Mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler

§ 1. Dette cirkulære omfatter mikrobiologiske kontrolundersøgelser, screeningsundersøgelser og overvågningsundersøgelser i forbindelse med kontrol med virksomheder, der er autoriseret i henhold til levnedsmiddellovens § 31, samt virksomheder der er godkendt eller registreret i henhold til levnedsmiddellovens § 34.

§ 2. Ved mikrobiologiske kontrolundersøgelser, screeningsundersøgelser og overvågningsundersøgelser af råvarer, halvfabrikata og færdigvarer og ved rengøringskontrolundersøgelser skal fremgangsmåden i bilag 1 iagttages. Ved mikrobiologiske kontrolundersøgelser skal bestemmelserne i §§ 3-7 endvidere iagttages.

§ 3. Som obligatoriske parametre ved mikrobiologiske undersøgelser af råvarer, halvfabrikata og færdigvarer skal de parametre, som er anført i bilag 2 anvendes.

§ 4. Ved indikationsbaserede mikrobiologiske undersøgelser af råvarer, halvfabrikata og færdigvarer anbefales en eller flere af de parametre, som er anført i bilag 3.

§ 5. Ved indikationsbaserede mikrobiologiske undersøgelser i forbindelse med holdbarhedsundersøgelser og rengøringskontrolundersøgelser anbefales fremgangsmåden i bilag 3.

§ 6. Ved udtagning, opbevaring og mærkning af prøver til mikrobiologiske undersøgelser skal reglerne i bilag 5 følges.

§ 7. Ved mikrobiologiske undersøgelser skal de metoder, som er beskrevet i bilag 6 anvendes.

Stk. 2. Efter drøftelse med Veterinær- og Fødevaredirektoratet i hvert enkelt tilfælde kan andre ligeværdige metoder dog anvendes.

§ 8. Dette cirkulære skal anvendes fra 1. januar 1998.

Veterinær- og Fødevaredirektoratet, den 3. december 1997

P.D.V.

Jørgen Fredsted

/Henrik G. Jensen

INDHOLDSFORTEGNELSE BILAG 1. FREMGANGSMÅDE VED MIKROBIOLOGISKE UNDERSØGELSER AF LEVNEDSMIDLER 1.1 Kontrolundersøgelser 1.1.1 Obligatoriske parametre 1.1.2 Indikationsbaserede parametre 1.2 Screeningsundersøgelser og overvågnings undersøgelser 1.3 Meddelelse af resultat 1.4 Område BILAG 2. OBLIGATORISKE PARAMETRE 2.1 Kød og kødvarer 2.1.1 Kød og kødprodukter, ikke varmebehandlede 2.1.2 Kød og kødprodukter, varmebehandlede 2.1.3 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter med en vandaktivitet over 0,94 2.1.4 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter med en vandaktivitet under 0,94 2.2 Fisk og fiskevarer 2.2.1 Ferske fisk 2.2.2 Udskæringer af fersk fisk, hakket fiskekød og skaldyr 2.2.3 Varmebehandlede fiskevarer 2.2.4 Røgede samt gravade fiskevarer 2.3 Frugt, grøntsager og produkter heraf 2.3.1 Ubehandlet frugt og grønt, tørrede frugter, marmelade, oliven m.m. 2.3.2 Frøspirer og snittede grøntsager 2.3.3 Varmebehandlede grøntsagsprodukter 2.4 Vin, øl og mineralvand 2.5 Saft og saftprodukter 2.6 Kage-, dessert- og konsumisprodukter 2.7 Mayonnaisesalater og lignende 2.7.1 Mayonaise og dressing 2.7.2 Mayonaisesalater 2.8 Krydderier, ikke afkimede 2.9 Mælk og mælkeprodukter 2.9.1 Ost og osteprodukter 2.9.2 Mælk og øvrige mælkeprodukter 2.10 Ammemælk, pasteuriseret 2.11 Færdigretter 2.12 Æg og ægprodukter BILAG 3. INDIKATIONSBASEREDE PARAMETRE 3.1 Levnedsmiddelgrupper 3.1.1 Kød og kødvarer 3.1.1.1 Kød og kødprodukter, ikke varmebehandlede 3.1.1.2 Kød og kødprodukter, varmebehandlede 3.1.1.3 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter 3.1.2 Fisk og fiskevarer 3.1.3 Frugt, grøntsager og produkter heraf 3.1.4 Vin, øl og carboniseret mineralvand 3.1.5 Saft og saftprodukter 3.1.6 Kage-, dessert- og konsumisprodukter 3.1.7 Mayonnaisesalater og lignende 3.1.8 Krydderier, ikke afkimede 3.1.9 Mælk og mælkeprodukter 3.1.10 Ammemælk, pasteuriseret 3.2 Holdbarhedsundersøgelser 3.3 Rengøringskontrolundersøgelser BILAG 4. OPHÆVET BILAG 5. PRØVEUDTAGNING 5.1 Udtagning af prøver 5.2 Prøveudtagningsteknik 5.3 Prøveudtagningsrapport BILAG 6. METODER 6.1 Forbehandling af prøver 6.1.1 Metodik 6.1.2 Prøvemængde 6.1.3 Forbehandling af dybfrosne levnedsmidler 6.2 Sensorisk undersøgelse 6.2.1 Forhold af betydning for undersøgelsen 6.2.2 Undersøgelsens gennemførelse 6.3 Metoder for mikrobiologiske analyser 6.3.1 Bacillus cereus 6.3.2 Bakteriesporetal 6.3.3 Brochothrix thermosphacta 6.3.4 Termofile Campylobacter 6.3.5 Clostridium perfringens 6.3.6 Coliforme bakterier 6.3.7 Enterobacteriaceae 6.3.8 Enterococcer 6.3.9 Gær og skimmel 6.3.10 Kim på blodagar 6.3.11 Kimtalsbestemmelse 6.3.11.1 Aerobt kimtal 6.3.11.2 Psykrotrofe bakterier 6.3.11.3 Fremmede kim 6.3.11.4 Direkte Epifluorescens Filter Teknik (DEFT) 6.3.12 Lactobaciller 6.3.13 Listeria monocytogenes 6.3.14 Mælkesyrebakterier 6.3.15 Proteolytiske bakterier 6.3.16 Udgået 6.3.17 Salmonella 6.3.18 Skimmelsvampe og gær 6.3.19 Svovlbrinteproducerende bakterier i fisk 6.3.20 Staphylococcus aureus 6.3.21 Sulfitreducerende clostridier 6.3.22 Termotolerante coliforme bakterier / fækal coliforme bakterier 6.3.23 Vibrio parahaemolyticus 6.3.24 Yersinia enterocolitica 6.3.25 Aeromonas 6.4 Tælling og angivelse af kimtal 6.4.1 Tælling af mikroorganismer 6.4.2 Beregning af kimtal 6.4.3 Angivelse af kimtal 6.5 Øvrige metoder 6.5.1. pH 6.5.2 aW 6.5.3 Histamin

BILAG 1. FREMGANGSMÅDE VED MIKROBIOLOGISKE UNDERSØGELSER AF LEVNEDSMIDLER

Mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler inden for levnedsmiddellovens område er enten kontrolundersøgelser, screeningsundersøgelser eller overvågningsundersøgelser.

1.1 Kontrolundersøgelser

Når der gennemføres en mikrobiologisk kontrolundersøgelse på en prøve, gøres dette med to sæt parametre: Obligatoriske parametre og indikationsbaserede parametre. Disse to parametersæt bruges på følgende måde

1.1.1 Obligatoriske parametre

De obligatoriske parametre - der fremgår af bilag 2 - skal som minimum medtages ved mikrobiologisk analyse af de prøver, der ligger inden for rammen af minimumprøveudtagningen jf. Levnedsmiddelstyrelsens cirkulære nr. 36 af 29. februar 1996 om kontrol med levnedsmiddelvirksomheder m.m. - herefter benævnt kontrolcirkulæret. Når tilsynsmyndigheden skønner det relevant for kontrollens udførelse, medtages relevante indikationsbaserede parametre sammen med de obligatoriske parametre.

Er der i tilsynsmyndighedens kontrolaktivitetsplan fastsat en større prøveudtagningsfrekvens end den mindste prøveudtagningsfrekvens jf. kontrolcirkulæret, kan tilsynsmyndigheden ved disse prøveudtagninger vælge at se bort fra de obligatoriske parametre i analyseprogrammet og sammensætte et analyseprogram efter bilag 3 - indikationsbaserede parametre.

De obligatoriske parametre revurderes årligt på grundlag af tilgængelige oplysninger om forekomsten af levnedsmiddelrelaterede sygdomsfremkaldende mikroorganismer i alle led af produktion, omsætning og indtagelse.

Tilsynsvejledningerne for de autoriserede virksomheder kan omfatte undersøgelser, som ikke fremgår af bilagene.

1.1.2 Indikationsbaserede parametre

De indikationsbaserede parametre - som fremgår af bilag 3 - omfatter både kimtal og patogene mikroorganismer.

De indikationsbaserede undersøgelser tænkes anvendt, når tilsynsmyndigheden finder konkrete forhold, der kræver denne kontrol, eller erfaringen med den enkelte virksomhed specielt tilsiger denne særlige kontrol iværksat med det formål at kontrollere specifikke problemstillinger ved virksomhedens produktion og håndtering af levnedsmidler. Det er således ikke hensigten med de indikationsbaserede undersøgelser, at tilsynsmyndigheden forud fastsætter et generelt rutinevalg af indikationsbaserede parametre.

Ved prøveudtagninger inden for minimumprøveudtagningsfrekvensen kan de indikationsbaserede parametre anvendes som et supplement til de obligatoriske parametre, når dette skønnes relevant.

Ved prøveudtagninger, som ligger over minimumprøveudtagningsfrekvensen, kan de indikationsbaserede parametre anvendes som et supplement til eller helt erstatte de obligatoriske parametre.

Ved kontrolundersøgelserne vælger tilsynsmyndigheden frit i disse parametre, så der fastsættes et analyseprogram, der er relevant for den udtagne prøve.

Til de indikationsbaserede undersøgelser hører både undersøgelser for hygiejneparametre og undersøgelser for sygdomsfremkaldende mikroorganismer. Opmærksomheden henledes på, at kontrollen af patogener ønskes intensiveret, og at kontrollen derfor i videst muligt omfang ønskes baseret på disse parametre.

For de sygdomsfremkaldende mikroorganismer gives en kort beskrivelse af forskellige indikationsforhold i bilag 3.

1.2 Screeningsundersøgelser og overvågningsundersøgelser

Screeningsundersøgelser har til formål at kortlægge mikrobiologiske problemstillinger, mens overvågningsundersøgelser anvendes til over tid at følge udviklingen i forekomsten af mikroorganismer i levnedsmidler.

Screeningsundersøgelser gennemføres flere gange om året som hovedregel efter en forud fastlagt plan. Screeningerne kan være lokale eller landsdækkende og inddrage nogle eller alle levnedsmiddelkontrolenheder. Undersøgelserne søges tilrettelagt på en sådan måde, at det enkelte laboratorium vil kunne opretholde en rutine på flest mulige parametre.

Veterinær- og Fødevaredirektoratet udarbejder - efter drøftelse med tilsynsmyndighederne - hvert år inden den 1. oktober en samlet plan over det næste års screeningsprojekter. Der kan herudover i løbet af året forekomme screeningsprojekter, som det - efter drøftelse med tilsynsmyndighederne - skønnes nødvendigt at gennemføre. Der tænkes her på projekter nødvendiggjort af akut opståede problemer, hvor en afklaring her og nu er påkrævet.

Veterinær- og Fødevaredirektoratet udarbejder projektbeskrivelse for den enkelte screeningsundersøgelse og orienterer de deltagende laboratorier om undersøgelsens indhold og om den praktiske gennemførelse.

Veterinær- og Fødevaredirektoratet udarbejder efter hver undersøgelse en rapport, som indeholder en resultatvurdering. Resultater af gennemførte screeningsundersøgelser vil indgå i vurderingen ved revision af obligatoriske og indikationsbaserede parametre.

Overvågningsundersøgelser iværksættes af Veterinær- og Fødevaredirektoratet. Overvågningsundersøgelserne kan inddrage alle eller et antal levnedsmiddelkontrolenheder.

1.3 Meddelelse af resultat

Resultatet af laboratorieanalyserne samt tilsynsmyndighedens bemærkninger meddeles den virksomhed, hvor prøven er udtaget. Såfremt levnedsmidlet er tilvirket i en anden virksomhed end den, hvor prøven er udtaget, og undersøgelsen giver anledning til bemærkninger af sundhedsmæssig betydning, der kan henføres til produktionsvirksomheden, meddeles resultatet endvidere til den myndighed, der fører tilsyn med den pågældende virksomhed.

Tilsynsmyndigheden skal efter anmodning fra Veterinær- og Fødevaredirektoratet indberette oplysninger om de foretagne undersøgelser samt resultaterne heraf.

1.4 Område

Bilag 1-4 henvender sig specielt til levnedsmiddeltilsynet og bilag 6 til det mikrobiologiske laboratorium.

BILAG 2. OBLIGATORISKE PARAMETRE

I dette bilag angives de parametre, som det er obligatorisk at undersøge for ved kontrol i forbindelse med prøveudtagninger, der ligger indenfor minimumprøveudtagningsfrekvensen jf. kontrolcirkulæret. Efter tilsynsmyndighedens faglige vurdering kan der på samme prøve på indikation gennemføres analyser for yderligere mikrobiologiske parametre. For sådanne indikationsbaserede parametre henvises til bilag 3.

Bilaget er opdelt i relevante levnedsmiddelgrupper og undergrupper. For hver gruppe angives de parametre, som en undersøgelse af produkter inden for gruppen skal omfatte.

Visse produkter kan ikke indplaceres i de anførte levnedsmiddelgrupper. For sådanne produkttyper må tilsynsmyndigheden selv sammensætte et relevant program.

For at sikre en løbende vurdering af forekomsten af patogener skal de obligatoriske undersøgelser inden for de forskellige virksomhedskategorier spredes så jævnt som muligt over hele året.

2.1 Kød og kødvarer

2.1.1 Kød og kødprodukter, ikke varmebehandlede

Hele kødstykker

Produkteksempler: Udskæringer, indmad, marineret kød

Sensorisk undersøgelse

Hakket kød

Produkteksempler: Hakket kød, rørt fars

Sensorisk undersøgelse

Salmonella

Aerobt kimtal, 25 graderC

Tartar undersøges tillige for

Listeria monocytogenes (semikvantitativ metode)

Fjerkræ

Produkteksempler: Helt fjerkræ, udskæringer, hakket fjerkræ

Sensorisk undersøgelse

Salmonella

Termofile Campylobacter

Aerobt kimtal, 25 graderC (gælder kun hakket fjerkrækød)

2.1.2 Kød og kødprodukter, varmebehandlede

Produkter der ikke er håndterede eller minimalt

håndterede efter varmebehandling

Produkteksempler: Wienerpølser, kogt skinke og andre ikke skivede pålægsvarer

Sensorisk undersøgelse

Aerobt kimtal, 25 graderC

Produkter der er håndterede efter varmebehandling

Produkteksempler: Skivede pålægsvarer

Sensorisk undersøgelse

Listeria monocytogenes. Der anvendes normalt semikvantitativ metode. Hvis produktet har en holdbarhed på over 7 dage på prøveudtagningstidspunktet og samtidig formodes at understøtte vækst anvendes dog kvalitativ metode

Aerobt kimtal, 25 graderC

2.1.3 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter med en vandaktivitet over 0,94

Produkteksempler: Spegepølse, bacon, rå hamburgerryg, spegeskinke, filet

Sensorisk undersøgelse

Salmonella

Staphylococcus aureus

Listeria monocytogenes (semikvantitativ bestemmelse)

2.1.4 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter med en vandaktivitet under 0,94

Produkteksempler: Spegepølse

Sensorisk undersøgelse

2.2 Fisk og fiskevarer

2.2.1 Ferske fisk

Sensorisk undersøgelse

2.2.2 Udskæringer af fersk fisk, hakket fiskekød og skaldyr

Produkteksempler: Rå fiskefiletter, fiskefars

Sensorisk undersøgelse

Kimtal 21 graderC i Jern agar

Kimtal 15 graderC i Long and Hammer's medium (se 6.3.11.1).

2.2.3 Varmebehandlede fiskevarer

Produkteksempler: Fiskepate, rejer

Sensorisk undersøgelse

Kimtal 21 graderC i Jern agar (alternativt kan aerobt kimtal, 25 graderC benyttes).

2.2.4 Røgede og gravade fiskevarer

Produkteksempler: Røgede sild, fersk røget laks, gravad laks

Sensorisk undersøgelse

Listeria monocytogenes (semikvantitativ bestemmelse)

2.3 Frugt, grøntsager og produkter heraf

2.3.1 Ubehandlet frugt og grønt, tørrede frugter, marmelade, oliven m.m.

Sensorisk undersøgelse

2.3.2 Frøspirer og snittede grøntsager

Produkteksempler: Snittede blandede salater i detailemballage, bønnespirer

Sensorisk undersøgelse

Listeria monocytogenes (semikvantitativ bestemmelse)

Frøspirer undersøges tillige for Salmonella.

2.3.3 Varmebehandlede grøntsagsprodukter

Produkteksempler: Vegetabilske færdigretter, grøntsagspate

Sensorisk undersøgelse

Clostridium perfringens eller sulfitreducerende Clostridier

Bacillus cereus

Aerobt kimtal 25 graderC

2.4 Vin, øl og mineralvand

Sensorisk undersøgelse

2.5 Saft og saftprodukter

Sensorisk undersøgelse

2.6 Kage-, dessert- og konsumisprodukter

Produkteksempler: Kagecreme, flødeskum, fromage, budding og soft-ice

Sensorisk undersøgelse

Bacillus cereus

Fækal coliforme bakterier

Aerobt kimtal 25 graderC eller fremmede kim

2.7 Mayonnaisesalater og lignende

2.7.1 Mayonnaise og dressings

Sensorisk undersøgelse

pH

2.7.2 Mayonnaisesalater

Sensorisk undersøgelse

pH

Listeria monocytogenes. Der anvendes normalt semikvantitativ metode. Hvis produktet har en holdbarhed på over 7 dage på prøveudtagningstidspunktet og samtidig formodes at understøtte vækst anvendes dog kvalitativ metode

Aerobt kimtal 25 graderC eller fremmede kim

2.8 Krydderier, ikke afkimede

Produkteksempler: Sort peber, carry mv.

Sensorisk undersøgelse

2.9 Mælk og mælkeprodukter

2.9.1 Oste og osteprodukter

Sensorisk undersøgelse

Listeria monocytogenes. Der anvendes normalt semikvantitativ metode. Hvis produktet har en holdbarhed på over 7 dage på prøveudtagningstidspunktet og samtidig formodes at understøtte vækst anvendes dog kvalitativ metode.

Staphylococcus aureus

2.9.2 Mælk og øvrige mælkeprodukter

Sensorisk undersøgelse

2.10 Ammemælk, pasteuriseret

Sensorisk undersøgelse

2.11 Færdigretter

Produkteksempler: Spiseklare gryderetter, sovse, supper, andre ikke håndterede varmebehandlede levnedsmidler

Sensorisk undersøgelse

Clostridium perfringens eller sulfitreducerende Clostridier

Bacillus cereus

Aerobt kimtal, 25 graderC

2.12 Æg og ægprodukter

Produkteksempler: rå æg, æggestand, røræg, omelet

Sensorisk undersøgelse

Salmonella

BILAG 3. INDIKATIONSBASEREDE PARAMETRE

I dette bilag gives der forslag til parametre, som kan medtages ved den indikationsbaserede undersøgelse. Sådanne undersøgelser kan danne grundlag for en mere detaljeret vurdering af produkternes mikrobiologiske status.

Bilaget er opdelt i levnedsmiddelgrupper og undergrupper, som stort set svarer til opdelingen i bilag 2. I bilaget gives endvidere anvisninger på gennemførelse af holdbarhedsundersøgelser og rengøringskontrolundersøgelser.

De indikationsbaserede parametre kan anvendes på samme prøve som et supplement til de obligatoriske undersøgelser eller selvstændigt i forbindelse med analyse af prøver udtaget ud over frekvensen for minimumprøveudtagninger jf. kontrolcirkulæret.

Forhold, som kan give anledning til anvendelse af indikationsbaserede undersøgelse, er f.eks. mistanke om uhensigtsmæssig behandling eller håndtering af levnedsmidler, som ikke kan afsløres ved tilsynet. Endvidere kan der være behov for opfølgende eller dokumenterende undersøgelser ved mistanke om, at sygdom er opstået på grund af levnedsmidler, ved klager og i forbindelse med driftskontrol m.m. Ved de indikationsbaserede undersøgelser kan tilsynsmyndigheden frit sammensætte et undersøgelsesprogram, der belyser den aktuelle problemstilling.

Tilsynsmyndigheden kan iværksætte andre undersøgelser end de i bilaget foreslåede, hvis der er behov for det.

Kontrollen med patogener ønskes opprioriteret. Derfor bør der medtages analyser direkte for patogener, hvor det er mistanken om denne type forurening, der ønskes kontrolleret.

Hygiejneparametre

Ved hygiejneparametre forstås undersøgelse for indikatororganismer eller andet, der er relevant for den pågældende produkttype og for analysens formål. Eksempler er aerobt kimtal, mælkesyredannende bakterier, coliforme bakterier, termotolerante coliforme bakterier, enterococcer, Brochothrix thermosphacta og gær- og skimmelsvampe.

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

I ikke varmebehandlede kødvarer kan det, afhængigt af kødets oprindelse og risiko for krydskontaminering, være relevant ud over undersøgelse for Salmonella at undersøge for andre sygdomsfremkaldende mikroorganismer som f.eks. Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica og Campylobacter.

I situationer, hvor der er risiko for krydskontaminering af varmebehandlede produkter fra alle typer råvarer kan det være relevant at undersøge for Listeria monocytogenes. I situationer, hvor der er særlig risiko for krydskontaminering fra råt kød, især fjerkræ, kan det endvidere være relevant at analysere for Campylobacter. Ved mistanke om, at personer med hudlæsioner har håndteret varmebehandlede produkter, er det relevant at analysere for Staphylococcus aureus. Ved mistanke om afkølingsfejl eller opbevaring ved for høj temperatur af sammenkogte kød- og grøntsagsretter eller produkter med ikke afkimede krydderier er det relevant at analysere for Clostridium perfringens og Bacillus cereus. Det samme gælder varmebehandlede produkter, der opbevares varmeholdte ved for lav temperatur. Det er relevant at undersøge for Listeria monocytogenes og Yersinia enterocolitica i fersk kød og behandlede kødvarer, som er pakket med en teknik, der har til hensigt at forlænge produkternes holdbarhed, f.eks. modificeret atmosfære pakning og vakuum pakning.

3.1 Levnedsmiddelgrupper

3.1.1 Kød og kødvarer

3.1.1.1 Kød og kødprodukter, ikke varmebehandlede

Hygiejneparametre

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

3.1.1.2 Kød og kødprodukter, varmebehandlede

Hygiejneparametre

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

3.1.1.3 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter

Hygiejneparametre

aW/saltprocent

pH (fermenterede produkter)

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

3.1.2 Fisk og fiskevarer

Hygiejneparametre

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

Hygiejneparametre

Ved bestemmelse af kimtal benyttes Jern agar ved 21 graderC (specifikke fordærvelsesbakterier). Ved bestemmelse af kimtal i MA-pakkede ferske saltvandsfisk og fiskevarer benyttes Long and Hammer's medium ved 15 graderC (se 6.3.11.1). I øvrigt benyttes hygiejneparametre som beskrevet i indledningen til bilag 3.

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

I fisk kan der, hvor det skønnes at være relevant, analyseres for Salmonella, Listeria monocytogenes og Vibrio spp.

3.1.3 Frugt, grøntsager og produkter heraf

aW (tørrede produkter)

pH (syrnede produkter)

3.1.4 Vin, øl og carboniseret mineralvand

pH

Hygiejneparametre: For frisktappede produkter kimtal

Der henvises i øvrigt til bekendtgørelse nr. 463 af 5. september 1984 om naturligt mineralvand.

3.1.5 Saft og saftprodukter

Gær og skimmel

pH

3.1.6 Kage-, dessert- og konsumisprodukter

Hygiejneparametre

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

3.1.7 Mayonnaisesalater og lignende

Hygiejneparametre

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

I mayonnaisesalater, som er fremstillet i detailleddet, kan den obligatoriske undersøgelse for Listeria monocytogenes suppleres med undersøgelse for Salmonella og Bacillus cereus.

3.1.8 Krydderier, ikke afkimede

3.1.9 Mælk og mælkeprodukter

Der henvises til Veterinærdirektoratets cirkulære af 15. juli 1996 om undersøgelsesfrekvens, parametervalg, normer og metoder ved den laboratoriemæssige undersøgelse af mælk, mælkeprodukter m.v.

3.1.10 Ammemælk, pasteuriseret

Hygiejneparametre

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer.

Sygdomsfremkaldende mikroorganismer

Ved mistanke om utilstrækkelig varmebehandling af ammemælk vil det være relevant at undersøge for Staphylococcus aureus samt for hæmolytiske streptokokker.

3.2 Holdbarhedsundersøgelser

Holdbarhedsundersøgelse foretages på færdigpakkede levnedsmidler forsynet med datoen for mindste holdbarhed, »Mindst holdbar til« eller »Sidste anvendelsesdato«, med det formål at vurdere den hygiejniske og sundhedsmæssige kvalitet af levnedsmidlet ved holdbarhedstidens udløb.

Oplysningen »Mindst holdbar til« eller »Sidste anvendelsesdato« angiver den dato, til og med hvilken produktet efter korrekt opbevaring har bevaret sine specifikke egenskaber.

Prøver til holdbarhedsundersøgelse udtages som hovedregel på den virksomhed, hvor levnedsmidlet er færdigpakket, og transporten til laboratoriet skal ske under iagttagelse af den foreskrevne opbevaringstemperatur. Hvis der er indikation herfor, kan der også udtages prøver, som ikke er færdigpakkede i den pågældende virksomhed. Prøver opbevares på laboratoriet i ubrudt forbrugerpakning ved den opbevaringstemperatur, som er anført på pakningen indtil holdbarhedstidens udløb.

Undersøgelsen består i en bedømmelse af den sensoriske tilstand. Ved vurderingen heraf er det vigtigt at skelne mellem kvalitetsfaktorer og sådanne forhold, som kan tilskrives holdbarhedsmæssige forandringer. En vare kan eksempelvis tilsigtet have en syrlig smag, hvilket ikke må bedømmes som en fejl med holdbarhedsmæssig årsag. Holdbarhedsundersøgelsens resultat kan derfor med fordel sammenlignes med bedømmelse af en initialprøve samt videre, når dette skønnes nødvendigt, suppleres med en bedømmelse af prøver opbevaret i en del af holdbarhedsperioden.

Sensoriske forandringer er begrundet i enzymatisk aktivitet af oftest mikrobiel oprindelse, og i tilfælde af væsentlige afvigelser i forhold til initialprøven bør supplerende mikrobiologiske parametre indgå i undersøgelsen af holdbarhedsprøverne. Supplerende undersøgelser kan omfatte mikroorganismer med høj biologisk aktivitet f.eks. Brochothrix thermosphacta, gær, proteolytiske bakterier, Shewanella putrefaciens o.a., afhængig af den sensorske tilstand og levnedsmidlets art. Der bør desuden foretages en mikroskopisk undersøgelse.

Den sensoriske vurdering af holdbarhedsundersøgelsen bør mindst omfatte bedømmelse af udseende, lugt og evt. smag.

Holdbarhedsundersøgelsen omfatter evt. også undersøgelse for forekomst af sygdomsfremkaldende mikroorganismer. Man skal være opmærksom på, at f. eks. Listeria monocytogenes i visse levnedsmidler vil kunne opformeres til et uacceptabelt niveau uden at medføre erkendelige sensoriske forandringer.

3.3 Rengøringskontrolundersøgelser

Som angivet i NMKL nr. 5, 4. udg., 1987, idet det dog i visse tilfælde kan være en fordel at anvende kommercielt fremstillede rengøringskontrolsystemer.

BILAG 5. PRØVEUDTAGNING

5.1 Udtagning af prøver

Prøver til laboratorieundersøgelse udtages som led i tilsynsmyndighedens tilsyn og kontrol med levnedsmiddelvirksomhederne.

Prøverne skal udtages af personale ansat ved levnedsmiddelkontrolenhederne. Prøveudtageren skal være instrueret om, hvorledes prøverne skal udtages. Der bør være en repræsentant fra virksomheden til stede under prøveudtagningen.

Hvis virksomheden ønsker det, skal der tages en kontraprøve, som virksomheden kan anvende til at efterprøve tilsynsmyndighedens analyseresultat. Kontraprøven skal opbevares, analyseres m.v. efter anvisning af tilsynsmyndigheden.

Prøveudtagningen kan omfatte prøver af færdigvarer, halvfabrikata, råvarer, emballage samt prøver til undersøgelse af inventar og redskaber.

Prøvens størrelse skal være sådan, at de undersøgelser, der foreskrives i nærværende cirkulære, kan gennemføres. Af ikke færdigpakkede levnedsmidler udtages normalt mindst 200 g.

Ved vurdering af et parti kan det være nødvendigt at lade prøven bestå af flere stikprøveenheder. Der henvises til NMKL rapport nr. 2, 1983, vedr. udtagning af stikprøveenheder og delprøver af levnedsmidler til mikrobiologiske undersøgelser samt til kapitlerne 11-26 i »Microorganisms in Foods 2, Sampling for microbiological analysis: Principles and specific applications«, ICMSF 1986, der omhandler prøveudtagningsplaner for forskellige levnedsmiddeltyper.

5.2 Prøveudtagningsteknik

Personale, der foretager prøveudtagning, skal være orienteret om principperne for korrekt udtagning af prøver.

Beholdere og udstyr, der anvendes ved prøveudtagning, skal være rene, tørre og sterile. Sterilisering skal foretages ved autoklavering ved 121 graderC i 15 minutter, tørsterilisering ved 170 graderC i minimum 1 time eller tilsvarende. Kommercielt tilgængelige sterile prøvebeholdere, spatler, skeer og andet udstyr kan anvendes.

Prøvebeholderen skal umiddelbart før eller efter prøveudtagningen mærkes på en holdbar måde, således at den pågældende prøve kan identificeres entydigt.

Prøver skal transporteres til laboratoriet så hurtigt som muligt. Under transporten skal prøverne opbevares, så de ikke udsættes for forurening fra omgivelserne. Prøverne skal under transporten opbevares ved en temperatur på 0-5 graderC, og prøver af frosne produkter skal opbevares nedfrosset indtil analyse.

Let-fordærvelige prøver, der ikke kan analyseres umiddelbart efter ankomsten til laboratoriet, skal opbevares ved 0-5 grader C.

Prøver må højst opbevares i 24 timer fra prøveudtagning til analysen påbegyndes, med mindre der er tale om en holdbarhedsprøve, som opbevares efter forskriften indtil analyse.

5.3 Prøveudtagningsrapport

Der skal ved hver prøveudtagning udarbejdes en prøveudtagningsrapport, som skal indeholde følgende oplysninger

1) Entydig prøvenummerering

2) Virksomheden, hvor prøven er udtaget

3) Virksomheden, hvor produktet er fremstillet

4) Årsag til prøveudtagningen

5) Prøvetype / tilstrækkelige oplysninger til entydig identifikation

6) Fremstillingstidspunkt - om muligt

7) Holdbarhed

8) Eventuel identifikation af levnedsmiddelparti

9) Opbevaringsforhold i virksomheden - herunder temperatur for køle- og frostvarer

10) Hvor i produktionsforløbet prøven er udtaget, hvis det er relevant for vurdering af prøven

11) Dato og klokkeslet for prøvetagningen

12) Dato og klokkeslet for modtagelse af prøven på laboratoriet

13) Prøveudtagerens navn

BILAG 6. METODER

Dette bilag indeholder metoder for undersøgelse af de parametre, som er angivet i bilag 2 og 3.

Mange af metoderne henviser til metoder publiceret af Nordisk Metodik-Komite for Levnedsmidler, NMKL, med eventuelle præciseringer og tilføjelser.

Metoderne er angivet i alfabetisk rækkefølge.

De i cirkulæret anførte metoder er gældende indtil andet angives ved skrivelse fra Veterinær- og Fødevaredirektoratet.

Alternative metoder må anvendes efter godkendelse fra Veterinær- og Fødevaredirektoratet.

Substrater, der varierer i sammensætning fra den anviste opskrift, må anvendes efter Veterinær- og Fødevaredirektoratets tilladelse. Kommercielle substrater skal fremstilles efter fabrikantens anvisninger.

Tolerancer for inkubationsbetingelser og pH i substrater er generelt

For lufttermostater: +/- 1,0 graderC

For vandbadstermostater: +/- 0,2 graderC

Ved autoklavering: +/- 2,0 graderC

For pH i substrater (incl. fortyndingsvæske): +/- 0,2

For inkubationstider

- 24 timer +/- 3 timer

- 48 timer +/- 4 timer

- 72 timer +/- 6 timer

Tolerancerne er i overensstemmelse med den reviderede »Handledning i kvalitetssakring for mikrobiologiske laboratorier«, NMKL-rapport nr. 5, 2. udgave, 1994. Tolerancerne er gældende generelt, medmindre andet er præciseret i nærværende cirkulære. Hvis en mere snæver tolerance er angivet for et givet kommercielt substrat, skal denne dog overholdes.

Smeltede substrater skal opbevares i vandbad ved 45-48 graderC

Anvendelse af positiv kontrol

Ved en undersøgelse for patogener, hvor der anvendes flydende opformering, skal der medtages en positiv kontrol for at sikre, at den anvendte teknik og de anvendte medier fungerer tilfredsstillende. Kontrollen udføres ved, at den pågældende mikroorganisme opslemmes i en passende koncentration i et passende medium, hvorefter hele analysen, inclusive alle opformeringstrin, udføres. Et passende medium kan være normal fortyndingsvæske eller bedre en levnedsmiddelprøve, der vil give en mere realistisk kontrol.

6.1 Forbehandling af prøver

6.1.1 Metodik

Som anført i NMKL nr. 91, 2. udg. 1988.

6.1.2 Prøvemængde

Det må tilstræbes at tage mindst 5-10 g prøve i arbejde ved undersøgelse. Ved undersøgelse for specifikke patogene mikroorganismer kan det være foreskrevet at tage andre prøvemængder i arbejde.

6.1.3 Forbehandling af dybfrosne levnedsmidler

Dybfrosne levnedsmidler optøes i køleskab ved højst 5 graderC. Prøven tages i arbejde så hurtigt, at en repræsentativ delprøve kan udtages. Optøningsproceduren skal være tilendebragt inden for højst 24-26 timer. Løs-frosne prøver, hvor optøning ikke er nødvendig, kan direkte tages i arbejde.

6.2 Sensorisk undersøgelse

En sensorisk undersøgelse og vurdering udgør et vigtigt led ved gennemførelse af en laboratoriemæssig undersøgelse af et levnedsmiddel. Objektive analyser, som omfatter mikrobiologiske, kemiske og fysiske undersøgelser, er ofte ikke tilstrækkelige for en vurdering af levnedsmidlets sundhedsmæssige og hygiejniske kvalitet, men må suppleres med en sensorisk bedømmelse.

For visse levnedsmidler er en sensorisk analyse ofte tilstrækkelig for kontrolmyndighedens vurdering af et levnedsmiddel. Dette gælder f.eks. ved undersøgelse af friske frugter og visse produkter heraf.

Såfremt der ved den indledende sensoriske bedømmelse af et levnedsmiddel er konstateret en abnorm tilstand, f.eks. abnorm lugt, kan objektive analyser medvirke til en nærmere opklaring af årsagsforholdene og som dokumentation, men er egentlig ikke påkrævet for vurderingen af levnedsmidlets hygiejniske og sundhedsmæssige kvalitet.

6.2.1 Forhold af betydning for undersøgelsen

Den sensoriske bedømmelse udføres i tilslutning til den laboratoriemæssige analyse og skal indeholde en bedømmelse af levnedsmidlets udseende, farve, konsistens, lugt og eventuelt smag. Smagsmæssig bedømmelse udelades, hvis der er mistanke om tilstedeværelse af mulige sygdomsfremkaldende mikroorganismer. Vurderingen foretages i relation til en »normaltilstand«, hvorfor det er vigtigt, at der til brug for bedømmelsen er erhvervet et grundigt kendskab til produkternes normale karakteristika.

En sensorisk bedømmelse er behæftet med usikkerhed på grund af, at den indeholder et subjektivt skøn, og forskelle i ydre vilkår kan endvidere øge denne usikkerhed.

For at reducere en uheldig virkning af de ydre vilkårs indflydelse på bedømmelsen bør laboratoriet indføre en række praktiske regler for bedømmelsens udførelse. Af sådanne regler kan nævnes

- Bedømmelsen bør optimalt foretages af flere personer, som gennem erfaring og optræning har opnået et kendskab til levnedsmidlets normale sensoriske karakteristika.

- Bedømmelsen bør fra gang til gang foretages under de samme lokalemæssige forhold, herunder lys og temperaturforhold, og uden at der i lokalet er forstyrrende fremmede lugte og i øvrigt under rolige betingelser. Mindst 1 time før analysens gennemførelse bør der ikke indtages nydelsesmidler, mad eller lignende, der kan påvirke (bedøve) smagsevnen, ligesom også håndvask med sæbe lige før undersøgelsen forstyrrer denne.

- Lugtbedømmelsen bør normalt foretages ved stuetemperatur, og det er en fordel, at prøverne i forvejen er varmet op til denne temperatur. Ofte kan man dog med fordel lugtbedømme den samme vare både i kold tilstand (frossen eller kølet), og efter at denne har antaget stuetemperatur. Lugtbedømmelse foretages bedst på friske brud- eller snitflader. Mange af de kemiske forbindelser, der er ansvarlige for dårlig lugt, er luftarter med lavt damptryk, der kan erkendes allerede på frosne eller kølede levnedsmidler. Ved undersøgelse af vakuumpakkede kødvarer kan der ofte ved pakkens åbning konstateres en karakteristisk »poselugt«, som kan forsvinde, efter at pakken har været åbnet 10-15 minutter. »Poselugt« behøver ikke at betyde, at varen er mikrobielt fordærvet.

6.2.2 Undersøgelsens gennemførelse

Prøvens udseende

Undersøgelsen omfatter en bedømmelse af prøvens farve, konsistens, forekomst af eventuelle defekter m.v. Det bemærkes, om levnedsmidlets overflade er fugtig, slimet, indtørret, smudskontamineret, belagt med udfældninger (f.eks. saltudslag), mugpletter eller lignende. For visse levnedsmidler bør der foretages en vurdering af såvel overflade som dybde.

Bedømmelse af konsistens og tekstur kan være særlig værdifuld for vurdering af den sensoriske kvalitet af f.eks. kød, fersk fisk, pølser samt visse frugter og grønsager.

Lugt

Afvigende lugt skyldes ofte dannelse af flygtige nedbrydningsprodukter, hvorved levnedsmidlet kan få en lugt, der, afhængig af mikrofloraen, kan være sur, stikkende, frugtagtig, blomsteragtig, acetonelignende, kemikalieagtig, ammoniakalsk eller putrid m.m.

Afvigende lugtforekomst kan imidlertid også skyldes f.eks. medikamentel behandling, restforekomst af kemikalier eller kønslugt hos slagtedyr.

I tilfælde, hvor mistanke om afvigende (abnorm) lugt foreligger i kød- og fedtprøver, bør den umiddelbare undersøgelse suppleres med en koge- og/eller stegeprøve.

Kogeprøve

Udføres bedst ved at anbringe terninger af prøven i kogekolbe (f.eks. 300 ml erlenmeyerkolbe). Der tilsættes så meget vand, at prøvematerialet netop dækkes, og kolben pålægges et urglas, hvorefter kolben opvarmes til svag kogning.

Man lugter til dampene i kolbens hals efter opvarmningens afslutning og efter delvis afsvaling.

Stegeprøve

Udføres ved stegning på omhyggelig rengjort pande eller i øvrigt efter producentens anvisning og uden anvendelse af fedtstof.

6.3 Metoder for mikrobiologiske analyser

Aeromonas

Se 6.3.25

6.3.1 Bacillus cereus

Metodik

Som anført i NMKL nr. 67, 4. udgave, 1997.

Ved undersøgelse af levnedsmidler, som formodes at have højt indhold af gramnegative bakterier, kan blodagar tilsættes 25 i.e. Polymyxin B-sulfat eller 75 i.e. Kolistin sulfat pr. ml.

6.3.2 Bakteriesporetal

Metodik

Den forbehandlede delprøve (10-1 fortynding) varmebehandles i vandbad ved 80,0 +/- 1,0 graderC i 10 minutter.

Videre 10 folds fortyndinger fremstilles ud fra denne jfr. 6.1.

Aerobe sporedannende bakterier: Der udsås af passende fortyndinger i blodagar jfr. 6.3.10.

Dyrkning: 30,0 graderC i indtil 8 døgn.

Sulfitreducerende clostridier: Der udsås 1 ml af passende fortyndinger i Jern-sulfit agar (se NMKL nr. 56, 3. udgave, 1994).

Dyrkning: 37,0 graderC i indtil 8 døgn.

Andre inkubationsbetingelser kan anvendes, når der er behov for dette.

6.3.3 Brochothrix thermosphacta

Metodik

Som anført i NMKL nr. 141, 1991.

Forbehandling af prøven kan foretages som anført i MNKL nr. 91, 2. udgave, 1988.

6.3.4 Termofile Campylobacter

Metodik

Som anført i NMKL nr. 119, 2. udgave, 1990, med følgende præciseringer

Til de termofile Campylobacter af betydning for human sygelighed, der kan påvises ved denne metode, regnes primært Campylobacter jejuni subsp. jejuni, Campylobacter coli og Campylobacter lari.

Pkt. 5.1

Substraternes pH skal være 7,4+/-0,2. Som alternativ til hesteblod kan kalveblod anvendes. Citratstabiliseret blod kan anvendes som alternativ til defibrineret blod.

Pkt. 9.1

Ved præopformeringen inkuberes 25 g prøve i 225 ml Prestonbouillon. Der kan anvendes 250 ml flaske med tætsluttende skruelåg, hvorved præopformeringsbouillonen ikke behøver mikroaerofile inkubationsbetingelser.

Præopformeringbouillonen inkuberes ved 42,0+/-0,5 graderC i 24 timer.

Pkt. 9.2

Modified Charcoal - Cefoperazone - Desoxycholate - Agar (mCCDA), erstatter brugen af Preston - og CBFS agar. mCCDA findes kommercielt tilgængelig.

Pkt. 9.5

Præsumptive Campylobacter rendyrkes på blodagar (Base 2).

Pkt. 9.6

Indoxyl acetat hydrolyse.

Med henblik på at opnå yderligere sikkerhed i differentieringen mellem de tre »termofile« species af Campylobacter ( C. jejuni, C. coli og C. lari ) kan der udføres en test for indoxyl acetat hydrolyse . I denne test vil C. jejuni og C. coli være positive mens C. lari vil være negativ.

Materialer

Indoxyl acetat (Sigma I-3500)

Acetone

Concentration disks 1/2' (Difco 1571-33)

Destilleret vand

Der fremstilles en 10% (vægt/volumen) opløsning af indoxyl acetat i acetone. Hver disk påsættes 25 microl af denne opløsning. Diskene lufttørres ved stuetemperatur. Efter tørring kan diskene opbevares mørkt i en lufttæt beholder ved 4 graderC. De imprægnerede disks er holdbare i mindst 6 måneder, hvis de opbevares mørkt og fugtfrit ved 4 graderC.

Fremgangsmåde

Med podenål overføres kolonimasse til en indoxyl acetat imprægneret disk. Der påsættes herefter 1 - 2 dråber destilleret vand. Reaktionen aflæses efter 10 min..

Aflæsning

Indoxyl acetat positiv

Udvikling af blå/blågrøn farve efter 10 min.

Indoxyl acetat negativ

Ingen farveændring efter 10 min.

Pkt. 9.6.1

Ved udførelse af test for hippurat-hydrolyse overføres rigelig kolonimasse til Na-hippuratopløsningen.

FLOW DIAGRAM FOR PÅVISNING AF TERMOFILE CAMPYLOBACTER --------------------------------- --------------------------------- Flydende levnedsmidler Centrifugering eller f.eks. mælk, vand filtrering gennem 0,45 my eller 0,22 my membranfiltre --------------------------------- --------------------------------- --------------------------------- --------------------------------- Faste levnedsmidler med lavt Prestonbouillon, indhold af Campylobacter 42,0 +/- 0,5 graderC i 24 timer 25 g prøve tilsættes 225 ml 250 ml flaske m. tætsluttende Prestonbouillon låg el. mikroaerofil atm. --------------------------------- --------------------------------- --------------------------------- --------------------------------- Prøver med forventet højt Modificeret CCDA agar indhold af Kraftig udsæd. 42,0 +/- Campylobacter 0,5 graderC i op til 48 t. microaerofil atm. --------------------------------- --------------------------------- --------------------------------------------- Fasekontrast-mikroskopi af suspekte kolonier. Eller farvning med 2% karbolfuksin i 5 minutter. --------------------------------------------- ---------------------------- Blodagar Rendyrk- 42,0 +/- 0,5 graderC ning 20-24 t. Mikroaerofil atm. ---------------------------- ---------------------------- Verifi- Katalase + kation Cytochromoxidase + ---------------------------- ------------------------------------------------ hippurat indoxylacelat nalidixin hydrolyse hydrolyse følsomhed Biokemisk C. jejuni + + + differentie- C. coli - + + ring C. lari - - - ------------------------------------------------

Hurtigmetoder

Gen-Probe Accuprobe Campylobacter Culture Identification Test

Gen-Probe Accuprobe Campylobacter Culture Identification, kat.nr. 2810, fra Kingo Diagnostika ApS kan anvendes til verifikation af Campylobacter jejuni, Campylobacter coli og Campylobacter lari fremvokset på fast substrat efter forudgående opformering i forbindelse med NMKL nr. 119, 1990.

Metoden er produceret af Gen-Probe. Metoden udføres efter producentens anvisninger.

6.3.5 Clostridium perfringens

Metodik

Som anført i NMKL nr. 95, 3. udgave, 1997.

6.3.6 Coliforme bakterier

Metodik

Som anført i NMKL nr. 44, 4. udgave, 1995.

6.3.7 Enterobacteriaceae

Metodik

Som anført i NMKL nr. 144, 1992, med følgende bemærkninger.

Pkt. 8.3

Konfirmering udføres, når dette er ønskeligt eller nødvendigt.

6.3.8 Enterococcer

Metodik

Som anført i NMKL nr. 68, 2.udgave, 1992.

6.3.9 Gær og skimmel

Metodik

Som anført i NMKL nr. 98, 3. udgave, 1995, med følgende ændringer

Forbehandling af prøven kan foretages som anført i NMKL nr. 91, 2. udgave, 1988.

Undersøges alene for gær kan substratet OGYE (Oxytetracyclin-Glucose-Yeats-extract) agar med følgende sammensætning benyttes

Gærekstrakt 5,0 g Glucose 20,0 g Biotin 0,0001 g Agar 12,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,0

Opvarm til alle ingredienser er opløst. Fordel på flasker med 100-200 ml i hver og autoklaver ved 115 graderC i 10 minutter.

Til det smeltede, til 50 graderC nedkølede substrat, tilsættes før brug 1 ml oxytetracyclinopløsning pr. 100 ml, der fremstilles ved at opløse 100 mg oxytetracyclin i 10 ml destilleret vand som derefter sterilfiltreres.

Dyrkning

25,0 graderC i 5 døgn.

6.3.10 Kim på blodagar

Metodik

Der anvendes dybde- eller overfladeudsæd i blodagar med følgende sammensætning

Pepton 10,0 g Kødekstrakt 5,0 g Natriumklorid 7,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand ad 1.000ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,2

Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, overføres substratet til mindre flasker, der autoklaveres ved 121 graderC i 15 minutter.

Der kan også anvendes blodagar som foreskrevet i Veterinærdirektoratets cirkulære af 1. november 1984 om mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler og Veterinærdirektoratets cirkulære af 15. marts 1983 med senere ændringer om mikrobiologiske undersøgelser af fersk kød, fersk fjerkrækød og kødvarer m.m. på de eksportautoriserede kødvirksomheder.

Til det smeltede og til 45-48 graderC afkølede substrat tilsættes 5-8% sterilt, stabiliseret eller defibrineret kalveblod samt evt. 25 i.e. Polymyxin B-sulfat eller 75 i.e. Kolistin sulfat pr. ml.

Såfremt blodpladerne skal anvendes specielt til at påvise grampositive hæmolytiske bakterier, kan de gram-negative stavbakterier hæmmes ved tilsætning af Polymyxin B-sulfat som oven for anført. Hvis blodpladerne derimod skal anvendes til en generel vurdering af mikrofloraen i et levnedsmiddel, anvendes blodagar uden hæmmende stoffer.

Dyrkning

37,0 graderC i 24-48 timer.

Andre inkubationsbetingelser kan anvendes, når der er behov for dette.

Aflæsning

Aflæsning og vurdering af hæmolytiske bakterier foretages efter 24 og 48 timer. Kimtallet aflæses efter 48 timer.

Hovedgrupperne af den fremvoksende mikroflora vurderes og sammenholdes med øvrige kimtal. Såfremt hæmmende stoffer ikke er anvendt, kan samtlige kolonier tælles, og resultatet anvendes som et 37 graderC kimtal. Hæmolytiske bakterier kan tælles, og arten af de dominerende typer evt. angives efter fornøden identifikation.

6.3.11 Kimtalsbestemmelse

Kimtalsbestemmelse kan omfatte

- Aerobt kimtal

- Antal psykotrofe bakterier

- Fremmede kim

- Kim på blodagar

6.3.11.1 Aerobt kimtal

Aerobt kimtal i Plate Count Agar

Som anført i NMKL nr. 86, 2. udgave, 1986. Bestemmelse af total kimtal udføres ved anvendelse af Plate Count agar, inkuberet ved 25,0 graderC i 3 døgn. Ved aflæsning foretages, udover tælling af antallet af kolonier, en vurdering af floraens sammensætning. Afvigelser fra normalfloraen noteres.

Aerobt kimtal i Jernagar

Som anført i NMKL nr. 96, 2. udgave, 1994 med rettelsesblad af december 1994.

Inkubation kan foretages ved en temperatur i intervallet 20-25 graderC

Aerobt kimtal i Long and Hammer agar

Floraen i modificeret atmosfære pakket ferske saltvandsfisk og fiskevarer domineres af fordærvelsesbakterien Photobacterium phosphoreum, som ikke er i stand til at vokse på jernagar. I stedet anvendes overfladeudsæd på Long and Hammer agar med 1% NaCl.

Metodik

Der anvendes overfladeudsæd på Long and Hammer (1% NaCl) agar med følgende sammensætning

Proteose-pepton (Difco 0120-17-6) 20,0 g Gelatine 40,0 g K2HPO4 1,0 g NaCl 10,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand ad 1000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,0

Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 graderC i 15 minutter.

Ferricitrat tilsættes substratet til en koncentration på 0,25 g/l i det færdige substrat. Denne koncentration opnås ved at tilsætte 0,25 ml af en 10% opløsning pr. 100 ml færdigt substrat.

Fortyndingsvæske og substrat afkøles til ca. 5 graderC før brug. Temperaturen i prøven og i fortyndinger heraf må ikke overskride 20 graderC.

Dyrkning

15 graderC i 5 døgn.

Aflæsning

Efter endt inkubation tælles kolonier.

6.3.11.2 Psykrotrofe bakterier

Metodik

Som anført i NMKL nr. 74, 2. udgave, 1989.

6.3.11.3 Fremmede kim

Metodik

Der anvendes dybdeudsæd i Sukkerfri-pepton agar med følgende sammensætning

Pepton (kulhydratfri) 7,5 g Trypton (kulhydratfri) 7,5 g Natriumklorid 5,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,6

Bestanddelene opløses evt. under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 graderC i 15 minutter.

Substratet er kommercielt tilgængeligt.

Dyrkning

25,0 graderC i ca. 72 timer.

Aflæsning

Alle kolonier botset fra pin-point kolonier tælles.

Man skal være opmærksom på, at en evt. ikke-mikroaerofil del af starterkulturen vil have gode vækstbetingelser på en sukkerfri agar. Vurdering af resultatet er derfor vanskelig, med mindre starterkulturens sammensætning er kendt.

Andre inkubationsbetingelser kan anvendes, når der er behov for dette.

6.3.11.4 Direkte Epifluorescens Filter Teknik (DEFT)

Metodik

Som anført i NMKL nr. 137, 1990.

6.3.12 Lactobaciller

Der findes i dag ikke metoder til undersøgelse for lactobaciller specifikt. Der henvises til afsnit 6.3.14 Mælkesyrebakterier.

6.3.13 Listeria monocytogenes

Kvalitativ bestemmelse

Metodik

Som anført i NMKL nr. 136, 1990, med følgende præciseringer

Pkt. 6.5

Alternativt til den foreskrevne BA kan tynde blodagarplader med bundlag benyttes. Disse fremstilles på følgende måde

Hæld 10 ml smeltet og afkølet blodagar base uden blodtilsætning op i en petriskål. Efter størkning, og medens agaren stadig er varm, påhældes 6 ml blodagar, som fordeles jævnt. Pladerne opbevares i køleskab i plastpose. Disse tynde blodagarplader kan afsløre Listerias Beta-hæmolyse, der undertiden kan være meget svag.

Hæmolysen hos L. monocytogenes kan være meget svag og kan evt. kun ses under selve kolonien, hvorfor denne bør fjernes på et repræsentativt antal kolonier for at bedre vurderingen.

pkt. 9.3

Udstrygning kan i stedet foretages med en 10 microl øjepodenål.

Pkt. 9.4.7

CAMP-test kan udelades.

Semi-kvantitativ bestemmelse

5-10 g levnedsmiddel stomacheres med 9 dele fysiologisk kogsaltopløsning med pepton, hvorefter en 10-folds fortyndingsrække fremstilles. 1.0 ml fra hver fortynding overføres til 9 ml LB I til undersøgelse for indhold af L. monocytogenes efter NMKL forskrift nr. 136 med ovennævnte modifikationer. Fravær af L. monocytogenes ved udsæd fra 10-1 fortyndingen (den stomacherede prøve) svarer til, at bakterien ikke påvises i 0.1 gram og dermed har en forekomst på < 10/gram. Påvises L. monocytogenes ikke ved udsæd fra 10-2 fortyndingen, har bakterien tilsvarende en forekomst på < 100/gram.

Hurtigmetoder

GEN-PROBE Accuprobe Listeria Monocytogenes

GEN-PROBE Accuprobe Listeria Monocytogenes fra Kingo Diagnostica ApS kan anvendes til verifikation af Listeria monocytogenes fremvokset på fast substrat efter forudgående opformering i forbindelse med NMKL nr. 136, 1990.

Metoden produceres af GEN-PROBE INC. Metoden udføres efter producentens anvisninger. Metoden må kun anvendes på kolonier, der er rendyrkede på blodagar.

Oxoid Listeria Rapid Test

Oxoid Listeria Rapid Test fra Oxoid A/S kan anvendes til påvisning af Listeria species i alle typer levnedsmidler. Metoden kan således anvendes til udpegning af prøver med muligt indhold af Listeria monocytogenes.

Metoden produceres af Unipath LTD. Metoden udføres efter producentens anvisninger.

Transia Plate Listeria Kit

Transia Plate Listeria Kit kat.nr. LI 691, LI 681, LI 685, LI 689 og LI 694 fra Diffchamb Danmark A/S kan anvendes til påvisning af Listeria spp. i alle levnedsmidler.

Metoden produceres af Diffchamb SA. Metoden udføres efter producentens anvisninger.

FLOW DIAGRAM FOR PÅVISNING AF LISTERIA MONOCYTOGENES --------------------------------------------- Selektiv opformering: 25 g prøve tilsættes 225 ml LB-I 30,0 graderC i 24 +/- 2 t. --------------------------------------------- --------------------------------------------- 0,1 ml LB-I podes i 10 ml LB-II 30,0 graderC i 24 +/- 2 t. --------------------------------------------- --------------------------------------------- Subkultivering Oxford-agar, evt. suppleret med Palcam-agar 37,0 graderC i 24 og 48 t +/- 2 t --------------------------------------------- --------------------------------------------- Rendyrkning Blodagar mindst 10 suspekte Listeria kolonier (beta-hæmolytiske) 37,0 graderC i 24-48 t. --------------------------------------------- --------------------------------------------- BHI agar (eller anden non-selektiv agar uden blod) 37,0 graderC ca. 20 t. --------------------------------------------- --------------------------------------------- Gram positiv Katalase positiv Bevægelig: Paraplyvækst i halvflydende agar, eller tumlende bevægelser ved direkte mikroskopi --------------------------------------------- --------------------------------------------- CAMP-test (kan udelades) Kulhydratforgæring: Rhamnose positive Xylose negativ 37,0 graderC 1-7 dage (Verifikationen kan afsluttes efter 24-48 timer, hvis isolatet er Rhamnose-positivt) ---------------------------------------------

6.3.14 Mælkesyrebakterier

Gruppen af mælkesyrebakterier er ikke helt veldefineret. Den omfatter lactobaciller, carnobakterier, pediococcer, lactococcer og Leuconostoc, hvorimod tilhørsforholdene for bl.a. enterococcer, aerococcer og bifidobakterier diskuteres. Mælkesyrebakterier er grampositive, oftest katalasenegative, ubevægelige, ikke sporedannende og fermenterer kulhydrater med mælkesyre som hovedprodukt.

For alle medier anbefalet til selektiv dyrkning af bakterier indenfor mælkesyrebakteriegruppen kan der være problemer i form af for kraftig eller for svag selektivitet, idet vækstbetingelser er til stede for beslægtede bakterier som f.eks. Enterococcer, Brochothrix og Listeria.

Fortolkningen af høje mælkesyrebakteriekimtal kan således støttes af andre kimtal som f.eks. enterococcer og Brochothrix samt eventuelt periodevis basal identifikation af den fremvoksede flora.

Metodik

Som anført i NMKL nr. 140, 1991 med følgende ændringer

I stedet for MRS-S agar anvendes NAP agar.

Ved NAP agar anvendes APT agar som basissubstrat og efterfølgende tilsætning af de inhiberende stoffer.

Basissubstrat - APT agar

Pepton 12,5 g Gærekstrakt 7,5 g Glukose 10,0 g NaCl 5,0 g tri-Natriumcitrat 5,0 g di-Kaliumhydrogenfosfat (K2HPO4) 5,0 g Tween 80 0,2 g Magnesiumsulfat 0,8 g Manganklorid 0,14 g Jern(II)-sulfat 0,04 g Thiamindiklorid 0,001 g Agar 13,5 g Destilleret vand 1000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 6,7

Bestanddelene kvælder i vandet i mindst 10 min. og opløses derefter fuldstændigt i det destillerede vand under opvarmning. Substratet overføres til flasker med 200 ml agar, der autoklaveres ved 121 graderC i 15 min.

Såfremt agaren skal anvendes til at undersøge drikkevarer, kan der tilsættes yderligere 1% fructose for at tilpasse substratets sammensætning til produktet.

Inden brug tilsættes pr. 200 ml smeltet og til 50 graderC afkølet substrat

1) 1 ml sterilfiltreret 12% (w/v) natriumnitritopløsning (12 g natriumnitrit + destilleret vand ad 100 ml).

2) 1 ml sterilfiltreret 0,2% (w/v) actidionopløsning (= cycloheximid) (200 mg cycloheximid + destilleret vand ad 100 ml).

3) 1 ml sterilfiltreret polymyxin-B-opløsning med 5000 IU/ml (fremstilling afhængig af den deklarerede aktivitet af polymyxin-B).

Opløsning 1) og 2) kan opbevares 3 uger på køl. Opløsning 3) kan opbevares 1 uge på køl. Opløsningerne kan købes færdige og opbevares da efter producentens anvisning.

Der anvendes dybdeudsæd med dæklag eller inkubering af pladerne, der i så fald kan være overfladeudsået i 5-10% CO2-atmosfære.

Dyrkning

25,0 graderC i 3 døgn.

Aflæsning

Der tælles på plader af passende fortyndinger.

På NAP agar tælles samtlige kolonier, dog undtaget typiske kolonier af Bacillus-arter og gær, der kan vokse på substratet. Brochothrix kan i visse tilfælde vokse på substratet uden at kunne skelnes kolonimorfologisk, men der er ikke påvist en entydig sammenhæng mellem forekomst af Brochothrix i produktet og på NAP-pladerne. Brochothrix kan skelnes fra mælkesyrebakterier ved rendyrkning på APT-plader, katalasetest (20% v/v H2O2) og mikroskopi. Brochothrix er katalasepositiv på APT-agar, ubevægelig og stavformet (polymorf).

6.3.15 Proteolytiske bakterier

Metodik

Der anvendes dybdeudsæd i Gelatine agar med følgende sammensætning

Neopepton 4,0 g Gærekstrakt 1,0 g Gelatine 10,0 g Agar 10,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,2

Bestanddelene opløses under opvarmning, og substratet ophældes på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 graderC i 15 minutter.

Sulfosalicylsyre reagens

Sulfosalicylsyre 20,0 g Destilleret vand ad 100 ml

Sulfosalicylsyre reagens kan opbevares i 1 måned ved max. 5 graderC.

Dyrkning

25,0 graderC i 48 timer.

Aflæsning

Efter endt inkubation overhældes pladen med 3-4 ml sulfosalicylsyre reagens og henstår ca. 5 minutter. Samtlige kolonier, der er omgivet af en klar zone, tælles som proteolytiske.

6.3.16 Udgået

6.3.17 Salmonella

Metodik

Som anført i NMKL nr. 71, 4. udgave, 1991, med følgende præciseringer

Pkt. 4.2.4

Kommercielle præparationer af RV-medier skal indeholde 29 g magnesiumklorid, 6H2O/liter, svarende til 13.58 g vandfrit magnesiumklorid pr. l. (Oxoid CM 669 er derfor ikke anvendeligt).

Pkt. 7.4

Som fast selektivt substrat/indikativt substrat benyttes enten brilliantgrønt-fenolrødt (BLSF/BG) agarplader, Rambach agar plade eller xylose-lactose-desoxycholat (XLD) agar. Inkubation ved 37,0 graderC i 18-24 timer. Ved mistanke om S. dublin (prøver indeholdende oksekød) må ikke benyttes Rambach agar alene, da denne serotype her udviser ukarakteristisk vækst. Kommercielle substrater er tilgængelige.

På BLSF vil ikke påvises laktosepositive Salmonella, mens XLD er mindre selektiv end BLSF og evt. vil medføre et lidt højere antal biokemiske verifikationer. Rambach har i undersøgelser vist sig på højde med eller lidt bedre end XLD og BLSF, men Pseudomonas og Acinetobacter kan give suspekte positive reaktioner, ligesom enkelte Salmonella serotyper lejlighedsvis kan udvise atypisk farvereaktion (bl.a. S. dublin og S. typhimurium).

Pkt. 7.5

Rambach agarpladen: Røde, svagt røde og rosa kolonier bedømmes som Salmonella suspekte.

Pkt. 7.6

Fra de selektive/indikative agarplader udtages suspekte kolonier, der efter rendyrkning på non-selektiv agar stikkes i TSJ og Lysin jern agar. Typisk reaktion rød/gul/luft/sværtning i TSJ og purpur/purpur/luft/sværtning i Lysin jern agar. Atypiske reaktioner kan forekomme.

Biokemisk karakterisering kan alternativt foretages med API 20E systemet. Hafnia alvii kan give falsk positiv reaktion (hyppigt som S. choleraesuis). Hafnia alvii kolonier fremstår med takket vækst og let ujævn overflade og lugter lidt »hengemt« og adskiller sig derfor morfologisk fra Salmonella. S. choleraesuis er sorbitol positiv, og adskiller sig hermed fra Hafnia alvii. I tvivlstilfælde indsendes kulturen til serotypning

Objektglasagglutination

Såfremt kolonierne på grundlag af disse biokemiske undersøgelser stadig må anses for Salmonella-suspekte, kan foretages agglutinationsprøve med polyvalent Salmonella-O-antiserum. Såfremt agglutinationsprøven giver positiv reaktion, skal det sikres, at den pågældende stamme ikke er spontan agglutinabel ved afprøvning af reaktionen i fysiologisk kogsaltopløsning.

Det bemærkes, at en negativ agglutinationsprøve kan forekomme for Salmonella som følge af, at antigengenkendelsen hos det polyvalente Salmonella-O-antiserum er begrænset til de almindeligst forekommende typer. Sortering må derfor ikke foregå ved agglutination alene.

Serotypning

Den isolerede bakteriestamme indsendes til serotypning på Statens Veterinære Serumlaboratorium med oplysning om oprindelse.

Kopi af følgeseddel indsendes til Levnedsmiddelstyrelsen, således at styrelsen kan indhente isolatet på SVS.

FLOW DIAGRAM OVER ISOLATION AF SALMONELLA EFTER NMKL 71 ---------------------------------------------- Præopformering Peptonvands buffer 1 del prøve + 9 dele buffer mindst 25 g prøve. 37,0 graderC i 18-24 t. ---------------------------------------------- ---------------------------------------------- Selektiv opformering Rappaport-Vassiliadis bouillon (RV). 0,1 ml præopformeringsbouillon podes i 10 ml RV. 41,5 graderC +/- 0,5 graderC (luftinkubator) i 18-24 t, eller 42,0 +/- 0,2 graderC (vandbad) i 18-24 t. ---------------------------------------------- ---------------------------------------------- Selektiv indikativ BLSF (BG agar) evt. tilsat teepol og/eller dyrkning på fast Rambach agar. og/eller XLD agar substrat 37,0 graderC i 18-24 t. ---------------------------------------------- ---------------------------------------------- Rendyrkning Udsæd på non-selektiv agar af 2-4 suspekte kolonier. 37,0 graderC i 18-24 t. ---------------------------------------------- ---------------------------------------------- Verifikation Alle inkuberes ved 37,0 graderC TSJ agar 24-48 t. Lysin jern agar, 18-24 t. evt. sorbitol Alternativ karakterisering kan foretages med API 20E. Polyvalent Salmonella O antiserum. ---------------------------------------------- ---------------------------------------------- Serotypning Isolerede stammer indsendes til serotypning på Statens Veterinære Serumlaboratorium. Kopi af følgeseddel indsendes til Veterinær- og Fødevaredirektoratet. ----------------------------------------------

Modified Semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) til påvisning af Salmonella

Anvendelsesområde

Metoden bør ikke benyttes til levnedsmidler, der har været nedfrosne i mere end 3 måneder.

Princip

MSRV er et halvflydende selektivt medium til isolering af bevægelige Salmonella spp. fra levnedsmidler. MSRV tillader, p.g.a. sit lave agarindhold (0.3%), sværmning af bevægelige bakterier samtidig med at RV mediets selektive egenskaber overfor Salmonella udnyttes.

Fra en præopformerings-kultur dråbeinokuleres på den halvflydende agar. En Salmonella suspekt reaktion ses ved dannelse af en sværmezone omkring udsædsstedet.

Salmonella pullorum/gallinarum er ubevægelige og vil ikke kunne påvises med MSRV metoden. Lejlighedsvis kan Salmonella udvise nedsat bevægelighed. SVS-Kbh anvender MSRV rutinemæssigt i kombination med anden diagnostik og har indtil nu ikke observeret eksempler på manglende bevægelighed. RV mediet har været forbundet med forringet påvisning af Salmonella dublin, men SVS har fundet, at alle veterinære isolater af Salmonella dublin har kunnet påvises på MSRV såvidt.

Metodik

Prøveforberedelse og præopformering foregår som for NMKL 71, 4. udgave med evt. cirkulæremodifikationer.

MSRV medium fremstilles som MSRV basissubstrat med efterfølgende tilsætning af Novobiocin.

MSRV Medium Base Tryptose 4,59 g Kasein hydrolysat 4,59 g Natrium klorid 7,34 g Kalium dihydrogen fosfat 1,47 g Magnesium klorid (anhydr.) 10,93 g Malakit grøn oxalat 0,037 g Agar 2,7 g Destilleret vand ad 1000 ml pH 5,2

Selective Supplement

Novobiocin tilsættes til en koncentration på 20 mg/l i det færdige substrat.

De ophældte plader skal have en tykkelse på 4-5 mm. Efter ophældning afkøles og lufttørres pladerne ca. 1 time ved stuetemperatur med låget på skrå. Agaren er halvflydende og pladerne skal stables retvendt. Ved den rette konsistens vil agaren dirre ved at knipse på siden af petriskålen.

Salmonella adabraka punktinokuleres fra opformeringskultur som positiv kontrol.

MSRV-mediet er kommercielt tilgængeligt.

Podning af MSRV-agar

Præopformeringskulturen omrystes let før udtagning. Overfør 3 dråber (i alt 0,1 ml) præopformeringskultur til en stuetempereret MSRV-plade. Prøverne afsættes i et triangulært mønster i tre enkeltliggende dråber på overfladen af MSRV-pladen med omtrent lige stor afstand mellem de enkelte dråber og pladens sider.

Dyrkning

Der inkuberes i 18-24 timer ved 41,5+/-0,5 graderC. Bemærk, at inkubationstid over 24 timer kan medføre uspecifik sværmning, samt at højere temperatur end 42 graderC vil beskadige bakteriernes flagelfunktion med manglende sværmning til følge. En lavere temperatur end 41,5 graderC øger antallet af prøver med sværmning af ikke-salmonella bakterier.

Aflæsning

Gennemfaldende lys letter aflæsningen. En tydelig lys zone af bakterier, der er sværmet ud fra en eller flere af de afsatte dråber, er indikation på, at der er Salmonella i prøven. Ingen tegn på sværmning og vækst ud over grænserne for de afsatte dråber aflæses som en negativ reaktion. Aflæsning skal foregå indenfor 1 time, efter at pladen er taget ud af inkubatoren.

Verifikation

Med en podenål stikkes til bunden af MSRV-pladen i yderkanten af sværmezonen med efterfølgende udstrygning på en af følgende indikative plader BLSF-agar, XLD-agar eller Rambach-agar. Bemærk, at enkelte andre enterobacteriaceae, bl.a. Enterobacter cloacae kan sværme på MSRV.

Den videre verifikation foretages i henhold til NMKL nr 71, 4. udgave med evt. cirkulære modifikationer.

Hurtigmetoder

EiaFoss Salmonella

EiaFoss Salmonella typenr. 23000 fra Foss Electric A/S kan anvendes til påvisning af Salmonella i fersk kød og fersk fjerkræ, varmebehandlede kødprodukter og varmebehandlet fjerkræ, røgede og saltede kødprodukter og fermenterede kødprodukter.

Metoden udføres efter producentens anvisninger. Vær opmærksom på, at producentens krav til minimums og maximums opvarmningstider overholdes. Følgende temperaturafvigelser på inkubationstemperaturer accepteres

===================================================================== Fase Anbefalet temperatur Accepteret variation --------------------------------------------------------------------- Forbehandling/ varmeskab + 37,0 grader C +/- 1,0 grader C --------------------------------------------------------------------- Opformering/ varmeskab + 41,0 grader C +/- 0,5 grader C --------------------------------------------------------------------- Postopformering i vandbad + 42,0 grader C +/- 0,2 grader C =====================================================================

Transia Salmonella Detection Kit

Transia Salmonella Detection Kit fra Diffchamb Danmark A/S kan anvendes til påvisning af Salmonella i fersk kød, fersk fjerkræ, røgede og saltede kødprodukter, varmebehandlede kødprodukter, varmebehandlet fjerkræ og svaberprøver.

Metoden produceres af Diffchamb SA. Metoden udføres efter producentens anvisninger.

Tecra Salmonella Visual Immunoassay

Tecra Salmonella Visual Immunoassay fra Struers Kebo Lab A/S kan anvendes til påvisning af Salmonella i fersk kød og svaberprøver.

Metoden produceres af Tecra Diagnostic. Metoden udføres efter producentens anvisninger.

6.3.18 Skimmelsvampe og gær (se 6.3.9)

6.3.19 Svovlbrinteproducerende bakterier i fisk

Metodik

Som anført i NMKL nr. 96, 2. udgave, 1994 med rettelsesblad af december 1994. Forskriften med hensyn til hydrogensulfid-producerende bakterier følges.

Inkubation kan foretages ved en temperatur i intervallet 20-25 graderC. Se iøvrigt 6.3.11.1.

Aflæsning

Som udtryk for totalkimtallet tælles samtlige kolonier uanset kolonifarve.

Antallet af sorte kolonier er et udtryk for indholdet af svovlbrinteproducerende bakterier, der i fersk fisk ofte domineres af Shewanella putrefaciens. Svovlbrinteproducerende bakterier omfatter dog også medlemmer af familierne Enterobacteriaceae og Vibrionaceae, der i nogen grad ses i letkonserverede fiskeprodukter (f.eks. letrøgede og gravede fisk).

6.3.20 Staphylococcus aureus

Metodik

Som anført i NMKL nr. 66, 2. udgave, 1992, med følgende præciseringer

Ved undersøgelse af levnedsmidler, som formodes at have højt indhold af gramnegative bakterier, kan blodagar tilsættes 25 i.e. Polymyxin B-sulfat eller 75 i.e. Kolistin sulfat pr. ml.

Staphylococcus aureus enterotoksin

Analyse for tilstedeværelse af Staphylococcus aureus enterotoksin kan foretages ved anvendelse af flere forskellige immunologiske metoder. Nærmere oplysninger kan fås ved henvendelse til Veterinær-og Fødevaredirektoratet.

6.3.21 Sulfitreducerende clostridier

Metodik

Som anført i NMKL nr. 56, 3. udgave, 1994.

6.3.22 Termotolerante coliforme bakterier / fækal coliforme bakterier

Metodik

Som anført i NMKL nr. 125, 3. udgave 1996.

Ved fækal coliforme bakterier forstås præsumptive E. coli som defineret i NMKL nr. 125.

Såfremt der ved undersøgelse af fisk og fiskevarer kræves en lavere detektionsgrænse, kan NMKL nr. 96, 2. udgave, 1994, (MPN-teknik med lauryl-sulfat bouillon) anvendes.

6.3.23 Vibrio parahaemolyticus

Metodik

Som anført i NMKL nr. 156, 2. udgave, 1997, med følgende præciseringer

Aflæsning

Ved kvantitative undersøgelser opgives resultatet efter anvisningerne i pkt. 8.4. efter fornøden identifikation. Ved kvalitative undersøgelser angives resultatet som påvist/ikke påvist i den undersøgte prøvemængde efter fornøden identifikation.

6.3.24 Yersinia enterocolitica

Som anført i NMKL nr. 117, 3. udgave, 1996, med følgende præciseringer

Pkt. 4.1.2

Det anbefales, at der tilsættes carbenicillin i prøver med højt kontaminationsniveau.

Pkt. 7.2, 7.3 og 7.4

Ved udstrygning på CIN anvendes 10 ((SPECIAL TEGN E6))l øjepodenål

Ved rutinemæssige undersøgelser kan undersøgelsesprogrammet begrænses således

Efter 1 uges kuldeopformering i PSB efterfulgt af 4 dages opformering i MRB subkultiveres på CIN agar. Herved reduceres antalles af subkultiveringer til en enkelt.

Suspekte isolater indsendes til Veterinær- og Fødevaredirektoratet, Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi, Afdeling for Mikrobiologi og Sikkerhed, med henblik på verifikation og serotypning.

FLOW DIAGRAM OVER ISOLATION AF YERSINIA ENTEROCOLITICA FRA LEVNEDSMIDLER: --------------------------------------------------------------------- 25-50 g levnedsmiddel homogeniseres i stomacher og tilsættes PSB i forholdet 1:9. I visse levnedsmidler med kraftig kontaminationsflora 1:99 (2,5 g levnedsmiddel til 247,5 ml PBS). Præopformering ved stuetemperatur (22-25 graderC) i 3 timer --------------------------------------------------------------------- ----------------------------------- ------------------------------- 1. subkultur: Præopformeringskulturen Udsæd på CIN agar. kuldeopformeres ved 4 Inkubering ved 30,0 graderC i graderC i 3 uger 20-24 t. ----------------------------------- ------------------------------- ------------------------------------------------------- Selektiv opformering: Efter 1 uges kuldeopformering overføres efter grundig blanding 0,1 ml til 10 ml MRB. Inkubering ved 22-25 graderC i 4 døgn ------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------- 2. subkultur: Udsæd på CIN agar fra MRB. Inkubering ved 30,0 graderC i 20-24 t. ------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------- 3. subkultur: Efter 3 ugers kuldeopformering udsås på CIN. Inkubering 30,0 graderC i 18-24 timer. Det anbefales at pode i MRB (som trin 3-4) forinden udsæd på CIN. -------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------- Fra 1., 2. og 3. subkultur overføres 4-5 typiske kolonier til BS agar. Inkubering ved 30,0 graderC i 12-24 t. --------------------------------------------------------------------- Indledende biokemisk karakterisering: Gule, sakkarose pos. kolonier testes i: Urinstof, TSJ (37 graderC 18-24 t.), halvflydende agar ved 20-22 graderC og 37,0 graderC i 18-24 t. --------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------- Endelig biokemisk og serologisk identifikation: Verifikation og biotyping. Suspekte isolater indsendes til Veterinær- og Fødevaredirektoratet til verifikation. ---------------------------------------------------------------------

6.3.25 Aeromonas

Som anført i NMKL nr. 150, 2. udgave, 1995.

6.4 Tælling og angivelse af kimtal

6.4.1 Tælling af mikroorganismer

De kvantitative mikrobiologiske analysemetoder foreskriver normalt det mindste og det største antal kolonier, som skal være vokset frem på petriskåle eller i glas, for at disse kan anvendes ved tælling og beregning af kimtal. Dette antal vil normalt være mellem 25 og 250 kolonier pr. plade eller glas, for visse indikative substrater dog ofte væsentligt færre. Der henvises i øvrigt til »Handledning i kvalitetssakring for mikrobiologiske laboratorier«. NMKL-rapport nr. 5, 2. udgave, 1994.

6.4.2 Beregning af kimtal

Ved enkeltundersøgelser tælles kolonier på den plade, som er egnet til tælling. Kimtallet udtrykkes som antallet af kolonier divideret med prøvemængden spredt på pladen.

Kimtallet beregnes ved

C1 + C2 + ... +Cn Kimtallet = ------------------ V1 + V2 + ... +Vn

hvor C1, C2, ...... Cn er antallet af kolonier talt i fortyndingerne V1, V2, ...... Vn.

Eksempel

Ved dybdeudsæd er der i 1 ml fra henholdsvis 10-3 og 10-4 fortynding talt 128 og 20 kolonier i PCA ved 25 grader C i 3 døgn.

128 + 20 Totalkimtal = ------------------ = 135.000/ g 140.000 g 10exp-3 + 10exp-4

6.4.3 Angivelse af kimtal

Indholdet af mikroorganismer i en prøve angives som antal pr. ml eller gram, idet antallet angives med 2 betydende cifre.

Der henvises i øvrigt til NMKL-rapport nr. 5, 2. udgave 1994

6.5 Øvrige metoder

6.5.1 pH

Metodik

Faste prøver homogeniseres, f.eks. ved brug af blender. Tørre levnedsmidler opblandes med lige dele vand, inden pH-måling foretages. Når prøven opblandes med vand skal denne henstå i 10 minutter ved den temperatur, hvorved målingen foretages, inden måling foretages.

6.5.2 aW

Metodik

Vandaktiviteten bestemmes som angivet i NMKL nr. 104, 1984.

6.5.3 Histamin

Metodik

Histamin bestemmes semikvantitativt som angivet i NMKL nr. 118, 1988.

Histamin bestemmes kvantitativt som angivet i NMKL nr. 99, 1981.

Mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler

I medfør af § 55, stk. 2 i lov nr. 310 af 6. juni 1973 om levnedsmidler m.m. som ændret ved lov nr. 351 af 9. juni 1993 og § 93 i bekendtgørelse nr. 1000 af 27. november 1996 om levnedsmiddelhygiejne og egenkontrol m.v. fastsættes

Ingen