalt 20 mm kaugusel üksteisest ning vähemalt 10 mm kaugusel Petri tassi servast. 21.3. Meetodi tundlikkuse kontrollimiseks kastetakse diskid penitsilliini standardlahusesse. Need diskid paigutatakse korrapäratult proovide diskide vahele ning nende arv peab moodustama vähemalt 2% proovide diskide arvust. Igal analüüsil kasutatakse vähemalt viit standardset diski. 21.4. Kui kõik diskid on asetatud korrapäratult söötmele ja identifitseerimiseks märgistatud, pööratakse Petri tassid ümber ja inkubeeritakse temperatuuril 63±1 °C kaks ja pool kuni viis tundi. 21.5. Pärast inkubeerimist uuritakse sobiva valgusallika abil plaatidel paberdiskide ümber selgete pidurdustsoonide olemasolu. Selged pidurdustsoonid mõõdetakse. 21.6. Penitsilliini standardlahuses immutatud diskide ümber peab olema vähemalt 2 mm selge pidurdustsoon. 21.7. Kui proovide diskide ümber moodustuvad penitsilliini standardlahusega võrreldes sama suured või suuremad selged tsoonid, viitavad need pidurdusainete esinemisele uuritavas proovis. 22. Pidurdusainete identifitseerimine ja nende hulga määramine 22.1. Alapunktis 21.1 kirjeldatud tegevust korratakse kuumutatud ja penitsillinaasiga töödeldud prooviga (edaspidi penitsillinaasi kontrollproov). 10 ml penitsillinaasi lisamise asemel võib kasutada penitsillinaasiga immutatud diske, mis kastetakse proovi ning asetatakse seejärel Petri tassile. Sama korratakse penitsilliini standardlahustega. 22.2. Proovidel, penitsillinaasi kontrollproovidel ja penitsilliini standardlahustel määratakse keskmine pidurdustsoonide diameeter. 22.3. Kui penitsillinaasiga immutatud diski ümber ei ole selget pidurdustsooni, kuid proovi ümber on selge pidurdustsoon, mis on võrdne või suurem 0,004 µg/ml penitsilliinisisaldusega standardlahuse diski ümber oleva tsooniga, sisaldab uuritav proov vähemalt 0,004 µg/ml naatrium- või kaaliumbensüülpenitsilliini. 22.4. Kui penitsillinaasiga immutatud diski ümber olev selge pidurdustsooni keskmine diameeter on võrdne proovi diski ümber oleva selge tsooni keskmise diameetriga, sisaldab piim pidurdusaineid, mida ei ole võimalik analüüsi käigus kasutatavate penitsillinaasi kontsentratsioonidega inaktiveerida. 22.5. Kui penitsillinaasiga immutatud diski ümber olev selge pidurdustsooni keskmine diameeter on väiksem kui kuumutatud proovi diski ümber oleva selge tsooni keskmine diameeter, sisaldab see proov penitsilliini koos teiste antibiootikumide ja sulfoonamiidega, välja arvatud penitsilliini või poolsünteetilist penitsilliini, mida ei saa määrata selles meetodis kasutatavate penitsillinaasi kontsentratsioonide puhul. 22.6. Sünteetilisi penitsilliine, näiteks naatriumkloksatsilliini, ei saa kirjeldatud analüüsitingimustel penitsillinaasiga inaktiveerida ning seda ei määratleta seetõttu penitsilliinina, vaid muu pidurdusainena. Nende täpsemaks identifitseerimiseks kasutatakse mõnda teist sobivat meetodit. 23. Penitsilliinisisalduse määramine 23.1. Penitsilliinisisaldust saab määrata standardkõvera joonestamisega või sisalduse arvutamisega penitsilliini standardlahuste selgete pidurdustsoonide diameetrite põhjal. 23.2. Penitsilliini kontsentratsiooni kümnendlogaritmi (log 10) ja pidurdustsoonide diameetri vahel on lineaarne korrelatsioon, mida saab väljendada standardkõverana, kusjuures penitsilliini kontsentratsioonid kantakse logaritmilisele ordinaatteljele ja pidurdustsoonid abstsissteljele. Pidurdustsoonidena käsitatakse dubleeritud analüüside keskväärtusi. Pidurdustsoonide keskmised diameetrid kantakse graafikule penitsilliini standardkontsentratsioonide järgi ning joonestatakse standardkõver. Pidurdustsoonide keskmiste diameetrite ja penitsilliini kontsentratsioonide järgi joonestatakse standardgraafik. 23.3. Penitsilliini kontsentratsiooni proovides arvutatakse pidurdustsoonide diameetrite põhjal, kasutades valemit või standardkõverat. Pidurdustsoonide raadiused peavad olema diski raadiusest vähemalt kaks korda suuremad ning kõige rohkem viis korda suuremad. 24. Tulemuste esitamine Tulemused väljendatakse penitsilliinisisaldusena, mis võrdub või ületab 0,004 µg/ml, või viidates määratud kontsentratsioonile või teiste pidurdusainete sisaldustena. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 4 KÜLMUMISTÄPI MÄÄRAMISE MEETOD 1. Kasutusala 1.1. Meetod võimaldab määrata toorpiima, pastöriseeritud, kõrgkuumutatud (UHT) ja steriliseeritud piima, väherasvase ja rasvata piima külmumistäppi seadmega (edaspidi termistorkrüoskoop ), milles termostaatiliselt kontrollitud vanni jahutatakse elektrilise külmutusseadmega ning milles elavhõbetermomeetrit asendab termistor (pooljuhttakistustermomeeter). 1.2. Külmumistäpi määramiseks kasutatakse seadmeid, millega on võimalik määrata külmumistäpp külmumiskõvera platool. Seadmeid, mis fikseerivad näidu kindla ajavahemiku järel, alates proovi külmumise algusest, võib kasutada üksnes seire käigus võetud proovide analüüsimiseks. 1.3. Külmumistäppi võib kasutada piimale lisatud vee määramiseks, kui proov sisaldab piimhapet kuni 0,18 g/100 ml piima kohta. 2. Määratlus 2.1. Piima külmumistäpp on näitaja, mille väärtus mõõdetakse käesolevas lisas kirjeldatud meetodi järgi ja väljendatakse Celsiuse kraadides (°C). 2.2. Külmumiskõvera platoo on see osa kõverast, millel proovi temperatuur jääb ±0,002 °C ulatuses konstantseks vähemalt 20 sekundi vältel. 3. Põhimõte 3.1. Analüüsitav proov ülekülmutatakse sobivale temperatuurile ja kristallisatsioon kutsutakse esile mehaanilise vibratsiooniga, mis põhjustab temperatuuri kiire tõusu proovi külmumistäpile vastavale platoole. 3.2. Termistorkrüoskoop kalibreeritakse nii, et prooviga samadel tingimustel ja sama analüüsi käiku kasutades saadakse täpne näit kahe standardlahuse jaoks. Sellisel juhul annab platoo piima külmumistäpi väljendatuna Celsiuse kraadides (°C). 4. Termistorkrüoskoobi ehitus ja tööpõhimõte 4.1. Termistorkrüoskoop koosneb vooluvõrku ühendatud termostaatiliselt kontrollitavast jahutusvannist, termistorist ja galvanomeetrist või näidikust, proovi segistist ja külmumist algatavast seadmest koos katseklaasiga. Termistorkrüoskoobi ehituse näidis on toodud lisas 13. 4.2. Jahutamiseks kasutatakse kahte tüüpi jahutusvanne: 4.2.1. immersioonivann, mis on hästi isoleeritud ja sisaldab sobivat jahutusvedelikku, mida segatakse nii, et temperatuuride erinevus vedeliku kahes punktis ei ületa 0,2 °C. Vedeliku temperatuur ei tohi kõikuda üle ±0,5 °C seadme valmistaja etteantud nimiväärtusest. Jahutusvannis hoitakse vedelikunivoo püsival tasemel, kusjuures katseklaasi ruumalamärgisest allapoole jääv osa peab asetsema täielikult jahutusvedelikus; 4.2.2. tsirkulatsioonivann, kus katseklaasi ümber tsirkuleerib sobiva jahutusvedeliku pidev vool. Vedeliku temperatuur ei tohi kõikuda üle ±0,5 °C seadme valmistaja antud nimiväärtusest. Jahutusvedelikuks sobib 33% (v/v) 1,2-etaandiooli (etüleenglükooli) vesilahus. 4.3. Termistor peab olema klaasist sondi tüüpi, läbimõõduga kuni 1,80±0,2 mm ja juhtme läbimõõduga kuni 0,31 mm. Termistori ajakonstant peab olema väiksem kui 2 sekundit ja β väärtus peab olema üle 3000. β on konstant, mis sõltub termistori materjalist ja näitab termistori takistuse sõltuvust temperatuurist järgmise valemi kohaselt

kus T on temperatuur Kelvini järgi, R on takistus oomides temperatuuril T,

on temperatuurikoefitsient. Elektrivoolu tööpinge, voolutugevuse ja energia hajumise konstandid peavad olema sellised, et töötamisel ümbritseva keskkonna temperatuuril –0,512 °C ei tõuseks termistori temperatuur sellega võrreldes rohkem kui 0,0005 °C. Takisti maksimaalne kõrvalekalle võib olla ±5%. Kui termistor on termistorkrüoskoobis tööasendis, peab klaaskuulikese tipp asuma katseklaasi teljega samal joonel, katseklaasi äärest 44,6 ±0,1 mm allpool. Seadmel on kaasas püsimall, mis võimaldab kasutajal termistori õigesse asendisse seada. 4.4. Termistorkrüoskoobiga mõõdetakse ja tulemit loetakse järgmiselt: 4.4.1. käsikasutuse korral tasakaalustatakse termistori takistus Wheatstone’i silla või muu sarnase seadme abil, kasutades kõrge kvaliteediga püsitakisteid, mille kõrvalekalle on kuni ±10% ja mille temperatuurikoefitsiendi väärtus on kuni 2×10–5 °C. Muutuv ehk tasakaalustav takisti võib kogu mõõteskaala ulatuses lineaarsusest kõrvale kalduda kuni 0,3% oma maksimaalväärtusest. Seadmega peavad olema kaasas kalibreerimiseks vajalikud takistite reguleerimisvahendid. Mõõteskaala peab olema gradueeritud kuni 0,001 °C intervalliga. 4.4.2. automaatkasutuse korral peab näidik tagama temperatuurivahemikus 0…1 °C väärtuste eristamise vähemalt 0,001 °C täpsusega. Näidiku ja selle vooluahela stabiilsus peab olema selline, et sama temperatuuri järjestikused näidud ei erine üle 0,001 °C. Vooluahela lineaarsus peab olema selline, et seadme normaalse töö korral on suurim viga ±0,001 °C mis tahes punktis vahemikus –0,400…–0,600 °C. 4.5. Proovi segamiseks kasutatakse piima suhtes inertsest materjalist valmistatud metallvarrast, mille läbimõõt on 1–5 mm. Segamisvarras on reguleeritava amplituudiga ja seatakse vertikaalselt, nii et varda alumine ots on samal tasandil termistori otsaga. Lubatud kõrvalekalle sellest asendist on kuni 1,5 mm. Mõõtmise kestel ühesuguse temperatuuri tagamiseks peab segamisvarras võnkuma küljelt küljele vähemalt ±1,5 mm vastavalt seadme valmistaja juhendile. Segamise käigus ei tohi varras ühelgi ajahetkel puutuda vastu termistori mõõtepead ega katseklaasi seina. 4.6. Külmumist algatav seade peab käivitamise korral kohe algatama proovi külmumise külmumistäpi suunas. Selleks võib kasutada segamisvarrast. Võimalikuks meetodiks on suurendada võnkumise amplituudi üheks või kaheks sekundiks nii, et segamisvarras puutub vastu katseklaasi seina. 4.7. Katseklaas peab olema järgmiste mõõtudega: 4.7.1. kõrgus 50,8±0,1 mm; 4.7.2. välimine diameeter 16,0±0,1 mm; 4.7.3. sisemine diameeter 13,5±0,1 mm; 4.7.4. seina paksus ei tohi kogu nõu ulatuses erineda üle 0,1 mm. 4.8. Katseklaasil peab olema mõõtjoon, mis paikneb ülemisest servast 29,8 mm allpool (21 mm ülevalpool nõu põhja) ja märgib proovi ruumala 2,5±0,1 ml. 4.9. Elektrivoolu pinge peab olema stabiliseeritud aparaadi sees või väljaspool aparaati selliselt, et elektri kõikumine ei ületa ±1% nominaalväärtusest, kui võrgupinge kõigub ±6%. 5. Muud seadmed ja vahendid: 5.1. mõõtekolvid, 1000 ml, klass A; 5.2. eksikaator; 5.3. kuivatuskapp, hästi ventileeritav, mis võimaldab hoida temperatuuri 130±1 °C juures; või ventileeritav elektriahi, mis võimaldab hoida temperatuuri 300±25 °C juures. 6. Reagendid 6.1. Borosilikaatklaasist aparatuuris destilleeritud vesi, mida keedetakse ja jahutatakse süsinikdioksiidi siduva toruga varustatud kolvis temperatuurini 20±2 °C. 6.2. Naatriumkloriid, mis on analüütilise reagendi kvaliteediga, peenelt jahvatatud, kuivatatud elektriahjus 3 tundi temperatuuril 300±25 °C või kuivatuskapis temperatuuril 130±1 °C juures vähemalt 24 tundi ning seejärel jahutatud eksikaatoris toatemperatuurini. 6.3. Naatriumkloriidi standardlahuste (edaspidi standardlahused ) valmistamiseks kaalutakse tabelis 1 nimetatud kogus kuiva naatriumkloriidi kaaluklaasi ja lahustatakse alapunkti 6.1 järgi valmistatud destilleeritud vees. Soolalahus kantakse kvantitatiivselt üle 1000 ml mõõtekolbi ja lahjendatakse 20±2 °C veega kuni mõõtjooneni. Standardlahuseid säilitatakse hästi suletavates kuni 250 ml polüetüleenpudelites temperatuuril ligikaudu 5 °C kuni kaks kuud. Enne standardlahuse kasutamist pööratakse pudelit sisu piisavaks segamiseks ettevaatlikult mitu korda ümber. Lahust ei tohi segada nii intensiivselt, et see tõmbaks endasse õhku. Pipeteerimisel tuleb standardlahused välja valada kuiva puhtasse nõusse. Säilitamisnõust ei tohi lahust pipetiga võtta. Pudeleid, millesse on jäänud standardlahust vähem kui veerand nõu ruumalast või mis on vanemad kui kaks kuud või ei ole konserveeritud selleks sobiva fungitsiidiga, näiteks tiomersaalilahusega 10 g/l, ei tohi kasutada. Tabel 1. 20°C juures valmistatud naatriumkloriidi standardlahuste külmumistäpid NaCl, g/l °C 6,859 –0,408 7,818 –0,464 8,149 –0,483 8,314 –0,492 8,480 –0,502 8,646 –0,512 8,811 –0,521 8,977 –0,531 9,143 –0,541 10,155 –0,600 7. Termistorkrüoskoobi kalibreerimine 7.1. Termistorkrüoskoop tuleb paigutada nii, et ümbritseva õhu temperatuur ei erineks üle 1 °C seadme kalibreerimistingimustest. Termistorkrüoskoopi ei tohi hoida otseses päikesevalguses ega tuuletõmbuses ja toatemperatuuril üle 26…27 °C. 7.2. Termistorkrüoskoop seatakse töökorda ja lülitatakse sisse enne kalibreerimist kooskõlas seadme tööjuhendis toodud nõuetega. Enne termistorkrüoskoobi kasutamist kontrollitakse termistori asendit, segamisvarda võnkumise amplituudi ja jahutusvedeliku temperatuuri. 7.3. Kalibreerimiseks valitakse tabelist 1 kaks standardlahust, mille temperatuurid on lähedased proovide eeldatavale külmumistäpile. Eelistatakse lahuseid, mille külmumistäppide erinevus on suurem kui -0,100 °C. Kui kasutatava termistorkrüoskoobi termistoriga seotud vooluring on konstrueeritud selliselt, et seda tasakaalustatakse kindla, seadme mõõtmispiirkonda jääva külmumistäpi väärtuse juures, võib lihtsustatud korras standardlahusena kasutada seadme valmistaja määratud külmumistäpiga standardlahust. 7.4. Termistorkrüoskoobi kalibreerimiseks pipeteeritakse 2,5±0,1 ml lahust puhtasse kuiva katseklaasi ja alustatakse mõõtmist termistorkrüoskoobiga. Kalibreerimisel kasutatavad katseklaasid peavad olema valmistatud samast klaasist ja pestud ning loputatud demineraliseeritud veega koos piima analüüsimiseks kasutatavate katseklaasidega. Standardlahuste ja proovide temperatuurid peavad olema ligilähedased. 7.5. Kalibreerimisseadeldisi reguleeritakse seadme kasutusjuhendi kohaselt, kuni termistorkrüoskoobi näit võrdsustub standardlahuse külmumistäpiga. Seejärel korratakse protseduuri teise standardlahusega. Sel viisil jätkatakse kalibreerimist järgmiste standardlahustega, kuni termistorkrüoskoobi näit kalibreerimisseadeldist reguleerimata vastab järjestikku mõõdetud standardlahuste külmumistäpile. Seejärel on termistorkrüoskoop kasutamiseks valmis ja näitab proovi külmumistäppi ilma korrigeerimist rakendamata. 8. Proovide analüüsimiseks ettevalmistamine 8.1. Proove säilitatakse vajadusel temperatuuril 0…5 °C. 8.2. Proovidest eemaldatakse kõik nähtavad võõrkehad või tahke piimarasva tükikesed, vajadusel filtreeritakse proov kuiva puhtasse nõusse ja segatakse ettevaatlikult. Kasutatav filter peab olema piima suhtes inertne ja toimima toatemperatuuril. 8.3. Piima analüüsitakse säilitamistemperatuuril 0…5 °C või lastakse piimal vahetult enne analüüsimise algust toatemperatuurini soojeneda. Kasutatavad standardlahused peavad olema prooviga samal temperatuuril. 8.4. Külmumistäpiga samaaegselt määratakse piima tiitritav happesus. Proove, mille happesus on suurem kui 0,18 g piimhapet 100 ml piima kohta, selle meetodi järgi ei analüüsita. 8.5. Kõrgkuumutatud (UHT) ja steriliseeritud piim peavad enne analüüsi algust seisma avatud nõus vähemalt 20 minutit. 9. Töö käik 9.1. Termistorkrüoskoobi eelkontrolliks veendutakse, et jahutusvedeliku nivoo ja temperatuur vastavad seadme valmistaja etteantud näitudele ja termistori mõõtepea asub õiges tühja katseklaasiga katseklaasiavas. Termistorkrüoskoop lülitatakse sisse ja kontrollitakse, et jahutusvedelik oleks korralikult segatud või tsirkuleeritud. Seadme valmistaja etteantud aja möödudes kontrollitakse jahutusvedeliku temperatuuri, segamisvarda asendit ja võnkumise amplituudi. 9.2. Kalibreerimise kontrolliks mõõdetakse enne iga analüüsimise alustamist naatriumkloriidi standardlahuse külmumistäppi seni, kuni kahe järjestikuse mõõtmise erinevus ei ole suurem kui 0,001 °C. Kui nende väärtuste keskmine erineb standardlahuse külmumistäpist rohkem kui 0,002 °C, kalibreeritakse termistorkrüoskoop uuesti punktis 7 sätestatud korras. Termistorkrüoskoobi pideval kasutamisel viiakse kalibreerimiskontroll läbi vähemalt üks kord tunnis. Kalibreerimiskontrollil lähtutakse seadme valmistaja juhendist. 9.3. Piima külmumistäpi määramiseks pööratakse katseklaasi korduvalt ümber ja segatakse õrnalt, et segu ühtlustuks. Proovi ei tohi segada nii intensiivselt, et see endasse õhku tõmbab. 2,5 ml±0,1 ml piima pipeteeritakse puhtasse kuiva katseklaasi ja üleliigne kogus eemaldatakse pipetiga. Termistor ja segamisvarras peavad olema puhtad ja kuivad, vajadusel pühitakse neid suunaga alt üles pehme puhta mittepudeneva lapiga. Katseklaas paigutatakse kalibreeritud termistorkrüoskoopi. Piima jahutatakse ja külmutamist alustatakse valmistaja määratud temperatuuril 0,1 °C täpsusega. Kui külmumine algas enne või pärast ettenähtud temperatuurivahemikku, katkestatakse analüüs ja seda korratakse sama piima uue kogusega. Juhul kui ka teine proov külmub enne ettenähtud temperatuuri, võetakse veel üks proov, soojendatakse seda 45 °C ja hoitakse 5 minutit sellel temperatuuril, et kristalne rasv sulaks. Seejärel jahutatakse piim katsetemperatuurini ja analüüsitakse kohe uuesti. Pärast külmumise algust tõuseb piima temperatuur kiiresti väärtuseni, mis jääb enne taaslangemist mõneks ajaks peaaegu muutumatuks. Külmumistäpp vastab sel perioodil saavutatud kõrgeimale temperatuurile ning see näit märgitakse üles. Kui mõõtmine on lõppenud, eemaldatakse katseklaas, loputatakse termistor ja segamisvarras veega ning kuivatatakse, pühkides altpoolt üles pehme puhta mittepudeneva lapiga. Seejärel tehakse paralleelkatse sama proovi ülejäänud kogusest. Kui erinevus saadud külmumistäppide vahel on suurem kui lubatud korduvus, siis tehakse korduskatse sama proovi uue kogusega. Kui kaks mõõtetulemust langevad 0,004 °C täpsusega kokku, võib neid väärtusi kasutada lõpptulemuse arvutamisel. 9.4. Automaatseadmete puhul on temperatuurinäitu võimalik lugeda digitaalnäidikult; käsiinstrumentide puhul saadakse sobiv täpsus jälgides, et külmutamine algaks, kui galvanomeetri osuti või visiirjoon on vastava näiduga kohakuti. Aeg, mille jooksul proovi temperatuur jääb konstantseks, samuti ajaline intervall külmumise alguse ja kõrgeima temperatuurinäidu saavutamise vahel on igal proovil erinev. Vee ja naatriumkloriidi standardlahuste puhul on see tunduvalt lühem kui piima puhul. Üles märgitakse kõrgeim temperatuurinäit. 9.5. Termistori jahutamiseks paigutatakse tühi katseklaas pärast seadme kasutamist katseklaasiavasse ning mõõtepea lastakse alla, et hoida termistori jahedana. Kui see ei ole termistorkrüoskoobi ehituse tõttu võimalik, veendutakse selles, et termistor on enne mõõtmise alustamist piisavalt jahutatud, tehes kontrollanalüüse kuni püsiva tulemuse saamiseni. 10. Tulemuste esitamine 10.1. Kui kalibreerimiskontroll kinnitab varasema kalibreerimise kehtivust, kasutatakse tulemusena kahe vastuvõetava külmumistäpi keskväärtust, mis ümardatakse kolmanda komakohani. Kui kahe vastuvõetava külmumistäpi väärtuse summa on paaritu arv, siis tuleb keskmine ümardada lähima paarisarvuni, nagu on näidatud tabelis 2. Tabel 2. Külmumistäpp (°C) Duplikaatväärtused Keskväärtus –0,544 –0,545 –0,544 –0,545 –0,546 –0,546 10.2. Meetodi korduvus (r) on 0,004 °C ja korratavus (R) 0,006 °C. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 5 MIKROORGANISMIDE ARVU MÄÄRAMINE TASSIMEETODIL TEMPERATUURIL 30 °C 1. Kasutusala Meetod võimaldab määrata mikroorganismide arvu kolooniate loendamisega temperatuuril 30 °C. Meetodit kohaldatakse toor-, pastöriseeritud, kõrgkuumutatud (UHT) ja steriliseeritud piimale. Kõrgkuumutatud ja steriliseeritud piima säilitatakse enne analüüsimist temperatuuril 30 °C 15 ööpäeva. 2. Määratlus Mikroorganism selle lisa tähenduses on organism, mis moodustab meetodis kirjeldatud tingimuste ja aeroobse kultiveerimise korral loendatavaid kolooniad. 3. Põhimõte Kindel kogus proovi segatakse söötmega Petri tassides ja seda inkubeeritakse temperatuuril 30 °C 72 tundi. Kolooniad loendatakse ja tassil kasvanud kolooniate arvu järgi arvutatakse mikroorganismide arv ühes milliliitris toor- või pastöriseeritud piimas või 0,1 milliliitris kõrgkuumutatud (UHT) või steriliseeritud piimas. 4. Seadmed ja vahendid: 4.1. kuumaõhusterilisaator, mis võimaldab hoida temperatuuri 170…175 °C; 4.2. autoklaav, mis võimaldab hoida temperatuuri 121±1 °C; 4.3. termostaat, mis võimaldab hoida temperatuuri 30±1 °C termostaadi kõikides punktides; 4.4. temperatuuri kompensatsiooniga pH-meeter mõõtmistäpsusega ±0,1 pH ühikut; 4.5. veevann, mis võimaldab hoida temperatuuri 45±1 °C; 4.6. luup suurendusega 2–4 korda; 4.7. luup suurendusega 8–10 korda; 4.8. koloonialoendaja; 4.9. segisti, mis võimaldab segada 1 ml proovi või selle kümnekordset lahjendust 9 ml lahjendusvedelikuga ja tagab katseklaasi sisu ekstsentrilise segamise; 4.10. katseklaasid, korkide ja vajaliku mahu ning jääkruumiga esimese 10 ml lahjenduse või edasiste lahjenduste segamiseks; 4.11. kolvid mahuga 150–250 ml või katseklaasid mahuga 20 ml söötme hoidmiseks; 4.12. pipetid, klaasist või steriilsest sünteetilisest materjalist, purunemata otsakuga ja suletud vatitopiga, nominaalmahuga 1 ml ja väljalaskeava läbimõõduga 1,75–3 mm; 4.13. Petri tassid, läbipaistvast värvusetust klaasist või steriilsest plastmassist, ühtlase paksuse ja sileda põhjaga, sisediameetriga 90–100 mm ja vähemalt 10 mm sisemise sügavusega; 4.14. klaasist vahendid steriliseeritakse lisa 2 punktis 3 kirjeldatud viisil. 5. Sööde ja lahjendusvedelik 5.1. Mikroorganismide loendamiseks kasutatava agarsöötme koostis: pärmiekstrakt 2,5 g; trüptoon 5,0 g; glükoos D(+) või dekstroos 1,0 g; lõssipulber 1,0 g; agar (sõltuvalt agari geelistavatest omadustest) 10–15 g; vesi 1000 ml. Lõssipulber ei tohi sisaldada pidurdusainete jääke. Seda kontrollitakse eelnevalt testiga, milles võrdlusmaterjaliks on teadaolevalt pidurdusainetevaba lõssipulber. Söötme tahked koostisosad suspendeeritakse ja lahustatakse vees järgmises järjekorras: pärmiekstrakt, trüptoon, glükoos ja seejärel lõssipulber. Lahustumise kiirendamiseks võib suspensiooni soojendada. Seejärel lisatakse segule agar ja segu kuumutatakse pidevalt segades keemiseni või hoitakse aurus umbes 30 minutit, kuni agar on täielikult lahustunud. Vajadusel filtreeritakse sööde läbi filterpaberi. Söötme pH reguleeritakse selliselt, et see pärast steriliseerimist oleks 6,9±0,1, mõõdetuna temperatuuril 25 °C. Söötme pH reguleerimiseks kasutatakse naatriumhüdroksiidilahust või soolhappelahust kontsentratsiooniga vähemalt 0,1 mooli/l. Sööde koguses 100–150 ml villitakse kolbidesse ja koguses 12–15 ml katseklaasidesse. Kolvid ja katseklaasid suletakse korgiga ja steriliseeritakse autoklaavis temperatuuril 121±1 °C 15 minutit. Pärast autoklaavimist kontrollitakse söötme pH-d. Kui söödet ei kasutata kohe, säilitatakse seda pimedas temperatuuril 1…5 °C kuni üks kuu. Söötme valmistamiseks võib kasutada valmissöödet selle kasutusjuhendi kohaselt. Kui valmissööde ei sisalda lõssipulbrit, lisatakse lõssipulber enne valmissöötme lahustamist vees. 5.2. Peptooni-keedusoolalahuse koostis: peptoon 1,0 g; naatriumkloriid (NaCl) 8,5 g; vesi 1000 ml. Lahuse koostisosad lahustatakse vees, lahust vajadusel soojendades. Lahuse pH reguleeritakse selliselt, et see pärast steriliseerimist on 7,0±0,1, mõõdetuna temperatuuril 25 °C. Lahuse pH reguleerimiseks kasutatakse naatriumhüdroksiidilahust või soolhappelahust kontsentratsiooniga vähemalt 0,1 mooli/l. Seejärel villitakse lahus katseklaasidesse arvestusega, et pärast steriliseerimist on igas katseklaasis 9,0±0,2 ml lahjendusvedelikku. Katseklaasid suletakse korgiga ja neid steriliseeritakse autoklaavis temperatuuril 121±1 °C 15 minutit. Pärast steriliseerimist kontrollitakse lahjendusvedeliku pH-d. Kui lahjendusvedelikku ei kasutata kohe, säilitatakse seda pimedas temperatuuril 1…5 °C kuni üks kuu. Lahjendusvedeliku valmistamiseks võib kasutada kuivi pulbreid või tablette nende kasutusjuhendite kohaselt. 6. Töö käik 6.1. Prooviks vajalik agarsöötme kogus soojendatakse kiiresti ja söötme temperatuur reguleeritakse veevannil 45±1 °C. 6.2. Proov segatakse korralikult, et tagada mikroorganismide ühtlane jaotumine uuritavas proovis. Segamiseks pööratakse proovinõud 25 korda kiiresti ümber. Segamise käigus tuleb vältida vahu teket või hiljem oodata, kuni vaht kaob. Ajavahemik proovi segamise ja analüüsiks vajaliku proovikoguse eraldamise vahel võib olla kuni kolm minutit. 6.3. Toor- või pastöriseeritud piima proovist esimese kümnekordse lahjenduse (10–1) valmistamiseks pipeteeritakse 1 ml uuritavat proovi steriilse pipetiga 9 ml lahjendusvedelikku nii, et pipett ei puutu kokku lahjendusvedelikuga. Lahjendusvedeliku ja proovi temperatuurid peavad olema ligilähedased. Saadud lahust segatakse segistiga hoolikalt 5–10 sekundi vältel. 6.4. Toor- või pastöriseeritud piima proovist järgmise kümnekordse lahjenduse valmistamiseks korratakse alapunktis 6.3 kirjeldatud toimingut, võttes 1 ml uuritava proovi asemel 1 ml esimest kümnekordset lahjendust. Sel viisil saadakse uuritavast proovist järgmine kümnekordne lahjendus (10–2). Lahjenduste valmistamist korratakse seni, kuni on saadud kohases lahjenduses nõuetekohane ja analüüsimiseks sobiv mikroorganismide arv. 6.5. Steriilse pipetiga külvatakse toorpiimast või selle sobivast lahjendusest 1 ml proovi Petri tassile. Analüüsitakse vähemalt kahte erinevat lahjendust. Igast valitud lahjendusest külvatakse üks Petri tass. 6.6. Steriilse pipetiga külvatakse pastöriseeritud piima või selle sobivast lahjendusest 1 ml proovi Petri tassile. Analüüsitakse vähemalt kahte erinevat lahjendust. Igast valitud lahjendusest külvatakse kaks Petri tassi. 6.7. Kõrgkuumutatud (UHT) ja steriliseeritud piima inkubeeritakse enne analüüsimise alustamist temperatuuril 30 °C 15 ööpäeva. Seejärel külvatakse steriilse pipetiga uuritavast proovist 0,1 ml Petri tassile. Analüüsimiseks külvatakse ühest proovist kaks Petri tassi. 6.8. Igasse külviga Petri tassi valatakse 15–18 ml agarsöödet. Pärast söötme lisamist liigutatakse Petri tasse ringikujuliselt, et saada pärast külvide inkubeerimist ühtlaselt jaotunud mikroorganismide kolooniad. Ajavahemik proovi ettevalmistamise, söötme lisamise ja segamise vahel ei tohi olla pikem kui 15 minutit. Petri tassid asetatakse tarduma puhtale ja jahedale horisontaalsele pinnale. 6.9. Inkubeerimiseks pööratakse tassid ümber ja asetatakse termostaati. Ühte virna paigutatakse kuni kuus tassi. Tassivirnad ei tohi kokku puutuda üksteisega ega termostaadi lae ja seintega. Proove inkubeeritakse temperatuuril 30±1 °C 72±2 tundi. 6.10. Ettenähtud aja möödudes loendatakse kolooniad Petri tassidelt, millel on kuni 300 kolooniat. Tasse uuritakse hajutatud valguses. Loendamise hõlbustamiseks võib kasutada sobiva suurusega luupi või koloonialoendajat. Kolooniate loendamisel tuleb vältida eksitavaid sadestunud aineosakesi tassil. Kahtlaseid moodustisi uuritakse vajaduse korral suurema suurendusega luubiga, et eristada kolooniad võõrmoodustistest. Laialivalgunud kolooniad loendatakse ühe kolooniana. Kui vähem kui veerand tassi on kaetud laialivalgunud kolooniatega, loendatakse kolooniad ülejäänud tassi osas ja selle põhjal arvutatakse kolooniate arv tassi kohta. Kui üle veerandi tassi pinnast on kaetud laialivalgunud kolooniatega, siis seda tassi loendamiseks ei kasutata. 7. Tulemuste arvutamine ja esitamine 7.1. Toor- ja pastöriseeritud piima puhul kasutatakse kõiki Petri tasse, mille kolooniate arv on 10 ja 300 vahel. Kui väljakasvanud kolooniate arv on alla 10 mikroorganismi/ml, väljendatakse tulemus järgmiselt: vähem kui 10×d mikroorganismi 1 ml/piimas, kus d on esimese arvesse võetud lahjendusteguri pöördarv. Kui väljakasvanud kolooniate arv on üle 300, kuid nende lugemine on võimalik, arvutatakse oletatav arv ja korrutatakse see lahjendusteguri pöördarvuga. Tulemust väljendatakse mikroorganismide oletatava arvuna ühes milliliitris. 7.2. Mikroorganismide arv ühes milliliitris toor- või pastöriseeritud piimas arvutatakse järgmise valemiga

kus N – mikroorganismide arv ühes milliliitris uuritavas proovis, ΣC – tassidel loendatud kolooniate summa, (n1 +0,1n2)d – Petri tassile külvatud proovi maht, millest n1 –esimese lahjenduse tasside arv, n2 –teise lahjenduse tasside arv, d – esimese lahjenduse lahjendustegur. Tulemus esitatakse kahe tüvenumbriga. Kui ümardatavaks numbriks on 5, ümardatakse lähima paarisarvuni. (Näiteks 29 500 ümardatakse 30 000-ni ja 24 500 ümardatakse 24 000-ni.) Näide pastöriseeritud piima kohta: 10–2 lahjendus: 278 ja 290 kolooniat, 10–3 lahjendus: 33 ja 28 kolooniat.

7.3. Kui kõrgkuumutatud (UHT) või steriliseeritud piima proovist väljakasvanud kolooniate arv on üle 10 koloonia 0,1 ml kohta, siis ei vasta proovi tulemus ega nimetatud viisil töödeldud piim «Toiduseaduse» § 26 lõike 4 alusel kehtestatud piima ja piimapõhiste toodete hügieeninõuete eeskirjas sätestatule. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 6 SOMAATILISTE RAKKUDE ARVU MÄÄRAMINE MIKROSKOOBIMEETODIL 1. Kasutusala Meetod võimaldab määrata somaatiliste rakkude arvu toorpiimas ning seda meetodit võib kasutada fluoro-opto-elektroonilise meetodi kalibreerimiseks ja selle meetodiga saadud tulemuste õigsuse kontrollimiseks. 2. Määratlus Somaatilised rakud selle lisa tähenduses on rakud, mille tuumi saab metüleensinise abil selgesti eristatavalt värvida. Somaatilised rakud on näiteks leukotsüüdid ja epiteelirakud. 3. Põhimõte 0,01 ml piima levitatakse üle 1 cm2 esemeklaasi pinna. Kile kuivatatakse ja värvitakse. Somaatilised rakud loendatakse mikroskoobi abil. Somaatiliste rakkude arv ühe milliliitri piima kohta saadakse määratud pinnal loendatud somaatiliste rakkude arvu korrutamisel töökordajaga. 4. Seadmed ja vahendid: 4.1. mikroskoop suurendusega 500–1000 korda; 4.2. mikropipett 0,01 ml mahuga ja täpsusega vähemalt ±2%; 4.3. esemeklaas, millel on 20 mm × 5 mm suurune märgitud ala kile jaoks, või standardesemeklaas ja trafarett suurusega 20 mm × 5 mm; 4.4. tasapinnaline soe plaat, mille temperatuur on vahemikus 30…50 °C, esemeklaasil piimakile kuivatamiseks; 4.5. ventilaator või föön piimakile kuivatamiseks; 4.6. veevann, mis võimaldab hoida temperatuuri 30…40 °C, proovide soojendamiseks; 4.7. standardplaat, gradueeritud 0,01 mm jaotiste kaupa. 5. Reagendid Värvimislahuse koostis: metüleensinine 0,6 g; etanool, 99% 54 ml; 1,1,1-trikloroetaan või tetrakloroetaan 40 ml; jää-äädikhape 6 ml. Värvimislahuse valmistamiseks segatakse etanool ja 1,1,1-trikloroetaan või tetrakloroetaan ning segu kuumutatakse veevannil kuni temperatuurini 60…70 °C. Seejärel lisatakse metüleensinine, segatakse hoolikalt ja jäetakse külmkappi temperatuurile 4 °C 12 kuni 24 tunniks jahtuma, seejärel lisatakse jää-äädikhape. Värvilahus filtreeritakse läbi filterpaberi, mille pooride läbimõõt on kuni 10–12 µm. Filtreeritud värvilahus jäetakse õhukindlasse pudelisse seisma. Kui lahusesse tekib säilitamise käigus hägu või sade, filtreeritakse lahus enne kasutamist uuesti. 6. Töö käik 6.1. Proove analüüsitakse kuue tunni jooksul, alates proovi võtmisest. Proovi säilitamisel ei tohi lasta proovi temperatuuril tõusta üle 6 °C ning tuleb vältida proovi külmumist. 6.2. Proov soojendatakse selle analüüsimiseks veevannil temperatuurini 30…40 °C, segatakse seejärel hoolikalt ja jahutatakse mikropipeti kalibreerimistemperatuurini (näiteks 20 °C). 6.3. Esemeklaasid puhastatakse etanooli või sarnase ainega, kuivatatakse tolmuvaba paberiga, kuumutatakse leegil ja jahutatakse. Esemeklaase hoitakse suletud karbis tolmu eest kaitstuna. 6.4. Kile valmistamiseks võetakse mikropipetiga 0,01 ml enne ettevalmistatud piima, puhastades pipeti välispinna hoolikalt piimast. Pipett asetatakse esemeklaasile, kuhu sellega kõigepealt joonistatakse välisring, mille mõõtmed on 20 mm × 5 mm. Seejärel täidetakse kogu pind piimaga nii ühtlaselt kui võimalik. Kile kuivatatakse soojal plaadil, kuni see on täielikult kuivanud. Proovist valmistatakse ja analüüsitakse vähemalt kaks kilet. 6.5. Kilede värvimiseks kastetakse kiled 10 minutiks värvilahusesse. Seejärel kile kuivatatakse, kasutades vajaduse korral ventilaatorit või fööni. Liigse värvaine väljapesemiseks kastetakse kile korduvalt vette. Kile kuivatatakse ja hoitakse tolmu eest kaitstuna. 6.6. Sõltuvalt valitud suurendusest (500–1000 korda) määratakse mikroskoobivälja kalibreerimiseks selle läbimõõt standardplaadi abil. 7. Loendamine ja arvutamine 7.1. Somaatiliste rakkude loendamiseks kasutatakse mikroskoopi. Rakkude loendamiseks loendatakse üksnes rakutuumi. Rakutuumad on selgelt eristatavad ja loendamiseks peab olema mikroskoobiväljas nähtaval vähemalt pool rakutuuma. Loendatakse ribasid või alasid, mis ulatuvad üle kile keskmise kolmandiku. Vältida tuleb nende ribade või alade loendamist, mis on valitud ainult kile äärmistelt aladelt. Kilede ettevalmistust ja sellest sõltuvat tulemuste usaldusväärsust kontrollitakse vähemalt üks kord kuus, loendades kile eri osade alasid. Loendada võib ka loendades mikroskoobivälju, mis on hajutatud nii, et kõik kile osad on võrdselt esindatud. 7.2. Kuna somaatiliste rakkude mikroskoopilist loendamist võib kasutada ka automaatsete ja mehhaniseeritud loendamisprotseduuride standardiseerimiseks, ei tohi identsete proovide loendamistulemuste variatsioonikoefitsient olla kõrgem kui elektrooniliste seadmete puhul. 400 000–600 000 rakku/ml sisaldava proovi korral ei tohi variatsioonikoefitsient ületada 5%. Sellise korratavuse saavutamiseks peab loendatavate rakkude arv igas proovis Poissoni jaotuse järgi olema üle 400. Poissoni jaotus eeldab, et M = V = s2 , kus M – keskväärtus, V – variatsioon, s – standarhälve. Variatsioonikoefitsient on

kus M (keskväärtus) tähistab loendatud osakeste (rakkude) arvu (näiteks 400, kui CV = 5%). 7.3. 0,01 ml piima kasutamisel arvutatakse töökordaja järgmiselt: 7.3.1. üle kile ulatuvate ribade loendamisel on loendatava riba pikkus 5 mm. Riba laius vastab mikroskoobivälja diameetrile, mis on määratud standardplaadi järgi.

kus d – standardplaadi järgi leitud mikroskoobivälja läbimõõt millimeetrites, b – täielikult loendatud ribade arv; 7.3.2. mikroskoobiväljade loendamine kile keskmisel kolmandikul või võrgustikuga

kus d – standardplaadi järgi leitud mikroskoobivälja läbimõõt millimeetrites, s – loendatud väljade arv. 7.4. Somaatiliste rakkude arv ühe milliliitri piima kohta saadakse loendatud somaatiliste rakkude arvu korrutamisel töökordajaga. Variatsioonikoefitsient ei tohi olla suurem kui 5%. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 7 SOMAATILISTE RAKKUDE ARVU MÄÄRAMINE FLUORO-OPTO-ELEKTROONILISEL MEETODIL 1. Kasutusala Meetod võimaldab määrata somaatiliste rakkude arvu toorpiimas, sõltumata sellest, kas proovi keemiliselt säilitatakse või mitte. 2. Määratlus Somaatilised rakud selle lisa tähenduses on osakesed, millel on minimaalne fluorestsentsi intensiivsus, mis on tingitud somaatilise rakkude tuumade DNA värvumisest. 3. Põhimõte Üks osa proovist, näiteks 0,2 ml, segatakse korralikult puhverlahuse ja fluorestsentslahusega ning osa sellest lahusest kantakse õhukese kihina pöörlevale kettale, mis on samal ajal mikroskoobi esemeklaasiks. Iga rakk tekitab elektrilise impulsi, mis võimendatakse ja registreeritakse. Somaatiliste rakkude arv väljendatakse tuhandetes ühe milliliitri toorpiima kohta. 4. Seadmed ja vahendid: 4.1. loendamisseade, mis töötab fluorestsents-optilisel põhimõttel; 4.2. veevann tsirkuleeriva veega, mis võimaldab hoida temperatuuri 40±1 °C; 4.3. katseklaas korgiga, mahuga umbes 15 ml. 5. Lahused 5.1. Puhverlahuse koostis: kaaliumvesinikftalaat 51,0 g; kaaliumhüdroksiid 13,75 g; polüetüleenglükool-mono-p(1,1,3,3-tetrametüülbutüül)fenüüleeter (näiteks triiton X-100, 1%-line, v/v) 10 ml; vesi kuni 10 000 ml-ni. Puhverlahuse (pH 5,7-5,9) valmistamiseks segatakse selle koostisosad. Saadud lahust võib säilitada õhukindlalt suletud nõus kuni seitse päeva. 5.2. Fluorestsentslahuse põhilahuse koostis: etiidiumbromiid 1,0 g; lahuse maht viiakse veega kuni 1000 ml-ni. Etiidiumbromiid lahustatakse vees ning seda võib säilitada valgus- ja õhukindlas pudelis kuni kaks kuud. 5.3. Fluorestsentslahuse töölahuse koostis: 20 ml fluorestsentslahuse põhilahust segatakse puhverlahusega kuni 1000 ml-ni. Töölahus on kasutuskõlblik kuni seitse päeva. 5.4. Pesemislahuse koostis: puhverlahus 10 ml; polüetüleenglükool-mono-p(1,1,3,3-tetrametüülbutüül)fenüüleeter (näiteks triiton X-100, 1%-line, v/v) 10 ml; ammoniaak 25%-line, v/v 25 ml; vesi kuni 10 000 ml. Pesemislahuse koostisosad segatakse omavahel ja lahuse maht viiakse veega 10 000 ml-ni. Lahust võib säilitada kuni 30 päeva. 6. Proovi säilitamine 6.1. Proov säilitatakse katseklaasis madalal temperatuuril, mis ei tohi ületada 6 °C. Keemiliselt konserveerimata proovi ei analüüsita esimese 24 tunni jooksul pärast lüpsmist, kuna sel juhul saadakse tegelikust analüüsitulemusest madalam tulemus. 6.2. Proovi keemiline konserveerimine tehakse pärast proovivõttu nii kiiresti kui võimalik, kuid mitte hiljem kui 24 tunni möödudes. 6.3. Proovi keemiliseks konserveerimiseks kasutatakse järgmisi säilitusaineid: 6.3.1. ortoboorhape – ortoboorhappe kontsentratsioon proovis ei tohi ületada 0,6 g/100 ml. Selliselt konserveeritud proovi võib säilitada kuni 24 tundi temperatuuril 6…12 °C. Lisaks võib selliselt konserveeritud proovi säilitamisaega kaaliumdikromaadi lisamisega pikendada 48 tunni võrra; 6.3.2. kaaliumdikromaat – kaaliumdikromaadi kontsentratsioon proovis ei tohi ületada 0,2 g/100 ml. Selliselt konserveeritud proovi võib säilitada kuni 72 tundi temperatuuril 6…12 °C; 6.3.3. naatriumasiid – naatriumasiidi kontsentratsioon proovis ei tohi ületada 0,024 g/100 ml. Sellist konserveerimisviisi võib kasutada juhul, kui proov jahutatakse kohe pärast proovivõttu temperatuurini 6…12 °C ja analüüsitakse 48 tunni jooksul, alates proovi võtmisest; 6.3.4. bronopool – bronopooli kontsentratsioon proovis ei tohi ületada 0,05 g/100 ml. Sellist konserveerimisviisi võib kasutada juhul, kui proov jahutatakse kohe pärast proovivõttu temperatuurini 6…12 °C ja analüüsitakse 72 tunni jooksul, alates proovi võtmisest. 7. Töö käik 7.1. Loendamisseade peab olema enne kasutamist kalibreeritud. Sellega määratakse loendamiskünnis ehk loendatavate osakeste suurus, millest alates hakatakse osakesi loendama. Kalibreeritakse seadme valmistaja väljatöötatud juhendi kohaselt kas etalonainega või prooviga, milles somaatiliste rakkude arv on määratud lisas 6 kirjeldatud meetodiga. 7.2. Proovide eeltöötlemiseks hoitakse uuritavat piima pärast proovide võtmist temperatuuril 2…6 °C vähemalt 24 tundi. Ilma eeltöötluseta ei ole proove soovitatav analüüsida, sest sel juhul võib analüüsitulemus olla tegelikust tulemusest madalam. Kui proovi analüüsimine on siiski vajalik, töödeldakse proovi vähemalt kolm tundi enne analüüsimise alustamist kaaliumdikromaadiga nii, et kaaliumdikromaadi kontsentratsioon proovis ei ületaks 0,2 g/100 ml. 7.3. Eeltöödeldud proov või vähemalt ühe päeva vanune eeltöötlemata proov soojendatakse veevannis ligikaudu temperatuurini 40 °C ja hoitakse seejärel kuni loendamiseni toatemperatuuril. 7.4. Somaatilised rakud loendatakse loendamisseadmega 15 minuti jooksul pärast proovi soojendamise lõpetamist. Somaatiliste rakkude ühtlaseks jaotumiseks peab proove enne loendamist korralikult segama. Proovi edasine lahjendamine ja töötlemine toimub loendamisseadmes automaatselt. 8. Korduvus ja korratavus Korduvuse (r) ja korratavuse (R) kohta puuduvad rahvusvaheliste võrdluskatsete põhjal saadud andmed. Teistes riikides läbiviidud võrdluskatsete põhjal võib lähtuda järgmistest andmetest, kui somaatiliste rakkude arv on 400 000–500 000/ml toorpiimas: 8.1. korduvuse standardhälve (sr)=20 000 rakku/ml, mis vastab 5–4% variatsioonikoefitsiendile; 8.2. korratavuse standardhälve (sR)=40 000 rakku/ml, mis vastab 10–8% variatsiooni koefitsiendile. 9. Täpsus Täpsust kontrollitakse etalonainega või prooviga, milles somaatiliste rakkude arv on määratud lisas 6 kirjeldatud meetodiga. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 8 MIKROORGANISMIDE ARVU MÄÄRAMINE TASSIMEETODIL TEMPERATUURIL 21 °C 1. Kasutusala Meetod võimaldab määrata mikroorganismide arvu kolooniate loendamisega temperatuuril 21 °C pastöriseeritud piimas, mida on eelnevalt hoitud temperatuuril 6 °C viis päeva. Meetodiga uuritakse pastöriseeritud piima saastumist psührotroofsete mikroorganismidega, mis on võimelised paljunema temperatuuril 6 °C. 2. Määratlus Mikroorganism selles lisas kirjeldatud meetodi tähenduses on organism, mis moodustab meetodis kirjeldatud tingimustel ja aeroobsel kultiveerimisel loendatavaid kolooniad. 3. Põhimõte Pastöriseeritud piima hoitakse temperatuuril 6 °C viis päeva. Kindel kogus proovi segatakse söötmega Petri tassis ja inkubeeritakse temperatuuril 21 °C 25 tundi. Kolooniad loendatakse. Petri tassil kasvanud kolooniate arvu järgi arvutatakse mikroorganismide arv ühes milliliitris pastöriseeritud piimas. 4. Seadmed ja vahendid: 4.1. lisa 5 alapunktides 4.1, 4.2 ja 4.4–4.13 loetletud seadmed ja vahendid; 4.2. termostaadid, mis võimaldavad hoida temperatuuri 6±0,5 °C ja 21±0,1 °C termostaadi kõikides punktides; 4.3. klaasist vahendid, mis steriliseeritakse lisa 2 punktis 3 kirjeldatud viisil. 5. Sööde ja lahjendusvedelik: 5.1. lisa 5 alapunktis 5.1 toodud kirjelduse järgi valmistatud agarsööde; 5.2. lisa 5 alapunktis 5.2 toodud kirjelduse järgi valmistatud peptooni-keedusoolalahus. 6. Töö käik 6.1. Prooviks vajalik agarsöötme kogus soojendatakse kiiresti ja söötme temperatuur reguleeritakse veevannil 45±1 °C. 6.2. Pastöriseeritud piima avamata pakendit või vähemalt 100 ml esinduslikku proovi inkubeeritakse 120±2 tundi termostaadis temperatuuril 6±0,5 °C. 6.3. Pärast inkubeerimist segatakse proov korralikult, et tagada mikroorganismide ühtlane jaotumine uuritavas proovis. Segamiseks pööratakse proovinõud 25 korda kiiresti ümber. Segamise käigus tuleb vältida vahu teket või hiljem oodata, kuni vaht kaob. Ajavahemik proovi segamise ja analüüsiks vajaliku proovikoguse eraldamise vahel on kuni 3 minutit. 6.4. Pastöriseeritud piima proovist esimese kümnekordse lahjenduse (10–1) valmistamiseks pipeteeritakse steriilse pipetiga 1 ml uuritavat proovi 9 ml lahjendusvedelikku nii, et pipett ei puutu kokku lahjendusvedelikuga. Lahjendusvedeliku ja proovi temperatuurid peavad olema ligilähedased. Saadud lahust segatakse segistiga hoolikalt 5 kuni 10 sekundi vältel. 6.5. Pastöriseeritud piima proovist järgmise kümnendlahjenduse valmistamiseks korratakse alapunktis 6.4 kirjeldatud toimingut, võttes 1 ml uuritava proovi asemel 1 ml esimest kümnekordset lahjendust. Sel viisil saadakse uuritavast proovist järgmine kümnekordne lahjendus (10 –2). Lahjenduste valmistamist korratakse seni, kuni on saadud kohases lahjenduses nõuetekohane ja analüüsimiseks sobiv mikroorganismide arv. 6.6. Steriilse pipetiga külvatakse proovist või selle sobivast lahjendusest 1 ml proovi Petri tassile. Analüüsitakse vähemalt kahte lahjendust. Igast valitud lahjendusest külvatakse kaks tassi. 6.7. Igasse külvatud Petri tassi valatakse 15–18 ml agarsöödet. Pärast söötme lisamist liigutatakse Petri tasse ringikujuliselt, et saada pärast külvide inkubeerimist ühtlaselt jaotunud mikroorganismide kolooniad. Ajavahemik proovi ettevalmistamise, söötme lisamise ja segamise vahel ei tohi olla pikem kui 15 minutit. Petri tassid asetatakse tarduma puhtale ja jahedale horisontaalsele pinnale. 6.8. Inkubeerimiseks pööratakse tassid ümber ja asetatakse termostaati. Ühte virna paigutatakse kuni kuus tassi. Tassivirnad ei tohi kokku puutuda üksteisega ega termostaadi lae ja seintega. Proove inkubeeritakse temperatuuril 21±1 °C 25 tundi. 6.9. Ettenähtud aja möödudes loendatakse kolooniad Petri tassidelt, millel on kuni 300 kolooniat. Tasse uuritakse hajutatud valguses. Loendamise hõlbustamiseks võib kasutada sobiva suurusega luupi või koloonialoendajat. Kolooniate loendamisel tuleb vältida eksitavaid sadestunud aineosakesi tassil. Kahtlaseid moodustisi uuritakse vastavalt vajaduse korral suurema suurendusega luubiga, et eristada kolooniad võõrmoodustistest. Laialivalgunud kolooniad loendatakse ühe kolooniana. Kui vähem kui veerand tassi on kaetud laialivalgunud kolooniatega, loendatakse kolooniad ülejäänud tassi osas ja selle põhjal arvutatakse kolooniate arv tassi kohta. Kui üle veerandi tassi pinnast on kaetud laialivalgunud kolooniatega, siis seda tassi loendamiseks ei kasutata. 7. Tulemuste arvutamine ja esitamine Tulemused arvutatakse ja esitatakse lisa 5 alapunktides 7.1 ja 7.2 kirjeldatud meetodi ja valemi järgi. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 9 COLI-LAADSETE BAKTERITE ARVU MÄÄRAMISE MEETOD TEMPERATUURIL 30 °C 1. Kasutusala Meetod võimaldab määrata coli-laadsete bakterite arvu kolooniate loendamisega pastöriseeritud piimas temperatuuril 30 °C. 2. Määratlus Coli-laadsed bakterid selle lisa tähenduses on organismid, mis moodustavad meetodis kirjeldatud tingimustel iseloomulikke või mitteiseloomulikke kolooniaid temperatuuril 30 oC, fermenteerides laktoosi gaasiks. 3. Põhimõte Kindel kogus proovi segatakse söötmega Petri tassis ja inkubeeritakse temperatuuril 30 °C 24 tundi. Iseloomulikud kolooniad loendatakse ja vajaduse korral identifitseeritakse mitteiseloomulikud kolooniad laktoosi fermenteerimise abil. Tassil kasvanud kolooniate arvu järgi arvutatakse coli-laadsete bakterite arv ühes milliliitris pastöriseeritud piimas. 4. Seadmed ja vahendid: 4.1. lisa 5 alapunktides 4.1–4.5 ja 4.11–4.13 loetletud seadmed ja vahendid; 4.2. aas plaatina ja iriidiumi või kroomi ja nikli sulamist; 4.3. katseklaasid korkidega, mahuga 20 ml, identifitseerimissöötme hoidmiseks ning Durhami torukesed, sobivate mõõtudega, katseklaasides kasutamiseks; 4.4. kolvid, mahuga 150–250 ml, selektiivsöötme hoidmiseks; 4.5. klaasist vahendid, mis steriliseeritakse lisa 2 punktis 3 kirjeldatud viisil. 5. Söötmed: 5.1. Tahke selektiivsöötme (violettpunane sapp-laktoos-agar ehk VRBL-agar) koostis: peptoon 7 g; pärmiekstrakt 3 g; laktoos (C12H22O11×H2 O) 10 g; naatriumkloriid (NaCl) 5 g; sapisoolad 1,5 g; neutraalpunane 0,03 g; kristallviolett 0,002 g; agar (sõltuvalt agari geelistavatest omadustest) 10–15 g; vesi 1000 ml. Söötme koostisosad suspendeeritakse ja lahustatakse vees ning jäetakse mõneks minutiks seisma, seejärel segatakse intensiivselt. Söötme pH reguleeritakse selliselt, et see pärast keetmist oleks 7,4±0,1, mõõdetuna temperatuuril 25 °C. Söötme pH reguleerimiseks kasutatakse naatriumhüdroksiidi- või soolhappelahust kontsentratsiooniga vähemalt 0,1 mooli/l. Sööde kuumutatakse aeg-ajalt segades kiiresti keemiseni ja villitakse kohe 100–150 ml steriilsetesse kolbidesse. Söötme temperatuur reguleeritakse veevannis temperatuurini 45±1 oC. Söötme steriilsust kontrollitakse selle valmistamise ajal. Söödet võib kasutada kuni kolme tunni jooksul, alates selle valmistamisest. Tahke selektiivsöötme valmistamiseks võib kasutada analüüsiks sobivat veevaba valmissöödet selle kasutusjuhendi kohaselt. 5.2. Kinnitustesti söötme (briljantroheline-laktoos-sapipuljong) koostis: peptoon 10 g; laktoos (C12H22O11×H2 O) 10 g; kuiv härjasapp 20 g; briljantroheline 0,0133 g; vesi 1000 ml. Söötme koostisosad lahustatakse vees keetes. Söötme pH reguleeritakse selliselt, et see pärast steriliseerimist oleks 7,2±0,1, mõõdetuna temperatuuril 25 °C. Söötme pH reguleerimiseks kasutatakse naatriumhüdroksiidi- või soolhappelahust kontsentratsiooniga vähemalt 0,1 mooli/l. Sööde villitakse 10 ml kogustena katseklaasidesse, kuhu on asetatud Durhami torukesed (käärtorukesed). Seejärel katseklaasid suletakse. Sööde steriliseeritakse autoklaavis temperatuuril 121±1 °C 15 minutit. Pärast steriliseerimist ei tohi Durhami torukestes olla õhumulle. Pärast steriliseerimist tuleb kontrollida söötme pH-d. Kui söödet ei kasutata kohe pärast valmistamist, siis võib seda säilitada pimedas temperatuuril 0…5 °C kuni üks kuu. Kinnitustesti söötme valmistamiseks võib kasutada analüüsiks sobivat veevaba valmissöödet selle kasutusjuhendi kohaselt. 6. Töö käik 6.1. Analüüsimiseks kasutatakse käesoleva lisa alapunkti 5.1 kohaselt valmistatud tahket selektiivsöödet (VRBL-agar). 6.2. Proov segatakse korralikult, et tagada mikroorganismide ühtlane jaotumine uuritavas proovis. Segamiseks pööratakse proovinõud 25 korda kiiresti ümber. Segamise käigus tuleb vältida vahu teket või hiljem oodata, kuni vaht kaob. Ajavahemik proovi segamise ja analüüsiks vajaliku proovikoguse eraldamise vahel on kuni kolm minutit. 6.3. Proovist, mille maht on 3 ml, tehakse steriilse pipetiga 1 ml kaupa külv kolmele Petri tassile. 6.4. Igasse külvatud tassi valatakse ligikaudu 12 ml VRBL-agarit. Pärast söötme lisamist liigutatakse Petri tasse ringikujuliselt, et saada pärast külvide inkubeerimist ühtlaselt jaotunud mikroorganismide kolooniad. Ajavahemik proovi ettevalmistamise, söötme lisamise ja segamise vahel ei tohi olla pikem kui 15 minutit. Söötme steriilsuse kontrollimiseks valatakse paralleelselt 12 ml VRBL-agarit kontrolltassile. Seejärel asetatakse Petri tassid puhtale horisontaalsele pinnale tarduma. Pärast söötme lõplikku tardumist valatakse külvatud agarile vähemalt 4 ml VRBL-agarit. Petri tassid asetatakse seejärel uuesti tarduma puhtale horisontaalsele pinnale. 6.5. Inkubeerimiseks pööratakse tassid ümber ja asetatakse termostaati. Ühte virna paigutatakse kuni kuus tassi. Tassivirnad ei tohi kokku puutuda üksteisega ega termostaadi lae ja seintega. Proove inkubeeritakse temperatuuril 30±1 °C 24±2 tundi. 6.6. Kui ettenähtud aeg on möödunud, loendatakse kolooniad Petri tassidelt, millel on kuni 150 kolooniat. Loendatakse coli -laadsetele bakteritele iseloomulikke tumepunaseid, vähemalt 0,5 mm läbimõõduga kolooniaid, mille ümber võib olla hägune rõngas. Kui mõned kolooniatest erinevad coli-laadsetele bakteritele iseloomulikest kolooniatest näiteks värvuse, suuruse või sademe moodustamise poolest, tehakse analüüsitulemuste kontrollimiseks kinnitustest. 6.7. Kinnitustesti läbiviimiseks viiakse aasaga 3 kuni 5 kahtlast kolooniat briljantrohelise-laktoosi-sapipuljongisse. Katseklaase inkubeeritakse temperatuuril 30±1 °C 24±2 tundi. Gaasi teke Durhami torukeses tõestab coli-laadsete bakterite olemasolu. 7. Tulemuste arvutamine ja esitamine 7.1. Loendamiseks kasutatakse tasse, millel on kuni 150 kolooniat. 7.2. Kui analüüsitulemuste kontrollimiseks on kasutatud kinnitustesti, arvutatakse coli-laadsete bakterite kolooniate arv kontrollitud coli-laadsete bakterite kolooniate osakaalu järgi. 7.3. Coli-laadsete bakterite arv ühes milliliitris pastöriseeritud piimas arvutatakse järgmise valemiga

kus N – mikroorganismide arv ühes milliliitris uuritavas proovis; ΣC – proovis (3 ml-s) loendatud coli-laadsete bakterite kolooniate arv; n – Petri tassile külvatud proovi maht 3 ml. Kui loendatud kolooniate arv on üle 100, siis esitatakse tulemus kahe tüvenumbriga. Kui ümardatavaks numbriks on 5, siis ümardatakse lähima paarisarvuni. Kui väljakasvanud kolooniate arv on üle 150, väljendatakse tulemus mikroorganismide oletatava arvuna ühes milliliitris. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 10 PATOGEENSETE MIKROORGANISMIDE MÄÄRAMISE MEETOD 1. Kasutusala Pastöriseeritud piima proove analüüsitakse patogeensete mikroorganismide esinemise suhtes kooskõlas «Toiduseaduse» § 26 lõike 4 alusel kehtestatud piima ja piimapõhiste toodete hügieeninõuete eeskirjas sätestatuga. 2. Määratlus 2.1. Pastöriseeritud piima uuritakse selliste bakterite suhtes, mis kõige sagedamini põhjustavad toidust tingitud haigestumisi. 2.2. Pastöriseerimine on töötlemisviis, mis tagab piimas termolabiilsete patogeenide hävimise. Kui pastöriseeritud piima bakterite üldarv temperatuuril 30 oC ja 21 o C, coli-laadsete bakterite arv ja fosfataasi aktiivsus vastavad käesoleva lisa punktis 1 nimetatud eeskirjas sätestatud nõuetele, määratakse patogeenseid mikroorganisme juhul, kui on alust arvata, et pastöriseeritud piim on toidumürgistuse puhangu põhjustaja. 3. Analüüsimise sagedus ja meetod 3.1. Analüüsimise sagedus ja käik määratletakse nii, et analüüsimise tulemusena on võimalik väljastada kuumtöödeldud piima nõuetekohasust tõendav dokument. 3.2. Proove analüüsitakse Eesti või rahvusvahelistele standarditele vastavate või samaväärsete meetoditega. Meetodi valikul lähtutakse analüüsi käigus uuritavatest patogeensetest mikroorganismidest. 4. Tulemuste esitamine 4.1. Uuritud patogeense mikroorganismi kohta väljendatakse tulemused järgmiselt: bakterite arv ühes milliliitris piimas või nende esinemine või puudumine pastöriseeritud piimakoguses, mis on ette nähtud analüüsimiseks kasutatud meetodis. 4.2. Katseprotokollis viidatakse analüüsimiseks kasutatud meetodile. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 11 FOSFATAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMISE MEETOD 1. Kasutusala Meetod võimaldab määrata fosfataasi aktiivsuse pastöriseeritud piimas. 2. Määratlus 2.1. Fosfataasi aktiivsus on aktiivse aluselise fosfataasi hulk tootes, mida väljendatakse vabanenud fenooli kogusena mikrogrammides ühe milliliitri pastöriseeritud piima kohta proovi analüüsimise korral käesoleva lisa kohaselt. 2.2. Selline piim, milles fosfataasi aktiivsus on väiksem kui 4 µg/ml, loetakse fosfataasnegatiivseks. 3. Põhimõte Fosfataasi aktiivsust hinnatakse fenooli hulga järgi, mis vabaneb proovile lisatud dinaatriumfenüülfosfaadist. Vabanenud fenool reageerib dibromokinoonkloorimiidiga, andes dibromoindofenooli (sinaka värvusega ühend). Värvuse intensiivsust mõõdetakse kolorimeetriliselt lainepikkusel 610 nm. Tulemust võrreldakse proovi suhtes, milles fosfataas on inaktiveeritud (edaspidi võrdlusproov). 4. Seadmed ja vahendid: 4.1. analüütiline kaal; 4.2. veevann, mis võimaldab hoida temperatuuri 37±1 °C; 4.3. spektrofotomeeter, absorptsiooni mõõtmiseks lainepikkusel 610 nm; 4.4. katseklaasid, 16 või 18 mm × 150 mm, gradueeritud ruumalani 5 ja 10 ml; 4.5. pipetid; 4.6. klaaslehtrid, sobiva suurusega, näiteks läbimõõduga 5 cm; 4.7. kurdfiltrid läbimõõduga vähemalt 9 cm, keskmise filtreerimiskiiruse jaoks; 4.8. mõõtekolvid standardlahuste valmistamiseks; 4.9. kõik klaasnõud ja proovivõtuvahendid tuleb hoolikalt puhastada, soovitatav on neid loputada värskelt keedetud destilleeritud veega või aurutada; 4.10. Selliste plastmasskorkide kasutamine, mis võivad põhjustada fenooliga saastumist, on keelatud. 5. Reagendid 5.1. Baariumboraat-hüdroksiidpuhvri valmistamiseks lahustatakse vees eraldi mõõtekolbides 50,0 g baariumhüdroksiidi [Ba(OH) 2×8H2O] ja 22,0 g boorhapet [H3BO3 ]. Mõlema lahuse maht viiakse veega 1000 ml-ni. Mõlemast lahusest soojendatakse 500 ml lahust temperatuurini 50 °C. Lahused segatakse ja jahutatakse kiiresti temperatuurini 20 °C. Seejärel kontrollitakse baariumboraat-hüdroksiidi puhverlahuse pH-d, mis peab olema 10,6±0,1 pH ühikut. Vajadusel reguleeritakse pH eelnevalt kirjeldatud baariumhüdroksiidi- või boorhappelahuse lisamisega. Valmis puhverlahust säilitatakse tihedalt suletud nõus. Enne kasutamist lahus lahjendatakse võrdse koguse veega. 5.2. Värvusttekitava puhvri valmistamiseks lahustatakse 6,0 g naatriummetaboraati (NaBO2) või 12,6 g naatriummetaboraattetrahüdraati (NaBO2×4H2 O) ja 20,0 g naatriumkloriidi (NaCl) vees ja lahuse maht viiakse 1000 ml-ni. 5.3. Värvustlahjendava puhvri valmistamiseks lahjendatakse 10 ml värvusttekitavat puhvrit veega kuni 100 ml-ni. 5.4. Puhversubstraadi valmistamiseks: 5.4.1. lahustatakse 0,1 g vee- ja fenoolivaba dinaatriumfenüülfosfaati 100 ml baariumboraathüdroksiidipuhvris; 5.4.2. lahustatakse 0,5 g dinaatriumfenüülfosfaati 4,5 ml värvusttekitavas puhvris, millele lisatakse kaks tilka BQC-lahust ja lastakse seista toatemperatuuril 30 minutit. Moodustunud värv ekstraheeritakse 2,5 ml 1-butanooliga ja lastakse seista, kuni 1-butanooli kiht on eraldunud. Seejärel eemaldatakse 1-butanooli kiht. Vajadusel korratakse ekstraheerimist. Lahust võib säilitada mõned päevad külmkapis. Enne lahuse kasutamist tekitatakse värvus ja ekstraheeritakse uuesti. Puhversubstraat valmistatakse vahetult enne kasutamist, lahjendades 1 ml seda lahust baariumboraat-hüdroksiidipuhvriga 100 ml-ni. 5.5. Tsink-vasksadesti valmistamiseks lahustatakse 3,0 g tsinksulfaati (ZnSO4×7H2O) ja 0,6 g vask(II)sulfaati (CuSO4×5H2O) vees ja lahjendatakse veega 100 ml-ni. 5.6. 2,6-dibromokinoonkloorimiidilahuse (edaspidi BQC-lahus ) valmistamiseks lahustatakse 40±1 mg 2,6-dibromokinoonkloorimiidi (BQC) (C6H2Br2CINO6) 10 ml 96%-lises (v/v) etanoolis. Lahust säilitatakse tumedas pudelis külmkapis. Lahus ei ole kasutuskõlblik, kui selle värvus on muutunud või kui lahus on vanem kui üks kuu. 5.7. Vask(II)sulfaadilahuse valmistamiseks lahustatakse 0,05 g vask(II)sulfaati (CuSO4×5H2O) vees ja lahjendatakse 100 ml. 5.8. Fenooli standardlahuse valmistamiseks kaalutakse 200±2 mg puhast veevaba fenooli, viiakse see 100 ml mõõtekolbi, lisatakse vesi, segatakse ja lahjendatakse kuni mõõtjooneni. See põhilahus säilib külmkapis stabiilsena mitu kuud. 10 ml põhilahust lahjendatakse veega 100 ml ja segatakse. 1 ml saadud lahust sisaldab 200 µg fenooli. 6. Töö käik 6.1. Analüüsimise käigus tuleb vältida: 6.1.1. otsest päikesevalgust; 6.1.2. kokkupuudet sülje või hingeõhuga, sest need võivad põhjustada valepositiivse näidu; eriti hoolikalt tuleb seda jälgida pipettide kasutamisel. 6.2. Analüüsid tehakse vahetult pärast proovivõttu. Proove võib säilitada külmkapis kuni kaks päeva. 6.3. Kahte katseklaasi pipeteeritakse 1 ml proovi. Ühte katseklaasi pipeteeritud proovi kasutatakse võrdlusproovi valmistamiseks. 6.4. Võrdlusproovi valmistamiseks kuumutatakse prooviga katseklaasi kaks minutit keevas vees; katseklaas ja veevann kaetakse alumiiniumfooliumiga nii, et kogu katseklaas kuumeneks ühtlaselt. Seejärel jahutatakse katseklaas kiiresti toatemperatuurini. 6.5. Edasise töö käigus käsitletakse prooviga ja võrdlusprooviga katseklaasi ühtemoodi. Katseklaasidesse lisatakse 10 ml puhversubstraati ja segatakse. 6.6. Katseklaasid asetatakse kohe veevanni temperatuurile 37 °C 60 minutiks soojenema ning katseklaaside sisu segatakse aeg-ajalt (vähemalt neli korda). 6.7. Katseklaase kuumutatakse keevas vees kahe minuti vältel sarnaselt alapunktis 6.4 kirjeldatule ja jahutatakse siis kiiresti toatemperatuurini. 6.8. Katseklaasidesse lisatakse 1 ml tsink-vasksadestit ja segatakse korralikult. 6.9. Katseklaaside sisu filtreeritakse läbi kuiva filterpaberi, esimesed 2 ml filtraati visatakse ära. Vajadusel filtreeritakse teist korda, kuni filtraat on täiesti läbipaistev; ning kogutakse 5 ml filtraati katseklaasi. 6.10. Katseklaasidesse lisatakse 5 ml värvusttekitavat puhvrit ja 0,1 ml BQC-lahust. Lahused segatakse ja jäetakse värvuse moodustumiseks 30 minutiks toatemperatuurile seisma. 6.11. Fosfataasi aktiivsuse määramiseks mõõdetakse proovi absorptsioon võrdlusproovi suhtes spektrofotomeetriga lainepikkusel 610 nm. 6.12. Kui mõõdetud absorptsioon on suurem kui standardil (20 µg fenooli katseklaasi kohta), korratakse mõõtmist sobivalt lahjendatud prooviga. Lahjendatud proovi valmistamiseks segatakse üks osa uuritavat proovi teatud koguse sama prooviga, mis on fosfataasi inaktiveerimiseks eelnevalt läbi keedetud. 6.13. Kalibreerimisgraafiku tegemiseks valmistatakse fenooli standardlahusest lahjendused, mis sisaldavad vastavalt 0 (kontroll-lahus), 2, 5, 10, ja 20 µg fenooli milliliitri kohta. Viide katseklaasi pipeteeritakse vastavalt kas 1 ml vett või 1 ml ühte erinevate fenoolilahuste lahjendusest. Igasse katseklaasi lisatakse 1 ml vask(II)sulfaadilahust, 5 ml värvilahjendavat puhvrit, 3 ml vett ja 0,1 ml BQC-lahust. Katseklaaside sisu segatakse. Värvusel lastakse moodustuda 30 minutit toatemperatuuril. Seejärel mõõdetakse lahuste absorptsioon kontroll-lahuse suhtes spektrofotomeetriga lainepikkusel 610 nm. Erinevatele lisatud fenooli kogustele vastavate absorptsiooni väärtuste järgi arvutatakse vähimruutude meetodil regressioonisirge. 7. Tulemuste esitamine 7.1. Regressioonisirge järgi arvutatakse absorptsiooni väärtusele vastav fenooli hulk. 7.2. Fosfataasi aktiivsust väljendatakse fenooli hulgana mikrogrammides ühe milliliitri pastöriseeritud piima kohta, kasutades järgmist valemit: Fosfataasi aktiivsus = 2,4×A×D, kus A – fenooli kogus mikrogrammides, D – lahjendusfaktor lahjendamisel, kui lahjendamist ei toimu, siis D=1, 2,4 on lahjendusfaktor (5/12 ühemilliliitrisest proovist). 7.3. Meetodi korduvus (r) on 2 µg fenool/ml ja korratavus (R) 3 µg fenool/ml. 7.4. Kui proovi lahjendatakse alapunkti 6.12 järgi, siis kehtivad alapunktis 7.3 sätestatud meetodi korduvuse ja korratavuse näitajad lahjendatud proovi kohta. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 12 PEROKSIDAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMISE MEETOD 1. Kasutusala Meetod võimaldab määrata peroksidaasi esinemise või puudumise pastöriseeritud piimas. Meetodit kasutatakse piima pastöriseerimise nõuetekohasuse kontrolliks. 2. Määratlus 2.1. Peroksidaaspositiivne reaktsioon: kui piim on nõuetekohaselt pastöriseeritud, omandab piim pärast segamise lõppu 30 sekundi jooksul sinaka värvuse. 2.2. Peroksidaasnegatiivne reaktsioon: 30 sekundi jooksul pärast segamise lõppu sinist värvust ei teki. 3. Põhimõte Peroksidaas on ensüüm, mis lõhustab vesinikperoksiidi. Lõhustumise käigus vabanev atomaarne hapnik oksüdeerib värvusetu 1,4-fenüleendiamiini violetseks indofenooliks (Storchi katse). Värvuse intensiivsus on võrdeline ensüümi kontsentratsiooniga. 4. Reagendid 4.1. 1,4-fenüleendiamiinilahuse valmistamiseks lahustatakse 2 g 1,4-fenüleendiamiini (C6H8N2) soojas (50 °C) vees ja viiakse lahuse ruumala 100 ml-ni. Lahust säilitakse tumedas klaaskorgiga suletud pudelis jahedas ja pimedas kohas. Kui 1,4-fenüleendiamiinilahusesse moodustub alates valmistamisest ühe või kahe päeva jooksul sade, siis lahust ei kasutata. 4.2. Vesinikperoksiidilahuse valmistamiseks lahjendatakse 9 ml 30%-list vesinikperoksiidi veega ja viiakse lahuse ruumala 100 ml-ni. Stabiliseerimiseks lisatakse ühe liitri lahuse kohta 1 ml kontsentreeritud väävelhapet. Vesinikperoksiidilahus püsib stabiilsena ühe kuu vältel, kui seda hoitakse klaaskorgiga suletud pudelis külmas ja pimedas kohas nii, et ta ei puutu kokku orgaaniliste ühenditega. 5. Töö käik 5.1. Puhtasse sobiva korgiga katseklaasi pipeteeritakse 5 ml piima. 5.2. Lisatakse 5 ml 1,4-fenüleendiamiinilahust. 5.3. Lisatakse 2 tilka vesinikperoksiidilahust. 5.4. Jälgitakse värvuse muutumist 30 sekundi jooksul pärast segamise lõppu. Kui värvus ilmub hiljem kui 30 sekundit pärast reaktiivide segamist, siis ei ole reaktsioon spetsiifiline. Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI Vabariigi Valitsuse 4. märtsi 2003. a määruse nr 69 «Toor- ja kuumtöödeldud piimast kontrollproovide võtmise ja analüüsimise meetodid» lisa 13 TERMISTORKRÜOSKOOBI EHITUS (mõõdud millimeetrites)

Põllumajandusminister Jaanus MARRANDI