Vurdering af genteknologiske forskningsprojekter m.v. (* 1) (+ 2) (* 3)

Bilag

Liste over eksempler på organismer indplaceret i risikogrupperne I, II, III og IV.

Denne liste giver eksempler på organismer, der er indplaceret i risikogrupperne I, II, III og IV.

Listen er udarbejdet på grundlag af materialet, der er nævnt i litteraturlisten. Organismerne er nævnt ved artsnavn og ikke som grupper af organismer, og ikke alle organismer er inkluderet i listen. Listen kan blive ændret i forbindelse med fremkomsten af nye oplysninger.

Der gøres opmærksom på, at arbejde med organismer listet i risikogruppe I ikke nødvendigvis altid kan udføres i laboratorieklasse 1, og at arbejde med organismer i risikogruppe II ikke altid kan udføres i laboratorieklasse 2 o.s.v., idet projektet som helhed skal vurderes til en given laboratorieklasse.

--------------------------------------------------------------------- Risiko- Bakterier Svampe Parasitter Virus gruppe --------------------------------------------------------------------- I Escherichia Aspergillus coli K-12 oryzae Bacillus (ikke- subtilis toksin- Lactobacillus dannere) acidophilus Saccha- Staphylococcus romyces epidermidis cerevisiae Streptococcus lactis --------------------------------------------------------------------- II Actinobacillus Aspergillus Ascaris Adenovirus lignieresii fumigatus lumbricoides (alle humane) Bacillus Blastomyces Entamoeba Coxsackie cereus dermatitidis histolytica virus Bordetella Cryptococcus Giardia lamblia Cytomegalo- pertussis neoformans Leishmania virus Borrelia Epidermo- donovanii Epstein-Barr recurrentis phyton Naegleria virus Campylobacter floccosum falciparum Herpes fetus Sporotrix Schistosoma simplex virus Chlamydia schenckii mansoni Human immuno- psittaci Tricho- Taenia deficiency Clostridium phyton saginata virus (HIV, botulinum rubrum Toxoplasma ved forsøg, Corynebacterium gondii der ikke diphteriae Trichinella indebærer Erysipelothrix spiralis opformering) rhusiopathia Trypanosoma Influenza Escherichia coli criuzi virus Haemophilus Parotitis influenzae virus Legionella Poliomyelitis pneumophila virus Mycobacterium Rabies virus fortuitum Rhinovirus Mycoplasma Rubella virus pneumoniae Rubeola virus Neisseria Varicella- gonorrhoeae Zoster Pasteurella Vaccinia multocida virus Pseudomonas Yellow fever aeruginosa virus Salmonella (svækkede typhimurium laboratorie- Shigella sonnei stammer) Staphylococcus aureus Streptobacillus moniliformis Streptococcus pyogenes Treponema pallidum Vibrio cholerae Yersinia enterocolitica --------------------------------------------------------------------- III Bacillus Coccidioides Central anthracis immitis European Brucella suis Histoplasma encephalitis Coxiella capsulatum virus burnetii Hepatitis B Francisella virus tulariensis Herpes B Mycobacterium virus tuberculosis (Simian). Pseudomonas Human immuno- mallei deficiency Richettsia akari virus (ved Yersinia pestis opformerings- forsøg) Human T-cell leukemia virus Lymphocytic chorio- meningitis Monkey pox virus (ved in vitro forsøg) Yellow fever virus (vildtype, ved in vitro forsøg) --------------------------------------------------------------------- IV Lassa virus Monkey pox virus (ved overfør- sels og in- okulations forsøg) Marburg virus Russian Spring Summer encephalitis virus Variola major Yellow fever virus (ved overfør- sels og in- okulations forsøg). ---------------------------------------------------------------------

Vurdering af genteknologiske forskningsprojekter m.v. (* 1) (+ 2) (* 3)

Indholdsfortegnelse

Indledning

1. Generelt om projektvurdering

1.1 Indplacering af organismer i risikogrupper

1.2 Det overførte genetiske materiales betydning ved projektvurdering

1.2.1 Produkter

1.2.2 Vektorer

1.3 Biologisk indeslutning

1.3.1 Eksempler på B 1 systemer

1.3.2 Eksempler på B 2 systemer

1.4 Valg af laboratorieklasse

2. Projektvurdering i praksis

2.1 Eksempler på projekttyper

2.2 Eksempler på laboratorieklasse 1 projekter

2.3 Eksempel på laboratorieklasse 2 projekt

2.4 Eksempel på laboratorieklasse 3 projekt

Ordliste

Litteraturliste

Bilag: Liste over eksempler på organismer

indplaceret i risikogrupperne I, II, III og IV

Indledning

Ifølge §6, stk. 1 i Arbejdsministeriets bekendtgørelse nr. 578 af 1. september 1987 om genteknologi og arbejdsmiljø og senere ændringer skal den, der vil påbegynde et forskningsprojekt eller andre laboratorieopgaver (herunder storskalaforsøg, jf. §11, stk. 1), hvori der indgår genteknologisk arbejde, foretage en samlet vurdering, jf. bilag 2, af mulige farer for sikkerhed og sundhed ved de biologiske systemer (projektvurdering). Ud fra vurderingen skal vedkommende bedømme, hvilken laboratorieklasse arbejdet skal udføres i, jf. §6, stk. 2. Vurderingen skal foretages, inden projektet iværksættes.

Denne anvisning giver nærmere retningslinier for, hvilke forhold ved det anvendte biologiske system der skal inddrages i ovennævnte vurdering. Herved uddyber anvisningen bekendtgørelsens bilag 2. Vurderingen skal foretages i overensstemmelse med denne anvisning eller på en anden måde, der er lige så forsvarlig.

Vurderingen skal forelægges sikkerhedsorganisationen, jf. §19.

Anvisningen beskriver alene de generelle principper for projektvurdering, idet kombinationsmulighederne for vært, donor, vektor og overført genetisk materiale er utallige, men den giver ved eksempler mulighed for at drage analoge slutninger om indplacering af arbejdet i laboratorieklasser.

Anvisningen er opdelt i to afsnit: 1: »Generelt om projektvurdering« der beskriver de biologiske aspekter, der skal inddrages i en projektvurdering af eventuelle risici, og som giver generelle retningslinier for valg af laboratorieklasse. 2: »Projektvurdering i praksis«, som giver eksempler på kombinationer af biologiske systemer, analyse af disse og den resulterende indplacering i laboratorieklasse.

1. Generelt om projektvurdering

Ifølge bekendtgørelse nr. 578 af 1. september 1987 om genteknologi og arbejdsmiljø, bilag 2, skal følgende forhold inddrages ved vurderingen af mulige farer for sikkerhed og sundhed ved de benyttede biologiske systemer

A. Sygdomsfremkaldende egenskaber ved benyttede mikroorganismer.

B. Sundhedsskadelige egenskaber ved stoffer, som det overførte genetiske materiale medfører dannelse af.

C. Mulige sundhedsfarer ved arbejde med hele dyr og planter samt cellekulturer, herunder benyttede virus og virusfragmenter.

D. Øvrige mulige sundhedsfarer ved alle dele af de benyttede biologiske systemer, såsom vært, vektor, donor og genteknologisk fremstillet organisme, herunder vurdering af biologisk indeslutningsgrad.

1.1 Indplacering af organismer i risikogrupper

Ifølge punkt A. i bilag 2, jf. ovenfor, skal sygdomsfremkaldende egenskaber ved benyttede mikroorganismer inddrages i projektvurderingen. Ved denne vurdering skal en anvendt organisme indplaceres i en risikogruppe. Til indplacering anvendes 4 risikogrupper, der definerer stigende risiko for human sygdom.

De 4 risikogrupper beskrives således

Risikogruppe I

En organisme, som efter al sandsynlighed ikke forårsager human sygdom.

Risikogruppe II

En organisme, som kan give human sygdom, og som kan udgøre en fare for laboratoriepersonale. Udsættelse for organismen i laboratoriet resulterer sjældent i infektion.

Risikogruppe III

En organisme, som kan give alvorlig human sygdom, og som kan udgøre en alvorlig fare for laboratoriepersonale. Der kan være risiko for spredning i samfundet.

Risikogruppe IV

En organisme, som giver alvorlig human sygdom, og som er en alvorlig fare for laboratoriepersonalet. Der er stor risiko for spredning i samfundet.

I bilaget findes en liste, der giver eksempler på indplacering af organismer i risikogrupper.

Ved genteknologisk arbejde med organismer, der ikke er nævnt i bilaget, påhviler det den ansvarlige forskningsleder at foretage en forsvarlig indplacering af organismen. Der skal i denne indplacering i det mindste tages hensyn til nedennævnte forhold

1. Organismens humane patogenicitet, herunder

- forårsaget sygdom og patogenicitetsmekanisme, herunder invasivitet, virulens, infektionsvej og -sted

- kommunikabilitet, transmissionsevne

- infektiøs dosis

- værtsspektrum og -specificitet

- antibiotikaresistens

- toksindannende egenskaber

2. Organismens allergifremkaldende egenskaber.

3. Organismens kolonisationsevne.

4. Eksistensen af effektiv profylakse og behandling.

Man skal iøvrigt være opmærksom på, at en hvilken som helst organisme - uanset genteknologi - skal behandles under behørig hensyntagen til dens patogene egenskaber, og med hensyntagen til at genevoldende effekter kan variere fra person til person, afhængig af almentilstanden.

1.2 Det overførte genetiske materiales betydning ved projektvurdering

Ifølge punkt B. i bilag 2 skal sundhedsskadelige egenskaber ved stoffer, som det overførte genetiske materiale medfører dannelse af, inddrages i projektvurderingen.

Det overførte genetiske materiale, d.v.s. det rekombinante DNA, vil oftest indeholde information af to forskellige typer: Der kan dels være tale om, at det overførte genetiske materiale koder for et produkt, normalt af proteinnatur dels kan det genetiske materiale have regulerende funktion. Begge typer af information vil hyppigt være til stede i den samme vektor. Herudover indeholder de fleste vektorer diverse selektionsmarkører, sædvanligvis gener for antibiotika-resistenser.

1.2.1 Produkter

Ved projektvurderingen skal der især lægges vægt på, om det overførte genetiske materiale medfører dannelse af

1. Toksiner, der er giftige overfor vertebrater (hvirveldyr), og som har en LD50 værdi mindre end 100 mikrogram pr. kg legemsvægt. Toksiners toksicitet inddeles i 3 intervaller efter deres LD50 værdi ifølge NIH-guidelines (1)

1 mikrogram - 100 mikrogram/kg legemsvægt: Toksiske, fx Staphyllococcus aureus alfa- og betatoksin, ricin, Yersinia pestis toksin.

100 nanogram - 1000 nanogram (1 mikrogram)/kg legemsvægt: Meget toksiske, fx alfa- og epsilontoksin fra Clostridium perfringens.

Mindre end 100 nanogram/kg legemsvægt: De mest toksiske, fx botulinum-, tetanus-, difteri- og dysenteritoksiner.

Denne 3-deling anvendes ved indplacering af genteknologisk arbejde i laboratorieklasserne 2, 3 og 4.

2. Biologisk højvirksomme stoffer. Herved menes stoffer, der har signalfunktion i den menneskelige organisme, fx hormoner, lymfokiner, vækstfaktorer og visse onkogenprodukter (onkoproteiner).

Det væsentligste at vurdere ved projekter, der indebærer dannelse af biologisk højvirksomme stoffer, er ikke i så høj grad disse stoffers akutte toksicitet, da de normalt vil have en LD50 værdi, der ligger væsentligt højere end 100 mikrogram/kg legemsvægt.

Det væsentlige er derimod at vurdere risikoen for genevoldende biologiske effekter, der kan være forbundet med, at et biologisk højvirksomt stof produceres og virker på forkert sted, forkert tidspunkt, eller i forøget koncentration, herunder muligheden for cellulær transformation.

Som eksempel på denne vurdering kan nævnes dannelse af biologisk højvirksomt stof i en mikrobiel vært. Her skal der tages hensyn til organismens kolonisationsevne, evne til at overføre genetisk materiale til andre organismer, og stoffets biologiske effekt, idet en evt. kolonisering af værtsorganismen i tarmkanal eller luftveje må antages at kunne give anledning til en vedvarende lokal dosis af det pågældende stof. Yderligere kan det være relevant - i mangel af LD50 værdier - at inddrage den normalfysiologiske koncentration af stoffet i vurderingen.

Fx er den fysiologiske koncentration af IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) ca. 14 mikrogram/kg legemsvægt hos en person, der vejer 70 kg. Det vides ikke, hvor høje koncentrationer, der skal til, før forholdene bliver ufysiologiske, endsige patologiske.

Et andet eksempel på vurdering af projekter med biologisk højvirksomme stoffer er arbejde i cellekulturer med protoonkogener og de deraf opståede onkogener, der er medvirkende i cellers vækst- og differentieringsmønster samt transformation.

Det vigtigste at tage stilling til her vedrørende eventuelle risici, jf. bekendtgørelsens bilag 2, punkt C, er, om vektoren (virusset) har human specificitet, om der er hjælpervirus til stede og, hvis der er, om denne har samme værtsspecificitet som vektoren. Desuden skal effekten af det biologisk højvirksomme stof samt udtryksstyrken af det tilsvarende gen (fx onkogen) vurderes.

I vurderingen af udtryksstyrken spiller tilstedeværelsen af særlige reguleringssekvenser, herunder stærke promotorer, en rolle.

Endelig skal man være opmærksom på, at gener for biologisk højvirksomme stoffer kan være konserverede gennem evolutionen, og derved kan sådanne stoffer fra andre organismer være aktive i mennesket (fx svineinsulin og c-ras fra gær).

3. Antibiotikaresistens betragtes her sammen med øvrige produkter, idet plasmidbåret resistens udøves via enzymatisk nedbrydning af antibiotikummet, fx beta-lactamase mod penicilliner og cephalosporiner, acetyl transferase mod kloramfenicol og en lang række andre enzymer, der adenylerer, acetylerer eller fosforylerer stoffet.

Projekter, der indebærer overførsel af antibiotikaresistens, skal forhåndsgodkendes af Arbejdstilsynet, hvis denne overførsel kan bringe brugen af det pågældende antibiotikum til kontrol af sygdomsfremkaldende agenser i fare, jf. bekendtgørelsens bilag 4.

Overførsel af antibiotikaresistens benyttes i vid udstrækning i gensplejsningsforsøg til at udvælge de kloner, der har optaget det rekombinante arvemateriale. Disse resistenser er vektor (plasmid) bårne og kan dermed let overføres til andre organismer, især hvis organismerne er nært beslægtede. Det kan i mange tilfælde være vanskeligt at afgøre, hvorvidt en given organisme har erhvervet eller kan erhverve en sådan egenskab naturligt, idet det er diskutabelt, hvad der forstås ved »naturligt«.

Det kan derimod med større lethed afgøres, om brugen af antibiotikaresistens kan have uheldige følger for bekæmpelse af smitsomme sygdomme. Det er derfor væsentligt at vurdere, om den overførte antibiotikaresistens er rettet mod et af de præparater, der primært benyttes til at bekæmpe netop den organisme, hvori resistensen indføres. For eksempel vil det være uheldigt at indføre resistens mod penicillin i Bacillus anthracis, idet penicillin netop benyttes til at bekæmpe miltbrand med.

I forbindelse med anvendelse af selektionsmarkører henledes opmærksomheden på mulighederne for at udvikle alternative vektorer med andre markører end antibiotika-resistens, fx evne til overvindelse af særlige vækstkrav for værtorganismen.

4. Andet. Her tænkes på produkter med andre evt. genevoldende effekter end ovennævnte, fx proteiner, der kan have allergifremkaldende effekter, eller mikrobielle virulensfaktorer.

1.2.2 Vektorer

Vektorer anvendes til at indføre genetisk materiale i en værtsorganisme.

Som udgangsmateriale stammer vektorer fra

- Bakteriofager

Virus med prokaryoter som værter. Fager kan være transducerende, enten specielt transducerende eller generelt transducerende.

- Plasmider

Ekstrakromosomalt, cirkulært DNA med replikationsevne og evne til evt. at overføre DNA til en anden celle ved konjugation.

- Virus

Virus med eukaryoter som værter. Det kan enten være DNA-virus, som fx SV40 eller RNA-virus som fx retrovirus.

Der er udviklet mange sammensatte vektorsystemer indeholdende såvel plasmidelementer som viruselementer. Kendskab til oprindelsen af de enkelte vektorelementer, d.v.s. hvilke plasmid- og viruselementer, der indgår i vektoren, er af betydning for vurderingen af en given anvendt vektor. Vurderingen skal indeholde følgende aspekter

- Overførselsevne

Om vektorsystemet er konjugerbart eller non-konjugerbart, d.v.s. kan det genetiske materiale overføres til andre organismer end værtsorganismen.

- Værtsspecificitet

Hvilke organismer vektoren kan overføres til og udtrykkes i.

- Hjælpervirus

Tilstedeværelse af hjælpervirus i værtscellen, hvorved det genetiske materiale kan spredes.

Da vektoren spiller en rolle i overførsel fra en organisme/celle til en anden, skal det vurderes, om det rekombinante genetiske materiale kan indføres/integreres i den menneskelige organisme/det humane genom ved fx rekombination, konjugation, hjælperfunktion eller lignende.

Risikoen ved en sådan indførsel/integrering af rekombinant genetisk materiale skal indgå i den samlede projektvurdering.

1.3 Biologisk indeslutning

I projektvurderingen skal den biologiske indeslutningsgrad indgå for hvert vært-vektor system, jf. bekendtgørelsens bilag 2 punkt D. Der skal tilstræbes en så høj grad af biologisk indeslutning som muligt. Biologisk indeslutning er ikke et veldefineret begreb, men beskriver et vært-vektor system, vurderet under et, hvor følgende forhold er begrænsede, jf. bilag 7 som ændret ved bekendtgørelse nr. 355 af 29. maj 1989

1) den genteknologisk fremstillede organismes evne til overlevelse og formering uden for kulturvæsker, og

2) overførsel af genetisk materiale til andre organismer end den oprindelige værts-organisme.

Der er etableret to niveauer af biologisk indeslutning, B 1 og B 2.

B 1 betegner et vært-vektor system, der giver moderat grad af biologisk indeslutning. Anerkendelse som et B 1 system hviler på en viden om organismens og vektorens egenskaber med hensyn til overlevelse og formering, samt om mekanismer for udveksling af genetisk materiale.

B 2 betegner et vært-vektor system, der giver høj grad af biologisk indeslutning. Anerkendelse som et B 2 system hviler på eksperimentelle data angående organismens og vektorens egenskaber, herunder det genetiske materiales konstruktion, stabilitet og overførbarhed samt vært-vektor systemets overlevelse og formering under non-permissive laboratorieforhold, der repræsenterer det relevante naturlige miljø.

Det gælder for disse systemer, at frekvensen af udslip af rekombinant arvemateriale, enten via overlevelse af organismen eller via overførsel af rekombinant arvemateriale, skal være mindre end 10-8 under særlige laboratorieforhold.

1.3.1 Eksempler på B 1 systemer

Som eksempel på systemer med moderat grad af biologisk indeslutning kan nævnes som vært E. coli K-12, hvor denne ikke indeholder autonome eller integrerede konjugative plasmider eller generelt transducerende fager, og hvor vektoren er non-konjugerbar, fx Col E 1 eller derivater heraf.

E. coli K-12 er en laboratoriestamme, der har mistet flere egenskaber i forhold til vildtype E. coli. Disse manglende egenskaber gør, at den er apatogen og har svært ved at kolonisere tarmen hos mennesker. De egenskaber, E. coli K-12 har mistet, omfatter

- antigen K, der er knyttet til celleoverfladen og hvis tilstedeværelse giver høj invasivitet

- del af lipopolysaccharid sidekæde

- evne til fimbriedannelse, der er nødvendig for vedhæftning til tarm-epithelieceller

- resistens over for lysis af human serum komplement

- nogen resistens over for fagocytose af hvide blodlegemer.

E. coli K-12 kan dog overleve uden for tarmen eller kulturvæsker, men dens formering uden for kulturvæsker er begrænset, og sammen med en non-konjugerbar vektor (mangler transfer-gener) begrænses overførsel af genetisk materiale fra værtsklonen til andre organismer.

Et andet eksempel på systemer med moderat grad af biologisk indeslutning er cellekulturer fra højere eukaryoter med egnede vektorer, der ikke kan spredes, idet disse cellers vækstkrav er komplicerede, og overlevelse uden for kulturvæsker derfor betragtes som minimal. På grund af vævskompatibilitet anbefales det, at der ikke arbejdes med egne celler, idet evt. etablering af cellerne i organismen med uønsket effekt til følge kan forekomme.

1.3.2 Eksempler på B 2 systemer

Som eksempel på systemer, der giver høj grad af biologisk indeslutning, kan nævnes E. coli K-12, stamme chi 1776 som vært med fx pBR322 som vektor, eller E. coli DP 50 typer med fag-vektorer af Charon- og gtWES type. Desuden kan nævnes Bacillus subtilis, ASB 298 med fx pUB 110 som vektor.

Cellekultursystemer betragtes som systemer med høj grad af biologisk indeslutning, hvis det er vist, at cellerne ikke indeholder hjælpervirus for en given anvendt viral vektor.

1.4 Valg af laboratorieklasse

Laboratorier, hvori der skal udføres genteknologisk arbejde, skal klassificeres af Arbejdstilsynet. Klassifikationen foretages i 4 klasser (*), hvor der i klasse 1 laboratorier kun må foretages forsøg af laveste farlighed. Klassifikation til klasse 2, 3 og 4 stiller stigende krav til indretning og sikkerhedsforanstaltninger.

Klasse 1

Hvis det vurderes, at de biologiske systemer ikke indebærer nogen fare eller kun en minimal fare, skal arbejdet mindst udføres i laboratorieklasse 1.

Som hovedregel indplaceres arbejde med organismer i risikogruppe I i laboratorieklasse 1.

Klasse 2

Hvis det vurderes, at de biologiske systemer indebærer en moderat fare, skal arbejdet mindst udføres i laboratorieklasse 2.

Som hovedregel indplaceres genteknologisk arbejde med organismer i risikogruppe II i laboratorieklasse 2. Arbejde med toksiner med en LD50-værdi fra 1 til 100 mikrogram/kg legemsvægt skal udføres i laboratorieklasse 2. Ved arbejde med biologisk højvirksomme stoffer skal man i særlig grad være opmærksom på, at de samlede omstændigheder ved arbejdets udførelse kan nødvendiggøre, at arbejdet skal udføres i en højere laboratorieklasse end klasse 1.

Klasse 3

Hvis det vurderes, at de biologiske systemer indebærer fare for alvorlige eller potentielt dødelige sygdomme, skal arbejdet mindst udføres i laboratorieklasse 3.

Sådanne projekter skal forhåndsgodkendes af Arbejdstilsynet. Som hovedregel indplaceres arbejde med organismer i risikogruppe III i laboratorieklasse 3. Ligeledes indplaceres arbejde med toksiner med en LD50 værdi fra 100 til 1000 ng/kg legemsvægt i laboratorieklasse 3.

Som udgangspunkt vil arbejde med en eukaryot viral vektor med højt udtryk af et biologisk højvirksomt gen-produkt skulle udføres i laboratorieklasse 3, hvis den virale vektor kan inficere

humane celler, og arbejdet samtidig involverer tilstedeværelse af et hjælpervirus med samme værtsspecificitet.

Klasse 4

Hvis det vurderes, at de biologiske systemer indebærer større fare for alvorlige eller potentielt dødelige sygdomme, eller farer for uhelbredelige alvorlige eller potentielt dødelige sygdomme, skal arbejdet udføres i laboratorieklasse 4. Disse projekter skal forhåndsgodkendes af Arbejdstilsynet.

Som hovedregel indplaceres arbejde med organismer i risikogruppe IV i laboratorieklasse 4. Ligeledes indplaceres arbejde med toksiner med en LD50 værdi under 100 ng/kg legemsvægt i laboratorieklasse 4.

Hvis særlige betingelser er til stede, fx god biologisk indeslutning, enten ved fravær af hjælpervirus eller konjugative plasmider, se afsnit 1.3, kan nedklassificering overvejes.

2. Projektvurdering i praksis

Analyse og vurdering af et givent projekt skal foretages analogt med de følgende specifikke eksempler på indplacering af projekter i laboratorieklasserne 1, 2 og 3. Analysen skal inddrage relevante aspekter, der er omtalt i foregående kapitel.

2.1 Eksempler på projekttyper

Det er ikke alle aspekter, der er lige relevante ved vurderingen af forskellige projekter. Der kan skelnes imellem følgende hovedtyper af projekter

A) Overførsel af genetisk materiale fra mikroorganismer til andre mikroorganismer. (Specifikke eksempler 1 og 4). Det væsentligste at vurdere vedrørende disse projekter er

- de anvendte mikroorganismers patogenicitet,

- hvor velkarakteriseret det overførte genetiske materiale er,

- tilstedeværelse af konjugerbare plasmider eller generelt transducerede fager i vært-vektor systemet,

- eventuelle genevoldende effekter ved gen-produkter.

Projekter, der involverer »shotgun« kloning fra patogener til apatogene prokaryoter eller lavere eukaryoter, skal vurderes i henhold til den risikogruppe, hvori donororganismen

er indplaceret, da det her endnu ikke vides, om enkelte kloner har fået overført uønskede egenskaber. Ved senere subkloninger, eller hvis der arbejdes med velkarakteriseret genetisk materiale, der ikke koder for produkter med genevoldende effekter, kan nedklassificering foretages i henhold til den risikogruppe, som værtsorganismen er indplaceret i. Det væsentligste aspekt, der gør sig gældende ved overvejelse om nedklassificering, er vært-vektor systemets biologiske indeslutningsgrad (se afsnit 1.3). I denne forbindelse skal det vurderes

- om plasmidvektorer er non-konjugerbare (mangler tra-gener) og/eller non-mobiliserbare (mangler mob-gener), og om værten (fx E. coli K-12) indeholder integrerede eller uafhængigt replikerende konjugative plasmider, der ville kunne mobilisere introducerede rekombinante non-konjugerbare plasmider.

- om anvendte fagvektorer er specielt transducerende eller generelt transducerende, og om værten (fx E. coli K-12) indeholder generelt transducerende fager. Det skal nævnes, at flere hyppigt anvendte fagvektorer er generelt transducerende, fx M13. Sådanne vært-vektor systemer betragtes ikke som biologisk indesluttede. Mange projekter, hvor M13 benyttes til sekvensbestemmelse, vil alligevel kunne udføres i laboratorieklasse 1, da projekterne ikke på anden måde frembyder risici.

B) Overførsel af genetisk materiale fra højere eukaryoter til mikroorganismer (specifikt eksempel 2).

Det væsentligste at vurdere vedrørende disse projekter er meget analogt med A)

- den mikrobielle værts patogenicitet,

- tilstedeværelse af konjugative plasmider eller generelt transducerende fager,

- det overførte genetiske materiales velkarakteriserethed m.h.t. genevoldende effekter, samt

- om det overførte genetiske materiale koder enten for proteiner, som kan have en effekt på humane celler udefra (eksternt) eller for proteiner, der alene udøver en effekt, hvis de udtrykkes i den humane celle (internt).

C) Overførsel af genetisk materiale fra højere eukaryoter til cellekulturer fra højere eukaryoter (især dyr) (eksempel 3 og 5).

Det væsentligste at vurdere vedrørende sådanne projekter er

- om det overførte genetiske materiale koder for produkter med biologisk eller evt. patogen/toksisk effekt,

- promotorstyrke og evt. styrken af andre reguleringssekvenser,

- om den anvendte vektor har human specificitet ligeledes om den kan inficere eller transformere humane celler,

- om der er hjælpervirus tilstede.

2.2 Eksempler på laboratorieklasse 1 projekter

1) Titel

Pyrimidin nukleotid biosyntese i E. coli.

Vært: E. coli K-12

Donor: E. coli K-12

Vektor: pBR322

Gen. mat.: pyr D, pyr E, pyr F.

Analyse

E. coli K-12 er apatogen og en organisme i risikogruppe I. Vektoren er non-konjugativ og giver sammen med E. coli K-12 en moderat grad af biologisk indeslutning. Det klonede genetiske materiale er dokumenteret til kun at indeholde de nævnte gener, hvis produkter ikke er toksiske, biologisk højvirksomme eller på anden måde risikobetonede. Resistensen mod tetracyclin, der kodes for på vektoren og som ville være det typiske bredspektrede præparat mod patogene enterobakterier, mistes hos rekombinanterne, når pyr-generne klones i Bam HI site i pBR322.

Konklusion

Projektet kan udføres i laboratorieklasse 1.

2) Titel

Fremstilling af humant Adrenocorticotropisk hormon (ACTH).

Vært: Bacillus subtilis (asporogen stamme)

Donor: humane hypofyser

Vektor: pUB110 samt stærk Bacillus promotor

Gen. mat.: cDNA for ACTH-genet

Analyse

Asporogen Bacillus subtilis, med en reversions frekvens for sporedannelse, der er lavere end 10-7, er en organisme i risikogruppe I. Vektoren pUB110 er ikke mobiliserbar i Bacillus, og bærer ikke resistens overfor antibiotika, der er rettet mod patogene Bacillus-arter.

Det overførte genetiske materiale koder for ACTH af human oprindelse. ACTH er et proteinhormon og er et biologisk højvirksomt stof. Genteknologisk arbejde, hvor biologisk højvirksomme stoffer udtrykkes i en fremmed vært kan give grund til, at projektet skal udføres i en højere laboratorieklasse end klasse 1.

Konklusion

Da vært-vektor systemet imidlertid giver en moderat biologisk indeslutning, kan projektet udføres i laboratorieklasse 1.

3) Titel

Onkogen effekt i mammale celler.

Vært: 3T3 musecellelinie

Donor: Abelson murine leukemia virus

Vektor: pCGBPV9

Gen. mat.: Oncogenet abl

Analyse

Vektoren, pCGBPV9, er en sammensat vektor, med replicon fra E.coli ColE1 og fra Bovin papilloma virus. Ingen del af vektoren har human specificitet. Det overførte genetiske materiale er isoleret fra Abelson murine leukemia virus, der kan inficere mus, rotter og hamster, men ikke mennesket, og ikke kan transformere humane celler in vitro.

Onkogenet abl er et isoleret fragment, og det overførte genetiske materiale indeholder ikke virusstruktur proteingener, hvorfor virus-partikler ikke kan udvikles. Værten er en cellekultur med celler fra en højerestående eukaryot, der ikke indeholder hjælpervirus.

Konklusion

Onkogenprodukter er biologiske højvirksomme, og giver anledning til at overveje om projekter skal udføres i en højere laboratorieklasse end klasse 1. Da oncogenet abl

ikke virker eksternt på celler og da det biologiske system ikke indeholder elementer med human specificitet og derved ikke kan etableres i mennesket, og da der ikke kan udvikles viruspartikler, giver det moderat biologisk indeslutning, hvorfor projektet kan udføres i laboratorieklasse 1.

2.3 Eksempel på laboratorieklasse 2 projekt

4) Titel

At rejse antistoffer mod tuberkulose-antigener.

Vært: E. coli K-12

Donor: Mycobacterium tuberculosis

Vektor: pBR322

Gen. mat.: gener for M. tuberculosis antigener

Analyse

Mycobacterium tuberculosis er en organisme i risikogruppe III. Vektoren er non-konjugerbar og giver sammen med E. coli K-12 som vært en moderat biologisk indeslutning. De klonede gener for M. tuberculosis antigener er ikke velkarakteriserede, da kloning er foretaget ved »shotgun« metoden, og der kan muligvis påføres værten patogene egenskaber.

Konklusion

Som hovedregel skal arbejde med organismer i risikogruppe III udføres i laboratorieklasse 3. Da vært-vektor systemet giver moderat grad af biologisk indeslutning, kunne nedklassificering til klasse 1 overvejes, men da det overførte genetiske materiale er fremkommet ved »shotgun« metoden og dermed ikke er velkarakteriseret, skal projektet udføres i laboratorieklasse 2.

Når enkelte kloner er velkarakteriserede m.h.t. det overførte genetiske materiale og dets produkters evt. skadelige virkninger, kan nedklassificering til laboratorieklasse 1 overvejes.

2.4 Eksempel på laboratorieklasse 3 projekt

5) Titel

Ekspression i eukaryote celler af gen kodende for FGF-lignende faktor (Fibroblast Growth Factor-lignende faktor).

Vært: Hamstercellelinie og Murin amfotrop pakkecellelinie.

Donor: Homo sapiens.

Vektor: Retroviral vektor, deriveret fra murint leukæmivirus. Vektoren indeholder mindre end 2/3 af det retrovirale genom. Indeholder G418 resistens.

Gen.mat.: FGF-lignende vækstfaktor. Genet udtrykkes under kontrol af LTR's (Long Terminal Repeat) enhancer/promotor.

Vektoren med det indsatte gen indføres i pakkecellelinien, hvorved der dannes retrovirus-partikler med bred værtsspecificitet. Det høstede virus anvendes til at inficere hamsterceller in vitro.

Analyse

Det klonede gen koder for et biologisk højvirksomt stof, der ved en fysiologisk koncentration på få pg/ml vil kunne udøve en effekt på celler. Der er derfor grund til at overveje om arbejdet skal udføres i en højere laboratorieklasse end klasse 1. Det klonede gen udtrykkes under kontrol af LTR's promotor, d.v.s. under ikke fysiologiske betingelser. Det kan ikke udelukkes, at der ved rekombination i pakkecellelinien kan dannes replikationskompetente hjælpervirus med bred værtsspecificitet, incl. humane celler.

Konklusion

Idet der kan dannes replikationskompetente hjælpevirus med bred værtsspecificitet er vært-vektor systemet uden biologisk indeslutning og arbejdet skal derfor mindst udføres i laboratorieklasse 2.

Da der ydermere her er tale om et biologisk højvirksomt stof, der udøver en ekstern effekt på celler ved en meget lav koncentration, og som udtrykkes under kontrol af en middelstærk promotor, skal dette projekt mindst udføres i laboratorieklasse 3.

Erik Andersen

Ordliste

Følgende ordliste forklarer særlige fagudtryk, sådan som de skal forstås i denne anvisning. Ikke alle fagudtryk findes i ordlisten, idet fx visse basale termer indenfor mikrobiologi forudsættes bekendte.

Aktivator

Protein, der binder til et DNA-område og forøger transskriptionen af et gen.

Allergenicitet

Evne til at fremkalde overfølsomhedsreaktion.

Amfotrop virus

Virus, der kan krydse artsbarrierer.

Asporogen

Ikke sporedannende.

Attachmentsite

DNA-område, hvor bakteriofag krydser ind i værtskromosomet.

Autonome

Selvstændige, d.v.s. ekstrakromosomale, replikationsdygtige enheder (fx plasmider).

Biologisk højvirksomme stoffer

Stoffer, der har signalfunktion i den menneskelige organisme, fx hormoner og lymfokiner.

Biologisk system

Samtlige anvendte biologiske materialer, d.v.s. alle celler, væv, organismer, virus og plasmider, der anvendes som donor, vært, vektor eller genteknologisk fremstillet organisme.

Differentiering

Ændring af cellefunktion og -morfologi fra stamcelle til specialiseret celle.

Donor

Den organisme eller celle eller det cellemateriale, hvorfra det anvendte genetiske materiale stammer.

Enhancerregion

Et DNA-område, der uafhængig af afstand fra et givet gen og orientering i forhold til genet, forøger transskriptionen.

Fagocytose

Cellulær optagelse af partikler i membranbundne »sække« med efterfølgende nedbrydning af partiklen.

Generelt transducerende

Et vilkårligt stykke DNA kan overføres af fagpartiklen.

Genteknologi

Anvendelse af teknikkerne gensplejsning, herunder selvkloning og deletion samt cellehybridisering.

Genteknologisk arbejde

Anvendelse af genteknologi eller anvendelse af genteknologisk fremstillede celler eller organismer, væv af sådanne organismer samt genteknologisk fremstillede virus.

Invasivitet

Evne til at trænge gennem vævsbarrierer.

Kolonisationsevne

Evne til at etablere sig og reproduceres i en vært, uden nødvendigvis at invadere eller ødelægge væv.

Kommunikabilitet

Overførselsmekanisme mellem værter.

Konjugation

Overførsel af DNA fra en bakterie til en anden gennem pili.

LD50

Median lethal dose, den dosis af et stof der slår 50% af forsøgsdyrene ihjel.

Non-permissive forhold

Forhold, der ikke tillader optimal cellevækst og -deling i kulturen.

Onkogener

Gener der kan transformere celler in vitro.

Operatorregion

DNA-område, hvortil en aktiv repressor bindes.

Patogen

Sygdomsfremkaldende.

Patologisk

Sygelig.

Profylakse

Forebyggelse af sygdom.

Promotor

DNA sekvenser, hvortil RNA-polymerasen binder og starter transskription.

Protoonkogener

Normale cellegener, der er beslægtet med onkogener.

Replicon

Et særligt stykke DNA, der er i stand til selv-replikation (origin of replication).

Repressor

Protein, der binder til et DNA-område og forhindrer transskription af pågældende gen.

Specielt transducerende

Kun DNA nær det fagspecifikke attachmentsite kan overføres af fagpartiklen.

Transfer-gener

Tra-gener, der er nødvendige for overførsel af et plasmid fra en organisme til en anden, ved konjugation.

Transformation

Celleforandring.

Transmissionsevne

Den patogene organismes overførselsevne.

Vektor

Det biologiske materiale, som kan benyttes til at indføre genetisk materiale i en vært.

Virulens

Grad af sygdomsfremkaldende evne (patogenicitet) samt evne til at kolonisere værten.

Vært

Den celle eller organisme, hvori det genetiske materiale indføres. Ved anvendelse af cellehybridiseringsteknik, hvor der ikke meningsfyldt kan skelnes mellem donor og vært, skal de anvendte celletyper alle opfattes som værter.

Værtsspektrum

Bredden af organismer, der kan fungere som værter.

Værtsspecificitet

Hvilke (specifikke) organismer, der kan fungere som vært.

Litteraturliste

1) Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules

National Institutes of Health, U.S.A. i Federal Register, vol. 51, no. 88, pp. 16958 - 985, 7. maj 1986.

2) Richtlinien zum Schutz vor Gefahren durch in-vitro neukombinierte Nukleinsauren

Bundesminister fur Forschung und Technologie, Bundesanzeiger Verlagsges mbH., Koln, 28. maj 1986.

3) Categorisation of pathogens according to hazard and catagories of containment

Advisory Comittee on Dangerous Pathogens, Her Majesty's Stationery Office, december 1983.

4) Laboratory Biosafety Manual

World Health Organization, Geneva 1983.

5) Recombinant DNA Safety Considerations

OECD, Paris 1986.

6) Onkogener, onkoproteiner og tumorceller - en risikoanalyse

Poul Andersson (Gensplejsningsgruppen) for Levnedsmiddelstyrelsen, Publikation nr. 160, februar 1988.

7) Bekendtgørelse nr. 578 af 1. september 1987 om genteknologi og arbejdsmiljø.

8) Bekendtgørelse nr. 355 af 29. maj 1989 om ændring af bekendtgørelse om genteknologi og arbejdsmiljø.

11