Instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk

Instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk

Med henvisning til § 5, stk. 2, i Landbrugsministeriets bekendtgørelse af november 1989 om kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk leveret til mejerivirksomheder fastsættes

1. Godkendelse af laboratorier i henhold til § 5, stk. 1, i ovennævnte bekendtgørelse meddeles af Veterinærdirektoratet efter nærmere fastsatte regler.

2. Laboratoriet meddeler mejeriet, hvis prøver det skal undersøge, den ugedag, på hvilken prøveudtagning skal finde sted, og skal i forvejen levere mejeriet sterile prøveudtagningsglas med hætter. Udtagningsglas, der skal benyttes til prøver, der skal undersøges for hæmmende stoffer, må ikke være forsynede med hætter med indlæg af gummi.

3. Glassene skal leveres i isolerede beholdere påfyldt så meget krystalis, at mejeriet (prøveudtagerne) kan sikre, at der er is ved prøverne, når disse afleveres.

4. Laboratoriet skal drage omsorg for, at prøverne samme dag, som de er udtaget, enten afhentes på mejeriet eller bringes fra mejeriet til laboratoriet. Hvis dette ikke er praktisk muligt, skal prøverne afhentes eller bringes senest den følgende formiddag. Transporten skal ske i de isolerede beholdere påfyldt tilstrækkelig is til sikring af, at der er is ved prøverne, når de ankommer til laboratoriet.

5. På laboratoriet skal prøverne, indtil undersøgelsen påbegyndes, opbevares i køleskab (0-4 graderC) eller i de isolerede beholdere påfyldt is. Prøverne må ikke fryses. Mælkeprøvernes undersøgelse skal iværksættes dagen efter prøveudtagningen, dog tidligst 12 timer efter denne.

6. Undersøgelsesmetoder

6.1. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser til bestemmelse af det totale kimindhold, indholdet af termoresistente bakterier og indholdet af psykrotrofe bakterier udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 1.

6.2. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser til bestemmelse af celletallet udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 2.

6.3. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser for bedømmelse af syn, lugt, og smag udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 3.

6.4. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser til bestemmelse af smudsindholdet udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 4.

6.5. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser til bestemmelse af stoffer, der hæmmer væksten af mælkesyrebakterier, udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 5.

6.6. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser til bestemmelse af indhold af Bacillus cereus udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 6.

6.7. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser til bestemmelse af frie fedtsyrer i mælk udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 7.

6.8. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser til bestemmelse af anaerobe sporer udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 8.

6.9. De i bekendtgørelsen anførte laboratoriemæssige undersøgelser til bestemmelse af mælkens frysepunkt udføres efter forskrifter, som angivet i bilag 9.

7. Ikrafttrædelsesbestemmelser

7.1. Instruksen træder i kraft den 8. januar 1990.

7.2. Den erstatter Veterinærdirektoratets og Statskontrollens instruks af 7. januar 1983 med senere ændringer for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

Veterinærdirektoratet den 2. januar 1990

E. Stougaard

P. Schmidt Madsen

Bilag 1 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

BESTEMMELSE AF DET TOTALE KIMINDHOLD,

INDHOLDET AF TERMORESISTENTE OG

PSYKROTROFE KIM

1. Det totale kimindhold

1.1. Mælkeprøvens blanding

Når en mælkeprøve tages i arbejde på laboratoriet, foretages en grundig blanding af prøven (mindst 10 dobbeltvendinger) før mælken afmåles. Afmålingen sker med rene, sterile pipetter.

1.2. Pladespredning

1.2.1. Manuel pladespredning

1.2.1.1. Materialer

Som fortyndingsvæske anvendes Ringer's opløsning i 1/4 del styrke (IDF Standard nr. 3-1958). Fortyndingsvæsken afmåles ved hjælp af dispenser, og der afmåles 0,5 til 1 ml i overskud. Glassene med fortyndingsvæske lukkes med hætte og autoklaveres ved 121 graderC i 15 minutter.

Petriskåle, som anvendes til bestemmelse af kimindhold, skal være sterile og have en diameter på ca. 9 cm. Skålene skal være mærket entydigt, så identifikation er mulig.

Der anvendes et substrat af følgende sammensætning

Gærekstrakt 2,5 g Trypton 5,0 g Glukose D(+) 1,0 g Skummetmælkspulver 1,0 g Agar 10-15 g (afhængig af stivneegenskab) Vand 1000 ml

eller andet ligeværdigt substrat.

Skummetmælkspulveret skal være fri for hæmmende stoffer. Dette skal bekræftes ved sammenligningsprøver, hvor der anvendes et skummetmælkspulver, der ikke indeholder hæmmende stoffer.

1.2.1.2. Bestemmelse af totalkim

Der anlægges en fortyndingsrække og herfra overføres med ren, steril pipette fortyndinger svarende til 1/300 og 1/3.000 ml mælk til petriskåle. Hver petriskål påhældes herefter ca. 10 ml steril substrat, som forud er smeltet og indstillet til en temperatur på 45-48 graderC.

Efter omhyggelig blanding af petriskålens indhold henstår skålen i ro på et vandret underlag, til substratet er størknet, og derefter inkuberes skålen med låget nedad i termostat ved 30 graderC i 3 døgn.

1.2.2. Maskinel pladespredning

For tiden er det af firmaet N. Foss & Co. A/S, Hillerød, udviklede apparat til bestemmelse af kimtal i mælk godkendt (Petrifoss).

1.2.2.1. Apparatets betjening

Apparatet betjenes i overensstemmelse med den af N. Foss & Co. udarbejdede vejledning for apparatets drift og vedligeholdelse samt i overensstemmelse med denne instruks.

1.2.2.2. Forberedelse af apparatet

Hver dag ved opstart monteres sterile øskener i apparatet. Det kontrolleres, at disse øskener er fri for synlige beskadigelser eller andre uregelmæssigheder. Herefter udføres ved blindprøver kontrol af, at petriskåle, substrat, Ringer's opløsning og afblæsningsluften er steril ved at lade Petrifoss'en gennemføre analyseprogrammet uden isættelse af mælkeprøver.

1.2.2.3. Udsæd

Der anvendes samme væsker og substrater som beskrevet under manuel pladespredning.

De klargjorte prøver placeres i Petrifoss'en, som er blevet forsynet med øskener, der udtager prøver på 1/300 og 1/3.000 ml mælk.

Analysen udføres som beskrevet i N. Foss & Co's vejledning.

Petriskålene mærkes og inkuberes som beskrevet under manuel pladespredning.

1.3. Tælling

Tælling foretages ved hjælp af kolonitæller eller med lup (x2) fortrinsvis på den petriskål, der har mellem 30 og 300 kolonier. Det totale kimtal pr. ml mælk beregnes ved at dividere det talte antal kolonier med den aktuelle fortyndingsfaktor eller udsåede prøvemængde.

Hvis den foretagne udsæd ikke har givet petriskåle med 30-300 bakteriekolonier, foretages alligevel tælling, og resultaterne angives således

For mælk med lavt kimindhold angives kimtallet ved antal kolonier i den laveste fortynding divideret med fortyndingsfaktoren. Hvis antallet af kolonier er under 20, angives kimtallet som mindre end det tal, der fås ved at dividere 20 med den aktuelle fortyndingsfaktor eller udsåede prøvemængde. For mælk med højt kimindhold må tællingerne udstrækkes op til et kolonital pr. plade på 500, hvorefter kimtallet angives som over det tal, der fås ved at dividere 500 med den aktuelle fortyndingsfaktor eller udsåede prøvemængde.

Kimtallet angives med to betydende cifre.

2. Termoresistente bakterier

2.1. Varmebehandling

Mælkeprøven blandes som beskrevet under 1.1., hvorefter der i sterile reagensglas afmåles op til 10 ml mælk. Den del af glasset, der ikke bliver neddyppet i vandbadet ved den nedenfor beskrevne varmebehandling, skal flamberes til forkulning af eventuelle mælkerester, forinden glassene tillukkes med vat eller hætter. Mælkeprøverne hensættes i termostatvandbad med en vandstand, der er mindst 2 cm højere end væskestanden i reagensglasset. Opvarmningen af mælkeprøverne skal ske i løbet af højst 5 minutter til en temperatur på 61,5 graderC +/- 0,5 graderC. Henstandstiden 30 minutter beregnes fra det tidspunkt, hvor mælkeprøverne er opvarmet til 61,0 graderC. Dette kan f.eks. kontrolleres ved, at der i et kontrolglas med mælk hensættes et termometer og tiden beregnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i dette glas er 61 graderC. Efter varmebehandlingen afkøles mælkeprøverne hurtigst muligt til stuetemperatur i rindende vand.

2.2. Udsæd og tælling af bakterier

På den varmebehandlede mælk foretages en bestemmelse af termoresistente bakterier ved undersøgelse af 1/30 og 1/300 ml mælk ved anvendelse af den teknik, som er anført under afsnittene 1.2. og 1.3.

3. Psykrotrofe bakterier

3.1. Mælkeprøven blandes som anført under 1.1.

3.2. Udsæd og tælling.

Psykrotrofe bakterier bestemmes ved undersøgelse af 1/30 og 1/300 ml mælk ved anvendelse af den teknik, som er anført under afsnittene 1.2. og 1.3., idet dog den i 1.2.1.2. nævnte inkubation erstattes af inkubation ved 17 graderC i 17 timer efterfulgt af 3 døgns inkubation ved 7 graderC +/- 0,2 graderC.

4. Kontrol af Petrifoss'en

4.1. Daglig kontrol

For mindst hver 20. mælkeprøve foretages kontrol som beskrevet i afsnit 1.2.2.2.

Disse kontrolpetriskåle inkuberes sammen med skålene fra de ordinære undersøgelser.

Hvis der forekommer vækst på kontrolpladerne, kan de tilhørende analyseresultater ikke anvendes.

4.2. Øskenkontrol

En gang om ugen skal der foretages en vejekontrol af de anvendte øskeners nøjagtighed ved følgende procedure: Et lille vejeglas med låg påfyldes mælk, hvorefter det vejes med 4 decimalers nøjagtighed. Med øskenen udtages 10 prøver af mælken, idet den dyppes nøjagtigt lige så dybt som i apparatet. Der foretages afskylning med Ringersvæske samt afblæsning af øskenen mellem hver udtag.

Til yderligere sikring af, at øskenen er helt fri for væske, foretages en aftørring med filterpapir. Vejeglasset vejes på ny, og differencen beregnes. For at korrigere for fordampning fjernes låget i nøjagtig samme tidsrum, som der er anvendt ved de 10 udtagninger. Herefter foretages fornyet vejning.

Den beregnede difference korrigeres for fordampningstabet og divideres med 10 for at beregne den gennemsnitlige udtagne mælkemængde. Hele processen gentages tre gange.

Hvis det aritmetiske gennemsnit af de tre undersøgelser afviger mere end 10% fra det, øskenerne er kalibreret til, skal disse justeres eller kasseres.

Veterinærdirektoratet kan godkende alternative metoder til øskenkontrol.

4.3. Kontrolspredning

Hver uge skal der foretages undersøgelse af 30 mælkeprøver til kontrol med, at der er overensstemmelse mellem den mekaniske pladespredning og den manuelle pladespredning.

Differencen mellem logaritmerne til de parvise bestemmelser af kimtal kvadreres. Summen af disse kvadrater udregnes. Standardafvigelsen (s) beregnes som kvadratroden af summen af kvadraterne divideret med 2 x antal enkelt bestemmelse medtaget i beregningen.

Hvis s er under 0,25 kan resultatet betragtes som acceptabelt (eksempel på beregning anført på side 6).

4.4. Resultaterne af de under afsnittene 4.1. - 4.3. foretagne kontrolundersøgelser skal bogføres. Det skal ligeledes angives, hvilke foranstaltninger, der er foretaget til udbedring af uregelmæssigheder.

Kvalitetskontrol

Kimtal: Log kimtal: Difference2 --------------------- ----------- Prøve: a) b) a) b) d2 ------------------------------------------------------------- 1 3.800.000 5.500.000 6,58 6,74 0,0256 2 82 120 1,91 2,08 0,0289 3 2.500 1.500 3,40 3,18 0,0484 4 650 470 2,81 2,67 0,0196 5 72 38 1,86 1,58 0,0784 6 31.000 18.000 4,49 4,26 0,0529 7 770 500 2,89 2,70 0,0361 8 6.000 8.000 3,78 3,90 0,0144 9 45.000 25.000 4,65 4,40 0,0625 10 700 1.800 2,85 3,26 0,1681 -------------------------------------------------------------

Standardafvigelsen er klart under grænsen på 0,20-0,25, og det må konkluderes,at arbejdet er udført tilfredsstillende.

Bilag 2 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

BESTEMMELSE AF CELLETALLET

A. Mikroskopisk celletælling

1. Prøvens forbehandling

Udstrygning bør foretages samme dag, prøven er udtaget, og må ikke foretages senere end dagen efter prøveudtagningen.

Såfremt der fra den udtagne prøve skal ske omhældninger, skal prøven blandes meget grundigt. Prøven, der skal anvendes til celletælling, skal inden udstrygningen opvarmes til 40 graderC på vandbad. Derefter afkøles prøven til 20 graderC, den temperatur mikrosprøjten er kalibreret til. Umiddelbart før udstrygning foretages, skal prøven blandes meget grundigt ved vending af glasset ved mindst 20 dobbeltvendinger, eventuelt ved brug af en vendemaskine. Ikke rystning, da det giver luftblærer.

Mikrosprøjten skal justeres med højst 3 måneders mellemrum.

2. Forberedelse til farvning

Farvningen skal foretages samme dag, udstrygningen finder sted.

Rene objektglas skylles grundigt med sprit eller syresprit og aftørres grundigt med fnugfrit papir eller klud.

Umiddelbart før brugen flamberes glassene og afkøles til stuetemperatur.

Ved brug af en skabelon lagt under objektglasset stryges ved hjælp af mikrosprøjte 0,01 ml mælk på et 2 cm x 0,5 cm stort felt. Dette gøres nemmest ved med den fyldte sprøjtes spids at tegne konturen af feltet op og derefter udtømme mælken inden for denne linie og fordele den. Sprøjten bør løftes fra præparatet nær den ene ende. Der er plads til 8 præparater på et objektglas. Objektglassene må mærkes på holdbar måde, f.eks. med diamant.

Efter udtømning af mælken opsuges og udtømmes mælk fra næste mælkeprøve 2-3 gange, inden prøven udtages. Inden prøven udstryges, aftørres den del af sprøjten, der har været i kontakt med mælken.

Præparaterne anbringes på en absolut plan flade, der er indstillet helt vandret ved hjælp af en libelle, og varmtørres grundigt.

Temperaturen på varmepladen må ikke overstige 50 graderC.

3. Farvning

Farvevæske

Methylenblåt (Merck eller Gurr) 0,6-1 g Ætylalkohol 96 pct. 54 ml Tetrachlorætan (teknisk) eller 1,1,1-Trichlorætan 40 ml Iseddikesyre 6 ml

Trichlorætan er mindre giftigt end Tetrachlorætan, hvorfor førstnævnte bør benyttes.

Ætylalkohol og Tri-/Tetrachlorætan blandes i en kolbe og opvarmes på vandbad til 60-70 graderC. Methylenblåt tilsættes og opløses ved grundig omrystning. Efter afkøling (køleskab) tilsættes iseddikesyre, og farvevæsken filtreres. Farvevæsken opbevares i glasflaske med glasprop og skal filtreres inden brugen.

Det tørrede præparat neddyppes i farvevæsken. Farvetid ca. 3 minutter. Det enkelte laboratorium må imidlertid tilstræbe at finde den farvetid, der giver bedst differentiering mellem celler og baggrund. Efter farvning stilles præparatet til afdrivning og tørres hurtigt, eventuelt med en føn.

Præparatet skylles derefter i 3 hold vand med en temperatur på 37-40 graderC og tørres derefter grundigt og hurtigt. Præparaterne skal under hele proceduren være beskyttet mod støvnedfald.

4. Tælling af celler

Til tælling anvendes mikroskop eventuelt med projektionsskærm.

Forstørrelsen skal være mindst 500 gange.

For hver optik må diameteren af et synsfelt måles i mm til anvendelse ved udregning af en arbejdsfaktor. Der skal tælles mindst 400 celler fra hver mælkeprøve.

Til udregning benyttes følgende formel

1. Ved tælling af synsfelter

A = 20 x 5 x 100 = 12732 ---------------- --------- pi x (d)exp2 x s dexp2 x s --- 4 Hvor d = synsfeltdiameter i mm og s = antal talte synsfelter. 2. Ved tælling af et bælte tværs over præparatet: A = 20 x 5 x 100 = 2000 ------------ ---- d x 5 d

Hvor d = synsfeltdiameter i mm.

De synsfelter, der skal undersøges, må placeres ligeligt på tværs

igennem midtten af den udstrøgne rektangel.

Ved tælling ved brug af mikroskop med skærm kan hele skærmen benyttes, hvis der bruges planoptik. Med almindelig optik, kan kun tælles på den centrale focuserede del.

5. Beregning af celletallet

Celletallet beregnes som totalantallet af celler i de talte synsfelter, multipliceret med arbejdsfaktoren, idet der tages hensyn til antallet af talte synsfelter fra tælling af mindst 400 celler.

B. Elektronisk celletælling

1. Elektronisk celletælling må kun udføres ved hjælp af apparatur, der er godkendt af Veterinærdirektoratet efter afprøvning på Statens Veterinære Serumlaboratorium. Veterinærdirektoratet godkender for tiden

Det af firmaet Foss-Electric, Hillerød, udviklede apparatur til fluoroopto-elektronisk tælling af somatiske celler i mælk (Fossomatic).

2. Prøvernes forbehandling

2.1. Celletallet i mælkeprøverne skal bestemmes tidligst ca. 24 timer efter sidste malkning og senest 48 timer efter, at prøveudtagningen har fundet sted.

2.2. Udtages der inden tællingen underprøver til andre formål, skal prøverne opvarmes til mindst 20 graderC, hvis der fjernes mere end 5% fra prøverne. Hvis det borttagne udgør mindre end 5%, er det af hensyn til celletællingen kun nødvendigt at blande prøverne omhyggeligt.

2.3. Inden tællingen foretages, skal mælkeprøverne opvarmes til 40 graderC i 15-20 minutter og må ikke være nedkølet til under 20 graderC inden tællingen.

2.4. Umiddelbart inden tællingen vendes prøverne mindst 10 gange.

3. Apparaturets betjening

Betjening af Fossomatic forudsætter et indgående kendskab til apparaturets funktion og virkemåde. Apparatet må derfor kun betjenes af personale, som er omhyggeligt instrueret i dets brug og har nøje kendskab til nærværende instruks og nøje følger den af Foss-Electric udarbejdede vejledning for apparatets drift og vedligeholdelse.

4. Forberedelse til tælling af celler

4.1. Det kontrolleres

at der er tilstrækkelig farvevæske, stødpudeopløsning og rensevæske i apparatets beholdere,

at der i balancebeholderne er tilstrækkeligt smøremiddel - glycerin/vand til doseringssprøjterne,

at nylontråden(e) i omrøreren har en passende længde.

4.2. Apparatet startes i henhold til vejledningen. Herefter lader man apparatet arbejde i 3-4 minutter, idet der benyttes en tilfældig mælkeprøve. Det kontrolleres herunder

at manometertrykket ligger inden for de godkendte grænser,

at afskylning af tælleskiven er tilfredsstillende,

at alle sprøjter fungerer tilfredsstillende,

at farvevæske og stødpudeopløsning ikke er »løbet tilbage«,

at der ikke er luft/dampbobler i tilførselsslangerne, f.eks. som følge af »stødkogning« i spiralerne,

at temperaturen i mælkefarveblandingen ligger inden for det acceptable,

at discriminatorlinien er forholdsvis rolig og løber lige eller i lange, lave »slanger«. Der må ikke forekomme kraftige, pludselige udslag af discriminatorlinien og af viseren i photo current.

5. Tælling af kontrolprøver

5.1. Som kontrolprøver benyttes konserverede mælkeprøver fremsendt fra Statens Veterinære Serumlaboratorium. Prøverne skal benyttes inden 14 dage efter modtagelsen.

5.2. Kontrolprøverne tælles og vurderes i henhold til de i nærværende instruks givne instruktoriske bestemmelser for standardisering af og kontrol med fluoro-opto-elektronisk tælling af somatiske celler i mælk ved brug af Fossomatic.

5.3. Kontrolprøverne skal tælles

før påbegyndelse af rutinemæssig celletælling,

når ca. 400 prøver er talt,

når den rutinemæssige celletælling er afsluttet.

6. Rutinemæssig celletælling

6.1. Under den rutinemæssige tælling kontrolleres jævnligt

at identifikation af prøverne er korrekt

at celletællingsresultaterne ligger på et sandsynligt niveau,

at alle funktioner nævnt under pkt. 4 er tilfredsstillende.

6.2. Ved påfyldning af farve, stødpude eller rensevæske under apparatets drift skal det sikres, at disse væsker er suget op i systemerne, inden tællingen igen påbegyndes.

6.3. Den rutinemæssige celletælling fortsættes kun, for så vidt celletallene i kontrolprøverne falder inden for de grænser, som er fastlagt i medfør af pkt. 10.1.

6.4. De mælkeprøver, hvis celletal er bestemt, må ikke bortkastes, før næste kontroltælling er foretaget.

7. Reagenser

De i vejledningen anførte reagenser skal benyttes i de angivne koncentrationer. Det skal bemærkes

at der ikke må benyttes reagenser af andre fabrikater eller sammensætninger end de i vejledningen nævnte,

at vejledningens metode til fremstilling af stamopløsninger og fortyndinger nøje følges,

at tidspunkterne for opløsningernes holdbarhed nøje overholdes.

8. Vedligeholdelse af apparatet

I vejledningen er angivet fremgangsmåden ved daglig, ugentlig og månedlig vedligeholdelse.

8.1. Ved daglig vedligeholdelse skal især fremhæves

at apparatet holdes vel rengjort ved aftørring af alle dele, der har berøring med væskerne, såsom stativer, prøvebane, bord, rotor, pipette og omrører, affaldsspand m.v. Der anvendes varmt vand med rengøringsmiddel.

8.2. Ved ugentlig vedligeholdelse må især lægges vægt på

at slanger er fri for bakterie- og svampevækst og for mælkeudfældninger,

at beholdere til farvevæske o.s.v. er vel rengjorte, inkl. filtre, at glassene i rotoren er rene,

at filter indskudt foran mikrosprøjten er rent, og

at linser og øvrige glas for lysgennemgang er helt rene.

8.3. Ved månedlig vedligeholdelse skal især iagttages

at vejledningen følges så nøje som muligt, således at alle dele kontrolleres, og slidte dele udskiftes. Det må i særlig grad sikres, at alle bevægelige dele er velsmurte.

For at holde apparatet så funktionsdygtigt som muligt og dermed begrænse stop og brækage må der ikke slækkes på vedligeholdelsen af det komplicerede apparatur.

Der bør derfor af hvert laboratorium udarbejdes et nøje fastlagt skema for vedligeholdelse, og ansvaret for denne bør overlades særligt uddannet personale.

9. Standardisering af og kontrol med den fluoro-opto-elektroniske celletælling

9.1. Udsendelse af kontrolprøver til laboratorierne.

En gang ugentlig udsender Statens Veterinære Serumlaboratorium 4 kontrolprøver, som hver består af 10 delprøver.

9.2. Behandling af kontrolprøverne på laboratorierne.

9.2.1. Kontrolprøverne anbringes i køleskab ved max. 5 graderC. Frysning af prøverne må under ingen omstændigheder finde sted.

9.2.2. For hver dag, der foretages rutinemæssig celletælling, udtages 1 delprøve af hver kontrolprøve, i alt 4 prøver.

9.2.3. De 4 udtagne delprøver forbehandles som anført i 2.3. og 2.4. (opvarmning og vending). Der foretages ingen fornyet opvarmning af delprøverne i løbet af dagen.

9.2.4. Delprøverne undersøges skiftevis 2 og 2, idet første

undersøgelse foretages, før den rutinemæssige tælling af

leverandørmælkeprøverne påbegyndes, og herefter mindst når ca.

400 prøver er talt, samt når de rutinemæssige tællinger er

afsluttet.

9.2.5. Hver delprøve tælles 5 gange ved hver kontrol.

10. Behandling og vurdering af de fundne celletal i kontrolprøverne

10.1 Behandling.

De enkelte resultater af de 5 bestemmelser (jfr. 9.2.4. og 9.2.5.) af celletallet i den enkelte delprøve indføres på, et skema, som af Statens Veterinære Serumlaboratorium udsendes samtidig med kontrolprøverne, og gennemsnitscelletallet udregnes. På skemaet er anført det af Statens Veterinære Serumlaboratorium fundne celletal i hver enkelt kontrolprøve sammen med grænseværdier for, hvad der er et acceptabelt gennemsnitscelletal i den enkelte kontrolprøve.

10.2. Vurdering.

10.2.1. Såfremt gennemsnitscelletallet i begge de 2 undersøgte delprøver af kontrolprøverne ligger inden for de af Statens Veterinære Serumlaboratorium angivne acceptable grænseværdier, kan de rutinemæssige celletællinger påbegyndes eller fortsættes, og de siden sidste undersøgelse af delprøver (jfr. 9.2.4.) fundne celletal kan godkendes.

10.2.2. Såfremt gennemsnitscelletallet i 1 af de 2 undersøgte delprøver ligger uden for de af Statens Veterinære Serumlaboratorium angivne grænseværdier, foretages celletælling på de 2 andre den pågældende dag udtagne delprøver (jfr. 9.2.3.). Ligger gennemsnittet i begge disse inden for de angivne grænser, kan de rutinemæssige celletællinger påbegyndes eller fortsættes, og de siden sidste kontrolundersøgelse bestemte celletal godkendes.

10.2.3. Såfremt gennemsnitscelletallet i begge de 2 delprøver ligger uden for de af Statens Veterinære Serumlaboratorium angivne grænseværdier, foretages en tælling af 4 nye delprøver af kontrolprøverne udtaget fra køleskabet og behandlet efter de i pkt. 9.2.3. angivne regler.

10.2.4. Hvis gennemsnitscelletallet i 3 af de i henhold til pkt. 10.2.3. udtagne delprøver ligger inden for de angivne grænseværdier, kan de rutinemæssige celletællinger påbegyndes eller fortsættes, og de siden sidste kontrolundersøgelse bestemte celletal godkendes

10.2.5. Såfremt uacceptable gennemsnitscelletal fortsat konstateres i 2 eller flere af de 4 delprøver, må apparatet ikke anvendes til rutinemæssige celletællinger, før resultaterne i mindst 3 af delprøverne ligger inden for grænseværdierne (jfr. 13), og de siden sidste undersøgelse af delprøver fundne celletal kan ikke godkendes.

11. Indsendelse af resultater af undersøgelse af kontrolprøver

Når ny sending kontrolprøver modtages, sendes resultaterne af tællingerne af de tidligere tilsendte prøver til Statens Veterinære Serumlaboratorium til vurdering.

12. Udsendelse og undersøgelse af særlige kontrolprøver

Statens Veterinære Serumlaboratorium kan efter nærmere aftale med Veterinærdirektoratet lejlighedsvis udsende særlige kontrolprøver uden angivet celletal til laboratorierne til celletælling. Tællingerne foretages efter retningslinier, som udsendes sammen med prøverne. Resultaterne indsendes til Statens Veterinære Serumlaboratorium til vurdering.

13. Justering eller reparation af Fossomatic på grund af uacceptable resultater af kontroltællinger

Såfremt et laboratorium har uacceptable resultater af tællinger af kontrolprøver, (jfr. pkt. 10.), skal laboratoriet foranledige årsagen til fundet og fejlen rettet.

14. Vurdering af resultater ved Statens Veterinære Serumlaboratorium

Statens Veterinære Serumlaboratorium foretager på de indsendte celletalsresultater (jfr. pkt. 11 og 12) en niveaukontrol samt beregning af apparaternes reproducerbarhed.

Kan forholdene ved denne vurdering ikke betragtes som acceptable, meddeler Statens Veterinære Serumlaboratorium dette til lederen af det pågældende laboratorium med kopi til Veterinærdirektoratet, evt. med angivelse af, hvorledes laboratoriet skal forholde sig til sikring af, at resultaterne af de rutinemæssige celletællinger kan godkendes.

Bilag 3 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

BEDØMMELSE AF SYN, LUGT OG SMAG

1. Prøvens forbehandling

Forud for bedømmelse på laboratoriet tempereres prøverne i vandbad til 20 graderC +/- 1 graderC, og bedømmelsen foretages straks efter opvarmningen.

2. Bedømmelse og klassificering

Efter omrystning af mælken fjernes proppen, og der lugtes til mælken i selve flasken. Derefter hældes lidt mælk ud i en ske og udseendet bedømmes. Hvis mælken ikke umiddelbart er deklasseret på grund af lugt og udseende, tages mælken i munden, og man skal her sørge for, at mælken vandrer rundt i hele mundhulen.

Mælken bedømmes nu på grundlag af de tre forskellige indtryk, og der gives en beskrivelse af eventuelle fejl ved mælken.

Mælken klassificeres i 3 klasser, og såfremt mælken klassificeres som 3. klasse, angives en karakteristik af fejlen.

Ved 1. klasses mælk forstås »normal« mælk. 2. klasses mælk er mælk, der afviger svagt fra »normal« mælk i udseende, lugt og/eller smag, dog ikke så afvigende, at det i almindelighed er muligt at give en nærmere karakteristik af fejlen. 3. klasses mælk repræsenterer afvigelser fra »normal« mælk, og der bør så vidt muligt gives en eksakt beskrivelse af fejlen.

Til bedømmelsen skal der være mindst to kvalificerede dommere til rådighed. Hvis mælken klassificeres i 1. klasse, er een dommers afgørelse tilstrækkelig, men såfremt mælken klassificeres i een af de to andre klasser, skal begge dommere være enige om klassificeringen og om eventuelle bemærkninger om fejlen.

Følgende bemærkninger bør anvendes

Udseende: 1. unormal farve, 2. unormal farve, rødlig, 3. unormal farve, grålig, 4. udfnugget, 5. udkærnet, 6. fremmedlegemer.

Lugt og/eller smag: 7. syrlig, 8. sur, 9. uren smag, 10. uren lugt, 11. vammel, 12. branket, 13. tællet, 14. harsk, 15. salt smag, 16. bitter smag, 17. afsmag, 18. foderafamag, 19. ammoniaksmag, 20. kemikaliesmag, 21. andre bemærkninger.

Kun hvis det af informative grunde skønnes påkrævet, kan der gives en særlig bemærkning eller en tillægsbemærkning f.eks. kemikaliesmag (lysol).

Bilag 4 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

BESTEMMELSE AF SMUDSINDHOLD

1. Prøvens forbehandling

Prøven opvarmes til 40 graderC. Umiddelbart inden filtreringen blandes prøven godt ved mindst 10 dobbeltvendinger.

2. Filtreringsudstyr

Til filtrering anvendes et smudsapparat (vacuum type Van Doorn eller lign.) samt bomuldsfiltre 1 1/4' af kvalitet som »Johnson & Johnson Lintine Disks«. Filtrenes gennemløbsfelt må ikke overstige 11 mm.

3. Filtrering

Smudsapparatet startes. En filterskive placeres under tragten, som herefter sænkes ned, så den slutter tæt til filterskiven. Prøven på 75 ml hældes i tragten. Når prøven er suget igennem, skylles tragten efter med rent, filtreret vand, og skyllevandet suges gennem filtret. Tragten løftes, og filterskiven fjernes og placeres på et perforeret papirark. Papirarkene placeres på bakker og tørres i tørreskab ved ca. 40 graderC eller ved stuetemperatur. Hvis prøverne tørres ved stuetemperatur, skal de være omhyggeligt afdækkede. De tørre filtre klæbes over med klar tape.

4. Bedømmelse

Bedømmelsen foretages på en plads, der ikke er udsat for direkte sollys.

Smudsfiltrene skal ved bedømmelsen belyses af en lampe, 75 watt, der er anbragt i en afstand af ca. 30 cm over filtrene. Lampen skal være forsynet med en skærm, der koncentrerer lyset til et begrænset felt ca. 0,2 m2.

Bedømmelse foretages ved at sammenligne med standardsmudsfiltre, der er fremstillet ved filtrering på ovennævnte smudsapparat af standardsmudsopslæmninger præpareret i henhold til American Public Health Association: »Standard Methods for the Examination of Dairy Products«. Prøverne klassificeres herefter i tre klasser på følgende måde

1. klasse: Til og med standardsmudsfilter 0,05 milligram pr. 75 ml.

2. klasse: Fra standardsmudsfilter 0,05 milligram pr. 75 ml til og med standardsmudsfilter 0,15 milligram pr. 75 ml.

3. klasse: Mere end standardsmudsfilter 0,15 milligram pr. 75 ml.

Bilag 5 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

UNDERSØGELSE FOR INDHOLD

AF HÆMMENDE STOFFER

1. Testorganisme

Som testorganisme anvendes en stamme af Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, strain C 953.

2. Substrater

a. Substrat til stamkulturen (skråagar)?

Gærekstrakt 2 g Pepton 5 g Kødekstrakt 1 g Natriumklorid 5 g Agar 10-15 g (afhængig af stivneegenskab) Destilleret vand 1.000 ml

Substratet steriliseres ved 121 graderC i 15 minutter. Slut pH 7,4 +/- 0,1. Efter udstrygning af kulturen på overfladen af skråagar inkuberes i 48 timer ved 60 graderC +/- 5 graderC. Kulturen kan holde sig i flere måneder i køleskab ved max. 5 graderC.

b. Bouillon til opformering af testkulturen

Gærekstrakt 1 g Tryptone 2 g Glukose 0,05 g Destilleret vand 100 ml

Substratet steriliseres ved 121 graderC i 15 minutter.

pH 8,0 +/- 0,1.

c. Substrat til antibiotikatestplader

Plate count agar med Trimethoprim

Gærekstrakt 2,5 g Tryptone 5 g Glukose 1 g Trimethoprimopløsning (jvf.2.e.) 10 ml Agar 10-15 g (afhængig af stivneegenskab) Destilleret vand 1000 ml

De faste bestanddele opløses fuldstændigt i vand ved opvarmning og omrøring, inden trimethoprimopløsningen tilsættes. Substratet steriliseres ved 121 graderC i 15 minutter. pH efter afkøling til ca. 45 graderC: 8,0 +/- 0,1.

d. Substrat til sporefremstilling

Plate count agar

tilsat 300 mikrogram MnSO4 , H20 pr. ml.

Substratet indstilles på pH 8,0 +/- 0,1 før brugen.

e. Trimethoprimopløsning

Trimethoprim 5 mg Ethanol 96% 5 ml Destilleret vand ad 1000 ml Opløs trimethoprim i ethanol og fortynd med vand. f. Paraaminobenzoesyreopløsning: Paraaminobenzoesyre 100 mg Ethanol 99% 10 ml

3. Fremstilling af testkultur

En af de to nedennævnte metoder benyttes.

a. Vegetative bakterier

10 ml opformeringsbouillon (jfr. 2.b.) podes med en øskenfuld kultur fra skråagaren (jfr. 2.a.). Inkubation ved 60 graderC +/- 5 graderC i 16-24 timer.

b. Sporer

Der fremstilles 3 skråagarglas med 10-12 ml sporuleringssubstrat (jfr. 2.d.) samt 1 Rouxflaske med 150 ml sporuleringssubstrat (jfr. 2.d.) og 15-20 sterile glasperler, der henstilles i 18-24 timer ved 37 graderC +/- 1o C for sterilitetskontrol.

Hvert af de 3 skråagarglas tilsås med 0,25 ml opformeret kultur (jfr. 3.a.) eller 0,25 ml sporesuspension. Inkubation ved 60 graderC +/- lo C i 18-24 timer.

Overfladevæksten i hvert skråagarglas opslemmes i hvert sit glas med 1 ml steril fysiologisk kogsaltopløsning. De 3 ml bakterieopslemning overføres til Rouxflasken og fordeles jævnt på substråtoverfladen med glasperlerne. Rouxflasken inkuberes ved 60 graderC +/- 1 graderC i 72 timer, hvorefter den henstilles i køleskab ved max. 5 graderC i 48 timer.

Overfladevæksten i Rouxflasken opslemmes i 10-ml steril fysiologisk kogsaltopløsning ved hjælp af glasperlerne. Opslemningen overføres til en 100 ml Erlenmeyerkolbe. Bakterieopslemningen koges i 10 minutter, hvorved de vegetative bakterier dræbes.

Sporeindholdet i sporesuspensionen bestemmes ved almindelig kimtælling (10-5 - 10-9) i Plate count agar efter inkubering ved 60 graderC +/- 1gradC i 18-24 timer. Sporesuspensionen fortyndes med steril fysiologisk kogsaltopløsning til ca. 200 mill. sporer pr. ml. Den fortyndede sporesuspension fordeles i 10 ml portioner i sterile glas med tætsluttende lukke og henstilles i køleskab ved max. 5 graderC. Sporesuspensionen kan holde sig i årevis ved denne temperatur.

(Kilde: J. Aarup Madsen: Bacillus stearothermophilus-påvisning af antibiotikarester. Beskrivelse af sporefremstillingsteknik. Dansk Veterinærtidsskrift 59, 1976, 134-137.)

Anden ligeværdig sporefremstillingsmetodik kan benyttes.

4. Fremstilling af testplader

a. Vegetative bakterier

Til 5 dele smeltet og afkølet agarsubstrat (jfr. 2.c.) tilføres 1 del opformeret kultur. Efter grundig blanding ophældes i skåle. Substrattykkelsen skal være så lille (0,6-0,8 mm) og ensartet som mulig, hvorfor skålen skal have helt plan bund, samt henstilles på et absolut vandret underlag. Pladerne er holdbare i adskillige dage under forudsætning af, at de afkøles umiddelbart efter ophældningen, og opbevaringen sker i forseglede plasticposer i køleskab ved max. 5 graderC.

b. Sporer

Til 50 dele smeltet, 55 graderC varm agarsubstrat (jfr. 2.c.) tilføres 1 del færdigfremstillet sporesuspension. Efter grundig blanding ophældes i skåle. Substrattykkelsen skal være så lille (0,6-0,8 mm) og ensartet som mulig, hvorfor skålen skal have helt plan bund, samt henstilles på et absolut vandret underlag. Pladerne er holdbare i adskillige dage under forudsætning af, at de afkøles umiddelbart efter ophældningen, og opbevaringen sker i forseglede plasticposer i køleskab ved max. 5 graderC.

(Kilde: J. Aarup Madsen: Bacillus stearothermophiluspåvisning af antibiotikarester. Beskrivelse af sporefremstillingsteknik. Dansk Veterinærtidsskrift 59, 1976, 134-137.)

c. Testplader til neutralisationsforsøg med paraaminobenzoesyre (jfr. 7.2.) fremstilles ved til substratet, som anført under a. og b., at tilsætte 10 ml paraaminobenzoesyreopløsning (jfr. 2.f.) pr. 1000 ml substrat.

5. Metodik

Papirdisken (jfr. 6.) dyppes i den grundigt blandede mælkeprøve ved hjælp af en ren, tør pincet (flambering og efterfølgende afkøling mellem hver prøve). Overskud af mælk fjernes ved at stryge disken langs randen af prøveglasset. Disken placeres forsigtigt på overfladen af agaren og presses let ned mod overfladen. Der skal være mindst 10 mm mellem hver disk, ligesom disks ikke må placeres nærmere end 10 mm fra skålens kant.

Pladen inkuberes ved 60 graderC +/- 5 graderC i 2 1/2 - 5 timer, idet inkubationstiden kan være kortest ved temperaturer i den øverste del af intervallet. Efter inkubation aflæses eventuelle hæmningszoner, f.eks. ved hjælp af skydelære. Hæmningszonens diameter måles i hele mm og sammenlignes med hæmningszonerne for dels penicillinstandarder, jfr. 7.1.1., dels sulfonamidstandarder, jvf. 7.2.1.

I forbindelse med hver undersøgelse for indhold af hæmmende stoffer bestemmes hæmningszonernes diametre for følgende penicillinstandarder: 1,0 i.e./ml, 0,1 i.e./ml, 0,05 i.e./ml, 0,01 i.e./ml, 0,005 i.e./ml og 0,0025 i.e./ml, og for følgende sulfonamidstandarder: 10 mikrogram/ml, 5 mikrogram/ml, 1 mikrogram/ml og 0,5 mikrogram/ml. De opnåede hæmningszonediametre indberettes hver måned til Veterinærdirektoratet.

6. Papirdisks

Papirdisks skal være 12-13 mm i diameter. På hver ny »batch« af papirdisks udføres en blindprøve på 9 disks med sterilt, destilleret vand for at kontrollere, at de anvendte papirdisks ikke giver uspecifikke zoner. Papirdisks opbevares tørt, helst i exsiccator.

7. Neutralisationsforsøg

7.1. Neutralisationsforsøg med penicillinase (penase).

Til konstatering af, om fremkomne hæmningszoner skyldes penicillin, foretages neutralisationsforsøg med penase som dobbeltbestemmelse. Penaseopløsningen fremstilles ved at opløse Penase Leo 100.000 enheder i 100 ml glasdestilleret vand. Ved opbevaring i køleskab (max. 5 graderC) er opløsningen holdbar i en uge. Alternativt kan benyttes disks præparerede med penase.

Mælkeprøven opvarmes ved 61 graderC i 30 minutter, afkøles til 37 graderC og deles i fire delprøver. Herefter foretages en af de to nedennævnte neutralisationsforsøg med penase

a. Til to delprøver tilsættes 0,1 til 0,2 ml penaseopløsning pr. 10 ml mælk til neutralisation af formodet tilstedeværende penicillin. Delprøverne omrystes. Alle fire delprøver undersøges herefter som angivet i 5.

b. De to delprøver undersøges som angivet i 5. To med penase forud præparerede disks dyppes i hver sin af de to andre delprøver, og undersøgelsen udføres derefter som angivet i 5. For tiden har Veterinærdirektoratet godkendt »Bacto concentration Disk Penase 1/2«, Difco', som en således præpareret disk.

Penasediskene vil afgive penase til de mælkeprøver, de bliver dyppet i, hvorfor disse prøver ikke kan bruges til penicillinpåvisning ved en eventuel senere kontrol.

Dannes der ingen eller kun en ganske smal hæmningszone omkring disken med den penasebehandlede mælkeprøve, subs. penasedisken, eller er zonen omkring penasedisken væsentlig mindre end zonen omkring den anden disk, anses det som udtryk for, at prøven har indeholdt penicillin.

Opstår der hæmningszoner af ens eller omtrent ens størrelse for begge

delprøver, må hæmningen tilskrives andre årsager end penicillin, og undersøgelsen fortsætter fra pkt. 7.2.

7.1.1. Penicillinstandarder.

Til fremstilling af penicillinstandarder anvendes kalium- eller natriumpenicillin, f.eks. i form af Penicillin Standard Rosco. 1 hætteglas (10 ml) indeholder 10 mg natriumpenicillin-G svarende til 16.500 i.e Hætteglassets indhold opløses i 16,5 ml phosphat-stødpude (primært kaliumphosphat (KH2PO4) 8 g, sekundært kaliumphosphat (K2HPO4) 2 g, destilleret vand ad 1000 ml, pH 6,0) eller i 16,5 ml sterilt destilleret vand. Ved opbevaring i køleskab (max. 5 graderC) er opløsningen holdbar i en uge. Ud fra denne stamopløsning fremstilles de nødvendige yderligere fortyndinger i ovennævnte stødpude eller i sterilt destilleret vand. Fortyndingerne skal bruges samme dag, de er fremstillede.

7.1.2. Standardkurve.

Det omtrentlige indhold af penicillin i mælkeprøver bestemmes ved hjælp af en standardkurve. En sådan kurve, der optegnes semilogaritmisk, fremstilles på grundlag af en undersøgelse af mindst 3 penicillinstandarder med koncentrationer, der skal ligge omkring den koncentration, som forventes fundet i den positive prøve. Standarder medtages ved alle kontrolundersøgelser af positive prøver. Hæmningszonens diameter for såvel standarder som den positive mælkeprøve skal måles på samme testplade.

7.2. Neutralisationsforsøg med paraaminobenzoesyre.

Til konstatering af, om hæmningszoner omkring disken med den penasebehandlede mælkeprøve (jfr. 7.1.a.), subs. penasedisken (jfr. 7.1.b.), skyldes sulfonamider, foretages neutralisationsforsøg med paraaminobenzoesyre.

Ved brug af den i 5. nævnte metodik udføres undersøgelse for hæmning af testorganismen ved anvendelse af 2 testplader, hvoraf den ene er tilsat paraaminobenzoesyre (jfr. 4.c.).

Dannes der ingen eller kun en ganske smal hæmningszone omkring disken ved brug af testplader med paraaminobenzoesyre, anses det som udtryk for, at prøven har indeholdt sulfonamider.

Opstår der hæmningszoner af ens eller omtrent ens størrelse omkring såvel disken på testpladen med paraaminobenzoesyre som omkring disken på den almindelige testplade må hæmningen tilskrives andre årsager end sulfonamider.

7.2.1. Sulfonamidstandarder.

Til fremstilling af sulfonamidstandarder anvendes 10 mg sulfadimidinnatrium opløst i 100 ml sterilt destilleret vand. Ved opbevaring i køleskab ved max. 5 graderC er opløsningen holdbar i 1 måned. Ud fra denne stamopløsning fremstilles de nødvendige fortyndinger, f.eks. 1 mikrogram/ml, 5 mikrogram/ml, 10 mikrogram/ml.

7.2.2. Standardkurve.

Det omtrentlige indhold af sulfonamid i mælkeprøven bestemmes ved hjælp af en standardkurve, der fremstilles på grundlag af en undersøgelse af mindst tre sulfonamidstandarder med indhold af sulfonamid, som ligger omkring den koncentration, der forventes fundet i den positive prøve.

8. Følsomhed

Den i 1. nævnte testorganisme kan hæmmes af vandige antibiotikaopløsninger, der pr. ml indeholder

Penicillin 0,004 i.e. Tetracyklin 2 mcg Oxytetracyklin 5 mcg Streptomycin 1 mcg Tylosin 0,5 mcg Spiramycin 1 mcg Neomycin 2 mcg Sulfadimidinnatrium 0,5 mcg

9. Indberetning til Veterinærdirektoratet

Fund af hæmmende stoffer indberettes til Veterinærdirektoratet på dertil udleverede skemaer senest dagen efter fundet.

Fund af zoner, der ikke ophæves af penicillinase og paraaminobenzoesyre, registreres og meddeles til Veterinærdirektoratet.

10. Ringtest

Veterinærdirektoratet kan lejlighedsvis udsende mælkeprøver til kontrol med metodens følsomhed og til sammenligning af resultaterne fra de enkelte laboratorier.

Bilag 6 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

BESTEMMELSE AF INDHOLD

AF BACILLUS CEREUS

1. Undersøgelsen udføres som anført i Nordisk Metodik-Komites forskrifter, for tiden nr. 67, 2. udgaver 1982, med følgende ændringer

Blodagar (5%) kan tilsættes 25 i.e. Polymyxin B-sulfat pr. ml. Undersøgelse for tilstedeværelse af Bacillus cereus kan ske ved undersøgelse af belastede (l7 graderC i 24 timer) prøver.

2. Alternative metoder kan kun benyttes efter Veterinærdirektoratets godkendelse, hvortil vil kræves dokumentation for metodens ligeværdighed med den under 1. nævnte.

Bilag 7 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

BESTEMMELSE AF FRIE FEDTSYRER I MÆLK

1. Formål og definition

Bestemmelse af mælkens indhold af frie fedtsyrer. Metodikken hviler på et ekstraktions-kolorimetrisk (EK) princip. De fundne resultater angives i milliækvivalenter frie fedtsyrer pr. liter mælk (mækv./l).

2. Princip

Mælk blandes med ekstraktionsopløsning. Til blandingen tilsættes destilleret vand og heptan. Det hele blandes i 5 min. og henstår indtil fasedeling. Heptanlaget indeholdende frie fedtsyrer overføres til prøverør, der hensættes i Auto Analyzerens prøveudtagningsenhed.

Heptanlaget gennembobles af CO2-fri kvælstof og overføres i CO2-fri tilstandtil Auto Analyzeren og blandes med arbejdsbufferopløsning og indikator. Der foretages blanding i spiral. Under blandingen forbruges noget af bufferen, pH ændres og indikatoren ændrer farve. Farvens intensitet måles ved 560 nm. Mængden af frie fedtsyrer kan hermed bestemmes ved sammenligning med resultater af analyser af palmitinsyre.

3. Apparatur og glasvarer

3.1. Auto Analyzer II (AAII) bestående af

3.1.1. Prøveudtagningsenhed.

Prøveudtagningsenheden består af en karrusel, på hvilken de ekstraherede prøver stilles, en kamskive, der bestemmer prøvefrekvensen, prøveudtagningskanyle, gennemboblingskanyle samt skyllekar for de to kanyler. Yderligere er denne enhed påmonteret en kvælstofkanyle.

3.1.2. Peristaltisk pumpeenhed.

Den peristaltiske pumpe er påmonteret pumpeslanger af mærket Solvaflex. Transportslangerne er af mærket Kel-F.

3.1.3. Blandespiral af Kel-F slange.

3.1.4. Kolorimeter.

Kolorimeteret er påmonteret en 15 mm gennemstrømningskuvette af glas. Ved målingen benyttes lys med bølgelængde 560 nm.

3.1.5. Udskrivningsenhed.

Udskrivningsenheden består af en recorder samt en printer.

3.2. Sovirelrør 100 x 26 mm med skruelåg og teflonindlæg.

3.3. Vendeapparat, ca. 25 omdrejn./min.

4. Reagenser

4.1. Ekstraktionsopløsning

Isopropanol 800 ml n-Heptan 200 ml 3 n Svovlsyre 20 ml 4.2. Buffer (stamopløsning): Natriumbarbitol 25,0 g Phenolrødt 10,0 g Destill. vand 1000 ml 4.3. Arbejdsbufferopløsning: Stamopløsning 4,00 ml 99% Ethanol (CO2-frit) 1000 ml 4.4. Palmitinsyreopløsning (4 mækv./l): Palmitinsyre 0,205 g n-Heptan 200 ml 4.5. Standarder: Palmitinsyre ad. n-Heptan Standard (4 mækv./1) (mækv./1) 5,0 ml 400 ml 0,20 10,0 ml 400 ml 0,40 15,0 ml 400 ml 0,60 20,0 ml 400 ml 0,80 25,0 ml 400 ml 1,00 30,0 ml 400 ml 1,20 35,0 ml 400 ml 1,40

5. Procedure

5.1. 2 ml mælk afmåles med justeret sprøjte i et 100 x 26 mm Sovirelrør (3.2.)

5.2. Der tilsættes 10 ml ekstraktionsopløsning. Under denne afmåling blandes mælken og ekstraktionsopløsningen, idet afmålingsrøret er tilspidset således, at væskestrålen er tynd og relativt hård.

5.3. 4 ml destilleret vand tilføres.

5.4. 6 ml heptan afmåles yderligere til røret, der lukkes med skruelåg og blandes på roterapparat (25 omdr. pr. min.) i 5 min. Efter 30 min. henstand i ro er en sikker fasedeling opnået.

5.5. Af heptanlaget, indeholdende frie fedtsyrer, afmåles med injektionssprøjte så meget som muligt uden at medtage noget af den underliggende fase. Den afmålte mængde overføres til et Sovirelrør (3.2.) med skruelåg og teflonindlæg.

5.6. Røret henstilles i prøveudtagningsenheden på AA II.

5.7. Overførsel af prøve til AA II.

5.7.1. Auto Analyzerens prøveudtagningsenhed påmonteres 3 kanyler.

To af disse går ned i prøverøret, hvorfra der suges prøve ind i AA II. Den ene af disse kanyler, hvorigennem der blæses CO2-fri kvælstof, har en sådan længde, at den udmunderover heptanopløsningen i røret. Herved udlægges under indsugning af prøve en kvælstofatmosfære, der hindrer luftens C02 i at influere på analyseresultatet. Den anden kanyle når ned i heptanopløsningen, hvorfra der suges prøve ind i AA II.

Under denne indsugning står den tredie kanyle nede i den efterfølgende prøve og gennembobler denne med G02-fri kvælstof for at fjerne C02 fra heptanopløsningen.

5.7.2. Heptanopløsningen blandes med arbejdsbufferopløsningen og væskestrengen segmenteres med CO2-fri luft, for at få en effektiv blanding i blandespiralen.

5.7.3. De frie fedtsyrer i heptanopløsningen forbruger af bufferen, herved ændres pH og indikatorens farve.

5.7.4. Umiddelbart før kuvetten afledes segmenteringsluften.

5.7.5. Indikatorens farveændring måles i kolorimeteret og sammenlignes med den farveændring, standardrækken af palmitinsyre giver anledning til.

5.8. Undersøgelser af palmitinsyre standarder.

5.8.1. Til kalibrering af Auto Analyzer foretages ved hver opstart på analyseserie en måling på de i 4.5 anførte standarder. Analysen fortages som anført i 5.6. og 5.7.

5.8.2. Til kontrol med Analysestabilitet foretages for hver 30-50 prøve en bestemmelse af standard indeholdende 0,60 mækv./l.

5.8.3. Resultaterne af de i 5.8.2. anførte analyser, må højst afvige 0,02 mækv./l fra standarden.

6. Resultatet udskrives på Auto Analyzerens recorder og printer

7. Resultater angives med 2 betydende cifre

Bilag 8 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

BESTEMMELSE AF ANAEROBE SPORER

1. Omfang og anvendelsesområde

Den foreliggende analyse foreskriver en metode til bestemmelse af anaerobe laktoseforgærende sporer (Clostridium tyrobutyricum) i mælk.

2. Definition

Clostridium tyrobutyricum er en anaerob, sporedannende stavbakterier (gram + og katalase -), som forgærer laktose under smørsyredannelse og luftudvikling.

3. Princip

Undersøgelsen for anaerobe sporedannere foretages efter »most probable number« (MPN) princippet ved podning i en selektiv bouillon tilsat redoxindikator. Efter tilsætning af paraffin foretages en varmebehandling af prøven for dels at

dræbe alle vegetative celler og dels for at få paraffinproppen til at slutte

De anaerobe forhold opnås ved at benytte en udkogt bouillon samt ved med

anførte paraffinprop at tætne for iltdiffusion under inkuberingen. Efter inkubering bedømmes rørene som positive, hvis den af sporedannerne udviklede gas

har forårsaget en opskydning af paraffinproppen.

4. Substrat/kemikalier

4.1. Sammensætning

Pepton fra kasein 15,0 g Kødekstrakt 10,0 g Gærekstrakt 5,0 g Na-lactat 5,0 g Na-acetat 5,0 g L-cystein klorhydrat 0,5 g Resazurin 2,5 mg Vand ad 1000 ml

Justeres til pH 5,9 +/- 0,1

Kommercielt substrat f.eks Merck's substrat art. 11734 (Basis substrat Tyrobutyricum-bouillon) kan benyttes.

Efter fuldstændig opløsning fordeles bouillonen i reagensglas 125 x

16 mm (5.1.) med 10 ml i hver og autoclaveres ved 121 graderC i 15 min.

4.2. Paraffin teknisk kvalitet. Smeltepunkt 56 - 58 graderC. (f.eks. Merck's

prod. nr. 7337).

5. Apparatur og glasvarer

5.1. Reagensglas 125 x 16 mm.

6. Forbehandling af prøven

Prøven blandes ved mindst 10 dobbeltvendinger.

7. Bestemmelse

7.1. Substratets farve skal på podetidspunktet være gullig. I tilfælde af lys rødlig farvetone må substratet udkoges i vand i ca. 20 min. evt. strømning i autoclave med efterfølgende nedkøling til 20 - 30 graderC.

7.2. Podningen foretages ved til 5 x 3 rør

at tilsætte 5 x 1 ml, 5 x 0,1 ml, 5 x 0,01 ml mælk.

7.3. Efter podningen tilsættes ca. 1 cm paraffin (ca. 2 ml).

Denne er først smeltet i paraffingryde.

7.4. Varmebehandling ved 75 graderC i 15 min.

7.5. Nedkøling i rindende koldt vand.

7.6. Inkubering og aflæsning.

Rørene inkuberes ved 37 graderC i 7 døgn.

Aflæsningen foretages ved at notere sig antal opskudte paraffinpropper i hver række. Kriteriet for positiv reaktion er en opskydning på mindst 2-3 mm. Bemærk: Paraffinpropper kan være sunket tilbage på bouillonoverfladen.

Kombinationen af positive rør noteres, og antal sporedannere aflæses i nedenstående tabel.

8. Resultat

Antal sporer pr. liter = tabeltal x 1000

Resultatet angives med 2 betydende cifre.

MPN pr. ml

5 x 1 ; 5 x 0.1000 ; 5 x 0.0100 pr. ml

-------------------------------------------------------------------- Kategori Confidence grænser ---------- ------------------------------- Resultat MPN 1 2 99% 95% -------------------------------------------------------------------- 0 0 1 0.2 x <0.1 1.3 <0.1 1.0 0 1 0 0.2 x <0.1 1.4 <0.1 1.0 1 0 0 0.2 x <0.1 1.5 <0.1 1.1 1 0 1 0.4 x 0.1 1.9 0.1 1.5 1 1 0 0.4 x 0.1 1.9 0.1 1.5 1 2 0 0.6 x 0.1 2.3 0.2 1.8 2 0 0 0.4 x 0.1 2.2 0.1 1.7 2 0 1 0.7 x 0.1 2.6 0.2 2.1 2 1 0 0.7 x 0.1 2.6 0.2 2.1 2 1 1 0.9 x 0.2 3.1 0.3 2.5 2 2 0 0.9 x 0.2 3.1 0.3 2.5 3 0 0 0.8 x 0.1 3.1 0.3 2.5 3 0 1 1.1 x 0.2 3.7 0.4 2.9 3 1 0 1.1 x 0.2 3.7 0.4 3.0 3 1 1 1.4 x 0.4 4.3 0.6 3.5 3 2 0 1.4 x 0.4 4.3 0.6 3.5 3 2 1 1.7 x 0.5 4.9 0.8 4.1 3 3 0 1.7 x 0.5 5.0 0.8 4.1 4 0 0 1.3 x 0.3 4.9 0.5 3.9 4 0 1 1.7 x 0.5 5.8 0.7 4.6 4 1 0 1.7 x 0.5 5.9 0.7 4.7 4 1 1 2.1 x 0.6 6.8 0.9 5.5 4 2 0 2.2 x 0.7 7.1 0.9 5.7 4 2 1 2.6 x 0.8 8.1 1.2 6.6 4 3 0 2.7 x 0.9 8.3 1.3 6.8 4 3 1 3.3 x 1.1 9.5 1.5 7.7 4 4 0 3.4 x 1.2 9.8 1.5 8.1 5 0 0 2.3 x 0.6 11.6 0.9 8.7 5 0 1 3.1 x 0.9 14.5 1.4 11.2 5 1 0 3 x 1 16 1 12 5 1 1 5 x 1 20 2 15 5 1 2 6 x 2 23 3 19 5 2 0 5 x 1 22 2 17 5 2 1 7 x 2 27 3 21 5 2 2 9 x 3 31 4 25 5 3 0 8 x 2 32 3 25 5 3 1 11 x 3 38 4 30 5 3 2 14 x 4 44 6 36 5 4 0 13 x 3 50 5 39 5 4 1 17 x 5 61 7 48 5 4 2 22 x 7 73 9 59 5 4 3 28 x 9 87 13 70 5 4 4 35 x 12 101 16 83 5 5 0 24 x 6 127 10 95 5 5 1 30 x 10 180 10 130 5 5 2 50 x 10 250 20 200 5 5 3 90 x 20 380 30 300 5 5 4 160 x 40 700 60 530 -------------------------------------------------------------------

Kategori 1: Normale resultater, opnås i 95% af tilfældene.

Kategori 2: Mindst sandsynlige resultater, opnås kun i 4% af tilfældene. Mindst sandsynlige kombinationer er ikke nævnt.

Bilag 9 til Veterinærdirektoratets instruks af 2. januar 1990 for laboratorier, der er godkendt til at foretage undersøgelse af mælkeprøver til kvalitetsbedømmelse og kvalitetsafregning af mælk.

BESTEMMELSE AF MÆLKENS FRYSEPUNKT

1. Bestemmelse udføres med cryoskop, som anført i IDF Standard 108 A: 1986.

Ingen