Cirkulære om mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler

BILAG 2

01.01.85 DRIKKEVARER

2.4. Drikkevarer.

2.4.1. Saft, mineralvand. vin og lignende.

Basisparametre. Supplerende paramet re.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Kimtal 30 grader C.

pH. 2) Lactobaciller.

Gær- og skimmelsvampe.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Kimtal 30 grader C anvendes ved undersøgelse af carboniseret vand (sodavand, danskvand).

2) Lactobaciller anvendes ved undersøgelse af saft, saftdrikke, vin og lignende.

Produkteksempler

Saft og saftdrikke, mineralvand, vin og lignende (levnedsmiddelgruppe 10).

2.4.2. Naturligt mineralvand.

Der henvises til miljøministeriets bekendtgørelse nr. 463 af 5. september 1984 om naturligt mineralvand.

BILAG 2.

01.01.85 KAGER M.M.

2.5. Kage- og konsumisprodukter.

2.5.1. Konditor- og konsumisprodukter.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Termotolerante coliforme bakterier.

Kimtal 30 grader C.

Coliforme bakterier.

Kim på blodagar 37 grader C.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Termotolerante coliforme bakterier anvendes ved mistanke om frisk fækal forurening.

Produkteksempler

Napoleonskager, lagkagestykker og lignende, kager med høj vandaktivitet samt konsumis og softice (levnedsmiddelgruppe 14 og 04.1).

2.5.2. Andre kager.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) aw.

Gær- og skimmelsvampe. 2) Kimtal 30 grader C. 3) Kim på blodagar 37 grader C. 4) Termotolerante coliforme bakterier.

Anvendelse af supplerende parametre

1) aw bestemmes, hvor der er tvivl om, hvilket undersøgelsesprogram der skal anvendes for den udtagne kage, f.eks. første gang kagetypen undersøges.

2) Kimtal bestemmes ved mistanke om, at der er anvendt belastede (gamle) råvarer.

3) Kim på blodagar 37 grader C anvendes fortrinsvis ved cremeholdige produkter.

4) Termotolerante coliforme bakterier anvendes ved mistanke om frisk fækal forurening.

Produkteksempler

Kager med smørcreme, trøfler, studenterbrød og lignende (levnedsmiddelgruppe 14).

BILAG 2.

01.01.85 MAYONNAISER OG SALATER

2.6. Mayonnaiser og salater.

2.6.1. Mayonnaiser og salater med pH > 4.5 samt kalorielette produkter uanset pH.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Fækale streptokokker.

Kimtal 30 grader C. 2) Lactobaciller.

Coliforme bakterier. 3) Holdbarhedsprøve.

Kim på blodagar 37 grader C.

Gær- og skimmelsvampe.

pH.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Fækale streptokokker anvendes på kødsalater.

2) Lactobaciller anvendes ved undersøgelse af salatprodukter, som ved organoleptisk undersøgelse, eller som i øvrigt giver mistanke om »syrnet tilstand«. Kan ikke anvendes på salatprodukter, fremstillet af syrnede mælkeprodukter.

3) Holdbarhedsprøve anvendes lejlighedsvis for færdigpakkede salater.

Produkteksempler: (Levnedsmiddelgruppe 03.6, 03.7 og 15).

2.6.2. Mayonnaiser og salater med pH < 4,5.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Holdbarhedsprøve.

Lactobaciller.

Gær- og skimmelsvampe.

pH.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Holdbarhedsprøve anvendes lejlighedsvis for færdigpakkede mayonnaiser og salater.

Produkteksempler

Som under pkt. 2.6.1.

BILAG 2.

01.12.86 SAMMENSATTE LEVNEDSMIDLER

2.7. Sammensatte levnedsmidler (f.eks. færdige middagsretter og desserter).

2.7.1. Varmebehandlede middagsretter.

Basisparametre. Supplerende paramet re.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Fækale streptokokker.

Kimtal 17/7 grader C eller

30 grader C. 2) Termotolerante coliforme bakterier.

Coliforme bakterier. 3) Holdbarhedsundersøgelse.

Sulfitreducerende clostridier.

Kim på blodagar 37 grader C.

Anvendelse af basisparametre

Inkubationstemperaturen ved kimtalsbestemmelse vurderes i relation til undersøgelsens formål. Ved holdbarhedsundersøgelse foretages altid en bestemmelse af antal psykrotrofe kim, og ved udtagning af prøver i tilslutning til tilvirkning bestemmes et kimtal ved 30 grader C.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Fækale streptokokker anvendes til vurdering dels af produktionshygiejnen dels af varens afkølingsfase (korrekt tid/temperatur).

2) Termotolerante coliforme bakterier anvendes ved mistanke om frisk fækal forurening.

3) Holdbarhedsundersøgelse anvendes lejlighedsvis for færdigpakkede middagsretter.

2.7.2. Desserter.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Termotolerante coliforme bakterier.

Kimtal 30 grader C.

Coliforme bakterier.

Kim på blodagar 37 grader C.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Termotolerante coliforme bakterier anvendes ved mistanke om frisk fækal forurening.

Produkteksempler

Ris a l'amande, budding, fromage og lignende.

BILAG 2.

01.01.85 HJÆLPESTOFFER

2.8. Hjælpestoffer (krydderier m.m.).

Basisparametre. Supplerende parametre.

Kimtal 30 grader C. Ingen.

Kim på blodagar 37 grader C.

Bakteriesporetal.

Produkteksempler

Blod og blodprodukter, krydderier, tilsætningsstoffer.

01.01.85. OST OG OSTEPRODUKTER

2.9. Ost og osteprodukter.

2.9.1. Modnede oste og skimmeloste.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Staphylococcus aureus.

Fremmede kim. 2) Gær- og skimmelsvampe.

Coliforme bakterier. 3) Histaminbestemmelse.

Termotolerante coliforme 4) Salmonella.

bakterier.

Fækale streptokokker.

Anvendelse af supplerende parametre

1-3) Disse parametre anvendes ved begrundet mistanke samt i øvrigt på baggrund af erfaring med produktet.

4) Salmonella anvendes især ved importerede oste.

Produkteksempler

Havarti, Danbo, Emmentaler, Brie og Roquefort (levnedsmiddelgruppe 02.1).

2.9.2. Smelteoste.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Termotolerante coliforme bakterier.

Kimtal 30 grader C. 2) Fækale streptokokker.

Coliforme bakterier. 3) Staphylococcus aureus. 4) Gær- og skimmelsvampe.

Anvendelse af supplerende parametre

1-4) Disse parametre anvendes på baggrund af kendskab til varmebehandling og teknologi.

Produkteksempler

Flødeoste rørt/pyntet med forskellige krydderier eller krydderurter (levnedsmiddelgruppe 02.2).

BILAG 3.

01.12.86 OVERSIGT

METODIK

INDLEDNING

3.1. FORBEHANDLING AF LEVNEDSMIDDELPRØVER.

3.2. ORGANOLEPTISK BEDØMMELSE. 3.2.1. SUBJEKTIVE MÅLEMETODER. 3.2.2. OBJEKTIVE MÅLEMETODER.

3.3. UNDERSØGELSESMETODER. 3.3.1. ALTEROMONAS PUTREFACIENS. 3.3.2. BACILLUS CEREUS. 3.3.3. BAKTERIESPORETALLET. 3.3.4. BROCHOTHRIX THERMOSPHACTA. 3.3.5. CAMPYLOBACTER. 3.3.6. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS. 3.3.7. COLIFORME BAKTERIER (37grd COLI). 3.3.8. ENTEROBACTERIACEAE. 3.3.9. FÆKALE STREPTOKOKKER. 3.3.10. GÆRINGSPRØVE. 3.3.11. GÆR- OG SKIMMELSVAMPE. 3.3.12. KIM PÅ BLODAGAR 37 grader C. 3.3.13. KIMTALSBESTEMMELSER. 3.3.14. LACTOBACILLER. 3.3.15. MÆLKESYREDANNENDE BAKTERIER. 3.3.16. PROTEOLYTISKE BAKTERIER. 3.3.17. REDUKTASEPRØVE. 3.3.18. SALMONELLA. 3.3.19. STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 3.3.20. SULFITREDUCERENDE CLOSTRIDIER. 3.3.21. TERMOTOLERANTE COLIFORME BAKTERIER (44 grader COLI). 3.3.22. VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS. 3.3.23. YERSINIA ENTEROCOLITICA.

3.4. TÆLLING OG ANGIVELSE AF KIMTAL.

3.5. HOLDBARHEDSUNDERSØGELSER.

3.6. HYGIEJNEUNDERSØGELSER. 3.6.1. RENGØRINGSKONTROLUNDERSØGELSER. 3.6.2. DRIFTSKONTROLUNDERSØGELSER. 3.6.3. OVERVÅGNINGSUNDERSØGELSER.

BILAG 3.

01.01.85 INDLEDNING

Indledning

Dette bilag indeholder metoder for udførelse af laboratoriemæssige undersøgelser for de i bilag 2 angivne mikrobiologiske parametre, herunder organoleptisk bedømmelse. Ved udførelse af fysisk-kemiske analyser anvendes de af statens levnedsmiddelinstitut foreskrevne analysemetoder.

De under pkt. 3.3. angivne metodeforskrifter henviser fortrinsvis til Nordisk Metodik Komite's forskrifter, hvor sådanne er udgivet for den pågældende parameter. I enkelte tilfælde er forskrifterne suppleret med præciseringer vedrørende substratvalg, identifikation, aflæsning m.v.

I tilfælde, hvor NMKL-forskrift ikke er udarbejdet, er angivet metodebeskrivelse.

Substrater, som er angivet ved opskrift, er ofte kommercielt tilgængelige, og vil i så fald direkte kunne anvendes, men i øvrigt kan de i metodeforskriften angivne substrater efter levnedsmiddelkontrolenhedens eget skøn erstattes af ligeværdige substrater.

BILAG 3.

01.01.85 FORBEHANDLING

3.1. Forbehandling af levnedsmidler.

Metodik: Som anført i NMKL nr. 91, 1975, med følgende præciseringer.

Ved undersøgelse af saltholdige levnedsmidler øges saltkoncentrationen i saltvandspeptonopløsningen og i de anvendte substrater til et passende niveau svarende til det undersøgte levnedsmiddels forventede saltindhold.

Ved undersøgelse af sukkerholdige levnedsmidler tilsættes sakkarose eller anden relevant sukkerart til fortyndingsvæsken og de anvendte substrater i passende koncentration svarende til det undersøgte levnedsmiddels sukkerindhold.

Ved undersøgelse af hårde oste anvendes 1 % natriumcitratopløsning som fortyndingsvæske i stomacher, mens saltvandspeptonopløsning anvendes til fremstilling af den videre fortyndingsrække.

Apparatur

Stomacher.

Sterile polyethylenposer (stomacherposer).

Sterile eller steriliserbare utensilier (knive, sakse, pincetter, skeer, skabeloner, brændejern m.m.).

Sterile pipetter (1 ml, 10 ml).

Sterile reagensglas.

Steril fortyndingsvæske.

Vægt (med nøjagtighed på minimum +/- 0,1 g).

Udførelse: Den anvendte fremgangsmåde afhænger dels af levnedsmidlets tilstandsform (fast, flydende, dybfrossen), dels af undersøgelsens formål (overfladeflora, dybdeflora, gennemsnitsflora).

A. Overfladeflora på faste levnedsmidler.

Ved hjælp af steril skabelon (2 x 5 cm) og skarp steril skalpel afmærkes omridset af 10 kvadratcentimeter overfladeareal, og skabelonen fjernes. Ved hjælp af steril skalpel og steril pincet overføres en delprøve bestående af det tyndest mulige lag af overfladen (1-2 mm) til steril polyethylenpose, og der tilsættes 10 ml afkølet fortyndingsvæske ved hjælp af steril pipette. Polyethylenposen placeres i stomacher, og der mikses i 30 sekunder

. 1 ml suspension modsvarer bakterieindholdet på 1 kvadratcentimeter overflade. Den miksede delprøve kan anvendes direkte til podning på eller i relevante substrater.

Såfremt fortynding er nødvendig, overføres 1 ml af den miksede delprøve til reagensglas med 9 ml fortyndingsvæske. Pipettespidsen må ikke komme i berøring med fortyndingsmediet, men skal holdes mod reagensglassets inderside ca. 1 cm over væskeoverfladen. Man afventer efterløb, hvorefter pipetten tømmes ved udblæsning, såfremt der ikke anvendes en udløbspipette. Med en ny pipette blandes reagensglassets indhold ved enten at suge det frem og tilbage i pipetten (mindst 10 gange) eller ved hjælp af whirlmikser (til »hvirvlen« når reagensglassets bund).

Videre 10 folds fortyndinger til passende fortyndingsniveau foretages efter samme princip.

B. Dybdeflora i faste levnedsmidler.

Overfladen steriliseres ved hjælp af brændejern. Med sterile utensilier fjernes den afsvedne overflade, og fra dybden udtages en delprøve på 5-10 g. Delprøven overføres i passende små stykker til stomacherpose, og der påfyldes 9 gange så meget afkølet fortyndingsvæske og mikses i 30 sekunder i stomacher . Suspension svarer til en 10exp(-1) fortynding, og kan anvendes direkte og fortyndes videre, som under A angivet, til passende fortyndingsniveau.

C. Gennemsnitsflora i faste levnedsmidler.

Der afvejes en delprøve på 5-10 g, udtaget på repræsentativ måde, således at materiale fra såvel overflade som dybde bliver ligeligt repræsenteret. Der fortsættes, som angivet under B.

D. Flydende levnedsmidler.

Flydende levnedsmidler afpipetteres og anvendes direkte ufortyndet til podning på eller i relevante substrater. Såfremt fortynding er nødvendig, overføres 1 ml delprøve til reagensglas med 9 ml fortyndingsvæske, som angivet under A.

E. Dybfrosne levnedsmidler.

Dybfrosne levnedsmidler optøes i køleskab ved højst 50 grader C. Prøven tages i arbejde, så hurtigt en repræsentativ delprøve kan udtages. Optøningsproceduren skal være tilendebragt inden for højst 18 timer. Mindre prøver og levnedsmidler, der let optøes, kan anbringes i varmlufttermostat ved højst 37 grader C i maksimalt 15 minutter. Løsfrosne prøver, hvor optøning ikke er nødvendig, kan direkte tages i arbejde. Forbehandling foretages efter de i A-D angive metoder, afhængig af levnedsmidlets tilstandsform i optøet stand samt undersøgelsens formål.

BILAG 3.

01.01.85 ORGANOLEPTIK

3.2. Organoleptisk bedømmelse.

Generelt.

En organoleptisk undersøgelse og vurdering udgør et vigtigt led ved gennemførelse af en laboratoriemæssig undersøgelse af et levnedsmiddel. Objektive analyser omfattende mikrobiologiske, kemiske og fysiske undersøgelser er ofte ikke tilstrækkelige for en vurdering af levnedsmidlets sundhedsmæssige og hygiejniske kvalitet, men må suppleres med en organoleptisk bedømmelse.

For visse levnedsmidler er en sensorisk analyse ofte tilstrækkelig for kontrolmyndighedens vurdering af et levnedsmiddel. Dette gælder f.eks. ved undersøgelse af friske frugter og visse produkter heraf.

Såfremt der ved den indledende organoleptiske bedømmelse af et levnedsmiddel er konstateret en abnorm tilstand, f.eks. abnorm lugt, kan objektive analysemetoder medvirke til en nærmere opklaring af årsagsforholdene og som dokumentation, men er egentlig ikke påkrævet for vurderingen af levnedsmidlets hygiejnisk/sundhedsmæssige kvalitet.

3.2.1. Subjektive målemetoder.

Den organoleptiske (sensoriske) bedømmelse udføres ved indledningen til den laboratoriemæssige undersøgelse og skal indeholde en bedømmelse af levnedsmidlets udseende, farve, konsistens, lugt og eventuelt smag. Vurderingen foretages i relation til en »normaltilstand«, hvorfor det er vigtigt, at der til brug for bedømmelsen er erhvervet et grundigt kendskab til produkternes normale karakteristika.

En sensorisk bedømmelse er behæftet med usikkerhed på grund af, at den indeholder et subjektivt skøn, og forskelle i ydre vilkår kan endvidere øge denne usikkerhed.

Det kan være vanskeligt at foretage en afgrænsning mellem sådanne afvigelser i organoleptisk tilstand, som alene har en kvalitetsmæssig årsag, og sådanne forandringer i levnedsmidlet, som er begrundet i hygiejnisk/sundhedsmæssige forhold.

For at reducere en uheldig virkning af de ydre vilkårs indflydelse på bedømmelsen, bør laboratoriet gennemføre en række praktiske regelsæt omkring bedømmelsens udførelse. Af sådanne regelsæt kan nævnes

a. Bedømmelsen bør optimalt foretages af flere personer, som gennem erfaring og optræning har opnået et kendskab til levnedsmidlets normale organoleptiske karakteristika.

b. Bedømmelsen bør fra gang til gang foretages under de samme lokalemæssige forhold, herunder lys og temperaturforhold, og uden at der i lokalet er forstyrrende fremmede lugte og i øvrigt under rolige betingelser. Mindst 1 time før analysens gennemførelse bør der ikke indtages nydelsesmidler, mad eller lignende, der kan påvirke (bedøve) smagsevnen, ligesom f.eks. også håndvask med sæbe lige før undersøgelsen forstyrrer denne.

Lugtbedømmelsen bør normalt foretages ved stuetemperatur, og det er en fordel, at prøverne i forvejen er varmet op til denne temperatur. Ofte kan man dog med fordel lugtbedømme den samme vare både i kold tilstand (frossen eller kølet), og efter at denne har antaget stuetemperatur. Lugtbedømmelse foretages bedst på friske brud- eller snitflader.

Mange af de kemiske forbindelser, der er ansvarlige for dårlig lugt, er luftarter med lavt damptryk, der kan erkendes allerede på frosne eller kølede levnedsmidler.

Ved undersøgelse af vakuumpakkede kødvarer kan ofte ved pakkens åbning konstateres en karakteristisk »poselugt«, som kan forsvinde, efter at pakken har været åbnet 10-15 minutter. »Poselugt« behøver ikke at betyde, at varen er mikrobielt fordærvet.

Vedrørende undersøgelsens gennemførelse.

Prøvens udseende

Undersøgelsen omfatter en bedømmelse af prøvens farve, konsistens, forekomst af eventuelle defekter m.v. Det bemærkes, om levnedsmidlets overflade er fugtig, eventuelt slimet, indtørret, smudskontamineret, belagt med udfældninger (f.eks. saltudslag), eventuelt mugpletter eller lignende. For visse levnedsmidler bør foretages en vurdering af såvel overflade som dybde.

Bedømmelse af konsistens og tekstur kan være særlig værdifuld for vurdering af den organoleptiske kvalitet af f.eks. kød, fersk fisk, pølser samt visse frugter og grønsager.

Lugt

Afvigende lugt skyldes ofte dannelse af flygtige nedbrydningsprodukter, hvorved levnedsmidlet kan få en lugt, der, afhængig af udviklingsgraden, kan være sur, stikkende, frugtagtig, blomsteragtig, acetonelignende, kemikalieagtig, annoniakalsk eller putrid m.m.

Afvigende lugtforekomst kan imidlertid også skyldes f.eks. medikamentel behandling, restforekomst af kemikalier, kønslugt hos slagtedyr.

I tilfælde, hvor mistanke om afvigende (abnorm) lugt foreligger i kød- og fedtprøver, bør den umiddelbare undersøgelse suppleres med en koge- og stegeprøve.

Kogeprøve

Udføres bedst ved at anbringe terninger af prøven i kogekolbe (f.eks. 300 ml erlenmeyerkolbe). Der tilsættes så meget vand, at prøvematerialet netop dækkes, og kolben pålægges et urglas, hvorefter kolben opvarmes til svag kogning.

Man lugter til dampene i kolbens hals efter opvarmningens afslutning og efter delvis afsvaling.

Stegeprøve

Udføres ved stegning på omhyggeligt rengjort pande og uden anvendelse af fedtstof. Stegeprøve egner sig bedst for undersøgelse af fedt- og spækprøver.

Såvel koge- som stegeprøver bør afsluttes med en smagsbedømmelse af det opvarmede kød og spæk.

3.2.2. Objektive målemetoder.

Sensoriske målinger kan suppleres med objektive kvalitetsmålinger, hvoraf kan nævnes

Bestemmelse af peroxidtal og Kreis reaktion: Anvendes ved mistanke om harskning af fedtstoffer.

Bestemmelse af trimethylamin (TMA): Anvendes ved undersøgelse af saltvandsfisk.

Bestemmelse af total flygtig nitrogen (TVN): Kan anvendes ved undersøgelse af alle fisk, herunder fisk som ikke indeholder trimethylaminoxyd (TMAO), ligesom den er mere velegnet til bedømmelse af fiskearter, der ved fordærv udvikler flere flygtige komponenter end blot TMA (rejer, blæksprutter, bruskfisk m.v.).

Bestemmelse af »thiobarbitursyre-tallet«: Kan anvendes til verifikation af »fiskelugt« ved svinespæk.

Viskositetsmålinger: Kan anvendes ved undersøgelse af f.eks. rå æg.

Konsistensmålinger: Kan anvendes ved undersøgelse af kød, grønsager m.m.

Spektrofotometriske farvemålinger: Kan anvendes ved undersøgelse af kød og kødvarer samt frugter og grønsager.

Vedrørende anvendelse af objektive målinger af friskhed og kvalitet henvises til speciallitteratur.

BILAG 3.

01.01.85 ALTEROMONAS PUTREFACIENS

3.3. Undersøgelsesmetoder.

3.3.1. Alteromonas putrefaciens.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Der anvendes dybdeudsæd i Jern agar med tyndt dæklag også bestående af Jern agar med følgende sammensætning

Pepton 20,0 g

Kødekstrakt 3,0 g

Gærekstrakt 3,0 g

Natriumklorid 5,0 g

Ferricitrat 0,3 g

Natriumthiosulfat 0,3 g

Agar 12,0 g

pH 7,4 +/- 0,1

Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Dyrkning : 21 grader C i 3 døgn.

Aflæsning: Som udtryk for total kimtallet tælles samtlige kolonier uanset kolonifarve.

Alteromonas putrefaciens (samt visse Enterobacteriaceae bakterier) danner sorte kolonier, og antallet heraf er et udtryk for indhold af specifikke fordærvelsesbakterier.

BILAG 3.

01.01.85 BACILLUS CEREUS

3.3.2. Bacillus cereus.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: NMKL's forskrift nr. 67, 2. udgave, 1982.

Ved undersøgelse af levnedsmidler, som formodes at have højt indhold af gramnegative bakterier, kan blodagar tilsættes 25 i.e. Polymyxin B-sulfat pr. ml.

BILAG 3.

01.01.85 BAKTERIESPORETAL

3.3.3. Bakteriesporetal.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Den forbehandlede delprøve (10exp(-1) fortynding) varmebehandles i vandbad ved 80-85 grader C i 30 minutter.

Videre 10 folds fortyndinger fremstilles ud fra denne (jfr. pkt. 3.1.).

Aerobe sporedannende bakterier: Der udsås 1 ml af passende fortyndinger som dybdeudsæd i Plate Count agar (jfr. pkt. 3.3.13.).

Dyrkning: 30 garder C i indtil 8 døgn.

Anaerobe sporedannere (sulfitreducerende clostridier): Der udsås 1 ml af passende fortyndinger i Jern-sulfit højagar (se NMKL nr. 56, 2. udgave, 1980).

Dyrkning: 37 grader C i indtil 8 døgn.

BILAG 3.

01.01.85 BROCHOTHRIX THERMOSPHACTA

3.3.4. Brochothrix thermosphacta.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Der anvendes overfladeudsæd på Streptomycinsulfat- thalliumacetat-actidion agar (STAA) med følgende sammensætning

Pepton 20,0 g

Gærekstrakt 2,0 g

Glycerol 15,0 g

Dikaliumhydrogenfosfat 1,0 g

Magnesiumsulfat 1,0 g

Agar 13,0 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,0 +/- 0,1

Bestanddelene opløses under opvarmning i destilleret vand. Når alle ingredienser er opløst, fyldes substratet på mindre flasker og autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Når substratet skal anvendes, tilsættes pr. 200 ml smeltet og til 50 grader C afkølet substrat

1 ml af en 10% dihydrostreptomycinsulfatopløsning

1 ml af en 1% thalliumacetatopløsning

1 ml af en 1% actidion (= cycloheximid) opløsning.

Opløsningerne er holdbare 3 måneder i køleskab ved max. 5 grader C. Fremstillede plader kan opbevares 1-2 uger i køleskab ved max. 5 grader C.

Dyrkning: Dyrkes ved 20-25 grader C i 48-72 timer.

Aflæsning: Brochothrix thermosphacta vokser frem som distinkte, cirkelrunde, helrandede, let hvælvede, blanke, hvidlige kolonier med en diameter på 1-2 mm.

Falsk positive kolonier kan være Pseudomonas arter. Disse kan påvises ved overhældning af pladerne med friskfremstillet oxidase reagens (1% opløsning af tetramethyl-p-phenylendiamin-dihydroklorid). Inden for 15-20 sekunder vil oxidase-positive kolonier (f.eks. Pseudomonas arter) farves blå, medens oxidase-negative Brochothrix kolonier ikke vil farves.

BILAG 3.

01.01.85 CAMPYLOBACTER

3.3.5. Termofile campylobacter .

Definition

Termofile campylobacter omfatter følgende arter: Campylobacter jejuni , C. coli og C. »laridis« *. Det er gramnegative, obligat mikroaerofile, katalase- og cytochromoxidasepositive, slanke, bevægelige stave. Formen varierer fra komma-, S- og mågeformede til længere spiralsnoede stave. I den stationære fase dannes irreversibleinvolutionsformer. Termofile campylobacter kan adskilles fra andrecampylobacter ved deres evne til at vokse ved 42 grader C men ikke ved 25 grader C.

* Citationstegnene angiver, at C. laridis ikke er angivet i Approved Lists of Bacterial Names: Int. J. Syst. Bacteriol. 1980, 30 , 225-420.

Oversigt over anvendte substrater

Transportsubstrat

1. Cary-Blair substrat

Dinatriumhydrogenfosfat 1,1 g

Natriumthioglycolat 1,5 g

Natriumklorid 5,0 g

Calciumklorid 0,09 g

Agar 5,6 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 8,4 +/- 0,2

Opløs bestanddelene i det destillerede vand ved forsigtig opvarmning til kogning. Fordel substratet i skruelågsrør og steriliser substratet ved 100 grader C i 15 min. uden anvendelse af overtryk.

Substratet kan ikke genopvarmes.

Flydende selektivt opformeringssubstrat

2. Preston Campylobacter Selektivt Opformeringssubstrat .

Nutrient Broth

Lab-Lemco pulver 10,0 g

Pepton 10,0 g

Natriumklorid 5,0 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,5 +/- 0,2

Opløs bestanddelene i det destillerede vand. Opvarm herefter til kogepunktet, til samtlige ingredienser er fuldstændigt opløst. Mediet fordeles i mindre flasker og autoklaveres ved 121 grader C i 15 min.

Til de kølede substrat tilsættes aseptisk antibiotika, vækstfremmende stoffer og blod.

Antibiotika

Polymyxin B 5 IU/ml

Rifampicin 10 microg/ml

Trimethoprimlaktat 10 microg/ml

»Actidione« 100 microg/ml

Der fremstilles stamopløsninger af de fire antibiotika i destilleret vand. Polymyxin B og trimethoprimlaktat er vandopløselige. Rifampicin opløses først i methanol eller dimethylformamid. »Actidione« opløses først i acetone. Stamopløsningerne filtreres gennem 0,22 microfiltre og opbevares i mindre portioner ved -20 grader C.

Anvendes kommerciel blanding, henvises til fabrikantens forskrift.

Vækstfremmende stoffer

Natriumpyruvat 0,25 g/l

Natriummetabisulfit 0,25 g/l

Ferrosulfat (FeSO4-7H2O) 0,25 g/l

Der anvendes frisk fremstillede stamopløsninger i destilleret vand. Opløsningerne sterilfiltreres gennem 0,22 microfiltre.

Anvendes kommerciel blanding, henvises til fabrikantens forskrift.

Blod

5% sterilt lyseret defibrineret hesteblod

5% sterilt defibrineret kalveblod kan anvendes i stedet.

Opformeringssubstratet ophældes på skruelågsflasker, og kan opbevares op til 7 dage ved +4 grader C.

Fast selektivt substrat

3. Preston Campylobacter Selektiv Agar

Campylobacter Agar Basal Substrat

»Lab-Lemco«-pulver 10,0 g

Pepton 10,0 g

Natriumklorid 5,0 g

Agar* 12,0 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,5 +/- 0,2

* I originalbeskrivelsen af substratet blev anvendt New Zealand Agar, i stedet kan anvendes en anden agar af god kvalitet (f.eks. Oxoid Agar No. 1 (L 11)).

Opblød bestanddelene i det destillerede vand, opvarm herefter til kogepunktet, til samtlige ingredienser er fuldstændigt opløst. Substratet fordeles i mindre flasker, og autoklaveres ved 121 grader C i 15 min. Afkøl substratet til 50 grader C og tilsæt aseptisk antibiotika og blod.

Antibiotika

Polymyxin B 5 IU

Rifampicin 10 microg/ml

Trimethoprimlaktat 10 microg/ml

»Actidione« 100 microg/ml

Vedrørende fremstilling af antibiotika-stamopløsninger og brug af kommerciel blanding henvises til det under Preston Campylobacter Selektivt opformeringssubstrat (2) anførte.

Blod

5% sterilt lyseret defibrineret hesteblod.

5% sterilt defibrineret kalveblod kan anvendes i stedet.

Substratet ophældes i Petriskåle med en diameter på 90 mm i en mængde af 20 ml substrat pr. skål. Efter at substratet er størknet, tørres pladerne 10 min. i tørreskab.

Pladerne må ikke udsættes for yderligere tørring. Ophældte plader kan opbevares i 3-4 dage ved +4 grader C i anaerob eller mikroaerofil atmosfære. Ophældte plader og substrater må ikke udsættes for lys i mere end ca. 15 min.

Non-selektive substrater

4. Blodagar med 1,2% agar

Blodagar Basal Substrat

Proteose pepton 15,0 g

Lever hydrolysat 2,5 g

Gærekstrakt 5,0 g

Natriumklorid 5,0 g

Agar 12,0 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,4 +/- 0,2

Det er nødvendigt at anvende et næringsrigt blodagar-basalsubstrat. Opblød bestanddelene i det destillerede vand ved forsigtig opvarmning til kogepunktet, til samtlige ingredienser er opløst. Substratet fordeles i mindre flasker, og autoklaveres ved 121 grader C i 15 min. Afkøl substratet til 50 grader C og tilsæt aseptisk blod.

Blod

5% sterilt defibrineret kalveblod.

Vedrørende ophældning af substratet og opbevaring af plader henvises til det under Preston Campylobacter Selektiv Agar (3) anførte.

5. Blodagar med 2% agar

Fremstilles som Blodagar med 1,2% agar, idet agarprocenten forhøjes til 2%.

Pladerne tørres natten over ved stuetemperatur, beskyttet mod direkte lys. Tørres derefter inden anvendelsen ca. 10 min. i tørreskab eller ca. 30 min. i inkubator ved 37 grader C.

6. Hippurat hydrolyse

Hippurat opløsning

Natriumhippurat 1 g

Sterilt, destilleret vand ad 100 ml

Opløsningen fordeles i mængder a 0,4 ml i skruelågsglas eller rør med korkprop og opbevares ved -20 grader C.

Ninhydrin opløsning

Ninhydrin 3,5 g

Acetone 50 ml

Butanol 50 ml

Opløsningen, der er let antændelig, opbevares beskyttet mod lys.

Fra en 1 døgn gammel kultur på blodagar overføres en øskenfuld vækstmasse til et optøet rør med 0,4 ml hippuratopløsning. Vækstmassen emulgeres, og røret inkuberes aerobt i 2 timer ved 37 grader C på vandbad. Inkubering i termostat ved 37 grader C kan eventuelt anvendes. Der tilsættes forsigtigt 0,2 ml ninhydrin- opløsning, og prøven inkuberes uden omrystning i 10 min. ved 37 grader C.

Hippurat-positiv: Mørkeblå.

Hippurat-negativ: Ufarvet, lyseblå, mellemblå.

Positiv kontrol: Streptococcus agalactiae.

Negativ kontrol: Streptococcus dysgalactiae.

7. Nalidixin-resistens

30 microg nalidixinsyre-tabletter.

Blodagar med 2% agar.

Fra en 1 døgn gammel kultur på blodagar (4) fremstilles en opslemning i 5 ml 0,1% peptonvand (8) svarende til ca. 10exp(8) bakterier pr. ml, eller en transmission ved 450 nm på ca. 23%. Med vatpodepind stregudsås fra opslemningen på blodagar med 2% agar (5). Der kan være 2 x 4 tests pr. plade. Midt på hver udsædsstreg anbringes aseptisk en nalidixin-tablet. Inkubation 2 døgn ved 42 grader eller 43 grader C i mikroaerofil atmosfære.

Hæmning >5 mm: Nalidixin-følsom

Hæmning <=5 mm: Nalidixin-resistent.

8. Peptonvand til Nalidixin-test

Bakteriologisk pepton 1 g

Destilleret vand 1.000 ml

Opløs peptonen i det destillerede vand ved opvarmning til kogning. Substratet fordeles i mindre flasker, og autoklaveres ved 121 grader C i 15 min.

Frysesubstrat .

9. FBP-bouillon med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) eller 10% glycerol.

FBP-bouillon (Ferro-Bisulfit-Pyrovat )

Nutrient Broth

Lab-Lemco pulver 10,0 g

Pepton 10,0 g

Natriumklorid 5,0 g

Agar 1,2 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,5 +/- 0,2

Opblød bestanddelene i det destillerede vand. Opvarm herefter til kogepunktet, til samtlige ingredienser er fuldstændigt opløst. Substratet fordeles i mindre flasker, og autoklaveres ved 121 grader C i 15 min.

Til det afkølede substrat tilsættes aseptisk vækstfremmende stoffer og DMSO eller glycerol.

Vækstfremmende stoffer

Natriumpyruvat 0,5 g/l

Natriummetabisulfit 0,5 g/l

Ferrosulfat (FeSO4-7H2O) 0,5 g/l

Der anvendes frisk fremstillede stamopløsninger i destilleret vand. Opløsningerne sterilfiltreres gennem 0,22 microfiltre. 10% DMSO eller 10% glycerol tilsættes.

Metodik

Den fremgangsmåde, der skal anvendes ved påvisning af campylobacter, fremgår af flow diagrammet, skema 3.3.5., samt nedenfor angivne anvisninger.

Valget af undersøgelsesmetodik må afpasses efter det forventede antal campylobacter i prøven.

Højgradig forekomst

Ved undersøgelse af f.eks. frisk slagtet fjerkræ og fækalt forurenede miljøer kan anvendes direkte udsæd på faste selektive substrater.

Lavgradig forekomst

Ved undersøgelse af levnedsmidler med et forventet lavt indhold af campylobacter, som f.eks. varmebehandlede levnedsmidler, anvendes opformering i flydende selektivt substrat efterfulgt af udsæd på fast selektivt substrat.

Flydende levnedsmidler som mælk og vand kan opkoncentreres ved centrifugering eller membranfiltrering inden opformering i flydende selektivt substrat efterfulgt af udsæd på fast selektivt substrat. Ved anvendelse af membranfiltrering skal anvendes filtre med porestørrelse på 0,45 micro, evt. efterfulgt af endnu en filtrering gennem 0,22 microfiltre. Filtrene overføres til selektivt opformeringssubstrat.

Transport af prøver

Udtagne prøver skal holdes nedkølede, ikke frosne, under transport.

Svaberprøver transporteres i Cary-Blair Substrat (1) for at forhindre udtørring.

Flydende prøver transporteres i lufttætte beholdere, der fyldes helt op med prøven, for at undgå iltning under transporten.

Det er uhyre vigtigt

at udtagne prøver og fremstillede fortyndinger udsættes så lidt som muligt for atmosfærisk luft. Alle prøver skal derfor udsås og inkuberes hurtigst muligt.

Mikroaerofil atmosfære

Termofile campylobacter vokser optimalt i en atmosfære bestående af ca. 5% 02, 10% CO2 og 85% N2 eller H2. Dyrkning kan foregå i anaerob- beholder eller eksikator forsynet med ventil til evakuering. Dyrkningsbeholderen evakueres med en vakuumpumpe til -55 cm Hg, hvilket svarer til ca. 2/3 evakuering. Der efterfyldes derefter med en blanding af 15% CO2 og 85% N2 eller H2. Væksten af termofile campylobacter er bedre, når dyrkningsatmosfæren indeholder H2, end når den indeholder N2, men anvendelsen af H2 indebærer en vis risiko for dannelse af eksplosiv gas.

Kommercielle systemer til etablering af mikroaerofil dyrkningsatmosfære kan også anvendes. Der henvises i forbindelse med brug af disse til fabrikanternes forskrifter.

Kontrol af, at den ønskede atmosfære er opnået, kan foregå ved at medtage en udstrygning af en termofil campylobacter-stamme ved alle inkuberinger af prøver med ukendt campylobacter-indhold.

Direkte udsæd på selektivt substrat

Der foretages kraftig udsæd. Pladerne inkuberes 2 døgn ved 42 grader eller 43 grader C i mikroaerofil atmosfære. Negative plader inkuberes eventuelt yderligere 1 døgn.

Selektiv opformering

Faste levnedsmidler homogeniseres med Preston Campylobacter Selektivt Opformeringssubstrat (2) i Stomacher, og blandingen overføres til rør eller kolber.

Flydende levnedsmidler kan blandes direkte med Preston Campylobacter Selektivt Opformeringssubstrat (2), og blandingen overføres til rør eller kolber.

BILAG 3.

20.06.86 CAMPYLOBACTER/10

Flydende levnedsmidler kan opkoncentreres ved centrifugering eller filtrering. Anvendes membranfiltrering, skal anvendes 0,45 my filtre, evt. efterfulgt af endnu en filtrering gennem 0,22 my filtre. Bundfald fra centrifugering eller filtre overføres til Preston Campylobacter Selektivt Opformeringssubstrat (2) i rør eller kolber.

Opformeringssubstratet kan inkuberes aerobt i skruelågsrør. En mere optimal opformering kan foretages ved inkubering i mikroaerofil atmosfære. Her vil inkubation i kolber, der giver en stor substratoverflade, være at foretrække frem for inkubation i rør.

Opformeringssubstratet inkuberes aerobt eller mikroaerofilt ved 42 grader eller 43 grader C i 24 timer.

Subkultivering på fast selektivt substrat (3) .

Ved semikvantitative undersøgelser foretages overfladeudsæd af en stor øskenfuld fra den selektive opformering på Preston Campylobacter Selektiv Agar (3). Der foretages en tæt udsæd.

Ved kvantitative undersøgelser foretages overfladeudsæd af 0,1 ml fra den selektive opformering på Preston Campylobacter Selektiv Agar (3). Der foretages udstrygninger med Drigalskispatel. Opmærksomheden henledes på, at der ofte kun kan tælles ca. 10 kolonier pr. plade.

Faste selektive substrater inkuberes 2 døgn ved 42 grader eller 43 grader C i mikroaerofil atmosfære. Negative plader kan evt. inkuberes yderligere 1 døgn.

Aflæsning af selektivt substrat

På trods af pladernes antibiotikaindhold er selektiviteten ikke så høj, at ledsageflora normalt fuldstændig undertrykkes.

Termofile campylobacters kolonimorfologi afhænger meget af pladernes fugtighedsgrad. Den i det følgende beskrevne kolonimorfologi iagttages kun på plader, der ikke er for tørre.

BILAG 3.

20.06.86 CAMPYLOBACTER/11

Suspekte kolonier af termofile campylobater er karakteristiske ved at have en blank overflade i påfaldende lys. I ældre kulturer kan overfladen blive mat med metalskær. Kolonierne viser tendens til spredning og konfluerende vækst langs udsædsstregen, hvis der er foretages udsæd med podenål. Farven veksler fra beige, rosa, over transparente til dugdråbelignende kolonier. Størrelsen varierer meget på grund af tendensen til konfluerende vækst.

Mikroskopi af celler fra suspekte kolonier

Morfologisk undersøgelse af celler fra suspekte kolonier foretages bedst ved fasekontrastmikroskopi, idet termofile campylobacter ofte farves dårligt ved gramfarvning. Som alternativ farvemetode kan anvendes farvning i 5 minutter med 2% karbolfuksin.

Ved fasekontrastmikroskopi af pladekulturer kan ofte iagttages bevægelighed af termofile campylobacter. Bevægeligheden er karakteristisk ved pludselige retningsskift af cellerne; endvidere ved at cellerne ofte ligger stille, for derefter pludselig at bevæge sig. Det er meget vigtigt, at vækstmassen ved disse undersøgelser ikke opslemmes i vand, idet mange termofile campylobacter derved momentant mister deres evne til bevægelighed. Vækstmassen kan i stedet monteres i en næringsrig bouillon, som f.eks. Brain-Heart Infusion Broth.

Ved cellemorfologiske undersøgelser kan anvendes montering i vand.

Verifikation af termofile campylobacter

Suspekte kolonier rendyrkes på blodagar (4), der inkuberes 20-24 timer ved 42 grader eller 43 grader C i mikroaerofil atmosfære.

Cellemorfologien bestemmes ved mikroskopi.

Følgende test udføres

Katalase +

Cytochromoxidase +

Vækst på Blodagar (4) 25 grader C i 5 døgn i mikroaerofil atmosfære

Biokemisk identifikation .

Følgende test udføres, såfremt en differentiering af de fundne termofile campylobacter ønskes: C.jejuni C.coli C.'laridis'

Hippurat hydrolyse + - -

Nalidixin resistens - - +

Jfr. pkt. 6 og 7 i »Oversigt over anvendte substrater«.

Opbevaring af termofile campylobacter .

Opbevaring af campylobacterstammer kræver specielle forholdsregler, idet de ved de fleste metoder hurtigt dør.

Kulturer på blodagar (4) kan normalt opbevares op til en uge ved +4o C i mikroaerofil atmosfære, eller måske bedst anaerobt.

Svabre med friske kulturer kan normalt opbevares i Cary-Blair Substrat (1) ved +4grader C i 10-14 dage.

Frysning ved -20 grader C

En stor øskenfuld af en frisk blodagarkultur overføres til FBP- bouillon (9) med enten 10% DMSO eller 10% glycerol. Stammer opbevaret på denne måde er normalt holdbare i op til en måned.

Frysning ved -80 grader C eller i flydende kvælstof.

En stor øskenfuld af en frisk blodagarkultur overføres til FBP- bouillon (9) med enten 10% DMSO eller 10% glycerol. Stammer opbevaret på denne måde er holdbare i flere år.

Frysetørring

Termofile campylobacterstammer kan med varierende resultat opbevares efter frysetørring.

Skema 3.3.5.

Flow diagram for påvisning af termofile campylobacter .

Flydende levnedsmidler, Centrifugering eller filtrering

eks. mælk, vand gennem 0,45 micro - 0,22 micro membran filtre

Faste levnedsmidler med Preston Campylobacter Selektivt

lavt indhold af campylobacter Opformeringssubstrat, 42 grader eller 43 grader C/24 t. Aerobt/mikroaerofil atm.

Kliniske prøver o.l. med Preston Campylobacter Selektiv

højt indhold af campy- agar. Kraftig udsæd, 42 grader eller

lobacter 43 grader C/48 t. Mikroaerofil atm. Fasekontrast-mikroskopi af suspekte kolonier Rendyrkning Blodagar 42 grader eller 43 grader C/20-24 t. Mikroaerofil atm. Verifikation Katalase +, cytochromoxidase + Vækst 25 grader C/5 d. i mikroaerofil atm. Biokemisk differentiering hippurat nalidixin hydrolyse resistens C. jejuni + + C. coli - - »C. laridis« - +

28.01.86 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

3.3.6. Clostridium perfringens.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: NMKL's forskrift nr. 95, 2. udgave, 1985.

Det bemærkes, at i henhold til forskriften bør isolation og identifikation af karakteristiske kolonier foretages fra agarplader med 20-200 kolonier.

15.03.85

3.3.7. Coliforme bakterier.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Som angivet i NMKL nr. 44, 2. udgave, 1975, med nedenstående tilføjelser.

Ved undersøgelse af levnedsmidler, hvor bakteriefloraen må anses for at være »stresset« som følge af f.eks. varmebehandling, frysning, tørring, fermentering eller kemisk konservering, anvendes metode, som angivet i forslag til NMKL nr. 105, 1984.

Verifikation: Der henvises til NMKL nr. 105, 1984 (metodeforslag). I stedet for Brilliantgrønt-galde-laktose bouillon kan der anvendes MacConkey bouillon.

ENTEROBACTERIACEAE

3.3.8. Enterobacteriaceae.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Som anført i NMKL nr. 44, 2. udgave, 1975, med følgende præciseringer (jfr. skema 3.3.8.).

I den i NMKL angivne Rødviolet-galde agar erstattes laktose med glukose. Trypton-soya agar er angivet i NMKL nr. 105 (metodeforslag) (jfr. pkt. 3.3.7.).

I levnedsmidler, hvor Enterobacteriaceae må forventes at forekomme ubeskadiget og i større tal, anvendes direkte udsæd i Rødvioletgalde agar med glukose eller Trypton-soya agar med dæklag af RVG agar med glukose.

I levnedsmidler, hvor Enterobacteriaceae må forventes at forekomme i ringe mængde eller være »stresset« som følge af levnedsmidlets behandling under fremstilling og opbevaring, kan en opformering være nødvendig.

Der afvejes 1-5 g af levnedsmiddelprøven, der opformeres i en passende mængde opformeringsbouillon (forhold ca. 1:10).

Opformering kan foretages direkte enten i Brilliantgrønt-galde- glukose bouillon (jfr. NMKL nr. 1O5 (metodeforslag), som nævnt i pkt. 3.3.7., hvor laktose i den angivne Brilliantgrønt-galde-laktose bouillon erstattes med glukose), eller i Enterobacteriaceae Enrichment bouillon (E.E. bouillon), eller der kan foretages præinkubering i Trypticase-soya bouillon (TSB) med efterfølgende opformering i E.E. bouillon.

Opformeringsmedierne har følgende sammensætning

E.E. bouillon

Pepton 10,0 g

Glukose 5,0 g

Dinatriumhydrogenfosfat 8,0 g

Kaliumdihydrogenfosfat 2,0 g

Oksegalde, dehydreret 20,0 g

Brilliantgrønt 0,015 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,3 +/- 0,1

Opløs bestanddelene i destilleret vand, ophæld bouillonen i passende glasbeholdere og autoklaver ved 121 grader C i 5 minutter eller ved 100 grader C i 30 minutter.

Trypticase-soya bouillon

Trypton 17,0 g

Soya pepton 3,0 g

Natriumklorid 5,0 g

Glukose 2,5 g

Dikaliumhydrogenfosfat 2,5 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,3 +/- 0,1

Opløs bestanddelene i destilleret vand, ophæld bouillonen i passende glasbeholdere og autoklaver ved 121 grader C i 15 minutter.

Dyrkning: Samtlige substrater ved 37 grader C i 24 timer. Aflæsning

Som angivet i NMKL's forskrift.

Identifikation: Såfremt undersøgelsens formål kræver en nærmere identifikation, foregår dette ved at overføre kolonier til Kødvandsagar eller Blodagar. Herefter udføres en oxidasetest med kolonimateriale fra Kødvands- eller Blodagar. Oxidase negative bakterier undersøges for glukoseforgæring. Er denne positiv, kan endelig identifikation gennemføres. Der henvises i denne forbindelse til speciallitteratur.

01.01.85 FÆKALE STREPTOKOKKER

3.3.9. Fækale streptokokker.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: NMKL's forskrift nr. 68, 1978.

Aflæsning: Der tælles på plader af passende fortyndinger. Kun typiske kolonier tælles, dvs. lyserøde-mørkerøde kolonier, eventuelt omgivet af en smal hvid zone. Der skal tilstræbes god spredning af kolonier, eftersom reduktion af tetrazolium kan udeblive, når kolonierne er små og tætliggende. Identifikation kan foretages efter Shermann kriterierne, hvor streptokokker af fæcalis-gruppen normalt vil have følgende reaktioner

Arginin +

Vækst ved 45 grader C: +

Vækst ved 10 grader C: +

Vækst i 6,5% salt: +

01.01.85 GÆRINGSPRØVE

3.3.10. Gæringsprøve til påvisning af konserveringsstoffer i levnedsmidler.

Metodik: Som angivet i NMKL nr. 37, 1961. Der henvises i øvrigt til: Teknisk Meddelelse af 21. november 1975 fra statens levnedsmiddelinstitut, afd. for tilsætningsstoffer.

01.01.85 GÆR- OG SKIMMELSVAMPE

3.3.11. Gær- og skimmelsvampe.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Ved valget af substrat skal der tages hensyn til sammensætningen af mikrofloraen i levnedsmidlet, herunder om der kan forventes at forekomme en blandingsflora, eller om gær- og skimmelsvampe forventes at være den dominerende mikroflora. Til kimfattige produkter (f.eks. drikkevarer) bør der således anvendes et substrat, der giver mulighed for vækst af så mange kim som muligt - f.eks. Malt agar (a). Såfremt levnedsmidlet indeholder en blandingsflora, bør der anvendes et højselektivt substrat som Glukose-gærekstrakt agar (b).

Endelig bør der, i de tilfælde hvor det drejer sig om f.eks. tørrede frugter, marcipan m.m., anvendes Malt-yeast-extrakt-40%-sucrose agar, der tilgodeser mikrofloraens krav om et osmofilt miljø (c).

a) Metodik: Der anvendes overfladeudsæd på Malt agar med følgende sammensætning: Maltekstrakt 30,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH 5-6

Bestanddelene opløses i destilleret vand under opvarmning til kogepunktet. Herefter omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 10 minutter.

Dyrkning: 25 grader C i 5 døgn.

b) Der anvendes overfladeudsæd på Glukose-gærekstrakt agar med følgende sammensætning: Gærekstrakt 5,0 g Glukose 20,0 g Biotin 0,0001 g Agar 12,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH 7,0 +/- 0 1

01.01.85

GÆR- OG SKIMMELSVAMPE/2

Bestanddelene opløses under opvarmning og omhældes i mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter. Efter afkøling tilsættes 100 mg oxytetracyklin og 50 mg gentamycin pr. liter substrat.

Dyrkning: 20-25 grader C i 3-5 døgn.

c) Der anvendes overfladeudsæd på Malt-yeast-extrakt-40%-sucrose agar (MY-40 agar) med følgende sammensætning: Maltekstrakt 20,0 g Gærekstrakt 5,0 g Sakkarose 400,0 g Agar 20,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH skal ikke justeres.

Bestanddelene opløses under opvarmning og omhældes i mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 20 minutter.

Dyrkning: 30 grader C i 2-3 uger.

Aflæsning: Gærsvampe og skimmelsvampe skal tælles særskilt. Gærsvampe tælles på plader med 30-300 kolonier. Skimmelsvampe tælles på plader med 20-50 kolonier.

01.01.85 KIM PÅ BLODAGAR

3.3.12. Kim på blodagar 37 grader C.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Der anvendes dybde- eller overfladeudsæd i blodagar (BA) med følgende sammensætning: Kødekstrakt 10,0 g Pepton 10,0 g Gærekstrakt 2,0 g Natriumklorid 5,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml pH 6,8 +/- 0,1

Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, overføres substratet til mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Til det smeltede og til 45 grader C afkølede substrat tilsættes 5-8% sterilt defibrineret kalveblod samt evt. 25 i.e. Polymyxin B-sulfat pr. ml.

Såfremt blodpladerne skal anvendes specielt til at påvise grampositive hæmolytiske bakterier, kan de gram-negative stavbakterier hæmmes ved tilsætning af Polymyxin B-sulfat som ovenfor anført. Hvis blodpladerne derimod skal anvendes til en generel vurdering af mikrofloraen i et levnedsmiddel, bør der ikke tilsættes hæmmende stoffer.

Dyrkning: 37 grader C i 24-48 timer.

Aflæsning: Hovedgrupperne af den fremvoksende mikroflora vurderes og sammenholdes med øvrige kimtal. Såfremt hæmmende stoffer ikke er anvendt, kan samtlige kolonier tælles, og resultatet anvendes som et 37 grader C kimtal. Hæmolytiske bakterier kan tælles, og arten af de dominerende typer evt. angives efter fornøden identifikation.

01.01.85 KIMTALSBESTEMMELSE

3.3.13. Kimtalsbestemmelse . Kimtalsbestemmelse kan omfatte: a. Total kimtal. b. Antal psykrotrofe bakterier. c. Fremmede kim v/30 grader C. a. Total kimtal .

Ved bestemmelse af kimtallet i ferske fisk og fiskevarer anvendes Jern agar, der inkuberes ved 21 grader C i 3 døgn (jfr. pkt. 3.3.1.).

Bestemmelse af total kimtal udføres ved anvendelse af Plate Count agar, inkuberet ved 21 grader C eller 30 grader C i 3 døgn. Såfremt anden dyrkningstemperatur anvendes, skal dette angives ved meddelelse af resultatet.

Forbehandling : Jfr. pkt. 3.1.

Metodik : NMKL's forskrift nr. 86, 1972, idet der for fortyndingsvæske anvendes saltvandspeptonopløsning (jfr. NMKL's forskrift nr. 91, 1975).

Ved undersøgelse af saltede og røgede kødvarer tilsættes fortyndingsvæsken og substratet NaCl i passende koncentration, dvs. for modnede, saltede kødvarer: 4% NaCl, og stærkt saltede kødvarer: 10% NaCl.

Ved undersøgelse af sukkerholdige levnedsmidler bør substratet tilsættes sakkarose eller anden relevant sukkerforbindelse i en passende koncentration.

b. Psykrotrofe bakterier .

Forbehandling : Jfr. pkt. 3.1.

Metodik : NMKL's forskrift nr. 74, 1970, med følgende ændring

I stedet for Mælke-pepton agar efter Søncke Knudsen anvendes Plate Count agar (PCA agar) med følgende sammensætning: Pepton 5,0 g Gærekstrakt 2,5 g Glukose 1,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH 7,0 +/- 0,1

Bestanddelene opløses i det destillerede vand under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Dyrkning : 17 grader C i 17 timer efterfulgt af 7 grader C +/- 0,2grader C i 72 timer.

c. Fremmede kim .

Forbehandling : Jfr. pkt. 3.1.

Metodik : Der anvendes dybdeudsæd i Sukkerfri-pepton agar med følgende sammensætning: Pepton (kulhydratfri) 7,5 g Trypton (kulhydratfri) 7,5 g Natriumklorid 5,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH 7,6 +/- 0,1

Bestanddelene opløses evt. under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 115 grader C i 15 minutter.

Dyrkning : 30 grader C i 72 timer.

Aflæsning : Ved undersøgelse af levnedsmidler, til hvilke der er anvendt starterkultur, er kendskab til sammensætningen af denne nødvendig for at kunne udelukke disse kolonier ved tællingen.

01.12.86 LACTOBACILLER

3.3.14. Lactobaciller .

Forbehandling : Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: En af følgende metoder kan anvendes

a) Dyrkning på de Man, Rogosa og Sharpe agar (MRS agar).

b) Dyrkning på Sorbinsyreagar.

Afgørende for substratvalget er den kendsgerning, at visse kræsne lactobaciller ikke kan vokse på Sorbinsyreagar. Ligeledes synes isolation af subletalt beskadigede lactobaciller at være vanskelig på Sorbinsyreagar.

Det kan således anbefales at anvende MRS agar ved undersøgelse for lactobaciller i levnedsmidler med pH < 4,5,

a) Dyrkning på de Man, Rogosa og Sharpe agar (MRS agar) . Metodik : Der anvendes MRS agar med følgende sammensætning: Pepton 10,0 g Kødekstrakt 8,0 g Gærekstrakt 4,0 g Glukose 20,0 g Tween 80 1,0 ml Dikaliumhydrogenfosfat 2,0 g Natriumacetat 3H2O 5,0 g Triamoniumcitrat 2,0 g Magnesiumsulfat 7H2O 0,2 g Mangansulfat 4H2O 0,05 g Agar 10,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH 6,2 +/- 0,1

Såfremt agaren skal anvendes til at undersøge diverse drikkevarer, skal der yderligere tilsættes 1% fruktose.

01.12.86 LACTOBACILLER/2

Bestanddelene opløses fuldstændigt i det destillerede vand under opvarmning. Substratet overføres til mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Der anvendes enten dobbeltlags teknik, dvs. pladerne påføres dæklag, eller pladerne inkuberes i 5-10% CO2 atmosfære.

Dyrkning : 37 grader C i 72 timer eller ved 30 grader C i 5 døgn. Såfremt der er tilsat fruktose, dyrkes ved 25 grader C i 5 døgn.

Aflæsning : Der tælles på plader af passende fortyndinger. Lactobaciller vokser frem som små, hvide kolonier. Identifikation kan være nødvendig, da ledsageflora kan vokse frem.

b) Dyrkning på Sorbinsyre agar.

Bør kun anvendes ved undersøgelse af levnedsmidler med pH over 4,5.

Metodik : Der anvendes overfladeudsæd på Sorbinsyre agar med følgende sammensætning: Pepton 10,0 g Kødekstrakt 10,0 g Gærekstrakt 5,0 g Glukose 20,0 g Natriumacetat 5,0 g Natriumcitrat 3,0 g Tween 8O 1,0 ml Magnesiumsulfat 0,2 g Mangansulfat 0,05 g Agar 16,0 g Destilleret vand 1.000 ml

0,4 g sorbinsyre opløses i 10 ml destilleret vand under opvarmning på vandbad til 50 grader C. Ca. 3 ml 1N natriumhydroxydopløsning tilsættes langsomt under omrystning, til sorbinsyren er fuldstændigt opløst. pH 5,0 +/- 0,1.

01.12.86 LACTOBACILLER/3

Opbland bestanddelene med undtagelse af sorbinsyreopløsningen i det destillerede vand. Efter henstand i ca. 15 minutter opvarmes forsigtigt på vandbad til kogepunktet, indtil samtlige bestanddele er opløst. Herefter afkøles til 50 grader C, hvorefter sorbinsyreopløsningen tilsættes. pH justeres til 5,2 ved 50 grader C. Substratet hældes på mindre flasker, der varmebehandles ved 100 grader C i 30 minutter. Der må ikke anvendes overtryk på autoklaven. Slut pH ved 30 grader C skal være 5,0 +/- 1.

Dyrkning : 30 grader C i 48 timer i 5-10% CO2 atmosfære.

Aflæsning : Der tælles på plader med passende fortyndinger. Kun typiske kolonier tælles, dvs. kolonier med en diameter på 2-3 mm. Staphylokokker kan vokse frem som typiske kolonier, medens enterokokker, pediokokker og leuconostoc kan forekomme som pin-point kolonier.

01.01.85 MÆLKESYREDANNENDE BAKTERIER

3.3.15. Mælkesyredannende bakterier.

Under visse forhold kan det være en fordel at bestemme den samlede flora af mælkesyredannende gram-positive stave og kokker, der foruden lactobacillus også omfatter visse streptokokker, f.eks. Streptococcus lactis samt leukonostoc.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Der anvendes dybdeudsæd i Nitrit-actidion-polymyxin agar (NAP agar) med følgende sammensætning: Pepton 12,5 g Gærekstrakt 7,5 g Glukose 10,0 g Natriumklorid 5,0 g Trinatriumcitrat 5,0 g Dikaliumhydrogenfosfat 5,0 g Tween 80 0,2 ml Magnesiumsulfat 0,8 g Manganklorid 0,14 g Ferrosulfat 0,04 g Thiaminklorid 0,001 g Agar 13,5 g Destilleret vand 1.000 ml pH 6,7 +/- 0,1

Bestanddelene opløses i det destillerede vand under opvarmning. Når bestanddelene er fuldstændig opløst, hældes substratet på flasker og autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Inden brug tilsættes pr. 200 ml smeltet og til 50 grader C afkølet substrat

1 ml natriumnitritopløsning indeholdende 12 g natriumnitrit pr. 100 ml.

1 ml actidionopløsning indeholdende 200 mg actidion pr. 100 ml.

1 ml Polymyxin-B-opløsning indeholdende 60 mg polymyxin pr. 100 ml.

Disse opløsninger opbevares i køleskab.

Dyrkning: 30 grader C i 72 timer.

Aflæsning: Samtlige kolonier tælles dog undtaget typiske kolonier af bacillusarter, der undertiden kan vokse frem på mediet.

01.01.85 PROTEOLYTISKE BAKTERIER

3.3.16. Proteolytiske bakterier.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Der anvendes dybdeudsæd i Gelatine agar med følgende sammensætning: Neopepton 4,0 g Gærekstrakt 1,0 g Gelatine 10,0 g Agar 10,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH 7,2 +/- 0,1

Bestanddelene opløses under opvarmning, og substratet ophældes på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter. Sulfosalicylsyre reagens: Sulfosalicylsyre 20,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml

Sulfosalicylsyre reagens kan opbevares i 1 måned ved max. 5grader C.

Dyrkning: 30 grader C i 48 timer.

Aflæsning: Efter endt inkubation overhældes pladen med 3-4 ml sulfosalicylsyre reagens og henstår ca. 5 minutter. Samtlige kolonier, der er omgivet af en klar zone, tælles som proteolytiske.

01.01.85 REDUKTASEPRØVE

3.3.17. Reduktaseprøve.

Undersøgelsen anvendes på hakket fiskekød og fiskefars, men kan ikke anvendes på produkter, i hvilke indgår rå løg.

I sterilt reduktaseglas (22 x 165 mm) afpipetteres 10 ml steril fysiologisk kogsaltopløsning (0,9% NaCl opløsning). Med steril ske overføres fiskefars til reduktaseglasset indtil 20 ml-mærket. Derefter afpipetteres 2 ml methylenblåt opløsning. Glasset lukkes med steril prop og rystes til sammenblanding.

Glasset hensættes derefter i vandtermostat ved 37 grader C.

Aflæsning: Aflæses for affarvning efter inkubatiuon i 10 og 30 minutter samt derefter hver halve time indtil i alt 4 1/2 time. Affarvningstiden angives i timer og minutter.

Som referenceprøve kan anvendes prøve uden tilsætning af methylenblåt opløsning.

10.03.86 SALMONELLA

3.3.18. Salmonella.

Metodik: Som angivet i NMKL nr. 71, 2. udgave, 1975 med følgende præciseringer

Trin 1. Præinkubation i non-selektivt flydende substrat.

25-50 g prøve afvejes i stomacherpose. Der påhældes steril ca. 37 grader C varm fosfatbuffer (pH 7,0) (jfr. NMKL nr. 71) tilsat 1% teepol 610 eller ligeværdigt overfladeaktivt stof i tilsvarende koncentration. (I alle tilfælde. hvor der anvendes teepol. skal dette forud være »steriliseret« ved 100 grader C i 10 minutter ). Prøven forbehandles i stomacheren i mindst 30 sekunder, idet der påhældes ca. 100 ml bufferopløsning. Efter forbehandlingen tilsættes bufferopløsning, således at forholdet prøve/bufferopløsning svarer til ca. 1:10.

I stedet for fosfatbuffer kan anvendes peptonbuffer med følgende sammensætning: Pepton 10,0 g Natriumklorid 5,0 g Dinatriumhydrogenfosfat (Na2HP04,12 H20) 9,0 g Kaliumdihydrogenfosfat (KH2P04) 1,5 g Vand 1.000 ml pH 7,0 +/- 0,1

Bestanddelene opløses under opvarmning til kogepunktet. Herefter omhældes bufferen i mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 20 minutter.

Dyrkning: 37 grader C (+/- 1 grader C) i 18-24 timer.

Trin 2. Selektiv opformering.

Efter endt præinkubation overføres 10 ml af den præinkuberede prøve til en steril kolbe og påhældes ca. 100 ml Tetrathionat bouillon (jfr. NMKL nr. 71) tilsat 1% teepol 610. Eventuelt kan anvendes 25 ml af den præinkuberede prøve, og der påhældes da ca. 200 ml Tetrathionat bouillon tilsat 1% teepol 610.

Dyrkning : 42 grader C (+/- 0,5 grader C) i 24 timer.

10.03.86 SALMONELLA/2

I stedet for Tetrathionat bouillon kan anvendes Rappaport bouillon med følgende sammensætning: Pepton 5,0 g Natriumklorid 8,0 g Dikaliumhydrogenfosfat 0,8 g Magnesiumklorid 40,0 g Malakitgrønt 0,12 g Vand 1.000 ml pH 6,0 (+/- 0,1)

Bestanddelene opløses under forsigtig opvarmning. Herefter omhældes substratet i mindre flasker, der autoklaveres ved 115 grader C i 20 minutter.

Dyrkning: 37 grader C i 48 timer.

Trin 3. Udstrygning på overfladen af fast selektivt og indikativt substrat.

Efter 24 timers inkubation foretages udsæd fra Tetrathionat bouillonen på Brilliantgrønt-laktose-sakkarose-fenolrødt agar (BLSF agar, jfr. NMKL nr. 71) tilsat 0,3% teepol efter afkøling og umiddelbart før påhældning. Udsæd foretages ved hjælp af en podenål med øsken, og således at der opnås enkeltliggende kolonier på BLSF- pladen.

Dyrkning: 37 grader C i 24 timer.

Aflæsning: Salmonellakolonier er rødlige eller lyserøde og transparente på dette substrat. Alle rødlige eller lyserøde kolonier anses som Salmonella-suspekte og undersøges videre som anført i trin 4.

Trin 4. Biokemiske undersøgelser og orienterende agglutinationsprøve.

Fra samtlige suspekte eller et rigeligt antal kolonier på BLSF agar foretages udstrygning på Mannitol-fenolrødt agar med følgende sammensætning: Pepton 10,0 g Kødekstrakt 5,0 g Mannitol 10,0 g Dinatriumhydrogenfosfat 2,0 g Natriumklorid 3,0 g Fenolrødt 0,08 g Agar 12,0 g Vand 1.000 ml pH 6,9 +/- 0,1

Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Efter afkøling og umiddelbart før ophældning tilsættes 0,3% teepol 610, som forud er varmebehandlet ved 100 grader C i 10 minutter.

Dyrkning: 37 grader C i 24 timer.

Aflæsning: Gule kolonier skal anses som salmonella-suspekte.

Endvidere udsås i Tresukker-jern agar (jfr. NMKL nr. 71). Til sidstnævnte substrat anvendes ophældning i små reagensglas ca. 10 x 130 mm, således at der dannes en agarsøjle i bunden og en skråflade foroven. Podningen foretages således, at der først anlægges en stikkultur og dernæst foretages udstrygning på skråfladen.

Dyrkning: 37 grader C i 24 timer.

Aflæsning: Kolonier, som i Tresukker-jern agar giver reaktionerne rød/gul/luft/sværtning eller rød/gul/luft, skal anses som salmonella- suspekte. (enkelte Salmonella, f.eks. S. Senftenberg, producerer ikke svovlbrinte og sværter derfor ikke substratet).

Fra Mannitol-fenolrødt agar og/eller Tresukker-jern agar udstryges suspekte kolonier på tykt ophældte Kødvandsagarplader. Efter 24 timers inkubation foretages orienterende agglutinationsprøve med polyvalent-0 salmonellaserum. Såfremt agglutinationsprøven giver positiv reaktion, skal det sikres, at den pågældende stamme ikke er spontan agglutinabel ved afprøvning af reaktionen i fysiologisk kogsaltopløsning. En negativ agglutinationsprøve med polyvalent-0 salmonellaserum er ikke ensbetydende med, at det ikke er en salmonellabakterie, og såfremt andre undersøgelser tyder herpå, bør bakterien indgå i eventuelle fortsatte undersøgelser. Man skal være opmærksom på, at suspekte kolonier, der podes videre, ikke nødvendigvis repræsenterer renkulturer, hvorfor subkulturer på Kødvandsagar kan bestå af en blandingsflora. Om nødvendigt må suspekte kolonier rendyrkes efter almindelige principper.

Trin 5. Videregående biokemiske og serologiske undersøgelser.

Som videregående biokemiske tests kan peges på de i nedenstående skema anførte reaktioner

Typiske salmonella-reaktioner. Mannitol + Sulfit-stik + Lysin-dekarboxylase + Urinstof 0

Endvidere henvises til, at en endelig serotypning bør udføres ved indsendelse af renkultur på Kødvandspepton agar til Statens Veterinære Serumlaboratorium eller Institut for Veterinær Mikrobiologi og Hygiejne, Den kgl. Veterinær- og Landbohøjskole.

01.01.85 STAPHYLOCOCCUS AUREUS

3.3.19. Staphylococcus aureus.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: NMKL nr. 66, 1980, med følgende præciseringer

Såfremt Baird-Parker's medium anvendes, bør der tilsættes 50 micro g sulfamethazin pr. ml substrat for at hæmme den gram-negative flora, der ellers kan vokse frem med typiske kolonier (f.eks. Proteus og Aeromonas).

Dyrkning: Blodagar: 37 grader C i 24 timer. Baird-Parker's medium: 37 grader C i 24-48 timer.

Aflæsning: Kun typiske kolonier tælles. Atypiske kolonier kan medregnes efter fornøden identifikation. På Baird-Parker's medium foretages en primær aflæsning efter 24 timer, og suspekte kolonier afmærkes. Endelig aflæsning foretages efter 48 timer.

01.01.85 SULFITREDUCERENDE CLOSTRIDIER

3.3.20. Sulfitreducerende clostridier.

Forbehandling : Jfr. pkt. 3.1.

Metodik : Som angivet i NMKL, nr. 56, 2. udgave, 1980 med følgende præciseringer

Aflæsning : Prøven aflæses efter 24 timers inkubation og derefter hver dag i indtil 4 døgn.

01.01.85 TERMOTOLERANTE COLIFORME BAKTERIER

3.3.21. Termotolerante coliforme bakterier (44 grader coli).

Forbehandling : Jfr. pkt. 3.1.

Metodik : Ved undersøgelse af fisk og fiskevarer for forekomst af termotolerante coliforme bakterier skal anvendes den i NMKL nr. 96, 1986 angivne metode. For andre levnedsmidler anvendes undersøgelsesmetoden som angivet i NMKL nr. 62, 1966 med nedenstående præciseringer.

Dyrkning: Dyrkes ved 37 grader C i 2 timer og herefter i vandbadstermostat ved 44 grader C +/- 0,5 grader C i 24 timer.

Aflæsning: Der tælles i glas med 5-50 kolonier. Kun typiske kolonier tælles, dvs. mørkerøde kolonier med diameter på mindst 0,5 mm omgivet af en rødfarvet præcipitationszone. Mindre kolonier uden præcipitationszone kan være termotolerante coliforme bakterier. Disse kan medregnes på erfaringsmæssigt grundlag, idet prøvematerialets art samt antallet af kolonier i glasset lægges til grund for denne vurdering. Identifikation af E. coli I kan ske ved IMVC-test eller ved udsæd i MacConkey bouillon (forvarmet i vandbad til 44grader C forinden podning) samt indolprøve.

01.01.85 VIBRIO PARAHAEMOLYTIGUS

3.3.22. Vibrio parahaemolyticus.

Forbehandling: Jfr. pkt. 3.1.

Metodik: Udføres efter NMKL, nr. 97, 1982 (preliminær metode) med følgende præciseringer

Aflæsning: Ved kvantitative undersøgelser opgives resultatet efter reglerne i pkt. 3.4. efter fornøden identifikation. Ved kvalitative undersøgelser angives resultatet som påvist/ikke påvist i den undersøgte prøvemængde efter fornøden identifikation.

O0.01.85 YERSINIA ENTEROGOLITIGA

3.3.23. Yersinia enterocolitica.

Metodik: Der anvendes en kvalitativ metode baseret på en kombination af kuldeopformering, selektiv opformering, subkultivering og screening på faste selektive medier samt afslutningsvis en biokemisk og serologisk identifikation.

Følgende medier anvendes

Opformeringsmedier.

1) Phosphat-sorbitol buffer (PSB) med følgende sammensætning

Dinatriumhydrogenfosfat (0,0607 M) 880,0 ml Kaliumdihydrogenfosfat (0,0607 M) 120,0 ml

Til 1.000 ml fosfatbuffer tilsættes

Natriumklorid 8,5 g

Sorbitol 20,0 g

Galdesalte 1,5 g

pH 7,6 +/- 0,1

Fordel mediet i passende beholdere (250-500 ml) og autoklaver ved 100 grader C i 15 minutter uden anvendelse af overtryk.

2) Modificeret Rappaport bouillon (MRB) med følgende sammensætning

Pepton 5,0 g

Natriumklorid 8,0 g

Dinatriumhydrogenfosfat 0,8 g

Magnesiumklorid 80,0 g

Malakitgrønt 0,12 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 6,0 +/- 0,1

Bestanddelene opløses i det destillerede vand under opvarmning.

Når alle ingredienser er opløst, omhældes bouillonen til passende beholdere og autoklaveres ved 115 grader C i 20 minutter.

Faste selektive medier.

1) Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin agar (CIN agar) med følgende sammensætning

Pepton 20,0 g

Gærekstrakt 2,0 g

Mannitol 20,0 g

Natriumpyrovat 2,0 g

Natriumklorid 1,0 g

Magnesiumsulfat 0,01 g

Natriumdeoxycholat 0,5 g

Agar 12,0 g

Destilleret vand 949,0 ml

Opløs ingredienserne fuldstændigt ved opvarmning til kogepunktet og under omrøring. Afkøl herefter til 80 grader C og tilsæt 1,0 ml af en 0,4% Irgasanopløsning i 96% etanol. Afkøl herefter til 50-55 grader C og tilsæt føldende ingredienser:.

Natriumhydroxydopløsning (5N) 1,0 ml

Neutralrødtopløsning (3 mg/ml) 10,0 ml

Krystalvioletopløsning (0,1 mg/ml) 10,0 ml

Cefsulodinopløsning (1,5 mg/ml) 10,0 ml

Novobiocinopløsning (0,25 mg/ml) 10,0 ml

Tilsæt herefter langsomt og under omrøring 10,0 ml sterilfiltreret 10% strontiumkloridopløsning. Juster pH til 7,4 +/- 0,1. Fordel mediet på petriskåle med ca. 25 ml i hver.

2) Salmonella-Shigella-deoxycholat agar (SS-D agar) med følgende sammensætning.

Kødekstrakt 5,0 g

Pepton 5,0 g

Gærekstrakt 5,0 g

Laktose 10,0 g

Natriumcitrat 10,0 g

Natriumthiosulfat 8,5 g

Ferricitrat 1,0 g

Galdesalte 8,5 g

Natriumdeoxycholat 20,0 g

Neutralrødt 0,025 g

Brilliantgrønt 0,0003 g

Agar 12,0 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,6 +/- 0,1

Screeningsmedium.

Bromthymolblåt-sakkarose agar (BS agar) med følgende sammensætning

Kødekstrakt 10,0 g

Pepton 10,0 g

Agar 15,0 g

Destilleret vand 1.000 ml

pH 7,5 +/- 0,1

Bestanddelene opløses under opvarmning. Mediet filtreres og afkøles til ca. 50 grader C. Der tilsættes herefter

Bromthymolblåtopløsning (0,2%) 12,0 ml

Sakkarose 20,0 g

Substratet fordeles i mindre beholdere og autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Bromthymolblåtopløsningen fremstilles af

Bromthymolblåt 1,0 g

Natriumhydroxyd (0,1 N) 25,0 ml

Destilleret vand 475,0 ml

Identifikationsmedier .

1) Urinstof-indol bouillion med følgende sammensætning

L-tryptofan 0,3 g

Kaliumdihydrogenfosfat 0,1 g

Natriumklorid 0,5 g

Urinstof 2,0 g

Etanol (96%) 1,0 ml

Fenolrødtopløsning (0,2%) 1,25 ml

Destilleret vand ad 1.000 ml

Saltsyre (1N) 0,1 ml

pH 6,5 +/- 0,1

Bestanddelene blandes og opløses i kolbe ved rystning. Mediet sterilfiltreres gennem membranfilter med porestørrelse på 0,22 micro. Mediet fordeles på små sterile kulturrør med 0,5 ml i hvert rør.

Fenolrødtopløsningen har følgende sammensætning

Fenolrødt 2,0 g

Natriumhydroxyd (0,1 N) 80,0 ml

Destilleret vand ad 1.000 ml

Opløs fenolrødt i natriumhydroxydopløsningen under opvarmning til kogepunktet i ca. 20 minutter. Tilsæt det destillerede vand efter fuldstændig opløsning af fenolrødt.

2) Tre-sukker-jern agar (TSJ) med følgende sammensætning

Proteosepepton 20,0 g

Natriumklorid 5,0 g

Agar 20,0 g

Destilleret vand ad 1.000 ml

Bestanddelene opløses ved opvarmning til kogepunktet, hvorefter der tilsættes: Laktose 10,0 g Sakkarose 10,0 g Glukose 1,0 g Natriumthiosulfat 0,2 g Ferroammoniumsulfat 0,2 g Penolrødt 0,025 g pH 7,0 +/- 0,1

Mediet fordeles i mindre flasker og autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Når mediet skal anvendes, skal det ophældes i reagensglas på en sådan måde, at der dannes en halv skråagar.

3) Mannitol-bevægeligheds agar . Kaseinpepton 5,0 g Neopepton 5,0 g Mannitol 2,0 g Kaliumnitrat (NK03) 1,7 g Fenolrødtopløsning (0,2%)* 20,0 ml Agar 2,5 g Destilleret vand ad 1.000 ml Natriumhydroxyd (5N) 0,9 ml pH 7,4 +/- 0,1 * Jfr. Urinstof-indol bouillon.

Bestanddelene opløses under opvamning og fordeles i reagensglas med 5 ml i hver. Autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.

Der anvendes følgende fremgangsmåde ved påvisning af Yersinia enterocolitica

Trin 1. Forbehandling og præinkubation.

Faste levnedsmidler (25-50 g) homogeniseres med PSB i stomacher. Flydende levnedsmidler (25-50 ml) kan blandes direkte med PSB uden yderligere forbehandling.

Den homogeniserede prøve af det faste levnedsmiddel eller prøven af det flydende levnedsmiddel præinkuberes i PSB i forholdet 1 del prøve til 9 dele PSB, hvorved bouillonens blandingsforhold bliver 1:10. Det inokulerede PSB medie inkuberes ved 22-25 grader C i 3 timer.

Trin 2. 1. subkultur og kuldeopformering.

Efter de 3 timers præinkubation blandes det inokulerede PSB medie grundigt, evt. ved hjælp af stomacher eller anden mekanisk blanding. 1. subkultur anlægges ved med platinøse at udstryge en dråbe på enten CIN agar eller SS-D agar. CIN agar inkuberes ved 30 grader C i 20 timer, medens SS-D agar inkuberes ved 30 grader C i 48 timer (se endvidere trin 6). Det resterende inokulerede PSB medie opformeres ved 4 grader C først i en uge (se trin 3) og derefter i yderligere 2 uger (se trin 5).

Trin 3. Selektiv opformering.

Efter en uges opformering ved 4 grader C blandes det inokulerede PSB medie grundigt, evt. ved hjælp af stomacher eller anden mekanisk blanding. Efter blanding overføres med steril pipette 0,1 ml fra PSB til 10 ml MRB, der inkuberes ved 22-25 grader C i 4 døgn.

PSB mediet hensættes igen ved 4 grader C til yderligere 2 ugers kuldeopformering.

Trin 4. 2. subkultur .

Efter 4 døgns inkubation blandes MRB mediet grundigt, evt. ved brug af whirl-mikser. Med platinøse udstryges en dråbe på enten CIN agar eller SS-D agar, der inkuberes som ovenfor under trin 2 angivet (se endvidere trin 6).

Trin 5. 3. subkultur .

Efter 3 ugers inkubation ved 4 grader C udstryges med platinøse fra PSB mediet en dråbe på CIN agar eller SS-D agar, der inkuberes som angivet ovenfor under trin 2 (se endvidere trin 6).

Trin 6. Screening .

Fra henholdsvis 1., 2. og 3. subkultur på CIN agar eller SS-D agar udvælges mindst 4 suspekte kolonier, der overføres til BS agar. (BS agaren kan med fordel inddeles i felter, således at flere kolonier

Yersiniasuspekte kolonier har følgende karakteristika

CIN agar: 2-4 mm store med skarprandet, rødfarvet centrum omgivet af en transparent zone.

SS-D agar: 1-3 mm store laktosenegative kolonier med en voksagtigkonsistens.

BS agar inkuberes ved 30 grader C i 12-24 timer. Yersiniasuspekte kolonier er på BS agar gule, dvs. sakkarose-positive.

Trin 7. Indledende biokemisk identifikation .

Gule kolonier på BS agar udsås i Urinstof-indol bouillon, TSJ agar samt 2 reagensglas med Mannitol-bevægeligheds agar. Medierne inkuberes ved 37 grader C i 18-24 timer, dog undtaget et reagensglas med Mannitol-bevægeligheds agar, der inkuberes ved 22-25 grader C.

Følgende reaktioner er typiske for Yersinia enterocolitica

Urinstof +

Indol -

TSJ gul/gul, -luft, -sværtning

Bevægelighed 37 grader C

Bevægelighed 22-25 grader C +

Mannitol +

Trin 8. Endelig biokemisk og serologisk identifikation.

Der anlægges renkultur på blodagar af de suspekte kolonier med ovennævnte (trin 7) reaktioner.

Der udføres eventuelt objektglasagglutination med specifikke sera samt

Cytochromoxydasetest -

Gram-farvning gramnegativ stav. Serogruppe 0:3 0:9

Sakkarose + +

Rhamnose - -

Melibiose - -

Raffinose - -

Simmons citrat - -

VP ved 22 grader C + +

VP ved 37 grader C - -

Ornithin decarboxylase + +

Lecithinase - -

Indol - (+)

Xylose - +

Suspekte stammer af Yersinia enterocolitica type 0:3 og 0:9 bør indsendes til verifikation på Statens Veterinære Serumlaboratorium eller Institut for Veterinær Mikrobiologi og Hygiejne, Den kgl. Veterinær- og Landbohøjskole.

Dyrkning: Som ovenfor anført.

Aflæsning: Som ovenfor anført.

Resultatet opgives som påvist/ikke påvist i det undersøgte antal gram prøve.

FLOW-DIAGRAM OVER ISOLATION AF YERSINIA ENTEROCOLITICA

(FRA KLINISKE PRØVER, LEVNEDSMIDLER, VAND OG SPILDEVAND)

Trin 1. Forbehandling og præinkubation

a) Kliniske prøver direkte på CIN agar, 30 grader C/20 timer opformering i PSB

b) Levnedsmidler 25-50 g levnedsmiddel homogeniseres i Stomacher, opformering i PSB (1:10)

c) Vand 100-1000 ml vand filtreres gennem 0,45 micro m filter, der opformeres i 100 ml PSB

d) Spildevand opformering af tampon (f.eks. OB-mini) i 250 ml PSB Præopformering af PSB ved stuetemp. (22 grader - 25 grader C) i 3 timer.

Trin 2. 1. subkultur: CIN agar eller SS-D agar (30 grader C/ 48 timer) Kuldeopformering af PSB ved 4 grader C/ 3 uger.

Trin 3. Selektiv opformering: Efter 8 dages kuldeopformering af PSB overføres efter grundig blanding 0,1 ml til 10 ml MRB, der inkuberes ved stuetemp. (22 grader - 25 grader C) i 4 døgn, hvorefter

Trin 4. 2. subkultur: 2. subkultur anlægges på CIN agar eller SS-D agar.

Trin 5. 3. subkultur: Efter 3 ugers kuldeopformering anlægges 3. subkultur på CIN agar eller SS-D agar.

Trin 6. Screening: Fra 1., 2. og 3. subkultur overføres mindst 4-5 typiske kolonier til BS-agar (30 grader C/12-24 timer).

Trin 7. Indledende biokemisk verifikation: gule, sakkarose + kolonier urinstofbouillon og TSJ (37 grader C/18-24 timer) og mannitolbevægelighedsagar, 2 rør, der inkuberes ved henholdsvis 37 grader C og 22 grader C i 18-24 timer.

Trin 8. Endelig biokemisk og serologisk identifikation: Renkulturer undersøges ved: cytochromoxidasetest: - gramfarvning: gramnegative stave objektglasagglutination med specifikt 0:3 og 0:9 sera yderligere biokemisk verifikation i henhold til forgæringsskema side 8.

01.01.85 TÆLLING M.M. AF KIMTAL

3.4 Tælling og angivelse af kimtal.

Tælling af mikroorganismer.

De kvantitative mikrobiologiske analysemetoder foreskriver normalt det mindste og det største antal kolonier, som skal være vokset frem på petriskåle eller i glas, for at disse kan anvendes ved tælling og beregning af kimtal. Dette antal vil normalt være mellem 30 og 300 kolonier pr. plade eller glas, for visse indikative substrater dog ofte væsentligt færre.

Beregning af kimtal.

A. Ved enkeltundersøgelser tælles kolonier på den plade, som er egnet til tælling, og antal af kolonier multipliceres med fortyndingsfaktoren.

B. Såfremt 2 plader efter hinanden i 10 folds fortyndingsrække begge indeholder kolonier i et antal, som er egnet til tælling, tælles begge plader. Kimtallet beregnes på begge fortyndinger og opgives som gennemsnit af de 2 værdier. Ved beregning af gennemsnit anvendes formlen

C1 + C2 gennemsnit = ------ W1 + W2

hvor C betegner antallet af kolonier, og W betegner prøvemængden.

Eksempel: Der tælles 128 (C1) kolonier i fortyndingen 10exp(-3) og 20 (C2) kolonier i fortyndingen 10exp(-4). Prøvemængden beregnes.

W1 = 1 x 10exp(-3) g/eller ml

W2 = 0,1 x 10exp(-3) g/eller ml

total 1,1 x 10exp(-3) g/eller ml

128 + 20 gennemsnit = ---------- = 135 x 103 kim/g eller ml 1,1 x 10exp(-3)

Der henvises i øvrigt til NMKL, Report no. 1, 2nd edition »Statistical Evaluation of Results from Quantitative Microbiological Examinations«.

C. Såfremt der er foretaget dobbelt udsæd, tælles på plade fra hver udsæd med samme fortynding. Det aritmetiske gennemsnit af de 2 tællinger multipliceres med fortyndingsfaktoren.

Angivelse af kimtal.

Indholdet af mikroorganismer i en prøve angives som antal pr. ml eller gram, idet antallet angives med 2 betydende cifre.

Hvis antallet af kolonier på en plade eller i et glas ikke har været inden for det foreskrevne minimum eller maksimum, skal det fundne antal mikroorganismer i en prøve angives som en cirkaværdi.

01.01.85 H0LDBARHEDSUNDERSØGELSE

3.5. Holdbarhedsundersøgelse.

Holdbarhedsundersøgelse foretages på færdigpakkede levnedsmidler forsynet med »mindst holdbar til« dato med det formål at vurdere den hygiejniske og sundhedsmæssige kvalitet af levnedsmidlet ved holdbarhedstidens udløb.

»Mindst holdbar til« dato er den dato, til og med hvilken produktet efter korrekt opbevaring har bevaret sine specifikke egenskaber.

Prøver til holdbarhedsundersøgelse udtages på den virksomhed, i hvilken levnedsmidlet er færdigpakket, og transporten til laboratoriet skal ske under iagttagelse af den foreskrevne opbevaringstemperatur.

Holdbarhedsundersøgelse udføres på prøver opbevaret på laboratoriet i ubrudt forbrugerpakning ved den på pakningen anførte opbevaringstemperatur og indtil holdbarhedstidens udløb. Undersøgelsen består primært i en bedømmelse af den organoleptiske tilstand, og ved vurderingen heraf er det vigtigt at skelne mellem kvalitetsfaktorer og sådanne forhold, som kan tilskrives holdbarhedsmæssige forandringer. En vare kan eksempelvis tilsigtet have en syrlig smag, hvilket ikke må bedømmes som en fejl med holdbarhedsmæssig årsag. Holdbarhedsundersøgelsens resultat må derfor altid sammenlignes med bedømmelse af en initialprøve samt videre, når dette skønnes nødvendigt, suppleres med en bedømmelse af prøve(r) opbevaret i del af holdbarhedsperioden.

Organoleptiske forandringer er begrundet i enzymatisk aktivitet af oftest mikrobiel oprindelse, og i tilfælde af væsentlige afvigelser i forhold til initialprøven bør supplerende mikrobiologiske parametre indgå i undersøgelsen af holdbarhedsprøverne og bør omfatte mikroorganismer med høj biologisk aktivitet, f.eks. Brochothrix thermosphacta, gær, proteolytiske bakterier, Alteromonas putrefaciens o.a., afhængig af den organoleptiske tilstand og levnedsmidlets art.

Den organoleptiske vurdering af holdbarhedsundersøgelsen bør mindst omfatte bedømmelse af udseende, lugt og smag.

Til brug for en vurdering af et levnedsmiddels holdbarhed kan det lejlighedsvis være hensigtsmæssigt at bedømme en prøve opbevaret ud over salgsdato eller »mindst holdbar til« dato.

01.01.85 HYGIEJNEUNDERSØGELSER

3.6. Hygiejneundersøglser.

3.6.1. Rengøringskontrolundersøgelser.

Som angivet i NMKL nr. 5, 3. udg., 1975, med følgende tilføjelser. Der kan evt. anvendes peptonvand og Plate-count agar i stedet for fysiologisk saltvand og Trypton-glukose-gærekstrakt agar, ligesom det i visse tilfælde kan være en fordel at anvende kommercielt fremstillede rengøringskontrolsystemer.

3.6.2. Driftskontrolundersøgelser.

Den pågældende produktionslinie analyseres for at fastslå, hvor de kritiske kontrolpunkter (HACCP, f.eks. en lokalitet, en overflade, en råvare, en ingrediens, en proces, en manuel operation, en tid/temperatur kombination) findes, både hvad angår mulighed for tilførsel og vækst af såvel humanpatogene som holdbarhedskompromitterende mikroorganismer.

Ved varmebehandlede levnedsmidler (kødvarer) kunne sådanne kritiske kontrolpunkter evt. være: Råvarerne som sådan (f.eks. højt indhold af fækale streptokokker i kødet) -behandling i hurtighakker og/eller Wolf - henstand af færdigblandet rå vare afventende varmebehandling - check på kogetider og cemtrumstemperaturer - check på afkølingsforløb (tid/temperatur) - undersøgelse af afkølede færdigvarer - vurdering af mulighed for efterkontamination (f.eks. varm portionering i alubakker af sylte, leverpostej og lignende).

Undersøgelserne på de enkelte kontrolpunkter indrettes efter forventet fund og simplificeres så meget som muligt, f.eks. ved at undlade at fremstille en suspension men benytte sig af podning af ca. 1 g prøve direkte i agar.

På en remouladeproduktionslinie kunne eksempelvis focuseres direkte på den eller de kompromitterende organismer, f.eks. Lactobacillus fructivorans dyrket i bouillon eller agar ved lavere pH, substraterne tilsat de til remouladen benyttede konserveringsstoffer.

Selv moderat eller ringe forhøjede kimtal i varmebehandlede levnedsmidler vil i mange tilfælde antyde, at produktionen er ude af hygiejnisk kontrol, og at det blot er et spørgsmål om tid, før også højere kimtal optræder.

Ved tilbageanalysering på produktionslinien focuseres på de i færigvaren påviste mikroorganismer.

3.6.3. Overvågningsundersøgelser.

Disse anvendes til at screene et produktionsmiljø for forekomst af patogener, Salmonella, Campylobacter o.a. I den enkelte virksomhed undersøges poolede prøver bestående af f.eks. skrab-og svaberprøver af inventar, redskaber og maskiner, tamponprøver fra afløb samt suspekte levnedsmidler. Undersøgelserne udføres f.eks. 1 gang årligt i virksomheder, hvor der produceres let fordærvelige levnedsmidler af animalsk oprindelse samt salater og levnedsmidler indeholdende creme, fromage og fløde.

01.01.85 SCREENINGSUNDERSØGELSER

4. Screeningsundersøgelser.

4.1. Veterinærdirektoratet til gennemføre landsdækkende undersøgelser (screeningsundersøgelser) med deltagelse af de lokale levnedsmiddelkontrolenheder.

4.2. Formålet med undersøgelserne vil primært være at vurdere niveauet for forekomst af specifikke mikroorganismer i produktionsmiljøet samt i såvel dansk producerede som importerede levnedsmidler.

4.3. Veterinærdirektoratet udarbejder een gang årligt en projektbeskrivelse for det kommende år. For hvert enkelt projekt angives

a) Hvilke(n) mikroorganisme(r).

b) Levnedsmiddeltype(r)/virksomhedstype(r), der skal indgå i undersøgelsen.

c) Deltagende laboratorier.

d) Tidsangivelse for gennemførelse.

4.4. Veterinærdirektoratet udarbejder een gang årligt en rapport, der beskriver resultaterne af de gennemførte screeningsundersøgelser.

01.12.86 OVERSIGT

SKADEDYR I LEVNEDSMIDLER

INDLEDNING

5.1. PRØVEUDTAGNING OG -OPBEVARING

5.2. LABORATORIEMÆSSIG UNDERSØGELSE

5.2.1. VISUEL UNDERSØGELSE

5.2.2. ARTSBESTEMMELSE OG MIKROSKOPI

5.2.3. FREMSTILLING AF PRÆPARAT

5.2.4. KONSERVERING

20.06.86 INDLEDNING

Indledning

Ved virksomhedstilsyn skal indgå en vurdering af lagerområdet og de opbevarede levnedsmidler for forekomst af skadedyr. Man må her også have opmærksomheden henledt på huller og bidmærker i emballagen samt efterladenskaber (ekskrementer o.l.), aftryk m.m. hidrørende fra skadedyr.

Såfremt der i lokalet forekommer afvigende lugt, f.eks. sødlig, honningagtig, muglugt, samt at der i lokalet generelt skønnes at være høj luftfugtighed, er dette forhold, som bør medføre skærpet opmærksomhed omkring forekomst af skadedyr.

Når partier af levnedsmidlet har stort støvindhold eller er klumpet sammen, kan dette videre skyldes skadedyrsangreb. Ved prøveudtagningen af disse levnedsmidler bør opmærksomheden endvidere være henledt på omgivelserne, herunder om emballagen er meget støvet, samt om der forekommer små støvbunker m.v.

Den laboratoriemæssige undersøgelse af levnedsmidler omfatter bl.a. en organoleptisk bedømmelse som basisparameter. Visse levnedsmiddelgrupper, f.eks. ubehandlede og letbehandlede frugter og grønsager samt tørrede frugter, har denne undersøgelse som eneste basisparameter.

Den organoleptiske bedømmelse, pkt. 3.2. i cirkulæret, omfatter bl.a. en bedømmelse af prøvens farve, konsistens samt forekomst af evt. defekter. Som eksempler på defekter kan nævnes »gnavspor«, klumpdannelse og efterladenskaber. Sådanne defekter bør lede tanken hen på forekomst af skadedyr og give anledning til nærmere undersøgelse.

20.06.86 PRØVEUDTAGNING

5.1. Prøveudtagning og -opbevaring

I tilfælde hvor tilsynsmyndigheden under tilsynets udøvelse får mistanke om forekomst af skadedyr, og hvor prøveudtagningens formål er at bekræfte, evt. afkræfte, denne mistanke, udtages prøver direkte fra de mistænkte partier. Derudover kan prøveudtagningen i særlige tilfælde, f.eks. ved import af produkter i hvilke der tidligere er fundet forekomst af skadedyr, udføres som en stikprøve bestående af flere stikprøveenheder.

Levende dyr (møllarver, biller m.v.) findes ofte ulige fordelt i varepartierne, idet disse skadedyr samler sig på de fugtige og varme steder. Ved prøveudtagningen må opmærksomheden derfor særligt være henledt på evt. fugtige varepartier.

Nogle skadedyr (støvlus, mider m.fl.) tåler ikke tørke, hvilket man må tage hensyn til ved prøvens opbevaring, og fugtige delprøver bør ikke blandes med tørre delprøver, idet man herved forringer skadedyrenes muligheder for at overleve under prøvens transport til laboratoriet m.v.

Prøven anbringes i plastpose eller glas med låg eller lignende og opbevares ved stuetemperatur indtil undersøgelsen kan finde sted på laboratoriet. Prøven bør kun opbevares kort tid inden undersøgelsens påbegyndelse, idet prøvens repræsentative værdi er kortvarig.

2O.O6.86 LABORATORIEMÆSSIG UNDERSØGELSE

5.2. Laboratoriemæssig undersøgelse

5.2.1. Visuel undersøgelse.

Emballager

Ved defekte emballager bør defektbilledet vurderes, idet små runde huller ofte skyldes billeangreb, medens mere uregelmæssigt formede huller kan være forårsaget af forskellige former for larver m.v. eller bid af mus, rotter m.m..

Prøvemateriale.

Prøven undersøges på hvid bakke forsynet med kant. Ved prøvens undersøgelse bør man have petriskåle med låg og pincet til rådighed, og synsfeltet bør kunne belyses rigeligt (ca. 6O watt). Lampen bør kunne forskydes over bakken.

Prøvematerialet spredes ud på bakken i et tyndt lag, og således at 1/3 af bakkens bund fortsat er fri til udførelse af sortering.

Hvis dyrene i prøven er for mange eller for livlige til, at man kan holde styr på dem, kan de beroliges eller aflives ved at prøven anbringes i dybfryser i nogle timer.

Levende og døde dyr, larver, æg m.v. opsamles til nærmere undersøgelse ved brug af pincet eller fugtet pensel.

Sigtning af prøver.

I forbindelse med den visuelle undersøgelse kan laboratoriet med fordel foretage en sigtning af varen (f.eks. cerealier).

5.2.2. Artsbestemmelse og Mikroskopi.

De fundne skadedyr kan betragtes i tør tilstand og søges identificeret ved anvendelse af billednøgle, jfr. speciallitteratur. Artsbestemmelse kan endvidere foretages af Statens Skadedyrlaboratorium (adresse: Skovbrynet 14, 2800 Lyngby).

Den visuelle bedømmelse kan suppleres med en mikroskopisk undersøgelse, der kan foretages enten ved brug af stereomikroskop eller ved undersøgelse af meget små skadedyr ved mikroskopi (100-400 x forstørrelse).

Til brug for mikroskopi af mider, støvlus m.v. kan anvendes et indlejringsmedium (Hoyers' Medium) med følgende sammensætning

30 g gummiarabicum (i klumper, pulver kan give uklare præparater)

50 ml destilleret vand

20 ml glycerol

50 g kloralhydrat

Gummiarabicum opløses i vandet i en kolbe forsynet med prop. Opløsningen af gummiarabicum kan fremmes ved svag opvarmning, men kan i øvrigt tage nogle dage. Derefter tilsættes glycerol og kloralhydrat, og efter opløsningen filtreres gennem si for at fjerne urenheder fra gummiarabicumklumperne. Indlejringsmediet opbevares i flaske med prop, og har herefter flere års holdbarhed.

5.2.3. Fremstilling af præparat.

På objektglas anbringes en dråbe indlejringsmedie. Spidsen af en nål dyppes i dråben, og skadedyret klæbes til nålen for herefter at overføres til indlejringsmediet. Derefter overdækkes præparatet med dækglas. Eventuelle luftbobler i indlejringsmediet uddrives ved svag opvarmning .

Dyr i vand eller glycerol kan uden videre overføres til indlejringsmediet, men dyr, der har været opbevaret i sprit eller mælkesyre, bør vaskes let forinden. En dråbe sprit i indlejringsmediet får det til at »flygte« og mælkesyre udfældes i indlejringsmediet.

Ved mikroskopisk undersøgelse anvendes forstørrelsen 100-400 gange, afhængigt af skadedyrets størrelse.

5.2.4. Konservering.

Levende dyr kan konserveres i sprit (7O% ethanol) tilsat glycerin i forholdet 3:1. Man kan også lade dyrene tørre af sig selv i en petriskål.

Kilde

Thorkil E. Halias og Henri Mourier: Skadedyr i levnedsmidler.

For yderligere undersøgelse og artsbestemmelse af skadedyr henvises til ovennævnte bog eller anden faglitteratur samt Statens Skadedyrlaboratorium, Skovbrynet 14, 2800 Lyngby (tlf. 02 878055).

Cirkulære om mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler

I henhold til § 29 i lov nr. 220 af 26. april 1973 om kød m.m. og § 24 i landbrugsministeriets bekendtgørelse nr. 482 af 27. september 1974 om kød m.m. til hjemmemarkedet fører veterinærdirektoratet overtilsynet med overholdelsen af de i bekendtgørelsen eller i medfør af bekendtgørelsen fastsatte bestemmelser.

I henhold til § 55, stk. 2, i lov nr. 310 af 6. juni 1973 om levnedsmidler m.m. udsteder statens levnedsmiddelinstitut forskrifter for de laboratoriemæssige undersøgelser af levnedsmidler. I henhold til aftale mellem statens levnedsmiddelinstitut og veterinærdirektoratet ved fastlæggelse af levnedsmiddellovens administration, udsteder veterinærdirektoratet regler for de mikrobiologiske undersøgelser.

I henhold til § 43 i lov nr. 310 af 6. juni 1973 om levnedsmidler m.m. og § 12, stk. 3, i miljøministeriets bekendtgørelse nr. 368 af 27. juni 1974 om autorisation af virksomheder, der tilvirker levnedsmidler eller tilsætningsstoffer, påhviler det veterinærdirektoratet af føre overtilsynet med virksomheder, der tilvirker levnedsmidler. I henhold til bekendtgørelsens § 16, stk. 1, kan veterinærdirektoratet og statens levnedsmiddelinstitut give retningslinier for prøveudtagning af råvarer, halvfabrikata, færdigvarer, emballage m.m.

I henhold til § 55 i miljøministeriets bekendtgørelse nr. 121 af 28. marts 1980 om detailforhandling af levnedsmidler fører veterinærdirektoratet overtilsynet med overholdelsen af bekendtgørelsen og giver vejledende retningslinier for udførelsen og omfanget af tilsynet med de af bekendtgørelsen omfattede virksomheder.

I henhold til § 8 i miljøministeriets bekendtgørelse nr. 367 af 27. juni 1974 om salg m.v. en gros af levnedsmidler fører veterinærdirektoratet overtilsynet med overholdelsen af bekendtgørelsen, og veterinærdirektoratet kan i henhold til bekendtgørelsens § 11 give retningslinier for prøveudtagning af råvarer, halvfabrikata, færdigvarer m.m. i de af bekendtgørelsen omfattede virksomheder.

Tilsynet med de af ovennævnte bestemmelser omfattede virksomheder

- virksomheder godkendt af veterinærdirektoratet i henhold til § 16, stk. 1, og af kommunalbestyrelsen i henhold til § 19, stk. 1, i landbrugsministeriets bekendtgørelse nr. 482 af 27. september 1974 om kød m.m. til hjemmemarkedet.

- virksomheder autoriseret af veterinærdirektoratet i henhold til § 2, stk. 1, i miljøministeriets bekendtgørelse nr. 368 af 27. juni 1974 om autorisation af virksomheder, der tilvirker levnedsmidler eller tilsætningsstoffer.

- virksomheder godkendt af den lokale tilsynsmyndighed i henhold til § 4 i miljøministeriets bekendtgørelse nr. 121 af 28. marts 1980 om detailforhandling af levnedsmidler.

- virksomheder godkendt af den lokale tilsynsmyndighed i henhold til § 2, stk. 1, i miljøministeriets bekendtgørelse nr 367 af 27. juni 1974 om salg m.v. en gros af levnedsmidler.

udøves af kommunalbestyrelsen og den respektive levnedsmiddelkontrolenhed.

Under henvisning til ovenstående og med det formål at sikre, at levnedsmiddelkontrolenhederne har

- den nødvendige indsigt med den hygiejniske og sundhedsmæssige kvalitet af levnedsmidler tilvirket og opbevaret på virksomheden og

- den fornødne indsigt med virksomhedens produktionshygiejne,

meddeler veterinærdirektoratet efter aftale med statens levnedsmiddelinstitut i nærværende cirkulære om mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler retningslinier for

a. Udtagning og udtagningsfrekvens for levnedsmiddelprøver (færdigvarer, halvfabrikata og råvarer) og emballager samt for hygiejneundersøgelser i virksomheden (jfr. bilag 1).

b. Mærkning, transport og opbevaring af levnedsmiddelprøver (jfr. bilag 1).

c. Parametervalg i form af basisparametre og supplerende parametre for de enkelte levnedsmiddelgrupper og undergrupper til brug ved rutinemæssige undersøgelser af levnedsmidler samt, hvor alternative undersøgelsesprogrammer ikke er beskrevet, til undersøgelser af råvarer og halvfabrikata (jfr. bilag 2).

d. Metodik for de laboratoriemæssige undersøgelser samt vejledende retningslinier for gennemførelse af driftskontrolundersøgelser samt undersøgelser til brug for vurdering af virksomheders hygiejne, herunder renholdelse af lokaler og inventar (jfr. bilag 3).

e. Screeningsundersøgelser til vurdering af niveauet for forekomst af specifikke bakterier (jfr. bilag 4).

Cirkulæret træder i kraft den 1. januar 1985. Samtidig ophæves statens levnedsmiddelinstituts og veterinærdirektoratets »Cirkulære af 11.juli 1977 om laboratoriemæssig undersøgelse af levnedsmidler tilvirket på virksomheder, som er autoriseret eller godkendt af veterinærdirektoratet«.

Veterinærdirektoratet, den 1. november 1984

Erik Stougaad

/E. Malling Olsen

01.12.86 INDHOLDSFORTEGNELSE

BILAG 1. PRØVEUDTAGNING 1.1. UDTAGNING AF PRØVER 1.2. MÆRKNING AF PRØVER 1.3. TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER 1.4. PRØVEUDTAGNINGSFREKVENS 1.5. MEDDELELSE AF RESULTATER

BILAG 2. PARAMETERVALG INDLEDNING 2.1. KØD OG KØDVARER. 2.2. FISK OG FISKEVARER. 2.3. FRUGT OG GRØNSAGER OG PRODUKTER HERAF. 2.4. DRIKKEVARER. 2.5. KAGE- OG KONSUMISPRODUKTER. 2.6. MAYONNAISER OG SALATER. 2.7. SAMMENSATTE LEVNEDSMIDLER (F.EKS. FÆRDIGE MIDDAGSRETTER OG DESSERTER). 2.8. HJÆLPESTOFFER (KRYDDERIER M.M.). 2.9. OST OG OSTEPRODUKTER.

BILAG 3. METODIK INDLEDNING 3.1. FORBEHANDLING AF LEVNEDSMIDDELPRØVER. 3.2. ORGANOLEPTISK BEDØMMELSE. 3.2.1. SUBJEKTIVE MÅLEMETODER. 3.2.2. OBJEKTIVE MÅLEMETODER. 3.3. UNDERSØGELSESMETODER. 3.3.1. ALTEROMONAS PUTREFACIENS. 3.3.2. BACILLUS CEREUS. 3.3.3. BAKTERIESPORETALLET. 3.3.4. BROCHOTHRIX THERMOSPHACTA. 3.3.5. CAMPYLOBACTER. 3.3.6. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS. 3.3.7. COLIFORME BAKTERIER (37 grader COLI). 3.3.8. ENTEROBACTERIACEAE. 3.3.9. FÆKALE STREPTOKOKKER. 3.3.10 GÆRINGSPRØVE. 3.3.11. GÆR- OG SKIMMELSVAMPE. 3.3.12. KIM PÅ BLODAGAR 37 grader C. 3.3.13. KIMTALSBESTEMMELSER. 3.3.14. LACTOBACILLER. 3.3.15. MÆLKESYREDANNENDE BAKTERIER. 3.3.16. PROTEOLYTISKE BAKTERIER. 3.3.17. REDUKTASEPRØVE. 3.3.18. SALMONELLA. 3.3.19. STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 3.3.20. SULFITREDUCERENDE CLOSTRIDIER. 3.3.21. TERMOTOLERANTE COLIFORME BAKTERIER (44 grader COLI). 3.3.22. VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS. 3.3.23. YERSINIA ENTEROCOLITICA. 3.4. TÆLLING OG ANGIVELSE AF KIMTAL. 3.5. HOLDBARHEDSUNDERSØGELSER. 3.6. HYGIEJNEUNDERSØGELSER. 3.6.1. RENGØRINGSKONTROLUNDERSØGELSER. 3.6.2. DRIFTSKONTROLUNDERSØGELSER. 3.6.3. OVERVÅGNINGSUNDERSØGELSER.

BILAG 4. SCREENINGSUNDERSØGELSER.

BILAG 5. SKADEDYR I LEVNEDSMIDLER.

BILAG 1.

01.12.86 OVERSIGT

PRØVEUDTAGNING

1.1. UDTAGNING AF PRØVER

1.2. MÆRKNING AF PRØVER

1.3. TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER

1.4. PRØVEUDTAGNINGSFREKVENS

1.5. MEDDELELSE AF RESULTATER

BILAG 1.

01.01.85.

PRØVEUDTAGNING

1.1. Udtagning af prøver

1.1.1. Prøver til laboratoriemæssig undersøgelse udtages som et led i levnedsmiddelkontrolenhedernes tilsyn med levnedsmiddelvirksomheder, og antallet af prøver og prøveudtagningsfrekvens fastsættes i et omfang er sikrer, at levnedsmiddelkontrolenheden har indsigt med produktionshygiejnen på virksomheden samt den hygiejniske og sundhedsmæssige kvalitet af levnedsmidler.

1.1.2. Udtagning af prøver skal ske ved foranstaltning af og ved personale ansat ved den levnedsmiddelkontrolenhed, der udøver tilsynet med den pågældende virksomhed. Prøveudtageren skal være instrueret om, hvorledes prøverne skal udtages, og der bør være en repræsentant fra virksomheden til stede.

1.1.3. Prøveudtagningen kan omfatte prøver (stikprøver) af færdigvarer, halvfabrikata, råvarer, emballager samt drifts- og hygiejnekontrolprøver.

1.1.4. Stikprøvens størrelse skal være sådan, at de undersøgelser, der foreskrives i nærværende cirkulære, kan gennemføres, og af ikke færdigpakkede levnedsmidler udtages normalt mindst 200 g. Stikprøven udtages således, at den så vidt muligt er repræsentativ for hele levnedsmidlet (partiet). Ved prøveudtagning af et parti, der skønnes at være af uensartet mikrobiologisk kvalitet, bør stikprøven bestå af flere prøver (stikprøveenheder). I særlige tilfælde, f.eks. ved importkontrol, underkastes hver stikprøveenhed en mikrobiologisk undersøgelse. (jfr. NMKL rapport nr. 2 vedrørende udtagning af stikprøve-enheder og delprøver af levnedsmidler til mikrobiologiske undersøgelser). Ved udtagning af prøver af færdigpakkede levnedsmidler, der skal underkastes holdbarhedsundersøgelse, udtages prøverne som dobbeltprøver.

1.1.5. Redskaber til prøveudtagning (f.eks. skeer, knive og pipetter) samt beholdere til prøver skal være rene, sterile og af et materiale, der ikke påvirker eller påvirkes af levnedsmidler (f.eks glas, rustfrit stål eller plast). Beholderne skal være af passende størrelse og således, at de kan rumme den foreskrevne prøvemængde, og skal være forsynet med tætsluttende lukke. Ved prøveudtagning af uemballerede levnedsmidler kan de af virksomheden anvendte portioneringsredskaber anvendes. Dette noteres i så fald i prøveudtagningsrapporten.

1.1.6. Termometre skal være af egnet materiale og udformning. Termometre skal normalt kunne måle i følgende temperaturområde: -30 grader C til 100 grader C med en nøjagtighed af mindst +/-1 grad C.

1.1.7. Prøveudtagningen skal ske på en sådan måde, at levnedsmidlet ikke forurenes ved prøveudtagningen.

1.2. Mærkning af prøver.

1.2.1. Umiddelbart efter udtagningen af prøven, skal den mærkes på tydelig og holdbar måde til sikker identifikation, og i en prøveudtagningsrapport skal anføres oplysninger, der sikrer dette samt oplyser om varens karakteristika m.m. (jfr. skema 1.1.).

a) Virksomhedens navn og adresse samt eventuelt register- eller autorisationsnummer.

b) Producentens navn og adresse samt eventuel register- eller autorisationsnummer.

c) Sted og tidspunkt for prøveudtagningen.

d) Prøvens kendetegn, f.eks. art, betegnelse, fremstillingsdato, behandling og opbevaringstemperatur.

1.3. Transport og opbevaring af prøver.

1.3.1. Så hurtigt som muligt efter prøvernes udtagning transporteres de til laboratoriet. Transporten skal foregå i lukkede og isolerede beholdere (transportmidler).

1.3.2. Såvel under transporten til laboratoriet som under opbevaring i laboratoriet skal prøverne være beskyttet mod påvirkninger, herunder temperatursvingninger, som kan give anledning til ændring af prøverne.

1.3.3. Den laboratoriemæssige undersøgelse af de udtagne prøver indledes så hurtigt som muligt efter prøvernes modtagelse på laboratoriet. Prøver, som tages i anvendelse mere end 6 timer efter prøveudtagningen, skal på laboratoriet opbevares ved følgende temperaturer

a) Let fordærvelige levnedsmidler: 0 - 2 grader C

b) Frosne levnedsmidler: < -10 grader C

1.4. Prøveudtagningsfrekvens.

1.4.1. I detail- og engrosforhandlingsvirksomheder med tilvirkning, udskæring eller emballering af levnedsmidler udtages prøver af levnedsmidler samt udføres hygiejneundersøgelser efter et af levnedsmiddelkontrolenheden skønnet behov. Ved denne behovsvurdering, der foretages mindst een gang årligt, indgår de under pkt. 2.1. i veterinærdirektoratets cirkulære af 12. september 1983 om tilsyn med bestemmelserne om detailforhandling og engrosforhandling af levnedsmidler anførte forhold samt levnedsmiddelkontrollens kendskab til virksomheden gennem tilsyn og analyseresultater af tidligere udtagne prøver.

1.4.2. Ved tilsynet med detailforhandlingsvirksomheder og levnedsmiddelengroslagre skal der normalt ikke udtages prøver af færdigpakkede levnedsmidler, der er fremstillet på autoriserede eller godkendte levnedsmiddelvirksomheder. Såfremt der for disse levnedsmidler foreligger tvivl om den sundhedsmæssige kvalitet, klager, konstaterede overtrædelser af opbevaringsforskrifter og lign., kan prøver dog udtages, men undersøgelsen bør normalt kun omfatte det (de) forhold, der har betinget udtagelsen.

1.4.3. For virksomheder godkendt eller autoriseret af veterinærdirektoratet fastsættes prøveudtagningsfrekvensen af veterinærdirektoratet. Nedenstående prøveudtagningsfrekvens er gældende, såfremt denne ikke er angivet i forbindelse med virksomhedens godkendelse

a) Virksomheder, der tilvirker let fordærvelige levnedsmidler eller levnedsmidler, der erfaringsmæssigt er forbundet med sundhedsmæssige risici: 12 gange årligt, heraf mindst een hygiejneundersøgelse.

b) Virksomheder, der tilvirker holdbare levnedsmidler: 4 gange årligt.

c) Virksomheder, der tilvirker levnedsmidler med ringe sundhedsmæssige risici: 2 gange årligt.

1.4.4. Levnedsmiddelkontrolenheden indstiller til veterinærdirektoratet om ændring af den under pkt. 1.4.3. nævnte prøveudtagningsfrekvens, når det skønnes rimeligt ud fra enhedens kendskab til virksomheden ved tilsyn samt ved resultater af analyser af udtagne levnedsmiddelprøver m.m.

I virksomheder, hvor der er etableret egenkontrolsystemer af hygiejnisk-sundhedsmæssig art, eksempelvis i form af Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) system, kan dette forhold indgå ved vurderingen af frekvenserne for udtagning af levnedsmiddelprøver, når virksomhedens resultater m.v. bliver stillet til kontrolmyndighedens rådighed.

1.4.5. Ekstra prøver udtages på tilsynsmyndighedens foranledning, når bl.a. virksomhedstilsyn og analyser af de rutinemæssigt udtagne prøver giver anledning til væsentlige bemærkninger.

1.5. Meddelelse af resultater.

1.5.1. Resultatet af den laboratoriemæssige undersøgelse samt levnedsmiddelkontrolenhedens eventuelle bemærkninger og anvisninger meddeles virksomheden, hvor prøven er udtaget. Såfremt levnedsmidlet er tilvirket i anden virksomhed end den, hvor prøven er udtaget, og undersøgelsen giver anledning til bemærkninger af væsentlig sundhedsmæssig betydning, meddeles resultatet til tilsynsmyndigheden ved den pågældende virksomhed.

1.5.2. Levnedsmiddelkontrolenhederne skal efter anmodning fra veterinærdirektoratet meddele oplysninger vedrørende de foretagne undersøgelser, herunder afgive indberetning om resultaterne af undersøgelserne.

Skema 1.1.

BILAG 2.

01.12.86 OVERSIGT

PARAMETERVALG

INDLEDNING

2.1. KØD OG KØDVARER.

2.2. FISK OG FISKEVARER.

2.3. FRUGT OG GRØNSAGER OG PRODUKTER HERAF.

2.4. DRIKKEVARER.

2.5. KAGE- OG KONSUMISPRODUKTER.

2.6. MAYONNAISER OG SALATER.

2.7. SAMMENSATTE LEVNEDSMIDLER (F.EKS. FÆRDIGE MIDDAGSRETTER OG DESSERTER).

2.8. HJÆLPESTOFFER (KRYDDERIER M.M.).

2.9. OST OG OSTEPRODUKTER.

BILAG 2.

01.01.85 INDLEDNING

Indledning

I det følgende er for de enkelte levnedsmiddelgrupper og undergrupper heraf angivet et parametervalg til brug for rutinemæssige undersøgelser af levnedsmidler. De angivne undersøgelsesprogrammer er udarbejdet til brug for en færdigvarekontrol, men vil, hvor alternative undersøgelsesprogrammer ikke er beskrevet, være anvendelige til rutinemæssige undersøgelser af råvarer og halvfabrikata.

Undersøgelsesprogrammerne er opbygget, dels af basisparametre, der normalt indgår ved undersøgelsen af levnedsmidler tilhørende den respektive levnedsmiddelgruppe, dels af supplerende parametre med hvilke basisparametrene kan udvides efter levnedsmiddelkontrolenhedens skøn og vurdering for en sufficient mikrobiologisk undersøgelse af det pågældende levnedsmiddel. En udvidelse med supplerende parametre bør dog normalt kun ske, hvor der foreligger sådanne forhold, der under de enkelte levnedsmiddelgrupper er fremhævet under »Anvendelse af supplerende parametre«, eller hvor der efter levnedsmiddelkontrolenhedens vurdering foreligger særlige hygiejniske og sundhedsmæssige (mikrobiologiske) forhold, eller hvor undersøgelsen omfatter specielle levnedsmidler inden for levnedsmiddelgruppen.

Såfremt levnedsmidler skal undersøges foranlediget af helt specielle forhold f.eks. mistanke til levnedsmidler som årsag til madforgiftning, klager eller kassation af et parti levnedsmidler, må den respektive levnedsmiddelkontrolenhed anvende de parametre, der i hvert enkelt tilfælde skønnes rimelige for en sufficient mikrobiologisk undersøgelse. Der kan herunder anvendes parametre, der ikke er angivet i cirkulæret, f.eks. specifikke patogener.

Vedrørende undersøgelse for specifikke patogener skal i øvrigt nævnes, at det angivne parametervalg ofte omfatter en undersøgelse for sådanne patogene bakterier, som vokser frem på blodagar (f.eks hæmolyserende stafylokokker og Bacillus cereus). Endvidere er for nogle levnedsmidler foreskrevet en undersøgelse for Clostridium perfringens, dels som basisparametre, dels som supplerende parametre. Undersøgelse for andre specifikke patogener, der kan optræde som causal mikroorganisme ved levnedsmiddelforgiftninger, f.eks. Salmonella og Yersinia enterocolitica, tænkes imidlertid udført som screeningsundersøgelser organiseret af veterinærdirektoratet, og en undersøgelse herfor bør derfor ikke indgå i de rutinemæssigt udtagne prøver uden særlig begrundelse. Der kan dog på relevante virksomheder udføres overvågningsundersøgelser for f.eks. Salmonella (jfr. pkt. 3.6.3.).

BILAG 2.

01.01.85 KØD OG KØDVARER

2.1. Kød og kødvarer

2.1.1. Fersk kød og slagteaffald. Basisparametre Supplerende parametre Organoleptisk bedømmelse. 1) pH. Kimtal 17/7 grader C. 2) Kimtal 30 grader C og termotolerante coliforme bakterier. Fækale streptokokker 3) Lactobaciller og Brochothrix thermosphacta. Kim på blodagar 37 grader 4) Alteromonas putrefaciens. C. 5) Proteolytiske bakterier og sulfitreducerende clostridier. 6) Peroxidtal.

Anvendelse af supplerende parametre

1) pH anvendes ved mistanke om forandringer i kødet, f.eks. PSE/DFD samt til brug for vurdering af hvilken mikroflora, der kan forventes.

2) Kimtal 30 grader C og termotolerante coliforme bakterier anvendes på prøver udtaget tidsmæssigt tæt på slagtetidspunktet.

3) Lactobaciller og Brochothrix thermosphacta anvendes på prøver af vakuum/gaspakkede kødvarer.

4) Alteromonas kan anvendes på kødprøver med pH > 6,2 til vurdering af holdbarheden.

5) Proteolytiske bakterier og sulfitreducerende clostridier anvendes på kød modnet i vakuumpakning.

6) Peroxidtallet anvendes på kød modnet i vakuumpakning eller svinekød, som har været opbevaret i lang tid i dybfrossen stand.

Produkteksempler

De for dansk husholdning normale detailudskæringer samt diverse engrosudskæringer (levnedsmiddelgruppe 05.1).

2.1.2 . Hakket kød og farsvarer . Basisparametre. Supplerende parametre. Organoleptisk bedømmelse. 1) pH. Kimtal 17/7 grader C. 2) Gæringsprøve. Fækale streptokokker. 3) Kimtal 30 grader C og coliforme bakterier. Kim på blodagar 37 grader C. 4) Peroxidtal. 5) Holdbarhedsundersøgelse. 6) Lactobaciller.

Anvendelse af supplerende parametre

1) pH anvendes ved mistanke om vækst af syredannende mikroorganismer.

2) Gæringsprøve anvendes ved mistanke om tilsætning af konserveringsmiddel.

3) Kimtal 30 grader C og termotolerante coliforme bakterier anvendes på prøver udtaget tidsmæssigt tæt på slagtetidspunktet.

4) Peroxidtallet anvendes på prøver af frosne produkter, hvor hakket svinekød udgør hele eller en væsentlig del af produktet til undersøgelse af eventuel harskning.

5) Holdbarhedsundersøgelse anvendes på prøver af langtidsholdbart kød. Undersøgelsen kan efter skøn suppleres med en undersøgelse for forekomst af Brochothrix thermosphacta.

6) Lactobaciller anvendes på prøver, hvortil er anvendt vakuumpakkede råvarer.

Produkteksempler

Hakket okse-, flæske- og kalvekød, rå medisterpølse og rørt fars samt maskinudbenet kød (levnedsmiddelgruppe 05.1 og 05.61).

2.1.3. Varmebehandlede kødvarer.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) aW.

Kimtal 17/7 grader C eller 2) Fækale streptokokker.

30 grader C.

Coliforme bakterier. 3) Termotolerante coliforme bakterier.

Kim på blodagar 37 grader C. 4) Sulfitreducerende clostridier. 5) Lactobaciller. 6) Brochothrix thermosphacta. 7) Holdbarhedsundersøgelse.

Anvendelse af basisparametre

Inkubationstemperaturen ved kimtalsbestemmelse vurderes i relation til undersøgelsens formål. Ved holdbarhedsundersøgelse foretages altid en bestemmelse af antal psykrotrofe kim, og ved udtagning af prøver i tilslutning til tilvirkning bestemmes et kimtal ved 30 grader C.

Anvendelse af supplerende parametre

1) aw anvendes ved vurdering af hvilken mikroflora, der kan vokse frem i varen med nedsættelse af holdbarheden til følge (f.eks. salttilsatte kødvarer).

2) Fækale streptokokker anvendes til vurdering dels af produktionshygiejnen dels af varens afkølingsfase (korrekt tid/temperatur).

3) Termotolerante coliforme bakterier anvendes ved mistanke om fækal forurening.

4) Sulfitreducerende clostridier anvendes ved undersøgelse af produkter, der har været underkastet lav varmebehandlingstemperatur (< 100 grader C), og hvor emballeringen eller varens sammensætning giver anaerobe forhold.

5) Lactobaciller anvendes for kødvarer varmebehandlet før emballeringen, og særligt ved undersøgelse af varer emballeret i vakuumpakning eller kontrolleret atmosfære.

6) Brochothrix thermosphacta anvendes ved undersøgelse af slicede charcuterivarer emballeret i vakuumpakning eller kontrolleret atmosfære.

7) Holdbarhedsundersøgelse anvendes lejlighedsvis for færdigpakkede kødvarer.

Produkteksempler

Rullepølse, kogt skinke, middagspølse, pålægspølse (levnedsmiddelgruppe 05.33 og 05.34).

2.1.4. Kølekonserves.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) pH.

Kimtal 17/7 grader C. 2) Holdbarhedsundersøgelse.

Fækale streptokokker.

Kim på blodagar 37 grader C.

Anvendelse af supplerende parametre

1) pH anvendes lejlighedsvis til fastlæggelse af niveauet til brug for holdbarhedsvurderingen.

2) Holdbarhedsundersøgelse udføres lejlighedsvis. Antallet af prøver relateres til produktionens størrelse.

Produkteksempler

Dåseskinke og farsvarer (pålægspølser) i impermeabel emballage (levnedsmiddelgruppe 5.31 og 5.32).

2.1.5. Helkonserves.

Ved undersøgelse af helkonserves anvendes den i NMKL nr. 59, 2. udgave, 1978, foreskrevne fremgangsmåde. Undersøgelse for holdbarhed foretages efter de i NMKL nr. 47, 1963, angivne forskrifter.

Produkteksempler

levnedsmiddelgruppe 05.4.

2.1.6. Saltede, ikke varmebehandlede kødvarer med aw < 0.9.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) pH.

aw. 2) Fremmede kim.

Anvendelse af supplerende parametre

1) pH anvendes lejlighedsvis ved fastlæggelse af niveauet til brug for holdbarhedsvurderingen.

2) Fremmede kim anvendes på prøver af fermenterede produkter. Med den foreslåede metodik er kendskab til den anvendte syrevækker en forudsætning for vurdering af resultatet.

Produkteksempler

Spegepølser (levnedsmiddelgruppe 05.2).

2.1.7. Saltede, ikke varmebehandlede kødvarer med aw > 0,9.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) pH.

aw. 2) Fremmede kim.

Kimtal 30 grader C. 3) Gærsvampe.

Fækale streptokokker.

Anvendelse af supplerende parametre

1) pH anvendes lejlighedsvis til fastlæggelse af niveauet. Sammenholdes med aw til brug for holdbarhedsvurdering.

2) Fremmede kim anvendes på prøver af fermenterede produkter. Med den foreslåede metodik er kendskab til den anvendte syrevækker en forudsætning for vurdering af resultatet.

3) Gærsvampe anvendes lejlighedsvis ved holdbarhedsundersøgelser.

Produkteksempler

Spegepølser, hamburgerryg, spegeskinker, bacon (levnedsmiddelgruppe 05.2).

Skema 2.1.

BILAG 2.

01.01.85 FISK OG FISKEVARER

2.2. Fisk og fiskevarer.

2.2.1. Ferske fisk og fiskevarer.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Bestemmelse af trimethylamin (TMA) og total flygtig kvælstof (TVN).

Kimtal 21 grader C i Jern

agar. 2) Reduktaseprøve.

Fækale streptokokker. 3) Gæringsprøve og amidolprøve. 4) Termotolerante coliforme bakterier i LST bouillon. 5) Vibrio parahaemolyticus og Salmonella.

Anvendelse af supplerende parametre

1) TMA- og TVN-bestemmelse kan kun anvendes ved undersøgelse af saltvandsfisk til bestemmelse af graden af mikrobielt fordærv. I rødspætter og sild dannes dog betydelig mindre mængder TMA end i andre saltvandsfisk.

2) Reduktaseprøven kan anvendes ved undersøgelse af hakket fiskekød og fiskefars, når prøverne ikke indeholder rå løg.

3) Gærings- og amidolprøve kan anvendes på fiskefars ved mistanke om tilsat konserveringsstof.

4) Termotolerante coliforme bakterier kan anvendes ved undersøgelse af filetterede produkter til vurdering af produktionshygiejnen.

5) Vibrio parahaemolyticus og Salmonella kan anvendes ved undersøgelse af importerede varer, særligt fra tropiske og subtropiske områder.

Produkteksempler

Hele og udskårne fisk, flåede og filetterede fisk, hakket fiskekød, fiskefars, lever og rogn samt tilsvarende produkter i frossen og dybfrossen stand (levnedsmiddelgruppe 06.1 og 06.2).

2.2.2. Varmebehandlede fisk og fiskevarer.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Fækale streptokokker.

Kimtal 21 grader C. 2) Sulfitreducerende clostridier.

Coliforme bakterier.

Kim på blodagar 37 grader C.

Anvendelse af basisparametre:.

Ved aflæsning af »Kim på blodagar 37 grader C« skal opmærksomheden specielt være rettet mod forekomst af Staphylococcus aureus.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Fækale streptokokker anvendes til vurdering dels af produktionshygiejnen og dels af varens afkølingsfase (korrekt tid/temperatur).

2) Sulfitreducerende clostridier anvendes for at undersøge, om der ved varmebehandlingen er sket en aktivering af sporer, således at der er foregået en opformering under afkølingsproceduren, og hvor emballeringsformen eller varens sammensætning giver nedsat ilttension. Eventuelt undersøges for forekomst af Cl. botulinum.

Produkteksempler

Kogte eller stegte fisk og fiskevarer (levnedsmiddelgruppe 06.33).

2.2.3. Letkonserverede fisk og fiskevarer.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) aw.

Kimtal 21 grader C. 2) pH.

Fækale streptokokker. 3) Gær- og skimmelsvampe.

Kim på blodagar 37 grader C. 4) Lactobaciller.

Anvendelse af basisparametret

Ved aflæsning af »Kim på blodagar 37 grader C« skal opmærksomheden specielt være rettet mod forekomst af Staphylococcus aureus.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Vandaktivitetsbestemmelse (aw) anvendes til bestemmelse af saltningens konserverende effekt.

2) pH anvendes især ved undersøgelse af spanderejer.

3) Gær- og skimmelsvampe anvendes ved undersøgelse af røgede fiskevarer.

4) Lactobaciller anvendes til at karakterisere et kimtal i f.eks. røget laks og spanderejer.

Produkteksempler

Letsaltede fisk og fiskevarer, varm- og koldrøgede fisk (røget sild, ål, makrel og laks), spanderejer (levnedsmiddelgruppe 06.31 og 06.32).

2.2.4. Halvkonserverede fiskevarer.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Gær- og skimmelsvampe.

pH. 2) Lactobaciller. 3) aw.

Anvendelse af supplerende parametre

1 og 2) Bestemmelse af eventuel forekomst af gærsvampe og lactobaciller anvendes i tilfælde af organoleptiske forandringer samt ved højt pH (pH > 5) og lav saltprocent (< 6 % salt).

3) Vandaktivitetsbestemmelse (aw) anvendes til bestemmelse af saltningens konserverende effekt samt ved tørrede fisk og fiskevarer. (levnedsmiddelgruppe 06.34 og 06.4).

Produkteksempler

Kryddersild, marinerede fiskevarer i glas, spande og lignende, kaviar samt tørrede fisk og fiskevarer (levnedsmiddelgruppe 06.34 og 06.4).

2.2.5. Krebs- og blødyr.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Fækale streptokokker.

Kimtal 21 grader C. 2) Termotolerante coliforme bakterier i LST bouillon.

Kim på blodagar 37 grader C. 3) Vibrio parahaemolyticus og Salmonella.

Anvendelse af basisparametre:.

Ved aflæsning af »Kim på blodagar 37 grader C« skal opmærksomheden specielt være rettet mod forekomst af Staphylococcus aureus.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Fækale streptokokker anvendes ved undersøgelse af kogte varer (rejer) til at bedømme produktionshygiejnen.

2) Termotolerante coliforme bakterier anvendes ved undersøgelse afbløddyr (østers, muslinger) til at bedømme vandet, hvori de er høstet og eventuelt renset.

3) Vibrio parahaemolyticus og Salmonella anvendes ved undersøgelse af produkter importeret fra tropiske og subtropiske områder, samt ved mistanke om kontamineret vand.

Produkteksempler

Kogte rejer, andre kogte krebsdyr, herunder frosne, samt muslinger, østers m.m. (levnedsmiddelgruppe 06.1, 06.2 og 06.33).

BILAG 2.

01.01.85 FRUGT OG GRØNSAGER M.M.

2.3. Frugt og grønsager og produkter heraf.

2.3.1. Ubehandlede og letbehandlede frugter og grønsager.

Basisparametre. Supplerende paramet re.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Termotolerante coliforme bakterier. 2) Cl. perfringens. 3) Salmonella.

Anvendelse af supplerende parametre:.

1) Termotolerante coliforme bakterier anvendes til at bedømme, om produkterne er fækalt forurenet.

2) Cl. perfringens anvendes som indikatororganisme til påvisning af eventuel fækal forurening, f.eks. som følge af forurenet vandingsvand.

3) Undersøgelse for Salmonella skal ses på baggrund af ovenstående.

Produkteksempler

Rå, findelte, eventuelt let konserverede frugter og grønsager, f.eks. salater, samt jordbær, druer, kirsebær m.m. (levnedsmiddelgruppe 09.1).

2.3.2. Dybfrosne frugter og grønsager.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Fækale streptokokker.

Kimtal 30 grader C.

Coliforme bakterier.

Anvendelse af supplerende parametre

1) Fækale streptokokker anvendes som indikator på kontaminerede råvarer eller en dårlig produktionshygiejne.

Produkteksempler

Blancherede, frosne grønsager, samt jordbær, hindbær m.m. (levnedsmiddelgruppe 09.2).

2.3.3. Tørrede frugter.

Basisparametre. Supplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Termotolerante coliforme bakterier. 2) Gær- og skimmelsvampe. 3) Aerobe/anaerobe bakteriesporedannere.

Anvendelse af basisparametre

Ved den organoleptisk bedømmelse skal opmærksomheden specielt være rettet mod forekomst af skadedyr.

Anvendelse af supplerende parametre:.

1) Termotolerante coliforme bakterier anvendes ved undersøgelse af soltørrede frugter til at bedømme, om varen er fækalt forurenet.

2) Gær- og skimmelsvampe anvendes ved undersøgelse af soltørrede frugter.

3) Bakteriesporedannere anvendes som indikator på støv- og jordforurening, idet de vil overleve i tørrede (soltørrede) produkter.

Produkteksempler

Rosiner, dadler, figner m.m. (levnedsmiddelgruppe 09.3).

2.3.4. Produkter af frugt og grønsager.

Basisparametre. Suplerende parametre.

Organoleptisk bedømmelse. 1) Gær- og skimmelsvampe.

pH. 2) Lactobaciller.

Måling af sukkerindhold

(grader Brix).

Anvendelse af supplerende parametre

Afhænger af pH, sukkerindhold og art og mængde af anvendte konserveringsstoffer.

Da der kan være tale om konserveringsstof-resistente lactobaciller, som f.eks. Lactobacillus brevis, fructivorans, buchneri og/eller osmofile gær- og skimmelsvampe, som Saccharomyces baillii, Claudosporium suaveolens, Penicillium glaucum, skal der ved valg af substrater tages hensyn til dette, f.eks. ved anvendelse af specielt berigede substrater som Brigg's tomatbouillon eller MRS-bouillon tilsat konserveringsstof eller sukker i niveau som i varen.

Produkteksempler

Tomatpure, tomatketchup, marmelade (levnedsmiddelgruppe 09.7 og 09.8). Lagesyltede frugter og grønsager (levnedsmiddelgruppe 09.5).

2.3.5. Frugt og grøntkonserves.

Ved undersøgelse af helkonserves anvendes den i NMKL nr. 59, 2. udgave, 1978 foreskrevne fremgangsmåde. Undersøgelse af holdbarhed foretages efter de i NMKL nr. 47, 1963 angivne forskrifter.

Produkteksempler

Levnedsmiddelgrupper 09.4 og 09.6.

Ingen